Tecnologa de ADN

Recombinante
Prof. Javier Cabello Schomburg, MS
 Reflexin
Cada criatura, al nacer, nos trae el mensaje de
que Dios todava no ha perdido la esperanza
en los hombres.
Rabindranath Tagore
 rbol Filogentico de la Vida
Dominio Bacteria: Bacterias en sentido estricto o eubacterias (todos unicelulares
procariotas)
Dominio Archaea: Arqueobacterias o arqueas. Son un linaje de procariotas unicelulares
totalmente distintos a las eubacterias.
Dominio Eukarya: Eucariotas (tanto unicelulares como pluricelulares).
Qu es un organismo modelo?
Son una herramienta fundamental en algunas reas de la
investigacin cientfica, ya que permiten realizar estudios sobre
determinados caracteres y los resultados pueden ser
extrapolados a otras especies
Las especies que se eligen como modelo tienen las siguientes
caractersticas en comn:
Fcil manutencin y manipulacin en el laboratorio;
- Ciclos de vida cortos;
- Gran nmero de descendencia;
- Disponibilidad de variabilidad fenotpica y genotpica;
- Fenotipo de inters sencillo de observar o medir;
- Tcnicas de estudio puestas a punto para estas especies.
organismos modelo en Gentica
 Tecnologa del ADN
El genoma de un organismo es el juego completo de ADN.
La planificacin del Proyecto Genoma Humano se inici en 1986, previsto para el
2007. En Junio de 2000 se present el 90% del borrador con la secuenciacin de unos
30,000 genes y 3 mil millones de pares de bases (pb). Los genes son secuencias
especficas de bases que codifican instrucciones para hacer protenas.
Los genes son un 2% del genoma humano.
Entre una persona y otra el ADN solo difiere en 0.2% 60%

IDENTIDAD GENTICA 20% De 289 genes

humanos
implicados en
enfermedades,
70% hay 177
cercanamente
similares a los
genes de
95% idntico
Drosophila.

R.
ALE
GR
A
CON
Humanos Chimpanc Ratn A. thaliana C. elegans D. melanogaster
30,000 30,000 30,000 25,000 19,000 13,000 ACY
genes genes genes genes genes genes T
200
Enzimas de Restriccin
Tijeras Moleculares
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

En 1968 se purific la primera endonucleasa de

restriccin, la K12 en E coli.

Cortaba fragmentos largos y concretos, por lo que se

pens que reconoca secuencias especficas del ADN.
Se abandon porque aunque reconoca una zona
determinada del ADN, cortaba al ADN a varias Kb de distancia.

En 1970 se asla otra endonucleasa de restriccin en

Haemophilus influenzae, que reconoce y una secuencia en
un duplex de ADN y la rompe en ese lugar produciendo
fragmentos discretos de longitud y secuencia bien definidos.
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
Fenmeno de restriccin: reconocimiento por parte de una
bacteria de un ADN extrao y lisis del mismo en pequeos
fragmentos.

El fenmeno de restriccin se descubri en E coli, cuando

se hizo crecer el bacterifago lambda. Si la bacteria crece
encontraremos varias colonias por placa. Si no crece, no
encontaremos colonias.

En la cepa C de E coli creca bien el bacterifago , pero

si este se creca en la cepa K o la R, la eficiencia de
crecimiento era mucho menor o nula. El fago era restringido
por esta cepa.
 MODIFICACION- RESTRICCION

Tpico ejemplo de
restriccin de crecimiento
del bacterifago lambda
en una cepa determinada
de E. coli

La eficiencia con la que el fago

crece en una cepa depende de la
ltima cepa donde fue propagado.
 MODIFICACION- RESTRICCION
Explicacin:

El DNA del fago es degradado en cuanto se incorpora, y a la

endonucleasa responsable de esta degradacin se le llama
endonucleasa de restriccin o enzima de restriccin.

El husped restrictivo debe proteger a su propio ADN de la

accin de las enzimas de restriccin y para ello modifica
a su propio ADN.

Modificacin: metilacin de ciertas bases en un nmero muy

limitado, justo en los lugares de reconocimiento de las
enzimas de restriccin.

