La ferroptosis es un proceso de muerte celular autofgica

Minghui Gao 1 , 2 , Prashant Monian 2

, Qiuhui Pan 2,3
, Wei Zhang 4
, Jenny Xiang 4
y
Xuejun Jiang 2
1. 1
Departamento de Laboratorio Clnico, Dcimo Hospital del Pueblo, Escuela de Medicina de la Universidad de
Tongji, Shanghai, China
2. 2 Cell Biology Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Nueva York, Nueva York 10065, EE.UU.
3. 3Departamento de Medicina de Laboratorio, Centro Mdico de Nios de Shanghai, Escuela de Medicina de la
Universidad de Shanghai Jiaotong, Shanghai, China
4. 4 Centro de recursos genmicos de recursos, Weill Cornell Medical College, Nueva York, EE.UU.
Correspondencia: Minghui Gao, E-mail: gaominghui@hotmail.com ; Xuejun Jiang, E-mail: jiangx@mskcc.org
Recibido el 14 de junio de 2016; Revisado el 23 de julio de 2016; Aceptado 25 de julio de 2016
Publicacin en lnea anticipada 12 de agosto de 2016
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Abstracto
La ferroptosis es una forma dependiente del hierro de necrosis regulada. Est
implicado en varias enfermedades humanas, incluyendo dao isqumico de
rganos y cncer. Aqu, se reporta el papel crucial de la autofagia, en particular
la degradacin autofgica de las protenas celulares de almacenamiento de
hierro (un proceso conocido como ferritinofagia), en la ferroptosis. Usando el
cribado de RNAi junto con el anlisis gentico subsecuente, identificamos
mltiples genes relacionados con la autofagia como reguladores positivos de la
ferroptosis. La induccin de la ferroptosis llev a la activacin de la autofagia y
la consecuente degradacin de la ferritina y el receptor de carga de
ferritinofagia NCOA4. De manera consistente, la inhibicin de la ferritinofagia
por bloqueo de la autofagia o eliminacin de NCOA4 anul la acumulacin de
hierro lbil celular asociado a la ferroptosis y las especies de oxgeno reactivo,
as como la eventual muerte celular ferropttica. Por lo tanto,
Palabras clave:
ferroptosis; autofagia; ferritinofagia; homeostasis del hierro; especies de oxgeno reactivas
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Introduccin

La muerte celular programada es crucial para diversos procesos fisiolgicos en

organismos multicelulares 1 , 2 , 3 . La desregulacin de la muerte celular programada
contribuye al desarrollo de mltiples enfermedades humanas, como el cncer y la
neurodegeneracin. Aunque la apoptosis es la forma ms estudiada de muerte celular
programada, estudios recientes demuestran que tambin hay procesos programados de
muerte celular que no son apoptosis 4 , 5 , 6 , 7 . Por ejemplo, la necroptosis y la
ferroptosis son dos vas de necrosis reguladas distintas que estn bajo control gentico
preciso y pueden funcionar en diversos contextos fisiolgicos y patolgicos 8 , 9 ,10 .

La ferroptosis est emergiendo como una nueva forma de necrosis programada cuya
ejecucin requiere la acumulacin de especies reactivas de oxgeno celular (ROS) de
una manera dependiente del hierro [ 8] . La erastina compuesta de molculas pequeas
sintticas puede desencadenar ferroptosis inhibiendo la actividad de cistina-glutamato
antiportante (sistema X c - ), llevando al agotamiento del glutatin (GSH), el principal
antioxidante celular cuya sntesis requiere cistena 11 , 12. Como tal, la ferroptosis es
causada por la prdida de la homeostasis redox celular. Adems, parece que los ROS /
perxidos lipdicos en lugar de los ROS citoslicos desempean un papel ms crucial en
la ferroptosis, y la inactivacin de la glutatin peroxidasa 4 (GPX4), una enzima
necesaria para el aclaramiento de ROS lpidos, puede inducir la ferropotosis incluso
cuando los contenidos celulares de cistena y GSH son normales 13 . Es importante
destacar que se ha demostrado recientemente que la va metablica intracelular
glutaminolisis tambin juega un papel crucial en la ferroptosis mediante la promocin de
ROS celular generacin [ 14 , 15] .
Aunque no se define la funcin fisiolgica de la ferroptosis, se ha establecido su papel
en las enfermedades humanas. Por ejemplo, la ferroptosis est implicada en la lesin
orgnica inducida por isquemia, y la inhibicin de la ferroptosis ha demostrado ser
eficaz en el tratamiento de la isquemia / reperfusin inducida por dao orgnico en
mltiples modelos experimentales [ 14 , 16 , 17] . La ferroptosis tambin se ha investigado
en cncer y cncer 11 , 13 . Es importante destacar, la ferroptosis contribuye a la funcin
supresora de tumores de p53 [ 18] . La prdida de p53 conduce a la sobre-regulacin
transcripcional del transportador de cistina SLC7A11, haciendo as que las clulas
cancerosas sean ms resistentes a la ferroptosis.

