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LA TOXICOLOGIE EXPERIMENTALE

I. Introduction
Les mdicaments usage humain ou vtrinaire doivent prsenter une scurit pour les sujets
auxquels ils sont destins. Cette scurit est apprcie par les investigations de toxicit
exprimentale chez lanimal. En effet aprs la mise en vidence dune proprit pharmacologique
intressante pouvant tre exploite en thrapeutique, la substance est soumise des tudes
toxicologiques pour apprcier les risques quelle prsente. Les essais de toxicit exprimentale se
divisent en deux groupes :
Ceux dont la ralisation est indispensable avant toute tentative dadministration lhomme
(essais pr-requis) :

Essais de toxicit par administration unique (toxicit aigu).


Essais de toxicit par administration ritre court terme (toxicit subaigu).
Essais de mutagense.

Ceux pour lesquels on prend le risque de les raliser conjointement avec les tudes cliniques chez
lhomme :

Essais de la toxicit par administration ritre long terme (toxicit chronique).


Essais de cancrogense.
Essais sur la reproduction.

Les tudes de toxicit exprimentale doivent tre effectues selon des protocoles biens tablis et
ralises dans des conditions de bonnes pratiques de laboratoire. Lvaluation exprimentale de la
toxicit globale dun mdicament permet de dterminer :

la dose maximale tolre,


les organes, tissus et cellules cibles,
les fonctions physiologiques altres,
les risques daltration gntique et de concerognse,
les risques de malformation congnitale.

Cette valuation permet, aprs tude clinique chez lhomme, lapprciation du bnfice attendu
par rapport aux risques encourus.

I. Essais de toxicit par administration unique (toxicit aigu)


La dtermination de la toxicit aigu permet lvaluation qualitative et quantitative des
phnomnes toxiques, et leur apparition dans le temps suite ladministration dune dose unique
dune substance pharmacologique. Cette dtermination permet de connatre le niveau de dose,
pouvant entraner la mort de lanimal de laboratoire ainsi que les symptmes de lintoxication
aigu. Lessai de toxicit aigu est la premire tude toxicologique effectuer pour une molcule
dont on ignore la nature de sa toxicit. Gnralement, on dtermine la dose minimale mortelle
(DMM) et la dose ltale 50 (DL50).

A. Dtermination de la dose minimale mortelle (DMM)


Cest la dose minimale de substance capable de tuer un animal par administration intraveineuse
lente, la mort est apprcie par arrt cardiaque. Cette dose permet lexprimentateur de choisir
les doses utiliser pour dterminer la DL50.

B. Dtermination de la dose ltale 50 (DL50)


a. Dfinition

La DL 50 correspond la dose capable de tuer, dans des conditions dtermines, la moiti des
animaux mis en exprience dans une mme espce animale.

a. Protocole exprimental

1. Slection de lespce animale

Gnralement, ce sont le rat et la souris qui sont slectionns pour dterminer la DL 50.
Quelquefois, une espce autre quun rongeur est utilise lorsque le schmas mtabolique chez la
souris et le rat est diffrent de celui de lhomme. La dtermination de la DL 50 se fait sur des
animaux des deux sexes, jeunes et gs, cause de leurs diffrences de sensibilit.

1. Voies dadministration

La substance est administre par deux voies, une qui est celle de lexposition humaine et lautre
assurant une biodisponibilit totale.

1. Dose et constitution des lots

Une gamme de six doses ou plus est slectionne pour la dtermination de la DL 50. Le rapport
entre deux doses successives doit tre compris entre 1,2 et 1,5. Les lots sont constitus de 10
animaux identiques sur les plans espce, souche ou origine, sexe, ge et poids. Chaque lot
danimaux recevra une dose de la substance tester.

1. Dure dobservation

Aprs administration les animaux sont mis en observation pendant 14 jours. Sil y a apparition
des signes de toxicit, la dure dobservation est indtermine.
a. Examens

Lheure de la mort et le nombre de morts doivent tre nots ainsi que les symptmes. Des
examens macroscopiques doivent tre faits sur tous les animaux morts et au moins quelques
survivants(ceux qui prsentent des signes de morbidit). Lautopsie est en mesure de fournir des
informations sur lorgane cible.

a. Evaluation

Ltude de la toxicit aigu dun produit permet dtablir la relation entre la dose administre et
lintensit des effets observs ainsi que le calcul de la DL50 avec ses limites de confiance.

