Академический Документы
Профессиональный Документы
Культура Документы
Lorena SP
2007
SOLANGE INS MUSSATTO DRAGONE
Lorena SP
2007
AUTORIZO A REPRODUO E DIVULGAO TOTAL OU PARCIAL DESTE
TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRNICO, PARA
FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Catalogao na Publicao
Biblioteca Universitria
Escola de Engenharia de Lorena da Universidade de So Paulo
663.48 - CDU
Este trabalho eu dedico a:
Meu marido, Giuliano, por estar ao meu lado em todos os momentos, pelo seu amor, respeito,
carinho e confiana.
Minha me, Idalina, por tudo! Por ter me criado com tanto amor e carinho, por ter me
educado e sempre me apoiado em todos os momentos.
Meu pai, Ercy, que infelizmente no est mais presente fisicamente entre ns, mas que estar
sempre dentro de mim como um grande exemplo de dignidade, fora, amor e humildade.
AGRADECIMENTOS
Dra. Ins Conceio Roberto, pela amizade, confiana e orientao, no apenas durante o
doutorado, mas desde 1998, quando iniciei meus trabalhos de pesquisa sob sua orientao.
Aos professores, George Jackson de Moraes Rocha, Adriane Maria Ferreira Milagres e Ismael
Maciel de Mancilha, pelas valiosas explicaes e sugestes dadas para que este trabalho
pudesse ser realizado da melhor forma possvel.
Aos professores Joo Batista de Almeida e Silva, Silvio Silvrio da Silva, Maria das Graas
de Almeida Felipe e Arnaldo Mrcio Ramalho Prata, pela amizade constante.
Palavras-chave: Bagao de malte. Hidrlise. Xilitol. cido lctico. Carvo ativado. cidos
fenlicos. Branqueamento.
ABSTRACT
The possibility of brewers spent grain integral use, in chemical and biotechnological
processes, was evaluated. The material was fractionated by means of three different
procedures: dilute acid hydrolysis, for the hemicellulose recovery; alkaline hydrolysis, for the
lignin solubilization, and enzymatic hydrolysis, for the cellulose conversion into glucose. A
study on the optimization of the fractionation conditions using previously selected variables
was performed for each one of these procedures. The hydrolysates produced under the
optimum conditions were used in chemical or biotechnological processes for obtainment of
commercial interest compounds, such as: 1. xylitol, produced by fermentation of xylose from
hemicellulosic hydrolysate, by Candida guilliermondii yeast; 2. Lactic acid, produced by
fermentation of glucose from cellulosic hydrolysate, by Lactobacillus delbrueckii bacterium;
3. activated charcoal, produced by chemical activation of the lignin present in the alkaline
liquor. The phenolic acids release during the lignin alkaline hydrolysis was also evaluated and
optimized. In addition, a study about the characteristics of the cellulose pulp produced under
the optimum conditions, before and after bleaching with hydrogen peroxide, was also
performed to evaluate the possibility of using this pulp on the production of paper or cellulose
derivatives. The hemicellulose acid hydrolysis results revealed that the efficiency of this
process in reactor was >85% for all the evaluated conditions, but the xylitol production was
favored from the hydrolysate obtained in the conditions of 1:8 g:g solid:liquid ratio, 100 mg
H2SO4/g dry matter, 120C for 17 min, attaining a yield factor of 0.70 g/g and productivity of
0.45 g/l.h. In the alkaline hydrolysis stage, the best results were obtained when the process
was performed at 120C for 90 min, using 2% w/v NaOH and a solid:liquid ratio of 1:20 g:g.
Under these conditions, the obtained pulp presented (% w/w): 90.4 cellulose, 8.2 lignin and
1.1 hemicellulose. In the optimized conditions of enzymatic hydrolysis for this pulp (45 FPU
/g dry matter, 2% w/v substrate, 100 rpm, 45C, 96 h), the efficiency of cellulose conversion
into glucose was 93.1%. The lactic acid production from this hydrolysate presented a high
yield (0.98 g/g), but the productivity increased 2.8-times when the medium was supplemented
with nutrients. The charcoals produced by chemical activation of the lignin presented high
efficiency for the removal of metals, mainly nickel, iron, chromium and silicon, which was
higher than that obtained from commercial charcoal. By alkaline hydrolysis of brewers spent
grain pretreated with dilute sulfuric acid, it was possible to recover several phenolic acids,
mainly ferulic and p-coumaric acids that are the two phenolic acids present in larger amount
in this material. Furthermore, the cellulose pulp obtained under these conditions presented
characteristics suitable for use on the production of cellulose derivatives when bleached by a
sequence using sodium hydroxide and hydrogen peroxide. Due to these results it was
concluded that brewers spent grain is an industrial by-product with great potential for use as
raw material in chemical and biotechnological processes.
Keywords: Brewers spent grain. Hydrolysis. Xylitol. Lactic acid. Activated charcoal.
Phenolic acids. Bleaching.
LISTA DE ILUSTRAES
Figura 3.3 - Representao esquemtica dos procedimentos utilizados para preparo dos
meios de fermentao a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte. ................................................................................................................... 50
Figura 3.4 - Banho termostatizado com leo de silicone, utilizado para a hidrlise alcalina
do bagao de malte. ............................................................................................. 53
Figura 4.1 - Grficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variveis: (1) relao
slido:lquido, (2) concentrao de cido sulfrico e (12) a interao entre
elas, nas respostas: eficincia de hidrlise da arabinana (A), eficincia de
hidrlise da xilana (B), eficincia de hidrlise da hemicelulose (xilana +
arabinana) (C) e concentrao de lignina solvel (D), obtidas nos processos
de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave. Efeitos acima da linha
de p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana. ............................... 73
Figura 4.7 - Consumo de xilose (A) e produo de xilitol (B) pela levedura Candida
guilliermondii em hidrolisado de bagao de malte: HDS (), HC (), HCT
() e HCDS ()................................................................................................. 94
Figura 4.10 - Grficos de Pareto para o efeito das variveis: concentrao de NaOH,
temperatura e tempo de reao, nas respostas: concentrao de cido ferlico
(A) e concentrao de cido p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise
alcalina do bagao de malte. Efeitos acima da linha de p=0,05 so
significativos ao nvel de 95% de confiana...................................................... 107
Figura 4.11 - Valores previstos pelo modelo linear em funo dos valores observados para
as respostas de concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de cido
p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte. 109
Figura 4.12 - Superfcies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose
( y 1 ) e o rendimento total (glicose + celobiose) ( y 2 ) da hidrlise enzimtica
do bagao de malte. ........................................................................................... 115
Figura 4.15 - Hidrlise enzimtica das amostras de bagao de malte original, celulignina e
polpa celulsica. (A) Concentrao de glicose e celobiose nos hidrolisados
obtidos; (B) Rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise para
cada amostra utilizada........................................................................................ 122
Figura 4.22 - Aparncia das amostras de bagao de malte original (A), polpa do bagao
original no branqueada (B), polpa do bagao original branqueada (C);
bagao de malte pr-tratado (D), polpa do bagao pr-tratado no
branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado branqueada (F)........................... 144
Figura 4.24 - Efeito da reduo do pH (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na