La autofagia es un proceso catablico intracelular conservado que entrega componentes

celulares al lisosoma para la degradacin 19 . La maquinaria principal de la autofagia
consiste en ms de 30 genes relacionados con la autofagia (ATGs). La autofagia es
generalmente un mecanismo de supervivencia que responde al estrs. Sin embargo,
una teora controvertida desde la observacin original de la autofagia es que la
autofagia tambin puede ser un mecanismo de muerte celular (muerte celular
autofgica) 20 , 21 . Autofagia podra promover la muerte celular en contextos especficos
[ 22 , 23] , pero los mecanismos subyacentes han sido elusivos.

En este estudio, demostrar que la ferroptosis es una forma de muerte celular

autofgica. Mecanicamente, la autofagia promueve la ferroptosis mediante una forma
de autofagia especfica de la carga conocida como ferrotinofagia. Tras la privacin de
cistina, la autofagia se activa para degradar la ferritina de almacenamiento de hierro, la
cual es mediada por el receptor de carga NCOA4. Dicha degradacin autofgica mediada
por NCOA4 de ferritina (ferropinofagia) 24 ,25 , 26 , 27 , manteniendo el contenido de hierro
lbil celular, favorece la acumulacin de ROS celulares y la consiguiente muerte celular
ferropttica.

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Resultados

Identificacin de nuevos actores de ferroptosis por RNAi screening

Para estudiar sistemticamente los mecanismos de ferroptosis, se realiz un cribado
RNAi. Una biblioteca de lentivirus de shRNA agrupada dirigida a 4 625 'sealizacin
Pathway Targets' (DECIPHER shRNA Library Mouse Mdulo
1: https://www.cellecta.com/products-services/cellecta-pooled-lentiviral-
libraries/decipher-shrna-libraries/ ) se transdujo en fibroblastos embrionarios de ratn
de tipo salvaje (MEF). Las clulas se trataron con medio normal o el medio inductor de
ferroptosis ( Figura 1A y 1B). Posteriormente se realiz la secuenciacin profunda de los
shRNAs integrados en el ADN genmico de clulas de control y clulas que sobrevivieron
a la induccin de ferroptosis. La comparacin de los datos de secuenciacin condujo a la
identificacin de shRNAs que se enriquecieron en clulas que sobreviven al tratamiento
de ferroptosis. Los objetivos genticos de los shRNAs enriquecidos son genes
potenciales que regulan positivamente la ferroptosis. Entre los golpes de la pantalla, se
identificaron muchos genes de ferroptosis, como la homeostasis del hierro que regula
los genes TFRC, ACO1 e IREB2; genes reguladores de la glutaminolisis SLC38A1 y
GLS2; y la va pentosa fosfato (PPP) gen G6PDX 12 , 14 ( Figura 1C). Estos resultados
positivos validaron nuestro enfoque de la pantalla. Adems, nuestra pantalla tambin
identific muchos genes no implicados previamente en la regulacin de
ferrotpsis. Sorprendentemente, 11 ATG genes se encuentran entre esta lista de posibles
reguladores positivos de la ferroptosis (el shRNA biblioteca utilizada para esta pantalla
contiene shRNAs dirigida a 22 genes ATG, Figura 1D ].
Figura 1.
 La pantalla gentica identifica a los reguladores de la ferroptosis. (A)RNAi
estrategia de cribado para identificar nuevos jugadores de ferroptosis. (B)
El diagrama de z-score (frecuencia de un shRNA especfico en lecturas de
secuenciacin total calculadas a partir de clulas tratadas con ferroptosis sobre
la frecuencia calculada a partir de clulas de control) de los resultados de la
pantalla RNAi muestra el enriquecimiento de shRNAs individuales. (C) Mltiples
reguladores de la ferroptosis conocidos se enriquecieron en nuestro cribado de
RNAi. (D)Mltiples genes relacionados con la autofagia fueron enriquecidos en
nuestro cribado RNAi.

Figura completa y leyenda (77 K )

La autofagia es un regulador positivo de la ferroptosis

Para examinar la relacin entre la autofagia y la ferroptosis, primero probamos si las
condiciones inductoras de ferroptosis pueden estimular la autofagia. El tratamiento de
MEFs y clulas de fibrosarcoma HT1080 humanas con inductor de ferroptosis erastin
indujo una conversin de LC3I a LC3II y GFP-LC3 puncta formacin, las caractersticas
de la respuesta de autofagia ( Figura 2A-2D ). El inhibidor lisosmico bafilomicina A1
(BafA1) puede mejorar adicionalmente la acumulacin de LC3II y la formacin de
puncta LC3-GFP, indicando un flujo funcionalmente intacto de autofagia.
Figura 2.