El DNA del fago que sobrevive algn ciclo en el husped restrictivo

se replica y tambin es metilado por las metilasas de la bacteria, y por
tanto modificado y protegido, y puede crecer bien en una nueva
reinfeccin.
METILACION Y RESTRICCION
SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION
 SISTEMAS DE RESTRICCION Y MODIFICACION

Nomenclatura:

Tres letras: 1a letra de gnero de la bacteria donde se encontr

2a y 3a letras especie de la bacteria donde se encontr

Letra de la cepa donde se produce la enzima de restriccin (si es alguna

cepa especial)

Si en la misma bacteria hay varios sistemas de restriccin, se especifica

por nmeros romanos.
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Extremos cohesivos Extremos romos

ENDONUCLEASAS DE
RESTRICCION

Para reconocer el tamao de

los fragmentos que se
producen tras la accin de una
endonucleasa de restriccin
se utiliza la electroforesis
en gel de agarosa y la
tincin con bromurod de
etidio.
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION

Se han estudiado 10,000 bacterias para

Encontrar enzimas de restriccin.

Se han encontrado 3,000 enzimas de

Restriccin especficas para aproximada
mente 200 secuencias de ADN.

Las enzimas diferentes que tienen

especificidad por la misma secuencia
de ADN y que cortan en el mismo sitio
se les llama isoschizomeros.

Si reconocen la misma secuencia pero cortan en diferente lugar

al ADN se les denomina neoeschizomeros.

www.rebase.neb.com
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION
El nmero y el tamao de fragmentos de ADN generados por
una enzima de restriccin depende de la frecuencia de aparicin
De los lugares diana en el ADN.

Tericamente, si tenemos un ADN que sea:

- 50% de frecuencia de C+G

- las cuatro bases distribuidas al azar

El nmero de cortes en sera cada:

si la secuencia diana es de 4 bases corte cada 44(256) bases

si la secuencia diana es de 6 bases corte cada 46 (4096) bases

En la prctica, no ocurre exactamente as.

 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN
Son nucleasas que reconocen las molculas de ADN en sitios
determinados, por medio del reconocimiento de secuencias especficas
Las secuencias de reconocimiento son palindrmicas

Tipos de endonucleasas de restriccin:

tipoI y III: cortan el ADN en sitios poco especficos y distantes del
sitio de reconocimiento
tipo II: cortan las dos hebras de DNA en puntos equivalentes, muy
especficos, dentro de la secuencia de reconocimiento. Son las ms
tiles en ingeniera gentica. EcoRI: efecta cortes
escalonados en la secuencia
palindrmica especfica de 6pb
EcoRI
EcoRI: genera fragmentos
complementarios de hebra
simple denominados fragmentos
de restriccin con extremos
cohesivos
 ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN

Sitios de restriccin: secuencias palindrmicas reconocidas por las

endonucleasas de restriccin.

Sitios de corte Eje de simetra doble

EcoRI genera fragmentos de EcoRV genera fragmentos de

restriccin con extremos cohesivos restriccin con extremos romos
ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIN

Nomenclatura:
mediante tres
letras tomadas del
gnero y la especie
de la bacteria de la
que se aislaron
originalmente,
seguida de una
letra que indica el
serotipo y un n
romano, en el caso
de haber
encontrado
diferentes enzimas
en una misma
variente

Se han caracterizado ms de 3000 enzimas de

restriccin de tipo II con ms de 200 secuencias
de reconocimiento diferentes.
 MAPAS DE RESTRICCIN
Digestin de una molcula de DNA con una enzima de restriccin.
Separacin de los fragmentos de restriccin mediante electroforesis
Sitios de restriccin para EcoRI

A B C D E F G

NRH
 MAPAS DE RESTRICCIN
Construccin de un mapa de restriccin

Perfil electrofortico de los

fragmento de restriccin

Mapa de restriccin del

DNA, resultante de la
informacin obtenida en
(a)
MAPAS DE RESTRICCIN

Digestin del plsmido pAgK84 con:

BamHI (A)
PstI (B)
BglII (C)

