BIOQUIMICA Y BIOLOGIA MOLECULAR Pedro J.

Chimoy Effio
Manual de Prcticas

I. DETERMINACION DEL pH, pK Y PREPARACION DE

BUFFERS.
I.1 COMPETENCIAS (Dos sesiones, 8 H)
a. El alumno prepara las siguientes soluciones: HCl 20 y 200 mM ; NaOH
20 y 200 mM.
b. El alumno calibra y usa correctamente un pH-metro.
c. El alumno prepara los siguientes buffers: fosfato 0.2M pH 8.2, acetato
200 mM pH 3.8 y Tris-Glicina 25 mM pH 8.3.
d. El alumno haciendo uso de tres indicadores lquidos, determina el pH de
una solucin.
e. El alumno determina el pH de diferentes soluciones mediante el uso del
pH metro e indicadores, tiras o varillas.
f. El alumno podr preparar con tres indicadores lquidos un solo indicador
para medir el pH en un rango de 1-10.
g. El alumno titula los buffers acetato, fosfato y glicina a fin de evaluar su
capacidad de tamponamiento, as como determinar sus pK.

I.2 INTRODUCCIN
Dado que la gran mayora de reacciones en el organismo dependen del pH,
resulta importante medir este valor con gran exactitud.
El pH se define como Log [H+] = Log 1/ [H+].
En los lquidos corporales el pH se mantiene normalmente dentro de lmites
muy estrechos: en el lquido extracelular es aproximadamente de 7.4; y algo
menor en el intracelular.
Otro valor ligado al pH es el pKa cuyo valor se obtiene, en la ecuacin de
Herderson Hasselbach cuando la [Sal]=[cido]; la concentracin de la sal es
igual a la del acido:

pH = pKa + Log {[Sal]/[ac.]}, si [sal] = [ac.] entonces pH = pka

El pKa se puede obtener experimentalmente al plotear el valor de Log [sal] /

[ac.] vs. pH correspondiendo el valor del intercepto al pKa.
La medicin del pH se realiza por indicadores lquidos coloreados / incoloros,
indicadores de papel y con el pH-metro. Sin embargo la forma estricta de medir
el pH es con el pH metro (potencimetro).
Antes de entrar al detalle de cmo medir el pH, recordemos que en 1909
Sorensen defini que una solucin es neutra si el pH es igual a 7. Una
solucin es alcalina cuando el pH es mayor que 7 y una solucin es cida si el
pH es menor que 7.
Por otro lado, debemos considerar que un cido es toda sustancia que dona
protones (H+) mientras que una base aquella que acepta protones. Las bases y
los cidos pueden ser fuertes (ej. HCl) o dbiles (ej. Ac. Actico). La acidez de
una solucin est dada por [H+]. La concentracin de [H+] se expresa como la
molaridad (M) (mol de H+/ L). Ej. Un acido monoprotnico con 10 -6 M (mol.
H+/L) tendr un pH de Log 10-6 = 6.
El mtodo potenciomtrico comprende dos tipos de anlisis: a) la medicin
directa de un potencial de electrodo y b) los cambios en la fuerza electromotriz
que produce la adicin de un titulante.

Determinacin del pH, pK y Preparacin de Buffers. 1

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Los elctrodos ms empleados en los pH metros son: electrodos de vidrio,

electrodos de estados slidos y precipitados, electrodos de enzimas y sensores
de gases. El desarrollo de nuevos tipos de electrodos con selectividad inica
est pasando a ocupar su lugar junto con el electrodo de vidrio. Todos ellos
involucran un proceso de intercambio inico en el mecanismo de determinacin
del potencial; se producen potenciales que pueden describirse adecuadamente
por la ley de Nersnst; en todos los casos se miden las cavidades de los iones,
es decir la concentracin inica libre termodicamente efectiva, mas no
concentraciones.
Bates y Guggehein establecen que:

pH = pHs - {(E - Es)/2.3 RT}xF, donde:

pH = pH a determinarse
pHs = pH del Standard
T= Temperatura en grados kelvin (0K)
F= Constante de Faraday
R= constante de los gases
E= Fuerza electromotriz (fem) de la sustancia por determinante el pH
Es= fem. del standard.
El pH metro mide el voltaje de una solucin a travs del electrodo de vidrio, el
cual es permeable a H+ pero no a otros cationes o aniones; la magnitud de
este potencial viene dado por la ecuacin :

E= (2.303 RTxLog {[H+]i/[H+]e}/F, donde:

[H+] i = concentracin de H+ en el interior
[H+] e= concentracin de H+ en el exterior
Si la [H+] se fija en uno de ellos, el potencial ser determinado por el pH de la
otra solucin.