cor do licor alcalino de bagao de malte............................................................ 148
LISTA DE TABELAS
Tabela 4.6 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a
concentrao de lignina solubilizada durante a hidrlise cida do bagao de
malte. ................................................................................................................... 80
Tabela 4.8 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator
de rendimento (YP/S) e produtividade volumtrica em xilitol (QP) obtidos
durante a fermentao do hidrolisado de bagao de malte. ................................. 83
Tabela 4.9 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator
de rendimento em clulas (YX/S) obtido durante a fermentao do hidrolisado
de bagao de malte............................................................................................... 83
Tabela 4.12 - Composio dos hidrolisados de bagao de malte empregados como meio
de fermentao para produo de xilitol.............................................................. 91
Tabela 4.15 - Composio qumica do bagao de malte nas formas original (BO) e pr-
tratado com cido sulfrico diludo (BPT), massa recuperada e perda de cada
frao aps o pr-tratamento cido...................................................................... 97
Tabela 4.16 - Composio qumica das polpas de bagao de malte e perdas de celulose e
lignina aps o tratamento de hidrlise alcalina sob diferentes condies
operacionais. ........................................................................................................ 99
Tabela 4.17 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e resultados do teste t de
Student, para os teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a
partir do bagao de malte................................................................................... 100
Tabela 4.18 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus
respectivos R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de
lignina residual e teor de celulose nas polpas obtidas. ...................................... 101
Tabela 4.20 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus
respectivos R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de
concentrao de cido ferlico e concentrao de cido p-cumrico no licor
alcalino obtido. .................................................................................................. 108
Tabela 4.22 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student, para o
rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise
enzimtica do bagao malte............................................................................... 112
Tabela 4.23 - Anlise de varincia com erro total e teste da curvatura, para o rendimento
em glicose e rendimento total da hidrlise enzimtica do bagao malte........... 113
Tabela 4.24 - Equaes do modelo para a hidrlise enzimtica do bagao de malte e seus
respectivos R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de
rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) de hidrlise... 114
Tabela 4.28 - Rendimento e caractersticas das polpas de celulose obtidas por hidrlise
alcalina do bagao de malte nas formas original e pr-tratado com cido
sulfrico diludo................................................................................................. 140
Tabela 4.29 - Volume de cido sulfrico adicionado nas amostras do licor alcalino de
bagao de malte, caracterizao do licor obtido e quantificao da massa de
lignina precipitada. ............................................................................................ 146
Tabela 4.31 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a
remoo de nquel, ferro, cromo e silcio a partir do hidrolisado
hemicelulsico de bagao de malte, por adsoro nos carves ativados
preparados a partir da lignina............................................................................. 150
LISTA DE SIGLAS
C graus Celsius
beta
p pra
alfa
SUMRIO
1 INTRODUO 19
2 REVISO DA LITERATURA 21
3 MATERIAIS E MTODOS 40
4 RESULTADOS E DISCUSSO 68
5 CONCLUSES 152
REFERNCIAS 155
ANEXOS 172
ANEXO A Trabalhos que j foram publicados em peridicos cientficos a partir dos
resultados obtidos nesta tese. 172
ANEXO B Recomendaes para trabalhos futuros. 173
19
1 INTRODUO
Atualmente existe uma grande presso poltica e social no que diz respeito reduo da
carga poluente proveniente de atividades industriais. Esta uma preocupao dos rgos
ambientalistas no somente do Brasil, mas de pases do mundo todo. Praticamente todos os
pases, desenvolvidos ou em desenvolvimento, esto procurando se adaptar a esta realidade
modificando os seus processos de forma a reciclar ao mximo todo e qualquer resduo ou
subproduto produzido em suas estaes de processamento. Neste sentido, a maioria das
grandes empresas tem hoje uma viso onde os resduos e os subprodutos no devem mais ser
considerados inutilizveis, mas sim matrias-primas para outras indstrias. Seguindo este
raciocnio, alm de deixarem de ser problema, os resduos e os subprodutos passam a fazer
parte de novas tecnologias para desenvolvimento de produtos de interesse.
No processo de fabricao da cerveja, a gerao de subprodutos inevitvel, sendo o
bagao de malte, o lpulo gasto e a levedura, os mais produzidos. No entanto, como a maioria
destes subprodutos proveniente de matrias-primas agrcolas, eles podem ser reciclados e
reaproveitados. O presente trabalho teve como objetivo o aproveitamento integral do bagao
de malte em processos qumicos e biotecnolgicos. Inicialmente, a matria-prima foi
caracterizada quimicamente e em seguida foram avaliadas diversas condies de
fracionamento visando promover uma separao seletiva de todas as suas fraes polimricas
(celulose, hemicelulose e lignina). Nesta fase foram utilizados os procedimentos de hidrlise
cida (para separao da hemicelulose), hidrlise alcalina (para solubilizao da lignina) e
hidrlise enzimtica (para converso da celulose em glicose). Para cada um destes
procedimentos foi realizado um estudo de otimizao das condies de fracionamento,
empregando variveis previamente selecionadas. Os hidrolisados obtidos nas condies
otimizadas foram utilizados em processos qumicos e biotecnolgicos para produo de
compostos de interesse comercial, tais como: 1. xilitol, produzido por fermentao da xilose a
partir do hidrolisado hemicelulsico, pela levedura Candida guilliermondii; 2. cido lctico,
produzido por fermentao da glicose a partir do hidrolisado celulsico, pela bactria
Lactobacillus delbrueckii; 3. carvo ativado, produzido por ativao qumica da lignina
presente no licor alcalino. Foi tambm avaliada e otimizada a liberao de cidos fenlicos
durante a hidrlise alcalina da lignina, uma vez que estes compostos tambm apresentam
20
interesse comercial. Alm disso, foi ainda realizado um estudo sobre as caractersticas da
polpa de celulose obtida nas condies otimizadas, antes e aps o seu branqueamento com
perxido de hidrognio (tecnologia livre de cloro), para avaliar sua possibilidade de emprego
na produo de papel ou de derivados de celulose.
Este trabalho est inserido no programa de pesquisas do Grupo de Microbiologia
Aplicada e Bioprocessos do Departamento de Biotecnologia da Escola de Engenharia de
Lorena, que tem como objetivo o desenvolvimento de tecnologias para o aproveitamento de
resduos e subprodutos agrcolas e agro-industriais, visando a produo de insumos por via
biotecnolgica.
21
2 REVISO DA LITERATURA
Antes de ser utilizada no processo cervejeiro, a cevada obtida nos campos submetida a
um processo de maltagem, o qual serve para elevar o contedo enzimtico dos gros. No
entanto, a cevada recm colhida no pode ser diretamente malteada, pois ainda no apresenta
caractersticas adequadas de poder germinativo. Por este motivo, aps a colheita ela mantida
armazenada durante 4 a 6 semanas at atingir a plenitude de seu poder germinativo, o que
comprovado atravs de testes laboratoriais. Aps este tempo, a cevada j pode ser malteada
(TSCHOPE, 2001).
