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Notas sobre cultivo in vitro

NOTAS SOBRE CULTIVO IN VITRO CASERO


DE SEMILLAS DE ORQUDEAS
por Susi Cabrera

En el siglo XIX la nica manera de conseguir una orqudea, era extrayndola de su hbitat natural, y no era
posible hacer germinar sus semillas. Sin embargo observaron que cuando caan sobre las races de la planta
madre, s germinaban algunas (gracias al hongo mycorrhiza presente en las races).
En 1922, El profesor Lewis Knudson de la Cornell University descubri que, entre otras, las semillas de
orqudea podan germinar en un frasco conteniendo una gelatina a base de agar con nutrientes qumicos, lo
que posibilitaba la produccin de miles de plntulas a partir de una cpsula de semillas.
Knudson es el padre del cultivo in-vitro.

MULTIPLICACIN VEGETATIVA

Se pueden reproducir las orqudeas por va vegetativa, o sea, por particin, keikis, esquejes o meristema (que
es como se producen la mayora de las plantas que estn en el mercado).
En todos estos casos estamos obteniendo clones idnticos a la planta madre.

MULTIPLICACIN VIA SEXUAL

Existe otra manera, de la que vamos a tratar a continuacin : la va sexualo por semillas.
Las partes sexuales de la flor estn en la columna, los polinios (dos o ms bolsitas amarillas) protegidas por la
tapa de la antera, el estigma, (zona pegajosa) dnde se han de introducir los polinios, hasta llegar al ovario a
travs del canal del estigma.
La reproduccin por semillas da lugar a plantas hermanas, por lo tanto muy parecidas pero NO iguales.

POLINIZACIN MANUAL

Se retira la tapa de la antera con un palillo, se desprenden los polinios, y se introducen en el estigma al que se
adhieren.

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En la polinizacin es conveniente seleccionar la flor ms fuerte y que se encuentre ms cerca del pseudobulbo
o tallo, y no fecundar muchas flores en una misma vara.

Las flores tienen que tener unos das de maduracin segn su especie, por ejemplo las Phalaenopsis tienen que
tener 10 das como mnimo para que maduren y as poder polinizarlas.

Si la flor es perfumada, se pueden considerar maduras a partir de la aparicin del perfume.

FORMACIN DE LA CPSULA

Al da siguiente, la columna se cierra sobre la superficie estigmtica y la flor empieza a marchitarse, y a los
pocos das el ovario de la flor empieza a hinchar, la flor ha sido fecundada con xito y las semillas se
empiezan a formar tardando entre 3 y 14 meses en llegar a maduracin, dependiendo de cada gnero de
orqudea. La planta puede abortar la cpsula en cualquier momento, y no siempre las semillas resultarn
frtiles.

MADURACIN DE LA CPSULA

Cuando madura, la cpsula se abre y las semillas son liberadas al viento.


Una cpsula puede contener entre y 3 millones de semillas. Aunque pocas en la naturaleza llegan a
convertirse en plantas, ya que han de tener la suerte de caer en un sitio dnde exista su hongo mycorrhiza.

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GERMINACIN SIMBITICA

Las mycorrhizas son relaciones simbiticas que se establecen entre las races de las plantas y los hongos.

Las semillas de orqudea necesitan la asociacin simbitica con un hongo especfico (Rhizoctonia), ya que est
cubierta por una cpsula muy resistente la testa, el hongo destruye la testa sin alterar las clulas
interiores y permite la germinacin de la semilla.

Las semillas de las orqudeas son sumamente pequeas. Su contenido ha sido reducido a la ms mnima
expresin, pues no almacenan ningn elemento nutritivo.

Para suplir esta carencia de nutrientes se gener una dependencia con hongos que alimentan a los embriones
de las semillas en el momento de la germinacin.

GERMINACIN ASIMBITICA

Para facilitar la germinacin de las semillas y sustituir los efectos del hongo mycorrhiza, en primer lugar se
erosiona la testa durante la esterilizacin con hipoclorito de calcio (leja). Y ya que las semillas de orqudea
estn desprovistas de reservas nutritivas, hay que sembrarlas en un medio rico en sales minerales y azcares.

CULTIVO IN VITRO CASERO

MEDIOS DE CULTIVO

Frmula de Knudson "C

Otras frmulas caseras


Frmula de pltano ,Frmula del Tomate , Frmula del Anana (Pia) , Frmula de Tomate con Banana, Frmula
del Profesor Burgeff , Frmula de La Garde, Frmula de Hawai.

Frmulas comerciales
M&S
Phytamax

Las semillas de orqudeas terrestres necesitan para germinar un medio diferente con menos sales minerales y
un pH ms alcalino

ELABORACION DEL MEDIO

Para elaborar el medio necesitaremos:

Agua destilada
Frascos de cristal (botes de conserva...)
Medio Phytamax-6668 de SYGMA
Agar-Agar (en tiendas naturistas)
Agua oxigenada

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Semillas
Jeringuilla
Autoclave/Olla-express

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Preparando un cuarto de litro de medio, conseguiremos 5/6 frascos.