V= E fijo - 2.302 RTxLog{ [H+]i/H+]e}/F (1)

Conociendo que [H+] i = HCL 0.1N, luego

V= E fijo + 2.302 RT 2.302 RTxpH (2)

F F
V= constante 2.302 RTxpH
F
Donde el voltaje generado esta directamente relacionado con el pH. La Fig. 1
muestra un esquema general de un pH metro con electrodo de vidrio y uno de
referencia (calomel).

Una estrategia de medir el pH es mediante soluciones o tiras indicadores, estos

por lo general son cidos o bases dbiles cuyos iones tienen distinto color que
las molculas no disociadas. La disociacin depende de pH en que se
encuentre la solucin. El cambio de color se debe a la disociacin del indicador,
pues sus acido/base conjugada representa colores diferentes (una de ellas es
incolora, la otra coloreada).
Los indicadores lquidos (ej. Fenolftaleina, Rojo de metilo) son utilizados en los
anlisis volumtricos para reconocer el punto final de una titulacin.

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La ecuacin del estado de disociacin del indicador es:

[Hind] [H+] + [Ind-]

ac. dbil base conjugada
(Color a) (Color b)

Fig.I.1 Esquema General de un pH metro

(Adaptado de D. Freifelder. 1979)

Si consideramos que Hind es la concentracin y estado del indicador no

-
disociado; luego el estado disociado es: [H +] y [Ind ]; luego su constante de
disociacin est dada por la ecuacin:

K= [H+] [Ind-], despejando [H+] = [Hind] x k, calculando Log:

[Hind] [Ind- ]

- log [H+] = pK + Log {[Hind]/[Ind-]}

La relacin [Hind] / [Ind-] es la que determina el color y guarda una relacin
directa con el pH. Cada indicador tiene una zona de viraje caracterstica del
indicador; as por ejemplo el azul del bromofenol a pH 3 es amarillo mientras
que a pH4.6 es azul violceo (Prpura) (ver tabla I.1).
Las tiras de indicadores de pH son tiras de papel impregnadas con un indicador
o una mezcla de indicadores. Las tiras indicadoras permiten saber el pH de una
solucin con una aproximacin de 0.2 unidades.
Obviamente, la desventaja de los indicadores (an de las tiras) es que no se
pueden aplicar a soluciones coloreadas. Su utilidad, sin embargo debe
estimarse como preliminar o aproximado.

Los amortiguadores de pH (buffers, tampones, reguladores) son sistemas que

garantizan que el pH de una solucin vari muy poco despus de agregar un
cido o una base.
Los buffers generalmente estn compuestos de un cido dbil y su sal
conjugada.

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TABLA I.1 INDICADORES DE USO COMUN: pK Y COLOR

INDICADOR pK RANGO DE pH Y VARIACION DE COLOR

Azul de bromofenol 3.86 3.0 4.6 Amarillo - Azul Violeta (Prpura)
Azul de bromotimol 7.10 6.0 - 7.6 Amarillo Azul
Azul de timol 8.90 8.0 9.6 Amarillo Azul
Fenolftaleina 9.40 8.2 9.8 Incoloro - Grososella
Naranja de metilo 3.40 3.1 4.4 Rojo Anaranjado
Prpura de bromocresol 6.30 5.2 6.8 Amarillo- Purpura
Prpura de cresol (cido) 1.15 1.2 2.8 Rojo - Amarillo
Prpura de cresol (bsico) 8.32 7.4 9.0 Amarillo Purpura
Rojo de clorofenol 5.98 5.0 7.0 Amarillo Rojo
Rojo de cresol 8.20 7.0 8.8 Amarillo Purpura
Rojo de metilo 4.95 4.4 6.2 Grocella Anaranjado
Timolftaleina 7.76 7.0 - 8.2 Incoloro Azul
Verde de bromocresol 4.68 3.8 5.4 Amarillo Azul
Amarillo de alizarina 11.20 10 12.1 Amarillo Rojo Naranja

En los organismos vivos, sobre todo a los valores de pH en que se realizan la

mayor parte de sus funciones, los sistemas amortiguadores presentes en la
clula y algunos lquidos extracelulares garantizan la constancia de esta
caracterstica.
Los sistemas amortiguadores de pH, conocidos como buffers que tienen
incidencia en los organismos son:
(a) fosfato acido / fosfato bsico
(b) ac. carbnico / bicarbonato
(c) Protena acida / protena Bsica

Analicemos el buffer acetato:

(98.68%) (1.32%)
-
[CH3COOH] [CH3COO ] + [H+]
(1.32%) (98.68%)
-
[CH3COONa] [CH3COO ] + [Na+]

Cuando se aade un cido o una base:

[CH3COOH] + [CH3COO-] + [Na+] + [H+] sube [CH3 COOH]

+H+
Ka= [CH3COO-][H+]
[CH3COOH]

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-
[CH3COOH] + [CH3COO-] + [Na+] + [OH-] sube [CH3 COOH ]
+OH-
Ka= [CH3COO-][H+]
[CH3COOH]

El pH de un buffer esta dado por la ecuacin de Henderson hasselbach:

pH = pK+ log[sal]
[ac.]