1. Calcul de la DL50

Mthode de Karber et Behrens

DL50= DL100 ab / n

DL50 : dose ltale 50


DL100 : dose ltale 100
a : diffrence entre deux doses successives
b : moyenne de mort entre deux doses successives
n : nombre moyen danimaux par lot

Mthode de Miller et Tainter

Cest une mthode graphique qui consiste porter sur le papier semi log les pourcentages de
mortalit en fonction du logarithme dcimal des doses utilises.

% de mortalit

100

50
DL50 Log dose

Fig. 27. Graphe montrant la relation dose/mortalit(chelle semi-logarithmique).

Pour rendre linaire la courbe il faut porter sur le papier log-probit le pourcentage de mortalit en
fonction du log de la dose. Comme les produits des pourcentages 0 et 100% tendent vers linfini,
ceux ci sont remplacs par des valeurs corriges.

Correction de 0% :

Y0 = 50 / n

Correction de 100% :

Y100 = (100n 50) / n

n est le nombre danimaux des lots qui ont donn 0% et 100%de mortalit.

Probits

84

50

16

Log dose
DL16 DL50 DL84

Fig. 28. Graphe montrant la relation dose/mortalit (papier log-probit).

Lcart type de la DL50 :


S = ( DL84 - DL16)/ 2

Lcart la moyenne :

= 2 S / 2n

n est le nombre total danimaux dans les lots ayant donns des pourcentages de mortalit entre
et 93%

1.2.1) Rsultat

DL50 = DL50 graphique plus ou moins lcart la moyenne

a. Exploitation des rsultats

Les rsultats de lessai de la toxicit aigu permettent :

de dterminer la nature des effets toxiques aigus ;


de prdire les effets probables dune exposition massive chez lhomme ;
dorienter les essais ultrieurs de toxicologie exprimentale ;
de dterminer lindex thrapeutique.

Index thrapeutique

1. Dfinition

Pour chaque mdicament, il est dfinit un index thrapeutique appel aussi marge de scurit qui
une valeur reprsentant le rapport entre la dose ltale 50 et la dose efficace 50 (DL50 / DE50).

Efficacit Ltalit

Marge
de
scurit
50
Log dose
DE50 DL50

Fig. 29. Graphe montrant la relation dose/effet (chelle semi-logarithmique).

1. Signification
Les mdicaments faible index thrapeutique sont hautement toxiques car la dose ltale se
rapproche de la dose efficace. Ces substances ncessitent un suivi thrapeutique au cours de leur
administration (les cardiotoniques, la thophylline). En ce qui concerne les mdicaments index
thrapeutique moyen la toxicit es t significative (les antibiotiques). Pour les mdicaments
index thrapeutique trs large, la toxicit est trs faible (lacide ascorbique).

I. Essais de toxicit par administration ritre


Les intoxications mdicamenteuses aigus sont obtenues des doses leves, et leurs effets sont
dapparition immdiate. Dans le cas des expositions rptes de lhomme des doses non
toxiques (thrapeutiques), des effets tardifs dintoxication peuvent apparatre cause de
laccumulation du mdicament et/ou de ses mtabolites dans les tissus, et lvaluation de
survenue de ce germe de manifestations se fait par les tudes de toxicit par administration
ritre. Donc, le mdicament destin une administration prolonge doit tre soumis ce genre
dessai, dont la dure de ralisation sera en fonction de lutilisation prconise chez ltre
humain et la dure dexposition humaine. Daprs la directive 75/318 de la communaut
conomique europenne, les preuves de toxicit par administration ritre ont pour objet de
mettre en vidence les altercations fonctionnelles et/ou anatomopathologiques conscutives aux
administrations rptes de la substance active, ou lassociation de substances actives, et dtablir
les conditions de lapparition de ces altrations en fonction de la posologie. Ltude de la toxicit
par administration ritre permet :

davoir des informations sur les effets toxiques potentiels aprs exposition rpte ;
de connatre les organes cibles ;
la mise en vidence deffets rversibles ou irrversibles ;
lexistence ou non de phnomnes cumulatifs et deffets retards.