El inductor de ferroptosis activa la autofagia. (A , B) La conversin de LC3

inducida por erastina en clulas MEF (A) y HT1080 (B) . Las clulas sembradas
en placas de seis pocillos se trataron con la erastina 0,5 M (A) o 5
M (B) durante los tiempos indicados. Se aadieron BafA1 20 nM 2 h antes de
la recoleccin celular. Los extractos celulares se analizaron mediante
transferencia Western usando anticuerpos contra las protenas indicadas. La
acumulacin de LC3II (forma de migracin ms rpida) con respecto a LC3I
(forma de migracin ms lenta) es indicativa de la induccin de
autofagia. (C , D) Formacin de puncta GFP-LC3 inducida por erastina
en clulas MEF (C) y HT1080 (D). Las clulas que expresan de manera estable
GFP-LC3 crecido en cubiertas de vidrio se dejaron sin tratar o se trataron con
0,5 M (C) o 5 M (D) de erastina durante 7 h. Las clulas se fijaron con PFA
al 3,7%, se procesaron para obtener imgenes y se visualizaron bajo el
microscopio confocal usando el objetivo de aumento de 60 x.

Figura completa y leyenda (64 K )

Es la autofagia una fuerza motriz para la muerte de clulas ferroptticas, como sugiere
nuestra seleccin de RNAi? Esta es una cuestin importante ya que la autofagia suele
ser un mecanismo de supervivencia contra la muerte. Para abordar esta cuestin, se
examin el efecto de los inhibidores farmacolgicos de la autofagia en ferroptosis. En
efecto, los inhibidores lisosmicos BafA1 y cloroquina (CQ) pueden bloquear
significativamente la ferrroptosis inducida por erastin tanto en MEFs como en clulas
HT1080, medido mediante tincin de yoduro de propidio (PI) acoplada con citometra de
flujo ( Figura 3A-3C ). De manera similar, BafA1 tambin puede inhibir la ferroptosis
inducida por inanicin de cistina en MEFs y clulas HT1080 ( informacin suplementaria,
Figura S1 ). Se sugiri que la ferroptosis era independiente de la autofagia 12, lo que
parece estar en conflicto con nuestro hallazgo. Esto nos impuls a comparar
cuidadosamente nuestros resultados con el informe anterior. En el estudio anterior, la
muerte celular se midi en un momento relativamente tardo (24 h). Por lo tanto, se
midi la ferroptosis en dos tipos de clulas diferentes (MEFs y clulas HT1080) mediante
el uso de diversas concentraciones de erastina y en diferentes momentos ( informacin
complementaria, Figura S2 ). BafA1 y CQ bloquearon la ferroptosis en puntos
temporales anteriores, pero el efecto inhibidor se perdi gradualmente en puntos
posteriores, especialmente cuando se us una dosis ms alta de erastina. En conjunto,
la inhibicin de la funcin lisosomal, el punto final del flujo de autofagia, puede atenuar
significativamente y retrasar el proceso de ferroptosis.

Figura 3.

La autofagia regula positivamente la ferroptosis. (A - C) Los inhibidores de

autofagia BafA1 y CQ inhiben la ferroptosis en clulas MEF (A , B) y
HT1080 (C) . Las clulas se trataron como se indica. En A , el efecto de los
inhibidores de autofagia se demostr mediante microscopa (en blanco y negro:
fase de contrato, rojo: tincin PI) con los inhibidores y el tiempo (h) de
tratamiento como se indica. En B y C , la muerte celular se cuantific por
tincin PI junto con citometra de flujo. erastina: 1 \ mu M; BafA _ {1}: 20
nM; CQ: 50 \ mu M. Los datos muestran medios SEM de 3 experimentos
independientes (igual para todos los resultados cuantitativos a partir de
entonces). (RE)ATG13 es necesario para la ferroptosis. ATG13KO MEFs, o
ATG13KO clulas reconstituidas con expresin ectpica ATG13, se trataron
como se indica. La muerte celular se determin por tincin PI junto con
citometra de flujo. Western blot confirm la expresin de ATG13. erastina: 1 \
mu M. (E) Se requiere ATG3 para la ferroptosis. ATG3KO MEFs, o clulas
ATG3KO reconstituidas con expresin de ATG3 ectpica, se trataron como se
indic durante 12 h. La muerte celular se determin por tincin PI junto con
citometra de flujo. La expresin de ATG3 se confirm mediante
inmunotransferencia. erastina: 1 \ mu M; RSL3: 1 M.

Figura completa y leyenda (94 K )

Para confirmar an ms el papel de la autofagia en la ferroptosis, hemos probado el

requisito de los genes ATG para la ferroptosis. Los knockouts de ATG13 y ATG3, dos
actores claves de la autofagia que funcionan en diferentes etapas de la va autofagia 28 ,
redujeron en gran medida la sensibilidad de los MEF a la ferropotosis inducida por la
erastin o la cistina y la reconstitucin de ATG13 y ATG3 a estas clulas restauraron la
sensibilidad a la ferroptosis ( Figura 3D y 3E ). Consistentemente, la eliminacin de
otros genes de autofagia, como ULK1 / 2 y ATG5, y la inhibicin farmacolgica de PI3
quinasa todos condujo a niveles significativamente ms bajos de ferroptosis inducida
por erastin de una dosis y dependiente del tiempo ( informacin complementaria, la
figura S3). Todos estos resultados demuestran que la mecnica cannica de autofagia
juega un papel crucial en la ferroptosis. Es importante destacar que tanto
la inhibicin gentica ( Figura 3E ) como la farmacolgica ( Informacin
complementaria, Figura S4 ) de la autofagia tambin previnieron la ferroptosis inducida
por un inhibidor de GPX4, RSL3 de pequea molcula. Debido a que GPX4 previene la
ferroptosis a travs de la depuracin de los perxidos lipdicos, es ms probable que la
autofagia es esencial para la ferroptosis asociada a la generacin de ROS y perxidos
lipdicos. Como tal, el bloqueo de autofagia puede prevenir que las clulas acumulen
una cantidad letal de perxidos lipdicos, un requisito previo para la ferroptosis, incluso
cuando GPX4 es inhibido por RSL3.