La relacin [sal]/[ac.] da la concentracin del buffer ejemplo 100mL de una

solucin 0.2 M fosfato monobsico de sodio se mezcla con 100 mL de una
solucin 0.2 M de fosfato bibsico de potasio; luego el pH de la solucin
resultante ser: (pKa del H2PO4-=6.86).

pH =6.86 + log 100 = 6.86

100

A continuacin se muestra la Tabla I.2 con los pKs de los sistemas ms usados
en bioqumica.

Tabla I.2 pKas de algunos cidos importantes (250C)

SUSTANCIA pK1 pk2 pk3 pk4

Ac. Acetico 4.76
Ac. Ascorbico 4.30 11.82
Ac. Carbnico 4.68 10.25
Ac. Citrico 3.13 4.76 6.40
EDTA 2.00 2.67 6.27 10.95
Ac. Fomico 3.15
Ac. Ortofosforico 2.15 6.86 12.36
Ac. Parafosforico 1.58 2.36 6.60 9.25
Ac.-2-(N morfolino) 6.15
etano sulfonico
Ac. N-2-hidroxietilpipe-razina-
N2-etanosulfni-co 7.55
AC. oxlico 1.27 4.27
AC. Succnico 4.21 5.64
Glicina [H+] 2.35 9.78
Tris (hidroximetil)
Glicina TRS [H+] 8.08
veronal 7.43

Es importante sealar que para calibrar un potencimetro son necesarios

buffers standares proporcionados generalmente por el fabricante.

Tabla I.3 Buffers Estndares

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pH
25C 37C
Fosfato mono bsico-K 50 mM
4.01 4.02
Fosfato mono bsico-K 25 mM +
Fosfato dibsico-Na 25 mM 6.86 6.84

Tetraborato sdico 10 mM 9.18 9.06

Los rangos de tamponamiento de los buffers ms usados son:

Rango pH
Buffer acetato 3 --- 6
Buffer fosfato 6 --- 9
Buffer Amonio / Borato 8 --- 11

Finalmente consideramos las curvas de titulacin, obtenidas al graficar, en las

ordenadas, los valores de pH de una solucin y en el eje de las abcisas los
meq (volumen x normalidad) del titulante. Las grficas son diferentes,
dependiendo si se trata de un cido o a una base (fuerte o dbil).

I.3 MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS

Material de vidrio: Fiolas de 100 mL, Beackers de 50/100 mL, Pipetas de
1/5/10 mL
Reactivos: HCl 38%, NaOH anhidro, Azul de Bromotimol 0.1%, Verde de
bromocresol 0.04%, Rojo de fenol 0.1%. Ac. Actico glacial, Acetato de
sodio. Fosfato dibasico de sodio, Fosfato monobsico de potasio. Trizma
base, Glicina. (Merck o SIGMA)
Solucin RKS, indicador universal de pH rango 1-10
Soluciones standares de pH 4.01/6.86/9.18
Equipos: pH Metro / cocina elctrica.
Otros: Tiras Indicadores de pH SIGMA (0-14), Varillas de pH (0-14). Placas
de porcelana con pozos.

PROCEDIMIENTOS
A. PREPARACIN DE SOLUCIONES: (En todos los casos usar fiolas)
HCl 200 mM
0.73g* de ac. Clorhdrico fumante 38% ( =1.19)
Agua destilada cantidad suficiente para (csp) 100 mL
* Gramos de HCl/mL= (% del cido) (densidad del cido)= 0.38x1.19= 0.4522.
1 mL de cido actico 38% contiene 0.4522 g y 1.614 mL, 0.73g.

HCL 20 mM
Tomar 10mL de HCL 200 mM y agregar agua destilada csp 100ML.

NaOH 200 mM
0.8 g de hidrxido de slido (pesar rpidamente porque esta sustancia es
higroscpica) y aadir agua destilada csp 100 mL.

NaOH 20 mM

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Tomar exactamente 10mL de Na0H 200 mM y agregar agua destilada csp 100
mL.