Dans ce genre dtude, il est donc vitable dutiliser un lot tmoin recevant de leau
physiologique, afin de minimiser les risques dinterprtation des phnomnes pathologiques
indpendants de ladministration du produit.
A. Essai de la toxicit court terme
a. Protocole exprimental

1. Espce et nombre danimaux

Les espces animales choisies et lhomme doivent prsenter des similitudes sur le plan
pharmacocintique, ltude est effectue sur les deux sexes de deux espces de mammifre dont
lune est diffrente des rongeurs (rat et chien). Pour obtenir des donnes exploitables
statistiquement, on doit utiliser un nombre gal danimaux de chaque sexe pour chaque lot. (voir
tableau)

1. Voie dadministration

Pour la plus part des substances, la voie habituelle est la voie orale, par incorporation dans la
nourriture ou dans leau potable, sil y a risque de raction avec les constituants alimentaires. Si
le produit est dun got dsagrable, il est administr par gavage ou dans une capsule.

1. Dose et Dure

Il est recommand dutiliser une dose forte pouvant produire des signes caractristiques de
toxicit, mais insuffisante pour tuer les animaux ; Une dose faible sans effet toxique, mais active
sur le plan pharmacodynamique ; Une dose intermdiaire, moyenne gomtrique des deux doses
prcdentes. Les doses sont slectionnes sur la base des rsultats des tudes de toxicit aigu
(dl50 et pente de la droite dose rponse ). La dure de ses tudes est en gnral de 90 jours chez
le rat, et jusqu 6 mois voir une ou deux annes chez le chien.

1. Examens

On effectue:

le contrle de la consommation de la nourriture et de leau ;


le contrle de lvolution pondrale ;
les observations minutieuses du comportement ;
les examens fonctionnels (ECG, Ophtalmologie, etc. ) ;
les examens hmatologiques et biochimiques .

Les animaux morts au cours de ltude et les survivants sacrifis au terme de lessai sont
autopsis. les organes prlevs sont pess et les examens histopathologiques appropris sont
effectus.

a. Rsultats
Lvaluation des rsultats doit prendre en considration la mortalit, la prsence ou labsence des
anomalies comportementales et biologiques ainsi que lidentification des organes cibls et leurs
lsions.

a. Exploitation des rsultats

Ltude de la toxicit subaigu nous permet de connatre la dose sans effet observ de la
substance teste chez lanimal. Cette dose sera utilise ultrieurement en clinique et en
toxicologie exprimentale.

A. Etude de la toxicit long terme ( toxicit chronique )


a. Protocole exprimental

1. Espce et nombre danimaux

Le rat est lanimal de choix, suivi du chien et des primates. Chaque lot exprimental et le lot
tmoin comprennent un nombre identique de mles et de femelles, soit entre 40 et 100 individus
pour les rats, un nombre plus faible de chiens et de primates est admis.

1. Voie dadministration, dose et dure

La voie dadministration est la mme que dans les tudes court terme. Les doses utilises
tiennent compte la fois de lusage thrapeutique envisag pour la nouvelle molcule, et des
rsultats des tudes antrieures de toxicologie. Les doses utilises ne doivent pas compromettre la
vie des animaux pendant du temps de lessai. La dure des tudes est gnralement de 2 ans
chez le rat, les chiens et les primates peuvent tre maintenus sept ans ou plus.

1. Examens

Ce sont les mmes examens que ceux de ltude de la toxicit subaigu.

a. Rsultats

Ils sont identiques a ceux de ltude de la toxicit subaigu.

a. Exploitation des rsultats

Lobjectif des tudes de toxicit long terme est de dfinir la nature de la toxicit et de
dterminer la dose sans effet observ. Si la toxicit nest pas trop grave et quune dose sans effet
observ tait dfinie, une dose journalire peut tre extrapole partir des donnes animales, tout
en appliquant le facteur de scurit qui est gale 100. Si les donnes toxicologiques drives de
travaux scientifiques chez lhomme sont insuffisantes, le facteur de scurit, dans le cas contraire,
est abaiss.

I. Essai de la cancrogense long terme


La cancrogense est un processus pathologique caractris par lapparition de cellules
diffrentes des cellules normales dans l'organisme. Ces cellules, devenues malignes, transmettent
leurs proprits leur descendance. Le principe des essais de la cancrogense est de traiter par
une voie dadministration, un nombre important danimaux ds le sevrage et pendant la majeure
partie de leur vie.