La autofagia es necesaria para la acumulacin de ROS asociada a la ferroptosis

La acumulacin de ROS es una de las caractersticas de ferroptosis. Consistentemente,
los inhibidores de la ferroptosis (como la ferrostatina) y diversos antioxidantes o
eliminadores de ROS pueden inhibir completamente la acumulacin de ROS celular y la
muerte celular ferropttica 12 , 14 . Como la autofagia es necesaria para la ferroptosis
inducida por erastin y RSL3, hemos probado si la autofagia es necesaria para la
produccin de ROS asociada a la ferroptosis, especialmente la acumulacin de ROS de
lpidos. De hecho, BafA1 y CQ inhibi significativamente la ferroptosis asociada ROS
acumulacin total ( Figura 4A ]. De forma similar, el nivel de ROS total fue
significativamente menor en clulas deficientes en autofagia (ATG13-knockout
(ATG13KO) y ATG3-knockout (ATG3KO)) en comparacin con las clulas rescatadas con
autofagia ( Figura 4B y 4C). Es importante destacar que la inhibicin tanto
farmacolgica como gentica de la autofagia inhibi significativamente la acumulacin
de ROS lipdico asociada a la ferroptosis ( Figura 4D-4F ).
Figura 4.

La autofagia es necesaria para la acumulacin de ROS asociada a la

ferroptosis. (A) Los inhibidores de autofagia Baf1A y CQ pueden inhibir la
acumulacin de ROS asociada a la ferroptosis. Los MEF se trataron como se
indic durante 8 h. ROS se midi por tincin H2DCFDA junto con citometra de
flujo. BafA _ {1}: 20 nM; CQ: 50 \ mu M. (B) ATG13 knockout inhibe la
ferroptosis asociada ROS acumulacin. ATG13KO MEFs, o ATG13KO clulas
reconstituidas con expresin ectpica ATG13, fueron tratados con 1 M erastin
durante 8 h. ROS se midi por tincin H2DCFDA junto con citometra de
flujo. (DO)Se requiere ATG3 para la acumulacin de ROS inducida por
ferroptosis. ATG3KO MEFs o clulas ATG3KO reconstituidas con expresin de
ATG3 ectpica, se trataron con erastina 1 M durante 8 h. ROS se midi por
tincin H2DCFDA junto con citometra de flujo. (D) Los inhibidores de autofagia
BafA1 y CQ inhiben la generacin de ROS lipdica asociada a la ferroptosis. Los
MEF se trataron como se indic durante 8 h. La ROS lipdica se midi mediante
tincin con C11-BODIPY junto con citometra de flujo. erastina: 1 \ mu M; BafA
_ {1}: 20 nM; CQ: 50 \ mu M. (E , F) ATG13 y ATG3 son necesarios para la
acumulacin de ROS lipdica asociada a la ferroptosis. Los experimentos se
realizaron como B y C , excepto que se midi ROS lipdico (no ROS total)
mediante tincin con C11-BODIPY junto con citometra de flujo.(G) La autofagia
no es necesaria para la deplecin de GSH inducida por erastina. Los MEF se
 trataron como se indic durante 8 h. La GSH total se midi con o sin inhibicin
farmacolgica de la autofagia. BafA _ {1}: 20 nM; CQ: 50 \ mu M.

Figura completa y leyenda (56 K )

Debe tenerse en cuenta que, aunque la inhibicin de autophagy atenuado erastin

inducida por la acumulacin de ROS celular, no pudo prevenir la deplecin de GSH
inducida por la erastina ( Figura 4G ]. Este resultado no es inesperado: la erastina
impide la importacin de citina y por lo tanto agota uno de los componentes bsicos de
la sntesis de GSH; bajo esta condicin, el agotamiento de GSH no ser impedido por la
inhibicin de autofagia o cualquier otra intervencin aguas abajo.

La autofagia regula la homeostasis del hierro celular

La ferroptosis es una necrosis programada dependiente del hierro, y el hierro celular es
necesario para la acumulacin de ROS sobre la ferroptosis [ 12] . Por lo tanto, la
autofagia promover la acumulacin de ROS celular sobre la ferroptosis mediante el
aumento de los niveles de hierro libre en las clulas? Para probar esta posibilidad,
primero medimos la piscina de hierro lbil celular (LIP). El tratamiento con erastina
condujo a un aumento dependiente del tiempo del LIP celular ( Figura
5A ). Posteriormente, probamos si la inhibicin de la autofagia puede bloquear el
aumento de LIP inducido por erastina. De hecho, BafA1 puede bloquear la ferroptosis
asociada LIP aumento ( Figura 5B ]. LIP acumulacin tambin fue significativamente
menor en la autofagia deficiente de clulas en comparacin con autophagy reconstituido
clulas ( Figura 5C ].
Figura 5.