22
CEVADA
gua Macerao
(5 a 18C) / 48 h
PROCESSO DE
Germinao MALTAGEM
Secagem
Ar mido
(15 a 21C) / 6 a 7 dias
Armazenamento
MALTE DE CEVADA
Moagem
gua / Mosturao
aquecimento
Frao lquida PROCESSO
Filtrao CERVEJEIRO
Mosto
Frao slida
BAGAO DE MALTE
Embora sua composio qumica possa sofrer pequenas variaes, o bagao de malte
um material lignocelulsico rico em protenas e fibras, fraes que correspondem a
aproximadamente 20-30% e 70-80% de sua composio, respectivamente (HERNNDEZ et
al., 1999). A estrutura fibrosa deste material pode ser facilmente visualizada na Figura 2.4.
Hemicelulose, celulose e lignina so os principais componentes destas fibras (REINOLD,
1997). Alm de fibras e protenas, o bagao de malte tambm apresenta em sua composio,
lipdeos e cinzas (SANTOS et al., 2003), minerais, vitaminas e aminocidos (HUIGE, 1994).
De acordo com Kunze (1996), 25% dos minerais presentes no bagao de malte encontram-se
na forma de silicatos. Na Figura 2.4, os pontos brilhantes presentes na parte externa do
material correspondem a estes compostos. Nota-se, portanto a presena de grandes
quantidades de silicatos na estrutura do bagao de malte.
A B
Figura 2.4 - Microscopia eletrnica de varredura de partculas do bagao de malte. (A) Ampliao de
100 vezes; (B) Ampliao de 300 vezes.
25
ataque de bactrias e fungos. Por isso, para que se possa aproveitar integralmente o bagao de
malte, necessrio primeiramente submet-lo a tratamentos de fracionamento, capazes de
promover uma separao seletiva de seus componentes polimricos (celulose, hemicelulose e
lignina).
A separao dos principais componentes dos materiais lignocelulsicos pode ser
realizada atravs de diferentes tcnicas de fracionamento, as quais incluem tratamentos
trmicos, qumicos, fsicos, biolgicos, ou uma combinao entre estes. A escolha do
tratamento deve ser feita em funo do grau de separao requerido e da finalidade do
processo. No entanto, para que o processo seja economicamente vantajoso, o tratamento
empregado deve ser eficiente do ponto de vista energtico e qumico, e deve promover ou
proporcionar a converso efetiva do carboidrato de interesse, para que se obtenha um produto
final com alto rendimento. Logo, a degradao ou a perda de carboidratos deve ser evitada,
bem como a formao de compostos inibidores do metabolismo celular ou da ao de enzimas
usadas nos processos de converso da biomassa (McMILLAN, 1994).
Apesar de existirem vrios mtodos de tratamento, os processos de hidrlise com cido
diludo, hidrlise alcalina e hidrlise enzimtica so as tcnicas mais empregadas para
fracionamento dos materiais lignocelulsicos em geral.
A hidrlise com cido diludo um dos processos mais utilizados para separao da
hemicelulose (heteropolmero composto por pentoses e hexoses, cujo acar principal a
xilose) da biomassa lignocelulsica. Baseia-se em uma tcnica realizada normalmente em
temperaturas entre 120 e 200C, com a adio de pequenas quantidades de cidos minerais
como H2SO4 ou HCl (PALMQVIST; HAHN-HGERDAL, 2000).
Neste processo de hidrlise, o cido empregado libera prtons que rompem as ligaes
ter entre os acares existentes na cadeia polimrica formada pela hemicelulose e a celulose.
O rompimento destas ligaes promove a liberao de vrios compostos, principalmente
xilose, arabinose e glicose (AGUILAR et al., 2002). Segundo McMillan (1994) a hidrlise
completa da hemicelulose ocorre entre 5 a 10 minutos para uma temperatura de 160C, ou
entre 30 a 60 minutos para uma temperatura de 140C. Temperaturas mais elevadas (acima de
200C) favorecem a hidrlise da celulose. Devido estrutura ramificada das xilanas e ao seu
grau de cristalinidade ser inferior ao da celulose, as ligaes glicosdicas entre os monmeros
28
descrevem um alto grau de sinergismo durante a hidrlise da celulose (CAO; TAN, 2002; van
WYK, 1998).
P o lis s a c a r d e o s m e n o r e s
e n d o g lu c a n a se
lig a e s B (1 -4 )
CELULOSE
lig a e s B (1 -4 )
e x o g lu c a n a s e
lig a e s B (1 -4 )
g lu c o sid a se
C E L O B IO S E
G L IC O S E
Para que ocorra a hidrlise enzimtica da celulose necessrio primeiramente que haja
a difuso das enzimas no lquido e posterior transferncia destas para a superfcie do material,
formando ento o complexo enzima-celulose (CAO; TAN, 2002). A adsoro das enzimas na
superfcie da celulose caracteriza o primeiro estgio do processo de hidrlise, ocorrendo em
seguida a biodegradao da celulose em acares fermentveis e finalmente a dessoro da
celulase (SUN; CHENG, 2002). Durante o processo, as enzimas podem sofrer uma perda
progressiva de sua atividade cataltica, devido a fatores como: (a) inibio devido ao acmulo
do produto final de hidrlise no meio reacional (glicose e celobiose); (b) inativao ou
desnaturao devido ao efeito prolongado da temperatura e da agitao; (c) ocorrncia de uma
adsoro no especfica e/ou no produtiva de um ou mais componentes enzimticos sobre o
material (RAMOS; SADDLER, 1994). Alm disso, as variveis operacionais (pH, agitao,
temperatura, tempo de reao, concentrao de enzimas, concentrao de substrato) utilizadas
tambm podem interferir na eficincia do processo de hidrlise, inibindo ou acelerando a
velocidade da reao (KAYA; HEITMANN; JOYE, 2000). Segundo Aguiar e Menezes
(2002), a relao celulase/bagao apresentou grande influncia na hidrlise enzimtica do
32
2.3.1 Xilitol
Entretanto, a lignina pode ser utilizada como matria-prima para a obteno de vrios
produtos de interesse comercial, tais como carvo ativado, vanilina, fenis, benzeno,
fertilizantes, polmeros, agentes dispersantes, emulsificantes e quelantes, antioxidantes,
adesivos, entre outros (GARGULAK; LEBO, 2000). Normalmente a lignina isolada do licor
negro por precipitao com cido sulfrico ou clordrico, seguido por uma etapa de filtrao e
lavagem com gua para eliminao do lcali residual (SANTOS; CURVELO, 2001).
A lignina, por si s, j apresenta poder adsorvente com capacidade de remover corantes,
surfactantes, pesticidas, fenis e metais, tais como chumbo, cobre, zinco, cdmio, mercrio e
cromo. Porm, quando transformada em carvo ativado, sua capacidade de adsoro de
compostos aumentada. A transformao da lignina em carvo pode ser feita por ativao
fsica ou qumica. A ativao fsica um processo realizado em duas etapas onde o material
inicialmente carbonizado a 600-900C e em seguida ativado em presena de um gs oxidante
(por ex. CO2) a 600-1200C. Na ativao qumica, a lignina impregnada com um agente
qumico (H3PO4, KOH ou NaOH) e aquecida em atmosfera inerte a 450-900C, quando os
processos de carbonizao e ativao ocorrem simultaneamente (SUHAS; CARROTT;
RIBEIRO CARROTT, 2007). Segundo Guo e Rockstraw (2006), a ativao qumica mais
amplamente utilizada do que a ativao fsica, pois requer uma menor temperatura e
proporciona um maior rendimento do produto. Dentre os agentes qumicos que podem ser
empregados nesta tcnica, o cido fosfrico destaca-se como sendo o mais utilizado, devido a
questes econmicas e ambientais, uma vez que ele requer baixas temperaturas de ativao
(aprox. 400-500C) e pode ser recuperado ao final do processo (HSISIHENG; TIEN-SHENG;
LI-YEH, 1998; DIAO; WALAWENDER; FAN, 2002).