A. Indications
Les essais de cancrogense sont indiqus pour les produits qui prsentent une analogie
structurale troite avec les composs cancrognes ; les produits qui, lors de ltude
toxicologique long terme, ont provoqu des manifestations suspectes et les produits destins
une administration vie (les antihypertenseurs, les antidiabtiques oraux).

A. Protocole exprimental
a. Espce, nombre danimaux, dure du traitement

Les espces animales choisies doivent prsenter, avec lhomme, des similitudes mtaboliques vis
vis de la substance tester. Les espces utilises sont la souris, le rat et lhamster.
Gnralement, on commence les tests avec des lots de 50 animaux de chaque sexe par dose, y
compris les lots tmoins (un lot tmoin par sexe) qui reoit uniquement le vhicule cest dire
lexcipient. Le traitement est de 24 mois pour la souris et lhamster , et de 30 mois pour le rat.

a. Voie dadministration et dose

La substance tester doit tre donne lanimal par la voie de lexposition chez lhomme. Les
essais sont effectus trois niveaux posologiques. Une dose forte qui produit des signes de
toxicit sans rduire significativement la dure de vie des animaux. Elle est drive partir des
tudes de la toxicit 90 jours. Les deux doses infrieures sont des fractions de la dose la plus
forte (sur et ou ). Les deux lots tmoins recevront, par la mme voie dadministration,
uniquement lexcipient.

a. Examens

Les examens cliniques, biologiques et anatomo-pathologiques permettront la dtection et la


description dhyperplasie, des tumeurs bnignes et malignes, ainsi que les mtastases touchant
tous les tissus et organes. Tous les animaux morts ou mourants doivent tre autopsis. Les
survivants la fin de ltude doivent tre sacrifis, examins et les organes pess (foie, cerveau,
rein, poumons, etc.) Des chantillons de tous les tissus seront conservs pour des examens
histologiques et tous les tissus prsentant des signes de tumeurs ou danomalies morphologiques
seront examins.

a. Evaluation

La molcule teste doit tre depourvue de tout pouvoir cancrigne.


I. Essai de la mutagense
A. Dfinition
On appelle mutation, au sens strict, toute modification brusque et permanente de caractres, par
changement dans le nombre ou la qualit des gnes.

B. Principes des essais de la mutagense


Les essais de la mutagense sont bass sur trois principes :

Les agents mutagnes augmentent la frquence des mutations spontanes.


Toute atteinte qualitative ou quantitative de lADN peut induire une mutation.
Tout agent affectant lADN dun organisme(uni ou pluricellulaire) peut affecter
lADN des cellules humaines.

B. Description du protocole exprimental


a. Essais relatifs aux mutations gniques

Ces essais utilisent des bactries(Salmonella typhimurium, Escherichia coli), des


levures(Saccharomyces cervisiae), des cellules de mammifres en cultur (Cellules CHO
dhamster chinois), des insectes (Drosophila melanogaster) et des rongeurs (souris).
Le test dAmes utilise une souche de Salmonella typhimurium porteuse dune mutation His (-)
qui inhibe leur croissance dans un milieu dpourvu dhistidine(acide amin essentiel).En
contact dune substance mutagne ces bactries deviennent His (+) capables de se
dvelopper en labsence dhistidine.

a. Essais relatifs aux aberrations chromosomiques

Par ces tests on recherche si le produit est capable dendommager les chromosomes de
mammifres. In vitro ces essais sont raliss sur des cellules de mammifres en culture, par
analyse des chromosomes en mtaphase. In vivo les tests sont raliss sur les cellules de la
moelle osseuse dun rongeur, chez lequel, aprs administration du produit tester, on compte le
nombre de micronuclus dans les rythrocytes polychromatiques ou on analyse les chromosomes
des cellules en mtaphase.

a. Essais relatifs aux effets sur lADN

La cellule rpond aux agressions de lADN par les substances chimiques, par des rparations
enzymatiques pour liminer la partie endommage et la remplacer par un fragment nouvellement
synthtis. Pour valuer une lsion primaire de lADN, on se rfre aux tudes de crossing-over
mitotique chez saccharomyces cervisiae.