B. DETERMINACIN DEL pH
B.1 Mtodo potenciomtrico
Primero hay que standarizar al equipo: (ver Fig.I.2). El conmutador de funcin
debe estar en posicin (). Colocar las pilas (parte posterior). Verificar la cada
de potencial, haciendo que el conmutador de funcin (B) est en la posicin .
Luego observar que la aguja se ubique en la zona negra. Si no ocurre esto
cambiar de pilas.
En un beacker de 50 mL, colocar 25 mL un buffer pH 6.86; introducir
cuidadosamente el electrodo de vidrio (ES UNA MEMBRANA MUY DELICADA)
y asegrese que:
El potencimetro de sensibilidad (A) est en posicin 60 mV/ pH y el rango del
conmutador (C) en 0 - 14.
Ahora cambie el conmutador de funcin a posicin (I). Con el potencimetro de
punto cero (D) ajuste el valor de pH a 6.86. Retorne a la posicin ().
Lave el electrodo, squelo, a continuacin calibre con un buffer pH 9.08; si la
aguja no marca 9.18 ajustar con A. EL pH METRO YA EST LISTO PARA
MEDIR pH de cualquier solucin.
Despus de medir el pH lave bien los electrodos y deje el aparato en la
posicin ().

B.2 Mtodo de los indicadores lquidos:

Sobre una placa de porcelana con pozos, poner una gota pequesima del
indicador mixto (Merck 5). Luego una gota de los standares para el pH:

4.01 6.36 9.18

Determinacin del pH, pK y Preparacin de Buffers. 7

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Electrodo

A B C D
Fig.I.2 pH metro

Indique que pH corresponde al patrn de colores del indicador. Asimismo

discuta su sensibilidad y exactitud.

B.3 Mtodo de las tiras de papel o varillas indicadoras de pH

Considerar las mismas soluciones standares de pH 4.01, 6.86, 9.18, tomar un
centmetro de papel indicador de pH o una varilla, de rango 0-14; humedecerlas
con cada una de las soluciones por separado, es decir use un centmetro de
papel o una varilla por muestra. Analizar el viraje del color con el patrn de
colores que viene en la caja de la tira.

B.4 Medir el pH de soluciones diluidas de HCl e NaOH: El alumno prepara

una solucin de HCl 1N y NaOH 1N. Luego con cada una de ellas preparar
soluciones diluidas seriadas de HCl y NaOH 10 -1.10-2,10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
de la siguiente manera: de una solucin 1N tomar 1 mL y en una fiola
completar a 10 mL con agua destilada para obtener la dilucin 10 -1, de esta
dilucin tomamos 1 mL y completamos a 10 mL con agua destilada para
obtener la dilucin 10-2. De manera similar se obtendrn las siguientes
diluciones. Medir con el pH metro, tiras de pH y solucin universal el pH del
agua destilada y de todas las soluciones.

C. PREPARACIN DE BUFFERS
Buffer acetato 1M pH 3.8
Pesar 6.88 g de ac. Actico glacial ( = 1.42) y agregar agua destilada 80 ml,
ajustar, con el pH metro, a pH 4.00 con acetato de sodio (slido). Finalmente
agregar agua destilada csp 100 mL.

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Buffer acetato 100 mM pH 3.8

Tomar 10 mL de buffer acetato pH 3.8 1M y diluir con agua destilada csp 100
mL.

Buffer fosfato 1M pH 8.2

Pesar 14.2g de fosfato dibasico de sodio y agregar 80 ml de agua destilada,
luego ajustar a pH 8.2 con fosfato monobsico de potasio (slido) hasta
obtener pH 8.2. Finalmente completar con agua destilada csp 100 ml

Buffer Tris-glicina 25 mM pH 8.3

En una fiola de un litro, colocar 3g de Trizma base y 14.4g de glicina agregar
agua csp 1L. Verificar el pH con el pH metro.
En general para preparar un buffer se tiene en cuenta la ecuacin de
Henderson-Hasselbach y de sta extrapolar la concentracin del cido y de la
sal:

pH = pK + Log {[sal]/[cido]}

Ej. El pK del Ac. Actico es 4.76. Para preparar 100 mL de un buffer acetato
100 mM pH 4.00, preparamos 100 de una solucin de Ac. Actico 100 mM y
una solucin de Acetato-Na 100 mM. En la ecuacin de Henderson-Hasselbach
remplazamos valores pH= 4.00 y pK= 4.76 4 4.76= log [Sal/Acido]= - 0.76
antilog (-0.76)= Sal/Acido 0.17= Sal/Acido 0.17 (Acido)= Sal. Por lo
tanto debemos mezclar 50 mL de Acido Actico + 8.5 mL de Acetato-Na.
Verificar el pH con el pH metro. Si el pH es mayor ajustar con gotas (25 L) de
HCl 5M y si es menor con NaOH 5M, luego completar a 100 mL con agua
destilada. En la siguiente tabla damos los volmenes de sal y cido para
obtener los buffers acetato 100 mM pH 4,50, 5.00 y 5.50.