La autofagia es necesaria para la acumulacin de hierro lbil asociada a la

ferroptosis. (A) El tratamiento con erastina caus un aumento de LIP
celular. Los MEF se trataron con erastina (1 M) durante los tiempos
indicados. Las clulas se tieron con ster de calcena-acetoximetilo y LIP se
cuantific posteriormente mediante citometra de flujo. (B) La inhibicin
farmacolgica de la autofagia previene la acumulacin de LIP asociada a la
ferroptosis. Los MEF se trataron con o sin BafA1 como se indic durante 6 h. Las
clulas se tieron con ster de calcena-acetoximetilo, y LIP se cuantific
posteriormente mediante citometra de flujo. BafA _ {1}: 20 nM. (DO)La
disrupcin gentica de la autofagia previene la acumulacin de LIP asociada a la
ferroptosis. ATG13KO MEFs o ATG13KO MEF reconstituido con expresin de
ATG13 ectpica, se trataron con erastina 1 M como se indic durante 6 h. Las
clulas se tieron con ster de calcena-acetoximetilo y LIP se cuantific
posteriormente mediante citometra de flujo.

Figura completa y leyenda (35 K )

La autofagia regula la ferroptosis va ferritinofagia

El aumento de LIP podra ser debido al aumento de la captacin de hierro a partir del
medio o la degradacin de ferritina ferritina de almacenamiento de hierro celular. El
transporte de hierro mediado por transferrina es la va de captacin de hierro ms
importante 29 , y la transferrina es necesaria para la ferroptosis 14 , 15 . Sin embargo, la
erastina no cambi la tasa de internalizacin de la transferrina ( informacin
complementaria, figura S5 ).
Se ha informado que la homeostasis del hierro celular puede ser regulada por una va
especfica de autofagia mediada por NCOA4 llamada ferritinofagia 24 , 25 , 26 , 27. Utilizando
el NCOA4 como receptor de carga, la ferritinofagia reconoce la ferritina y la libera para
la degradacin lisosomal, lo que conduce a la liberacin de hierro libre y, por tanto, a un
aumento de LIP 24 , 25 , 26 , 27 . Se encontr que en el tratamiento con erastina, el nivel de
NCOA4 se redujo de manera dependiente del tiempo tanto en MEFs HT1080 y clulas
( Figura 6A y 6B). La disminucin de NCOA4 es a travs de la autofagia, ya que la
degradacin de NCOA4 fue ablated tanto por la inhibicin farmacolgica y gentica de
autofagia ( Figura 6C-6F ). De acuerdo con el modelo que la ferritinofagia desempea
un papel crucial en la ferroptosis, la eliminacin de la expresin de NCOA4 por
knockdown RNAi bloquear significativamente la ferroptosis ( Figura 6G ) y la ferroptosis
asociada a la acumulacin de ROS lpidos ( Figura 6H ).

Figura 6.

La ferritinofagia mediada por NCOA4 promueve la ferroptosis. (A , B)

La ferroptosis indujo la degradacin de NCOA4 de una manera dependiente del
tiempo en clulas MEF (A) y HT1080 (B) . MEFs o HT1080 clulas fueron
tratados como se indica. Se utiliz extracto de clulas totales para la
transferencia de Western para detectar el cambio de NCOA4 durante la
ferroptosis. erastina: 0,5 \ mu M (A) o 5 \ mu M (B) . (C , D) El inhibidor de
autofagia BafA1 puede bloquear la degradacin de NCOA4 inducida por
ferroptosis en clulas MEF (C) y HT1080 (D). MEFs o HT1080 clulas fueron
tratados como se indica. Se utiliz extracto de clulas totales para la
transferencia de Western para detectar el cambio de NCOA4 durante la
ferroptosis. erastina: 0,5 \ mu M (C) o 5 \ mu M (D) . BafA _ {1}: 20
nM. (E , F) La disrupcin gentica de la autofagia bloquea la degradacin de
NCOA4 inducida por ferroptosis. Se trataron MEFs (F) reconstituidos con
ATG13KO y ATG13 (E) , o MEFs reconstituidos con ATG3KO y ATG3 (F) , con
erastina 1 M durante los tiempos indicados. El lisado celular total se us para
la transferencia de Western para detectar el cambio de NCOA4 durante la
ferroptosis. (GRAMO)Knockdown de NCOA4 por shRNAs puede bloquear la
ferroptosis. MEFs infectados con shRNA no objetivo (NT) o dos shRNAs NCOA4
independientes fueron tratados con erastina 0,5 M durante 12 h. La muerte
celular se midi por tincin PI junto con citometra de flujo. (H) Knockdown de
NCOA4 por shRNA en MEFs puede bloquear la ferroptosis asociada a la
acumulacin de lpidos ROS. NCOA4-knockdown o knockdown control de clulas
fueron tratados con 1 M erastin durante 10 h. La ROS lipdica se midi
mediante tincin con C11-BODIPY junto con citometra de flujo.