A. Evaluation
Si les rsultats des essais effectus sont ngatifs, on peut conclure que le risque de la
mutagenicit est suffisamment faible chez lhomme. Par contre si les rsultats des essais effectus
sont positifs, on peut conclure que le produit test possde des proprits mutagnes.

I. Essais sur la reproduction


Depuis le drame de thalidomide (1962/1963), les essais sur la reproduction sont inclus dans le
protocole dvaluation exprimentale toxicologique de toutes les substances mdicamenteuses

A. Description du protocole exprimental


a. Segment I : Etude de fertilit

Cette tude a pour but de dterminer si le traitement des animaux mles et femelles, par le produit
tester, entrane leur strilit ou des malformations chez la descendance, suite laltration des
gamtes mles ou des gamtes femelles. Dans cette tude, on ralise trois combinaisons :
accouplement de mles traits avec des femelles non traites ; accouplement de mles non traits
avec des femelles traites et accouplement de mles traits avec des femelles traites.

a. Segment II : Etude dembryotoxicit et de foetotoxicit

Les femelles gestantes sont traites par le produit tester pendant la priode de lorganogense
embryonnaire ; deux jours avant la mise bas, les femelles sont sacrifies et les utrus prlevs.
Pour chaque femelle, on note les sites dimplantation, de rsorption, le poids et le sexe du ftus.

a. Segment III : Etude de pri et post natalit

Les femelles sont traites par le produit tester de la fin de la gestation jusqu la fin de la
lactation. Cette tude a pour but de dceler les perturbations de la croissance du ftus, de la
parturition et de la lactation.

I. Les bonnes pratiques du laboratoire


Pour amliorer la fiabilit dune tude toxicologique, la food and drug administration (FDA) a
propos en 1987 une srie de rglement pour de bonnes pratiques de laboratoire, ces rglements
renferment des directives dtailles sur les points suivants :

1. le personnel assurant les fonctions respectives de directeur* de l tude, de technicien


responsable de llaboration et de la mise en uvre des procdures opratoires au niveau des
diffrentes units et de responsable** de lassurance qualit ;
2. les conditions dlevage et de manipulation des animaux ;
3. le contrle des quipements, conception, maintenance et calibration ;
4. les procdures opratoires *** ;
5. les produits cliniques (produits tester et autres ractifs) : caractristiques, manipulation ;
6. les enregistrements : acquisition, archivage, prparation et teneur des comptes rendus ;
7. llimination des matriaux des tests aprs usage.
8. Pour une meilleure comprhension, le texte doit tre structur en chapitre, rdig en phrases
courtes et en termes simples.

* Le directeur dtude doit tre un toxicologue expriment.

** Le responsable de lassurance qualit est indpendant, il est non impliqu dans la


ralisation de ltude. Il est tenu de vrifier la conformit entre les crits et les faits, du dbut
jusqu la fin de ltude.

*** Les procdures opratoires constituent un travail original du laboratoire, elles peuvent
tre labores dans un premier temps partir de certains ouvrages.
Lors de la rdaction, une procdure opratoire doit comprendre :
un titre ;
un numro ;
le nom et la signature du responsable de son criture ;
la date

Tableau XXXV : Les diffrents essais toxicologiques raliss en phase prclinique

Type Espces animales Sexe Age Nombre / Dose (s) Voie (s)
dessai lot

Toxicit aigu Souris / rat M+F A/J 10 01 02

Toxicit court Rat+++ M+F A/J 10-30 03 celle(s)


dexposition chez
terme Chien++ 04-08 03 lhomme

Toxicit long Rat+++ M+F A/J 40-100 03 celle(s)


terme dexposition chez
Chien++ M+F 04-08 03 lhomme
Singe+ M+F 04-08 03

Souris+++ M+F A/J 50 03 celle(s)


dexposition chez
Cancrogense
long terme Hamsters M+F 50 03 lhomme
Rat+++ M+F 50 03

Reproduction :

Souris+++ M+F A 08 01 celle(s)


dexposition chez
Segment 1 Singe++ M+F lhomme

Rat++ M+F
celle(s)
Rat / Souris M+F A 08 01 dexposition chez
Segment 2 lhomme

celle(s)
Rat / Souris M+F A 08 01 dexposition chez
Segment 3 lhomme