mL, Actico 100 mM mL, Acetato-Na 100 mM pH

50 8.5 4.00
50 38.5 4.50
30 52.2 5.00
15 82.5 5.50

D. PRODUCCIN DE UN INDICADOR LQUIDO.

El alumno dispondr de 3 indicadores lquidos: azul de bromotimol + rojo fenol
+ verde de bromocresol, preparar las mezclas a) 1:1:1 b) 1:2:1 y c) 1:1:2. En
un beacker con 25 mL de HCl 0.1 M adicionar 2 gotas de la mezcla a- y
medir el pH con el pH metro registrando el color correspondiente. Luego
adicionar, de 100 en 100 L, NaOH 50 mM anotando los colores
correspondientes a los pHs 1, 2,310. Repetir este procedimiento para las
mezclas b, c-. Despus de confrontar los colores obtenidos con las tres
mezclas el alumno deber indicar cual es la mezcla ideal que permita
determinar el pH para cada color.

E .CAPACIDAD TAMPONANTE Y DETERMINANTE DE PKA

E.1 Del buffer fosfato pH 6.86: En un beacker de 50 mL colocar 25 mL de una
solucin buffer fosfato pH 6.86 100 mM medir el pH inicial con un pH metro.
Titular, de 100 en 100 L, con HCL 500 mM. Registrar el pH despus de aadir

Determinacin del pH, pK y Preparacin de Buffers. 9

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cada 100 L. Aadir HCl hasta pH aprox. 5. Realizar lo mismo con otros 25 mL
de buffer pero titulando con NaOH 500 mM hasta aprox. pH 9.

E.2 BUFFER ACETATO pH 4.76: preparar 100 mL de un buffer acetato-Na pH

4.76 100 mM. Titular como para el buffer fosfato (E.1) con HCl 500 mM Y NaOH
500 mM hasta aprox. pH 3 y 7 respectivamente. Registrar el pH despus de
aadir cada100 L.

E.3 BUFFER GLICINA: preparar 100 mL de una solucin 100 mM del

aminocido glicina (0.75g de glicina y agua csp 100 mL) titular con HCl y
NaOH, como se ha procedido con los buffers acetato y fosfato. Titular en los
rangos de pH 1-4 y 8-11.

E.4 Determinacin del pKa: con los valores obtenidos y registrados en E.1 y
E.2 se puede obtener directamente los puntos de inflexin correspondiente al
pK. Graficando pH / volumen vs. meq. De cido o base aadidos. El pK
corresponde al pH donde se produce un mximo.

I.4 RESULTADOS

I.5 DISCUSION Y CONCLUCIONES

I.6 CUESTIONARIO
1. Qu otros procedimientos conoce para determinar el pK a de una
solucin? Explique.
2. Qu problemas experimentales ocurren para medir pH con el electrodo
de vidrio?
3. Cul es el pH del ac. Actico 100 mM y del fosfato mono bsico-K 250
mM?
4. Explique como se preparan las varillas para medir pH (Merck o SIGMA)?
5. Qu otros procedimientos sugiere usted para realizar esta prctica?

I.7 REFERENCIAS
Chimoy E,PJ., Lpez L, C., Monteghirfo G, M.1989. Manual de Prcticas
de Bioqumica y Biologa Molecular. CONCYTEC. Fac. Cs. Biolgicas.
UNPRG. Lambayeque.
NELSON, D.L. & M.M. COX. 2000. Principles of Biochemistry. Worths
Publishers.
D. Freifelder.1979, Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular. Ed.
Reverte. Cp. 4.
FIELD K & W REAN. (1999). Molecular Biology Techniques: An intensive
laboratory course. Acad Press
Manual del manejo del pH-meter TM-5 Forschungsins Titutd Meinsberg.
Rendina, G. 1974. Tcnicas de Bioqumica Aplicada Ed. Internacional.
Mxico Cp.1
Tablas de Merck. Tablas auxiliares para el Laboratorio Qumico.
Walton HF & Reyes J. 1978. Anlisis qumico e instrumental Moderno. Ed
Reverte. Espaa.espaa.Cap .1.

Determinacin del pH, pK y Preparacin de Buffers. 10