As caractersticas dos carves obtidos por ativao qumica da lignina, tais como rea
superficial e distribuio do tamanho dos poros (micro, meso e macroporos) interferem na sua
capacidade de adsoro e podem variar de acordo com as condies de temperatura, tempo de
carbonizao, tipo de agente qumico, relao agente/lignina e tempo de impregnao,
utilizadas no processo de ativao (SUHAS; CARROTT; RIBEIRO CARROTT, 2007).
(Figura 2.6). Tais compostos incluem a vanilina e uma srie de cidos fenlicos, dentre estes
os cidos ferlico, p-cumrico, p-hidroxibenzico, vanlico, sirngico, entre outros, os quais
apresentam uma srie de possveis aplicaes, podendo ser convertidos quimicamente a teres
de arila (usados como aditivo para gasolina), solventes e cidos orgnicos (FENGEL;
WEGENER, 1989) e por bioconverso, a vanilina (LESAGE-MEESEN et al., 1996).
O cido ferlico, por exemplo, considerado como um dos mais importantes cidos
fenlicos existentes, pois apresenta ao anti-oxidante, anti-inflamatria, anti-microbiana,
anti-trombose e anti-cncer (OU; KWOK, 2004). Devido a todas estas propriedades, ele tem
recebido grande ateno para aplicao nas indstrias farmacutica, cosmtica e alimentcia
(KROON; WILLIAMSON, 1999). O cido p-cumrico tambm outro cido fenlico de
grande interesse devido a suas propriedades anti-oxidantes (TORRES y TORRES;
ROSAZZA, 2001). Alm disso, ambos cidos podem ser utilizados como precursores para a
produo de compostos naturais aromticos de valor agregado.
38
3 MATERIAIS E MTODOS
Bagao de malte
Obteno / Caracterizao
Processo Fermentativo
Produo de
CIDO LCTICO
Figura 3.1 - Representao esquemtica do trabalho proposto para aproveitamento integral do bagao
de malte.
41
O bagao de malte (10% de umidade) foi caracterizado quanto aos teores de celulose,
hemicelulose e lignina, baseando-se nas metodologias descritas por Browning (1967) e Rocha
(2000). Aproximadamente 2 gramas de amostra do material foram transferidas para um
bquer de 50 ml e adicionou-se 10 ml de H2SO4 72% p/p. A reao foi mantida em banho
termostatizado a 45 1C, por 7 minutos, sob agitao constante. Aps esse tempo, a reao
foi interrompida pela adio de 50 ml de gua destilada e todo o contedo do bquer foi
transferido quantitativamente para um Erlenmeyer de 500 ml, onde o volume total de gua foi
elevado para 275 ml. Em seguida, o Erlenmeyer foi fechado com papel alumnio e
autoclavado a 1 atm, 120C, durante 45 minutos, para promover a hidrlise completa dos
oligmeros restantes. Aps autoclavagem, o frasco foi resfriado at temperatura ambiente e o
material slido foi separado da frao lquida por filtrao utilizando papel de filtro
previamente tarado. O hidrolisado foi recolhido em um balo volumtrico de 500 ml e o
slido contido no papel de filtro foi lavado com gua destilada at atingir o volume do balo.
A lignina retida no papel de filtro foi lavada ainda com cerca de 800 ml de gua destilada e
42
secada em estufa 105C at atingir peso constante. A relao entre o peso do resduo e o
peso inicial da amostra foi utilizada para determinar a porcentagem de lignina insolvel
presente no bagao de malte (equao 1). Uma alquota de aproximadamente 1 ml da frao
lquida obtida foi filtrada em filtro Sep Pak C18 e analisada por Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE) para determinao das concentraes de glicose, xilose e arabinose, as
quais foram utilizadas para o clculo da porcentagem de celulose e hemicelulose presente na
amostra (IRICK et al., 1988) de acordo com as equaes 2 e 3:
% hemicelulose = (Xil*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)+(Arab*5000*Fc*Fph)/(PA*PSA)
equao 3
onde: Fc = fator de converso (0,9 para a celulose e 0,88 para a hemicelulose); Fph = fator de
perda de hidrlise (1,055 para celulose e 1,155 para hemicelulose); Gli, Xil, Ara =
concentrao de glicose, xilose e arabinose, respectivamente (g/l); PA = peso inicial da
amostra (g); PR = peso do resduo de lignina (g); PSA = peso seco da amostra (%).
onde: Ahid280 = absorbncia do hidrolisado a 280 nm; Cfurf e CHMF = concentrao de furfural e
hidroximetilfurfural, respectivamente, no hidrolisado (g/l); Efurf = absortividade do furfural
(146,85 l/g.cm); EHMF = absortividade do hidroximetilfurfural (114 l/g.cm).
O teor de protenas foi determinado como o contedo total de nitrognio pelo mtodo
Kjeldahl, utilizando o fator de correo N 6,25.
Tabela 3.1 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de hidrlise cida do
bagao de malte, em autoclave, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
YS = (C*V/M)*100 equao 7
= (YS/Ymx)*100 equao 8
acordo com o planejamento experimental apresentado na Tabela 3.2. O tempo necessrio para
aquecimento dos reatores at 120C foi de aproximadamente 1,5 h, sendo que um tempo
similar a este tambm foi necessrio para o posterior resfriamento dos reatores at
temperatura ambiente.
Ao trmino das hidrlises, os materiais slidos residuais foram separados por filtrao e
os hidrolisados obtidos foram caracterizados quanto concentrao de acares (xilose,
arabinose e glicose), cido actico, furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel. O
rendimento em acares recuperados e a eficincia de hidrlise para cada condio avaliada
foram calculados conforme descrito no item 3.1.6. A anlise dos resultados obtidos e
otimizao da melhor condio de hidrlise foram realizadas atravs do emprego da
metodologia estatstica de superfcie de resposta, utilizando o programa Statistica verso 5.0.
Tabela 3.2 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise cida do
bagao de malte, em reator, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
Tabela 3.3 - Composio do meio semidefinido utilizado para crescimento do inculo da levedura
Candida guilliermondii.
Componente Concentrao (g/l)
Xilose 20,0
Sulfato de amnio 3,0
Cloreto de clcio 0,1
Extrato de farelo de arroz 20,0*
* valor em % p/v
Hidrolisado original
Ajuste do pH para 6,5
Concentrao (4 vezes)
Hidrolisado
Suplementao com
Ajuste do pH para 6,5
acares (xilose, glicose e
arabinose) at uma
Hidrolisado concentrao 4 vezes maior
do que no hidrolisado
concentrado (HC) diludo e posterior ajuste do
pH para 6,5
Tratamento com carvo
ativado e posterior ajuste
do pH para 6,5 Hidrolisado diludo
suplementado (HDS)
Hidrolisado concen-
trado tratado (HCT)
Hidrolisado
concentrado, diludo e
suplementado (HCDS)
Figura 3.3 - Representao esquemtica dos procedimentos utilizados para preparo dos meios de
fermentao a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte.