Se calienta el agua destilada (250 ml.) con el agar (2 3 g) removiendo hasta que se disuelva casi
totalmente, entonces se echan 6,8 gramos de Phytamax P-6668.
Repartir entre los frascos. Verter unos 50 ml. de medio en cada uno (o sea, 1 o 2 cm. de fondo).
En las tapas se hace un agujerito en el centro para ventilacin, que se tapar con una tirita redonda por
fuera de la tapa.
Se cierran los frascos, y se envuelve la parte superior del frasco con papel de aluminio.

ESTERILIZACIN DEL MEDIO

Verter 1/2 l de agua en la olla express.


Se colocan cuidadosamente los frascos en la olla, que se pone al fuego tapndola, colocndole el silbato.
A los 20 minutos se apaga el fuego, al ratito se destapa la olla, y se deja reposar toda la noche para que
enfre y el agar solidifique poco a poco.

ESTERILIZACIN DE LAS SEMILLAS

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1.- Semillas inmaduras en cpsula verde.- slo se esteriliza la cpsula por fuera, luego en la zona asptica,
se corta la cpsula con un bistur tambin estril y se siembran las semillas tal cual.

2.- Siembra de semillas maduras.-

En un vaso preparar 10 ml. de agua destilada con leja al 5% y una gotita de mistol (mojante).
En una pequea probeta, verter unos 3ml., y aadir una pequesima cantidad de semillas.
Tras agitar de vez en cuando, dejar reposar unos 5 minutos, y las semillas frtiles irn cayendo
al fondo.
Enjuagar las semillas.- Con una jeringuilla estril, se succiona toda el agua que se pueda sin
absorber las semillas del fondo. Se vierte de nuevo un par de ml. de agua destilada y estril, se
agita un poquitn y se repite el proceso de retirar el agua con la jeringuilla 2 o 3 veces.
En la ltima, se deja un poco de agua (menos de 1 ml.) con las semillas, pues esto es lo que se
verter en los frascos de cultivo.

ZONA DE TRABAJO

La siembra en laboratorio se realiza en una cabina laminar de flujo, pero en casa se puede
trabajar sobre vapor, ya que el vapor crea una zona estril.
Preparar un spray con agua normal y 20% de leja, y vaporizar los frascos por FUERA.
Poner a hervir agua en una olla ancha llena con un tercio de agua, y sobre la rejilla colocada encima,
se realiza la siembra sin riesgo de contaminacin fngica, pues las esporas dispersas en el aire no
traspasan el vapor.

SIEMBRA

Colocamos tanto el frasco con el medio, como la probeta con las semillas esterilizadas.
Procedemos al vertido de las semillas en el frasco, evitando movimientos bruscos que muevan el aire y
con la mayor rapidez para evitar riesgos de contaminacin que puede ser por hongos o bacterias.
Tanto la apertura y cierre del frasco, como el vertido, se realiza sobre la rejilla, entre el chorro de
vapor y con rapidez.

ALMACENAMIENTO DE LOS FRASCOS

En zona iluminada, con refuerzo de luz fluorescente, para alcanzar 12 horas diarias.
Con temperatura lo ms constante posible (alrededor de 22 C).

GERMINACIN

Suelen germinar alrededor de las 4 a 6 semanas.

Empiezan hinchndose las diminutas semillas, para convertirse en protocormos (semejantes a bolas de caviar
de color verde).

Si germinan demasiadas semillas para un frasco, ser necesario repartir los protocormos en varios frascos
(esto se llama repicado).

El repicado se suele realizar dentro de una cmara laminar de flujo para asegurar las condiciones de
esterilidad y asepsia.

Los protocormos evolucionan desarrollando hojitas y ms tarde races.

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EXTRACCIN DE LAS PLNTULAS

La etapa de frasco puede durar de 1 a 2 aos, tambin en funcin de la especie.


Para extraer las plntulas, conviene echar agua templada en el frasco para reblandecer el agar y poder
desprender las races sin daarlas.
Al sacar las plntulas del frasco, se pueden poner a remojo unos minutos en agua templada con azcar y
vitamina B1 para paliar el estrs.

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ACLIMATACIN

Dentro del frasco tenan una


humedad del 100 %, por lo
que ahora es importante que la
aclimatacin sea progresiva.

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Comenzaremos cubriendo el recipiente con un film transparente creando as un mini-invernadero, e iremos


abriendo de vez en cuando para ventilar y a la vez acostumbrar a las plantas a su nuevo ambiente no estril.

Se pueden plantar en diversos medios (de grado fino y alta retencin de humedad):

Musgo
Arena de ro
Perlita
Sramis

En esta etapa (muy delicada), solo los ejemplares ms fuertes sobreviven.

A partir del momento en que empiezan a desarrollar nuevas races tienen posibilidades de sobrevivir.

Aqu no se acaba la historia. Empieza el cultivo ex-vitro. A partir de ahora pueden tardar entre 1 y 5 aos en
florecer segn la especie.

Susi Cabrera

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