NRH
HaeIII (D)
HincII (E)
SacI (F)
XbaI (G)
HpaI (H)
Carril
Aplicacin deI:los
fragmentos
mapas de de DNA de tamao
restriccin:
conocido
polimorfismos de longitud de los fragmentos
de restriccin (RFLP), valiosos para el
diagnstico de enfermedades hereditarias.
 MAPAS DE RESTRICCIN

Aplicacin de los mapas de restriccin: polimorfismos de longitud de los

fragmentos de restriccin (RFLP), valiosos para el diagnstico de
enfermedades hereditarias.
 Vectores de clonacin

Los vectores de clonacin son molculas pequeas de DNA que se replican

de manera autnoma

Tipos de vectores
Plsmidos
molculas de DNA circular que se encuentran en bacterias o
levaduras
se pueden clonar fragmentos de DNA de no ms de 10 kpb
Bacterifagos
fagos que infectan bacterias
se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta 16 kpb

Cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y de levaduras (YAC)

se pueden clonar fragmentos de DNA de hasta varios cientos de
kpb
 Vectores de clonacin

PLSMIDOS

Componentes bsicos de un vector de clonacin plasmdico

ori (origen de replicacin)

HindIII
PstI
SalI
BamHI
SmaI
SacI
EcoRI ampr (marcador de seleccin)

Policonector
(polylinker) Regin donde
se puede
insertar el
DNA extrao
 Vectores de clonacin
PLSMIDOS
Estructura y componentes del plsmido pUC18 (plsmido de clonacin universal)

Policonector:
contiene 13 sitios de
restriccin nicos

3 genes: permiten la seleccin de clones

recombinantes
ampR: resistencia a la ampicilina
LacZ: b-galactosidasa
 Vectores de clonacin

BACTERIFAGO

No necesaria para la
infeccin ltica
Fago infectivo
con un
fragmento
enzima de extrao de DNA
restriccin y
Empaquetamien
separacin de los
Apareamient to in vitro
fragmentos
o y unin

El DNA remanente contiene DNA

los genes necesarios para la recombinante
infeccin pero es pequeo Fragmento de DNA
para el empaquetamiento extrao de 15 kpb
 Transformacin y seleccin

Vector recombinante

Cromosoma Transformacin de bacterias

de E. Coli
Las bacterias se crecen sobre
placas que contienen agar y
ampicilina (antibitico).
Replicacin del plsmido
Sobreviven las clulas
transformadas, por poseer
Multiplicacin celular el gen AmpR, el resto
mueren.
 Transformacin y seleccin

Seleccin de clones que han incorporado un vector recombinante

X-gal: anlogo de la lactosa

Las clulas que incorporan un vector no recombinante (pUC18 no modificado)

son azules
 Biblioteca de ADN

Biblioteca genmica coleccin de clones formados a partir de todos los fragmentos

de ADN del genoma de una especie, tejido o tipo celular.

Biblioteca de ADN genmico los fragmentos de ADN provienen de la escisin

del genoma. Contiene regiones codificantes y no codificantes. Se genera por
clonacin de fragmentos genmicos al azar.

Biblioteca de cADN los fragmentos provienen de los mARNs retrotranscritos.

Contiene slo las secuencias expresadas de un tipo particular de clula.
 TCNICAS DEL ADN
RECOMBINANTE
TCNICA PROPSITO
Enzimas de Restriccin Cortan ADN en puntos especficos, hacen fragmentos de ADN
ADN Ligasa Une fragmentos de ADN
Vectores Virus o fagos: llevan ADN a las clulas y aseguran replicacin
Plasmidos Clase comn de vector
Marcadores Genticos Identifican a las clulas que han sido transformadas
PCR Amplifica la cantidad de ADN de muestras pequeas
ADNc Hace una copia de ADN de ARN mensajero
Sondas de ADN Para identificar y marcar una pieza de ADN conteniendo cierta
secuencia
Sntesis Gnica Para hacer un gen de una base de datos
Gel Electroforsis Para separar fragmentos de ADN
Secuenciacin de ADN Para leer la secuencia de bases de un segmento de ADN
mARNs
Construccin de
Bibliotecas de cADN