51
O pH dos hidrolisados foi ajustado para 6,5 pela adio de NaOH (pastilhas) e o
precipitado formado foi removido por centrifugao (1100 g, 20 minutos). O tratamento do
hidrolisado com carvo ativado consistiu na adio de 2,5 g de carvo/100 g de hidrolisado
em pH 2,0, a 150 rpm, 45C durante 60 minutos. Os cinco meios de fermentao obtidos
foram analisados por CLAE para determinao da concentrao de acares, cido actico,
furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenlicos.
As fermentaes foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 250 ml contendo 100 ml
de meio de fermentao inoculado com uma concentrao celular inicial de 1 g/l. Os frascos
foram incubados em agitador rotatrio (Tecnal TE-420) a 200 rpm, 30C durante 30 h (HD)
ou 96 h (HDS, HC, HCT e HCDS). Durante as fermentaes foram retiradas amostras para
determinao do crescimento celular, consumo de glicose, xilose e arabinose e produo de
xilitol.
O resduo do bagao de malte obtido aps a etapa de hidrlise cida nas condies de
100 mg H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos, foi
submetido a um processo de hidrlise alcalina empregando hidrxido de sdio como agente
qumico. As reaes foram realizadas em ampolas de ao inoxidvel de 200 ml de capacidade
total, mantendo uma relao slido:lquido de 1:20 g:g, porm, empregando vrias
combinaes entre as variveis temperatura, tempo de reao e concentrao de NaOH, de
acordo com o planejamento fatorial completo 23 apresentado na Tabela 3.4. Aps serem
preenchidas com o bagao de malte e a soluo de NaOH, as ampolas foram devidamente
fechadas e introduzidas em um banho com leo de silicone, onde foram mantidas durante o
tempo desejado. Ao trmino de cada reao, as ampolas foram retiradas do banho de silicone
e imediatamente resfriadas em um banho de gelo. Os licores obtidos, contendo a lignina
solvel, foram separados do resduo slido por filtrao em tecido 100% polister e
caracterizados quanto concentrao de cidos fenlicos (ferlico, p-cumrico, sirngico,
vanlico e p-hidroxibenzico). Os resduos slidos obtidos (polpa celulsica) foram lavados
52
Tabela 3.4 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise alcalina do
resduo do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
Nestes experimentos foi utilizada a polpa celulsica do bagao de malte obtida aps
pr-tratamento do material por uma seqncia de hidrlises cida (empregando 100 mg
H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos) e alcalina
(empregando uma soluo de NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por
90 minutos). Os processos de hidrlise foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1 e
3.5. Para a hidrlise alcalina, foram empregadas ampolas de ao inoxidvel de 500 ml de
53
Figura 3.4 - Banho termostatizado com leo de silicone, utilizado para a hidrlise alcalina do bagao
de malte.
3.6.1 Enzima
Tabela 3.5 - Planejamento fatorial completo 23 para avaliao do processo de hidrlise enzimtica da
celulose da polpa do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
alcalina: soluo de NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos;
3. hidrlise enzimtica: concentrao de substrato de 8% p/v, 45 FPU/g, 100 rpm, 45C por 96
h. Estes processos foram realizados conforme descrito nos itens 3.2.1, 3.5 e 3.6.2,
respectivamente. A atividade celuloltica total do extrato enzimtico comercial, Celluclast
1.5L (Novozymes), utilizado nestes experimentos de hidrlise enzimtica foi de 98 FPU/ml.
Nesta etapa do trabalho foram obtidas duas polpas de celulose, uma a partir do bagao
de malte original e outra a partir do bagao de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo
nas condies de 100 mg H2SO4/g de matria seca, relao slido:lquido de 1:8 g:g, 120C
por 17 minutos, conforme descrito no item 3.2.1. As condies utilizadas para obteno da
polpa de celulose a partir destes materiais basearam-se no uso de uma soluo de NaOH
2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos, conforme metodologia
descrita no item 3.5.
59
O licor utilizado nestes experimentos foi obtido a partir da hidrlise alcalina do bagao
de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo (100 mg H2SO4/g de matria seca, relao
slido:lquido de 1:8 g:g, 120C por 17 minutos, conforme metodologia descrita no item
3.2.1). As condies utilizadas para hidrlise alcalina basearam-se no uso de uma soluo de
NaOH 2% p/v, relao slido:lquido de 1:20 g:g, 120C por 90 minutos, conforme
metodologia descrita no item 3.5.
60
A lignina seca, recuperada a partir do licor alcalino por precipitao pela adio de
cido sulfrico at pH 2,15, foi macerada e passada por uma peneira de 170 mesh. Apenas as
partculas que passaram por esta peneira (<88 m) foram utilizadas para a produo de
carvo. O processo de ativao da lignina foi realizado empregando diferentes temperaturas
de carbonizao e relaes entre H3PO4/lignina, de acordo com o planejamento fatorial
completo 22 apresentado na Tabela 3.6. A lignina foi inicialmente impregnada com cido
fosfrico (85% p/p) na proporo de 1 a 3 g H3PO4/g lignina e mantida em temperatura
ambiente durante 1 h. Aps este tempo a mistura foi acondicionada em uma mufla onde foi
mantida a 100C durante 1 h. Em seguida a temperatura da mufla foi aumentada at a
temperatura de carbonizao desejada, sendo mantida durante 2 h. Os carves ativados
obtidos foram lavados com gua milli Q a 60C, durante 48 h, at apresentarem pH neutro.
61
Em seguida, estes foram secados em estufa a 105C durante 2,5 h, para perder a umidade.
Os carves obtidos nas diferentes condies de ativao foram utilizados para
destoxificao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte. A concentrao de metais
(nquel, clcio, magnsio, zinco, ferro, cromo, alumnio e silcio) e compostos fenlicos no
hidrolisado antes e aps o tratamento, foi determinada para poder calcular a eficincia de cada
carvo na remoo destes compostos. A cor dos hidrolisados antes e aps os tratamentos
tambm foi determinada. Uma anlise estatstica dos resultados foi realizada empregando o
programa Statistica verso 5.0.
Tabela 3.6 - Planejamento fatorial completo 22 para avaliao do processo de produo de carvo
ativado a partir da lignina do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis originais das variveis Nveis codificados das variveis
1 1 300 -1 -1
2 3 300 +1 -1
3 1 600 -1 +1
4 3 600 +1 +1
5 2 450 0 0
6 2 450 0 0
As concentraes dos metais, nquel, clcio, magnsio, zinco, ferro, cromo, alumnio e
silcio foram determinados por espectrometria de absoro atmica por chama, em um
equipamento PerkinElmer modelo Analyst 800. Para as determinaes, 1 ml da amostra foi
transferido para um bquer de vidro contendo 5 ml de gua (Millipore 18,2 m.cm), o qual
foi colocado em uma chapa com aquecimento. Durante o aquecimento da amostra, foi
adicionado 2 a 3 ml de uma mistura cida de HNO3:HCl, para digerir os acares formando
CO2 e H2O. O tempo de digesto foi de 3 a 4 h ou at que fosse notada mudana da cor
inicial. Aps a digesto, a amostra foi resfriada e transferida quantitativamente para um balo
volumtrico, onde o volume foi completado com gua (Millipore 18,2 m.cm). A diluio foi
feita em funo da concentrao da amostra e da sensibilidade do aparelho.