Figura completa y leyenda (99 K )

Dado que tanto la autofagia como el NCOA4 estn involucrados en la ferroptosis,

probamos si la ferritina de cadena ligera 1 (FTH1), un sustrato de ferritinofagia, tambin
se degrada por autofagia. Sorprendentemente, se observ un aumento del nivel
endgeno FTH1 durante la ferroptosis ( Figura 7A ]. Puesto que el aumento del nivel de
hierro celular inducir la expresin de FTH1 29 endgena , es probable que la
acumulacin de LIP durante la ferroptosis inducir la sobre-regulacin transcripcional de
la FTH1 endgena. De hecho, q-PCR anlisis confirm la upregulation de FTH1 endgeno
nivel de mRNA ( Figura 7B ] y esta upregulation es dependiente de NCOA4 ( Figura
7C). Para probar si hubo una degradacin simultnea de la protena FTH1 en la
induccin de ferroptosis, se control el nivel de GFP-FTH1 expresado
ectopicamente. Como se muestra en la Figura 7D , erastin indujo la degradacin de
GFP-FTH1, que podra ser prevenido por el inhibidor de autofagia BafA1.

Figura 7.

Regulacin de la expresin de FTH1 durante la ferroptosis. (A) Laferroptosis

indujo un aumento de los niveles de protena FTH1. Las clulas HT1080 se
trataron con erastina 5 M durante los tiempos indicados. El lisado celular total
se us para detectar la expresin de FTH1. (B) La ferroptosis indujo un
aumento de los niveles de mRNA FTH1. Las clulas HT1080 se trataron con
erastina 5 M como se indica. Se aisl ARN total y se midi el nivel de ARNm de
FTH1 mediante q-PCR. (C) NCOA4 se requiere para la ARR de ARNm de FTH1
inducida por ferroptosis. Las clulas HT1080 con o sin deplecin de NCOA4 se
trataron con erastina 5 M durante 10 h. Se aisl ARN total y se midi el nivel
de ARNm de FTH1 mediante q-PCR. (RE)BafA1 inhibe la ferroptosis asociada
FTH1 degradacin. Las clulas HT1080 se trataron como se ha indicado. El
lisado celular total se us para inmunotransferencia para detectar los cambios
de los niveles de protena diana.

Figura completa y leyenda (42 K )

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Discusin

Colectivamente, en este estudio se demuestra que la autofagia juega un papel

importante en la regulacin de la ferroptosis mediante la regulacin de la homeostasis
celular de hierro y la generacin de ROS celular. Tras la induccin de la ferroptosis, se
activa la autofagia, lo que conduce a la degradacin de la ferritina de protena de hierro
celular y, por tanto, a un aumento del nivel de lbil lbil celular a travs de la va de
autofagia mediada por NCOA4, ferritinofagia. Los altos niveles de hierro celular lbil
aseguran una rpida acumulacin de ROS celulares, que es esencial para la ferroptosis.

Debe hacerse hincapi en que el efecto de la inhibicin de la autofagia en ferroptosis es

ms evidente en la fase temprana de ferroptosis y cuando la induccin es modesta, y tal
efecto se estabiliz en puntos de tiempo posteriores y cuando la induccin es ms
dramtico (vase la Figura 3 y complementario informacin, Figura S3 ). Esto puede
explicar por qu un efecto tan crucial de la autofagia evadi el primer estudio de
ferroptosis 12 , y por qu slo un modesto efecto de la autofagia se observ en un
estudio reciente [ 30] ; ambos estudios utilizaron dosis relativamente altas de erastina y
puntos tardos de tiempo para la medicin de la ferroptosis.

El papel de la autofagia en la muerte celular y la supervivencia celular ha sido

controvertido. Es bien aceptado que en la mayora de las condiciones biolgicas la
autofagia funciona como un mecanismo de supervivencia [ 31] . La autofagia se puede
activar cuando las clulas se enfrentan a tensiones como el hambre de nutrientes, la
hipoxia, as como una amplia gama de terapias contra el cncer. Por esta razn, la
combinacin de inhibicin de autofagia y otros tratamientos contra el cncer podra ser
un enfoque teraputico anticancergeno eficaz [ 19] . Por otro lado, la autofagia tambin
puede ser un mecanismo de muerte celular en ciertos contextos especficos - la llamada
"muerte celular autofgica", a travs de mecanismos menos definidos 20 , 32. Aqu,
presentamos pruebas convincentes de que la ferroptosis es una forma de muerte celular
autofgica, ya que la ferroptosis satisface los dos criterios principales de muerte celular
autofgica, que el proceso de muerte est asociado con la activacin de la autofagia y
que la autofagia desempea un papel pro-muerte en la proceso de muerte
celular. Mientras que la activacin de la autofagia parece ser modesta segn se mide
por conjugacin de LC3, es muy probable que la autofagia especfica de la carga, la
ferritinofagia, se active preferentemente. Nuestro hallazgo de que la autofagia es crucial
para la ferroptosis es relevante para el tratamiento del cncer y plantea preocupaciones
sobre las estrategias de terapia de combinacin que involucran la inhibicin de la
autofagia. Por ejemplo, el sorafenib, un frmaco aprobado por la FDA para el
tratamiento del cncer de rin primario, cncer de hgado primario avanzado y
carcinoma avanzado de tiroides resistente a yodo radiactivo,33 . Si la ferroptosis
contribuye efectivamente al efecto teraputico del sorafenib, entonces la inhibicin de la
autofagia no debe combinarse con el sorafenib para el tratamiento del cncer.