ADN
 mRNAs
Construccin de
Hibridacin Bibliotecas de cADN
Cebador oligodT

RT
Retrotranscripcin de mRNAs a cDNA

NRH
Eliminacin del RNA (con lcali)
Adicin de una cola de polidG

oligodC

Sntesis hebra complementaria

Metilacin DNA

cDNA
 cDNA Construccin de
Bibliotecas de cADN
Ligador EcoRI

Regin reemplazable
EcoRI

EcoRI
Ligacin

Empaquetamiento in vitro
Vector: bacterifago
Viriones
recombinantes

Infeccin de E. Coli

Clones
individuales
 Cribado de la genoteca

Hibridacin de colonias in situ

1) Las colonias se transfieren desde una placa de cultivo a un filtro de
nitrocelulosa
2) Tratamiento del filtro con lcali y posterior secado; el DNA desnaturalizado
queda unido al filtro
3) Apareamiento con una sonda marcada radiactivamente; formacin de
hbridos con su DNA complementario

NRH
4) Autorradiografa

1
2 3 4 Colonias
detectadas
por la sonda
 SOUTHERN BLOT

Permite identificar un fragmento de DNA individual mediante

hidridacin con una sonda marcada

DNA

Escisin con
enzimas de
membrana autorradiografa
gel restriccin

Papel de filtro membrana

electroforesis

gel

Disolucin alcalina

Transferencia del DNA, por

capilaridad, del gel a la hidridacin revelado
membrana; el medio alcalino con la sonda
desnaturaliza el DNA. marcada
 NORTHERN

Permite analizar la expresin de un mRNA determinado

Etapas:
Aislamiento del RNA
Separacin mediante
electroforesis
NT 48 h 96 h Transferencia del RNA a una
membrana de nitrocelulosa
Hibridacin con una sonda
marcada, complementaria al gen
buscado
Autorradiografa
Ej.: Expresin del mRNA de b-globina en clulas
diferenciadas de eritroleucemia

NT: clulas no diferenciadas

48h: clulas diferencias durante 48h
96h: clulas diferencias durante 96h
La intensidad de la banda es
proporcional a la cantidad de
mRNA expresada
 PCR

PCR: reaccin en cadena de la polimerasa (polymerase chain reaction)

Permite amplificar regiones de DNA de secuencias conocidas

cebador
cebador

Etapas:
Desnaturalizacin del DNA: 95C
Hibridacin con un exceso de cebadores: 50- 60C
Cebador: oligonucletido de 18-20 nt de longitud
Tienen secuencia complementaria a los extremos 3 del segmento de DNA de inters

3) Sntesis de DNA: 72 C
Taq polimerasa (Thermus aquaticus, bacteria de aguas termales)
Estas etapas se repiten entre 20 a 30 veces
 PCR

Desnaturalizacin
Desnaturalizacin Ciclo 3 Hidridacin
Ciclo 1 Hidridacin

Sntesis

Desnaturalizacin
Ciclo 2
Hidridacin Sntesis

Sntesis

Ciclos 4, 5, 6, etc

La secuencia deseada (delimitada por los cebadores) se

incrementa exponencialmente, alrededor de un milln de veces
despus de 20 ciclos; el resto de secuencias en la muestra de
DNA original permanece sin amplificar.
 CLONACIN

CLONACIN: obtencin de un clon

 TCNICAS DE CLONACIN
CLONACIN de vectores recombinantes

Se genera un fragmento de DNA de tamao adecuado (con una enzima de

restriccin, por PCR o por sntesis qumica)
El fragmento se incorpora dentro de otra molcula de DNA conocida
como vector, que tiene las secuencias necesarias para dirigir la replicacin
del DNA Apareamiento de
fragmentos de DNA
Vector de DNA extrao
extrao con el
clonacin vector de clonacin
Endonucleasa de y ligamiento
restriccin

DNA
recombinante

El vector, con el DNA de inters, denominado DNA quimrico o

recombinante, se introduce en clulas husped donde se replica.
Transformacin
Las clulas que contienen el DNA buscado se identifican. Seleccin
 TCNICAS DE CLONACIN
Ligacin: unin de fragmentos de restriccin por una DNA ligasa

DNA vector
DNA genmico

fragmentos de
(b) y (c) restriccin no
apareados
2 ATP
DNA ligasa T4
2 AMP + 2 PPi

DNA recombinante