3.10.4 Determinao do pH
Para determinao da cor, o pH das amostras do hidrolisado foi ajustado para 5,5, pela
adio de NaOH 6N. Em seguida as amostras foram centrifugadas (4330 g, 10 minutos),
filtradas em membrana HSWP com poros de 0,45 m (Millipore) e diludas em gua destilada
tambm com o pH ajustado para 5,5. As solues obtidas foram analisadas em
espectrofotmetro (Beckman DU 640B) em um comprimento de onda de 440 nm. Nesta
anlise, o valor zero foi atribudo gua destilada, e a diferena entre as leituras foi calculada
como porcentagem de remoo de cor.
O fator de converso de xilose em xilitol (YP/S, g/g) foi calculado pela relao entre a
concentrao de xilitol formado (g/l) e a concentrao de xilose consumida (g/l). O fator de
converso de substrato em clulas (YX/S, g/g) foi calculado pela relao entre a concentrao
de clulas formadas (g/l) e a concentrao de substrato (glicose + xilose) consumido (g/l). O
fator de rendimento de xilitol por clula (YP/X, g/g) foi determinado pela relao entre a
concentrao de xilitol formado (g/l) e a concentrao de clulas presentes no meio de
fermentao (g/l). A produtividade volumtrica em xilitol (QP, g/l.h) foi calculada pela
relao entre a concentrao de xilitol formado (g/l) e o tempo de fermentao (h). O
coeficiente volumtrico de consumo de xilose (QS, g/l.h) foi calculado pela relao entre a
concentrao de xilose consumida (g/l) e o tempo de fermentao (h). A eficincia de
produo de xilitol (, %) foi calculada pela relao entre os valores de YP/S obtido (g/g) e o
valor mximo terico para este parmetro (0,917 g/g) de acordo com Barbosa et al. (1988).
O fator de converso de glicose em cido lctico (YP/S, g/g) foi calculado pela relao
entre a concentrao de cido lctico formado (g/l) e a concentrao de glicose consumida
(g/l). A produtividade volumtrica em cido lctico (QP, g/l.h) foi calculada pela relao entre
a concentrao de cido lctico formado (g/l) e o tempo de fermentao (h). O fator de
rendimento de cido lctico por clula (YP/X, g/g) foi determinado pela relao entre a
concentrao de cido lctico formado (g/l) e a concentrao de clulas presentes no meio de
fermentao (g/l). O rendimento mximo terico para a produo de cido lctico de 1 g/g
(para microrganismos homofermentativos).
onde: P = volume de KMnO4 que reagiu (ml); a = volume de Na2S2O3 consumido pela
amostra (ml); b = volume de Na2S2O3 consumido pelo branco (ml); f = fator de correo
determinado para cada P (TAPPI, 1985); N = normalidade da soluo de Na2S2O3; T =
temperatura da anlise (oC); W = massa da polpa seca (g); k = nmero kappa.
atingido o equilbrio trmico, a soluo foi aspirada e o tempo de escoamento foi medido
conforme descrito anteriormente. A viscosidade da polpa foi determinada pela equao 14:
V = kv*t*d Equao 14
A alvura das polpas foi determinada de acordo com a norma Tappi (1991). Para
determinao da alvura, foram preparados corpos de prova seguindo a norma Tappi T-218 sp-
97. Cerca de 4 g de polpa (base seca) foram suspensas em 1300 ml de gua destilada e a
suspenso obtida foi agitada durante 5 min, sendo posteriormente vertida em um funil de
Bchner de 70 mm de dimetro e filtrada a vcuo. Aps filtrao, o funil foi invertido e a
polpa foi liberada atravs da passagem de um fluxo de ar. A folha de prova assim formada foi
ento prensada e colocada para secar em ambiente protegido da luz. Aps um dia, as folhas,
com gramatura de 0,09 g/cm2, tiveram a porcentagem de reflexo em 457 nm determinada em
um aparelho Photovolt modelo 577. A porcentagem de reflexo foi determinada em trs
pontos diferentes das polpas e os resultados foram apresentados como mdia destas medidas.
A gramatura, ou seja, a massa por unidade de rea do papel, foi calculada atravs da equao
15, onde g = gramatura (g/cm2), m = massa do corpo de prova (g) e A = rea do corpo de
prova (cm2).
g = (m/A)*104 Equao 15
3.10.16 Fotomicrografias
4 RESULTADOS E DISCUSSO
Aps obteno, o bagao de malte foi lavado com gua para remover os acares
residuais provenientes do mosto, e secado at atingir 10% de umidade. Este procedimento foi
realizado para poder manter as caractersticas do material durante a estocagem, uma vez que,
o bagao de malte procedente do mosto cervejeiro contm acares fermentveis e apresenta
um teor de umidade de aproximadamente 80%, o que favorece sua deteriorao. A secagem
da matria-prima tambm interessante em termos de reduo de volume e diminuio dos
custos de armazenamento.
A composio qumica do bagao de malte utilizado neste trabalho est apresentada na
Tabela 4.1, onde os valores esto expressos como porcentagem em peso seco de celulose
(glucana), hemicelulose (xilana + arabinana), lignina total (Klason + solvel em cido), cinzas
grupos acetil, protenas, e extrativos. Observa-se que o bagao de malte produzido a partir de
100% malte de cevada um material lignocelulsico composto principalmente por (% p/p):
hemicelulose (28,42), lignina (27,78), celulose (16,78) e protenas (15,25). A estrutura
hemicelulsica formada pelos polissacardeos xilana e arabinana em uma proporo de
2,3:1. Embora o teor de arabinana no bagao de malte seja elevado, xilana e glucana so os
principais polissacardeos presentes neste material, assim como em outros resduos agrcolas.
Por outro lado, o bagao de malte apresenta um alto teor de lignina (27,78 % p/p) que o
diferencia da maioria dos resduos agrcolas. Bagao de cana-de-acar, palha de arroz e
palha da cevada, por exemplo, apresentam teores de lignina de 18,10, 17,20 e 15,80 % p/p,
respectivamente (ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; SUN et al., 2004, 2005).
O teor de protenas no bagao de malte (15,25 % p/p) tambm maior do que os teores
encontrados em outros materiais lignocelulsicos, tais como as palhas de cevada, aveia, arroz
e trigo, as quais contm entre 3,0 a 5,0 % p/p de protenas (THEANDER; AMAN, 1984). Os
aminocidos ligados s protenas no foram determinados no presente trabalho, mas alguns
69
autores relataram que o bagao contm os aminocidos: leucina, valina, alanina, serina,
glicina, cido glutmico, cido asprtico, tirosina, prolina, treonina, arginina, lisina, cistina,
histidina, isoleucina, metionina, fenilalanina, e triptofano (HUIGE, 1994; MARIANI, 1953).