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Materiales y mtodos

Reactivos y anticuerpos
Los anticuerpos primarios usados fueron anti-LC3 (Sigma, Cat # L7543), anti- -
tubulina (Sigma, Cat # T6557), anti-NCOA4 (Bethyl Labs, Cat # A302-272A), anti-FTH1
(Cell Signaling, Cat # 4393S), anti-ATG13 (Sigma, Cat # SAB4200100), anti-ATG3 (Cell
Signaling, Cat # 3415S), anti-actina (Sigma, Cat # A5316), erastina (Sigma,
Cat # E7781), bafilomicina A1 ( Sigma, Cat # B1793), Cloroquina (Sigma,
Cat # C6628), RSL3 (Selleckchem, Cat # S8155), wortmanina (Cell Signaling,
Cat #9951).

Cultivo de clulas
A menos que se especifique lo contrario, todas las clulas de mamfero se mantienen en
DMEM con glucosa alta, piruvato sdico (1 mM), glutamina (2 mM), penicilina (U / ml),
estreptomicina (0,1 mg / ml) y 10% FBS a 37 C y 5% de CO 2.

Medicin de la muerte celular y la viabilidad celular

La muerte celular se analiz por tincin PI junto con microscopa o citometra de
flujo. La viabilidad celular se determin usando el CellTiter-Glo luminescent Cell Viability
Assay (Promega).

Pantallas genticas RNAi de alto rendimiento

El virus del ratn de biblioteca de shRNA DECIPHER Lentiviral Mdulo 1 con ~ 27 500
horquillas shRNA dirigidas a 4 625 genes fue de Cellecta, Inc. El cribado de ARNi se
realiz de acuerdo con el manual del usuario. Brevemente, 8 10 7 MEFs fueron
infectados con virus a un MOI bajo (0,3) para asegurar que la mayora de las clulas
slo reciben 1 construccin viral con alta probabilidad. Despus de 48 h, el 20% de
eficacia de transduccin real se confirm por citometra de flujo y las clulas se
dividieron por igual en 2 muestras (> 1 10 8clulas / muestra). 24 horas ms tarde,
se recogi la muestra A y se almacen a -80C como control, y la muestra B con una
confluencia del 80% se someti a inanicin de aminocidos ms la muerte de FBS
durante 16 h. Se volvieron a transformar las clulas en medio DMEM completo y se
recuperaron hasta que las clulas se volvieron a confluir al 80%. Repita matando y
recuperando 3 veces ms. La muestra A y la muestra B se sometieron a aislamiento de
ADN genmico y secuencia HTseq de cdigos de barras integrados. Para la muestra A,
se usan 400 g de ADN genmico para PCR de cdigo de barras y secuenciacin de
HTseq. Para la muestra B, se utiliza todo el ADN genmico recuperado. Los shRNAs se
evalan basndose en el enriquecimiento de cdigo de barras en la muestra B frente a
la muestra A. Los golpes de gen se identifican basndose en la evaluacin de los
shRNAs dirigidos.

Medicin de ROS
Medicin de ROS total Las clulas se trataron como se indica y luego se aadieron 10
M de diacetato de 2 ', 7'-diclorodihidrofluorescena (H2DCFDA, Life Technologies,
Cat # D-399) y se incubaron durante 1 h. El exceso de H2DCFDA se elimin lavando las
clulas dos veces con PBS. Las clulas marcadas fueron tripsinizadas y resuspendidas
en PBS ms 5% de FBS. La oxidacin de H2DCFDA a la 2 ', 7'-diclorofluorescena (DCF)
altamente fluorescente es proporcional a la generacin de ROS y se analiz usando un
citmetro de flujo (Fortessa, BD Biosciences). Se analiz un mnimo de 10.000 clulas
por condicin.

Medicin de ROS de lpido Las clulas se trataron como se indic, y despus se

aadieron 50 M de C11-BODIPY (Thermo Fisher, Cat # D3861) y se incubaron durante
1 h. El exceso de C11-BODIPY se elimin lavando las clulas dos veces con PBS. Las
clulas marcadas fueron tripsinizadas y resuspendidas en PBS ms 5% de FBS. La
oxidacin de la parte de butadienilo poliinsaturado de C11-BODIPY dio como resultado
un desplazamiento del pico de emisin de fluorescencia de ~ 590 nm a ~ 510 nm
proporcional a la generacin de ROS de lpido y se analiz usando un citmetro de flujo.

Lentiviral mediada por interferencia shRNA

MISSION Los clones de shRNA lentivirales dirigidos a NCOA4 de ratn o humano y
construccin de control no dirigida a objetivos se compraron a Sigma-Aldrich. El
lentivirus se empaquet en clulas 293T y se us para infectar clulas diana que luego
se seleccionaron con puromicina durante al menos 3 das antes del uso en
experimentos. Los ID de clones para el ratn de orientacin con shRNA NCOA4-sh1:
TRCN0000095080; NCOA4-sh2: TRCN0000095083 y los identificadores de clon para el
shRNA dirigido al NCOA4-sh1 humano: TRCN0000019724 y NCOA4-sh2:
TRCN0000019726.

Medicin de GSH
Se sembraron 2 x 10 ^ { 5} MEF en placas de seis pocillos. Un da despus, las clulas
se trataron como se indic durante 6 h. Se recogieron las clulas y se determinaron los
nmeros de clulas. Total de glutatin se midi como se describe anteriormente [ 34] .

Microscopio fluorescente
Se cultivaron clulas HT1080 o MEF que expresaban de manera estable GFP-LC3 sobre
placas de cubierta de vidrio en una placa de seis pocillos. 24 h ms tarde, las clulas se
trataron como se indica. Las lminas de cubierta se fijaron entonces con
paraformaldehdo (PFA) al 3,7% (vol / vol) en HEPES 20 mM pH 7,5 durante 30 min a
temperatura ambiente. Los portaobjetos se montaron entonces en portaobjetos de
microscopio para su visualizacin utilizando el microscopio confocal Nikon usando
objetivos de ampliacin de 60x.

Medicin de LIP
LIP se midi de acuerdo con los mtodos descritos por Prus y Fibach 35 . Brevemente,
las clulas se tripsinizaron, se lavaron dos veces con 0,5 ml de PBS, y se incubaron a
una densidad de 1 10 6 / ml durante 15 min a 37 C con 0,05 M de ster de calcena-
acetoximetil (AnaSpec). A continuacin, las clulas se lavaron dos veces con 0,5 ml de
PBS y se incubaron con deferiprona (100 M) durante 1 ha 37 C o se dejaron sin
tratar. Las clulas se analizaron con un citmetro de flujo. La calcena se excit a 488
nm, y se midi la fluorescencia a 525 nm. La diferencia en la fluorescencia media celular
con y sin la incubacin de deferiprona refleja la cantidad de LIP.

Medicin de la internalizacin de la transferrina

La internalizacin y el reciclado de la transferrina se midieron como se ha descrito
anteriormente 36. Para el ensayo de internalizacin de transferrina, las clulas se
trataron primero con erastina 1 M o DMSO durante 2 h, y luego las clulas se lavaron
con PBS y se incubaron en medio libre de suero ms erastina o DMSO durante 30
minutos para eliminar cualquier transferrina residual. Posteriormente, las clulas se
incubaron con 25 g / ml de transferrina conjugada con Alexa Fluor 488 (Invitrogen) a
37 C durante los tiempos indicados. La internalizacin se detuvo al enfriar las clulas
sobre hielo. La transferrina externa se elimin mediante lavado con DMEM y PBS libre
de suero enfriado en hielo, mientras que la transferrina unida se elimin mediante un
lavado cido en PBS (pH 5,0) seguido de un lavado con PBS (pH 7,0). La intensidad de
fluorescencia de la transferrina internalizada se midi por citometra de flujo. Los datos
se normalizan a la fluorescencia media de las clulas control incubadas con transferrina
durante 10 min.
Anlisis estadstico
Todos los anlisis estadsticos se realizaron utilizando Prism 5.0c GraphPad
Software. Los valores de P se calcularon con la prueba t de Student no
emparejada . Los datos se presentan como media SEM de 3 experimentos
independientes.
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Contribuciones de autor

M Gao, X Jiang concebido y supervisado el estudio. M Gao realiz la mayora de los

experimentos en colaboracin con P Monian y Q Pan. W Zhang y J Xiang realizaron
secuenciacin de alto rendimiento. M Gao y X Jiang analizaron los datos y escribieron el
documento con sugerencias de otros autores. Todos los autores revisaron el documento.

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Intereses Financieros Competentes

Los autores declaran que no hay intereses financieros en competencia.

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Referencias
1. Danial NN, Korsmeyer SJ. Muerte celular: Puntos crticos de
control. Cell2004; 116 : 205 - 219. | Artculo | PubMed | ISI | CAS |
2. Green DR, Kroemer G. La fisiopatologa de la muerte celular
mitocondrial. Science 2004; 305 : 626 -
629. | Artculo | PubMed | ISI | CAS |
3. Fuchs Y, Steller H. La muerte celular programada en el desarrollo animal y la
enfermedad. Clula 2011; 147 : 742 - 758. | Artculo | PubMed | ISI | CA