Minerais (mg/kg)
Clcio 3515,0
Sdio 309,3
Potssio 258,1
Magnsio 1958,0
Alumnio 36,0
Ferro 193,4
Brio 13,6
Estrncio 12,7
Mangans 51,4
Cobre 18,0
Zinco 178,0
Fsforo 5186,0
Enxofre 1980,0
Cromo 5,9
Silcio 10740,0
Estes ensaios foram propostos para se ter uma avaliao preliminar do comportamento
da reao do bagao de malte em meio cido sulfrico, visando recuperar os acares da
frao hemicelulsica. Nesta etapa, foi utilizado um planejamento fatorial completo 22 para
avaliar a influncia das variveis relao slido:lquido e concentrao de cido sulfrico, na
hidrlise do bagao de malte. As faixas de valores das variveis utilizadas foram selecionadas
de acordo com trabalhos da literatura que utilizaram valores similares para hidrlise cida de
outros materiais lignocelulsicos (AGUILAR et al., 2002; ROBERTO; MUSSATTO;
RODRIGUES, 2003; TLLEZ-LUIS; RAMREZ; VZQUEZ, 2002).
Os hidrolisados obtidos nas diferentes condies de hidrlise foram analisados para
determinao da concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de
degradao (furfural, hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico. Os resultados
obtidos esto apresentados na Tabela 4.2. Nota-se que a concentrao destes compostos nos
hidrolisados variou para cada condio de hidrlise empregada. Todos os hidrolisados
continham xilose e arabinose em concentraes muito mais elevadas que a de glicose, sendo
que as mximas concentraes destes acares (obtidas no ensaio 3) corresponderam a 13,21
e 8,21 g/l, respectivamente, enquanto que a mais alta concentrao de glicose (tambm obtida
71
no ensaio 3) correspondeu a apenas 0,32 g/l. Estes resultados sugerem que as condies de
hidrlise utilizadas foram capazes de hidrolisar apenas a frao hemicelulsica do material,
sem interferir praticamente na estrutura da celulose, que teria permanecido inalterada.
Tabela 4.2 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradao (furfural,
hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico nos hidrolisados hemicelulsicos de
bagao de malte obtidos em autoclave sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa Respostas (g/l)
De acordo com Lee et al. (1978), durante o processo de hidrlise cida a hemicelulose
hidrolisada mais rapidamente do que a celulose; e quando a reao conduzida em condies
que favorecem a hidrlise da celulose, a maior parte da xilose degradada a furfural, sendo
ento muito pouco recuperada. No presente trabalho, as condies de hidrlise utilizadas
praticamente no hidrolisaram a celulose e tambm no favoreceram a formao de furfural e
hidroximetilfurfural (subprodutos provenientes da degradao de pentoses e hexoses,
respectivamente), uma vez que estes compostos estavam presentes nos hidrolisados em
concentraes muito baixas (<0,13 g/l, Tabela 4.2). Estes resultados mostram, portanto, que
para todas as condies de hidrlise estudadas, apenas pequenas quantidades de acares
foram degradadas. As concentraes de furfural e hidroximetilfurfural obtidas foram inclusive
menores do que os valores encontrados em hidrolisados cido diludos produzidos a partir de
outras matrias-primas lignocelulsicas, tais como silagem, gramneas, bagao de cana-de-
acar, palhas de arroz e de sorgo e madeiras (AGUILAR et al., 2002; KIM; YUM; PARK,
2000; NEUREITER et al., 2004; ROBERTO; MUSSATTO; RODRIGUES, 2003; TLLEZ-
LUIS; RAMREZ; VZQUEZ, 2002).
Durante a hidrlise cida do bagao de malte, os grupos acetil ligados estrutura da
xilana tambm foram liberados no meio reacional, uma vez que foi verificada a presena de
72
cido actico em todos os hidrolisados obtidos (Tabela 4.2). Porm, este composto tambm
estava presente em baixas concentraes nos hidrolisados, variando de 0,08 a 0,6 g/l. A
hidrlise cida foi ainda capaz de solubilizar parte da estrutura da lignina do bagao de malte,
sendo que a lignina solvel foi o subproduto obtido em maior concentrao nos hidrolisados
(variando de 2,05 a 3,79 g/l, Tabela 4.2). A escolha de uma condio de hidrlise que
minimize a formao destes compostos de grande interesse, pois favoreceria o emprego do
hidrolisado em processos de bioconverso uma vez que a lignina solvel composta
principalmente por compostos fenlicos, os quais so extremamente txicos para os
microrganismos (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
p=0,05
p=,05 p=0,05
(A) (B)
0 1 2 3 4 0 2 4 6 8 10 12
Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos
p=0,05 p=0,05
(C) (D)
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8
Estimativa dos efeitos Estimativa dos efeitos
Figura 4.1 - Grficos de Pareto para estimativa dos efeitos das variveis: (1) relao slido:lquido, (2)
concentrao de cido sulfrico e (12) a interao entre elas, nas respostas: eficincia de
hidrlise da arabinana (A), eficincia de hidrlise da xilana (B), eficincia de hidrlise da
hemicelulose (xilana + arabinana) (C) e concentrao de lignina solvel (D), obtidas nos
processos de hidrlise cida do bagao de malte em autoclave. Efeitos acima da linha de
p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana.
74
slido:lquido de 1:10 g:g e uma concentrao de cido sulfrico de 120 mg/g de matria
seca. Entretanto, os valores de eficincia obtidos com o uso destas condies de hidrlise
(67% para a xilana e 76,2% para a hemicelulose, ensaio 3) revelam que as condies de
hidrlise cida do bagao de malte ainda precisam ser otimizadas de forma a aumentar a
recuperao dos acares da frao hemicelulsica, principalmente xilose. Observando o
cromatograma obtido para esta condio de hidrlise (Figura 4.2), nota-se a existncia de
picos entre os tempos de reteno de 6,5 a 8 minutos, sugerindo a presena de oligmeros no
hidrolisado. De acordo com alguns autores, a hemicelulose apresenta duas fraes de xilana
com diferentes suscetibilidades hidrlise, sendo que uma reage mais rapidamente do que a
outra. A frao que mais facilmente hidrolisada com cidos diludos corresponde a 60-80%
do total enquanto que os restantes 20-40% correspondem a uma frao mais difcil de ser
hidrolisada (GARROTE; DOMNGUEZ; PARAJ, 2002; KIM; YUM; PARK, 2002;
LAVARACK; GRIFFIN; RODMAN, 2002).
arabinose - 10.486
1400.00
xilose - 9.517
1200.00
1000.00
800.00
MV
600.00
glicose - 8.863
400.00
12.046
200.00
0.00
1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 14.00
Minutes
Figura 4.2 - Cromatograma do hidrolisado obtido em autoclave, nas condies de relao slido
lquido de 1:10 g:g e 120 mg de cido/g de matria seca.
discutido na seo anterior. Estes ensaios foram realizados de acordo com um planejamento
fatorial completo 23 para avaliar o efeito das variveis relao slido:lquido, concentrao de
cido sulfrico e tambm do tempo de reao, nas respostas de eficincia de hidrlise da
xilana, da arabinana e da hemicelulose (xilana + arabinana) e na fermentabilidade dos
hidrolisados obtidos para a produo de xilitol.
Tabela 4.4 - Concentrao de acares (glicose, xilose e arabinose), produtos de degradao (furfural,
hidroximetilfurfural e lignina solvel) e cido actico nos hidrolisados hemicelulsicos
de bagao de malte obtidos em reator sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa Concentrao (g/l)b
Tabela 4.6 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a concentrao de
lignina solubilizada durante a hidrlise cida do bagao de malte.
Variveis independentes e EE E t
interaes
Mdia 2,819 0,083 33,92*
Curvatura 0,957 0,288 3,33*
X1 -0,712 0,166 4,29*
X2 -0,542 0,166 3,26*
X3 -0,517 0,166 3,11*
X1X2 0,547 0,166 3,29*
X1X3 0,052 0,166 0,32
X2X3 0,182 0,166 1,10
* valores significativos ao nvel de 95% de confiana.
X1 = relao slido:lquido; X2 = concentrao de cido sulfrico; X3 = tempo de reao.
Tabela 4.7 - Consumo de xilose, crescimento celular e produo de xilitol nos hidrolisados de bagao
de malte produzidos em reator, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Nveis das variveis Resultados dos processos fermentativosb
utilizadas na hidrlisea
(g:g) (mg/g) (min) (g/l) (%) (g/l) (g/l) (g/g) (g/l.h) (g/g)
1 1:8 100 17 21,88 78,7 3,86 10,76 0,70 0,45 0,23
2 1:12 100 17 14,28 89,3 3,97 6,30 0,46 0,26 0,28
3 1:8 140 17 21,44 75,2 3,65 9,28 0,53 0,39 0,19
4 1:12 140 17 15,11 86,1 3,61 6,98 0,50 0,29 0,24
5 1:8 100 37 20,96 82,5 4,15 9,07 0,50 0,38 0,21
6 1:12 100 37 14,36 94,5 4,51 5,32 0,38 0,22 0,31
7 1:8 140 37 22,62 67,0 3,18 9,08 0,55 0,38 0,17
8 1:12 140 37 15,48 87,2 3,98 6,43 0,43 0,27 0,24
9 1:10 120 27 18,16 79,1 3,27 7,87 0,55 0,33 0,21
10 1:10 120 27 17,69 88,1 4,46 8,05 0,51 0,33 0,26
11 1:10 120 27 17,60 88,1 4,28 7,76 0,48 0,32 0,24
12 1:10 120 27 16,94 96,9 4,57 7,45 0,41 0,31 0,24
a
S:L = relao slido:lquido; A = concentrao de cido sulfrico; T = tempo de reao.
b
So = concentrao inicial de xilose; Scons = porcentagem de xilose consumida; X = concentrao
celular; P = concentrao de xilitol; YP/S (g/g) = fator de rendimento em xilitol (gramas de xilitol
produzido/ gramas de xilose consumida); Qp (g/l.h) = produtividade volumtrica em xilitol
(concentrao de xilitol formado/ tempo de fermentao); YX/S (g/g) = fator de rendimento em clulas
(gramas de clulas formadas/ gramas de substrato (xilose + glicose) consumido).
O crescimento celular variou de 3,18 a 4,57 g/l, enquanto que a produo de xilitol
variou significativamente, de 5,32 a 10,76 g/l, dependendo do hidrolisado utilizado (Tabela
4.7). Como a produo de xilitol tende a aumentar com o aumento da concentrao inicial de
xilose (MUSSATTO; ROBERTO, 2003; PARAJ; DOMINGUEZ; DOMINGUEZ, 1995)
estes resultados devem ser comparados em termos dos parmetros fermentativos YP/S, QP e
YX/S. De uma forma geral, quando comparado com a fermentao de hidrolisados produzidos
a partir de outras matrias-primas lignocelulsicas, todos os hidrolisados obtidos a partir do
bagao de malte apresentaram boa fermentabilidade. Paraj, Dominguez e Dominguez (1995)
obtiveram um YP/S de 0,38 g/g e QP de 0,055 g/l.h durante a fermentao do hidrolisado de
madeira contendo 17 g/l de xilose, suplementado com nutrientes. Cruz et al. (2000)
conseguiram atingir um YP/S de 0,66 g/g e QP de 0,41 g/l.h durante a fermentao do
hidrolisado de farelo de cevada suplementado ou no com nutrientes. No presente trabalho,
valores de YP/S e QP de at 0,70 g/g e 0,45 g/l.h, respectivamente, foram obtidos a partir do
hidrolisado de bagao de malte contendo 21,9 g/l de xilose, no suplementado com nutrientes.
82
Tabela 4.8 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator de
rendimento (YP/S) e produtividade volumtrica em xilitol (QP) obtidos durante a
fermentao do hidrolisado de bagao de malte.
Variveis YP/S (g/g) QP (g/l.h)
independentes e
interaes EE E t EE E t
Mdia 0,506 0,022 22,65* 0,330 0,004 85,65*
Curvatura -0,037 0,077 0,48 -0,015 0,013 1,12
X1 -0,127 0,045 2,85* -0,140 0,008 18,17*
X2 -0,007 0,045 0,17 0,005 0,008 0,65
X3 -0,082 0,045 1,84 -0,035 0,008 4,54*
X1X2 0,052 0,045 1,17 0,035 0,008 4,54*
X1X3 0,007 0,045 0,17 0,005 0,008 0,65
X2X3 0,057 0,045 1,29 0,020 0,008 2,59*
* valores significativos ao nvel de 90% de confiana.
X1 = relao slido:lquido; X2 = concentrao de cido sulfrico; X3 = tempo de reao.
O fator de rendimento em clulas, YX/S, tambm foi avaliado durante a fermentao dos
hidrolisados de bagao de malte e apresentou diferenas significativas em funo do meio
utilizado (Tabela 4.7). A anlise estatstica para esta resposta revelou que os valores de YX/S
foram afetados principalmente pela relao slido:lquido e pela concentrao de cido,
variveis que apresentaram efeitos positivo e negativo, respectivamente (Tabela 4.9). Isto
significa que os valores de YX/S foram favorecidos em hidrolisados produzidos com a mais
alta relao slido:lquido e a mais baixa concentrao de cido.
Tabela 4.9 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para o fator de
rendimento em clulas (YX/S) obtido durante a fermentao do hidrolisado de bagao de
malte.
Variveis YX/S (g/g)
independentes e
interaes EE E t
Mdia 0,234 0,006 35,50*
Curvatura 0,007 0,023 0,33
X1 0,067 0,013 5,12*
X2 -0,047 0,013 3,61*
X3 -0,002 0,013 0,19
X1X2 -0,007 0,013 0,57
X1X3 0,017 0,013 1,33
X2X3 -0,007 0,013 0,57
* valores significativos ao nvel de 90% de confiana.
X1 = relao slido:lquido; X2 = concentrao de cido sulfrico; X3 = tempo de reao.
84
De uma forma geral, a anlise estatstica dos parmetros fermentativos revelou que os
hidrolisados de bagao de malte produzidos a partir de uma baixa relao slido:lquido,
favoreceram a formao de produto (os valores de YP/S foram aumentados); enquanto que
aqueles obtidos a partir de uma alta relao slido:lquido favoreceram o crescimento celular
(os valores de YX/S foram aumentados). Em outras palavras, com o aumento na relao
slido:lquido foram produzidos hidrolisados que proporcionaram um desvio no metabolismo
microbiano, da formao de produto para o crescimento celular.
Com base nos resultados da anlise estatstica, a melhor condio para hidrlise do
bagao de malte com cido sulfrico diludo foi estabelecida como sendo baseada no uso de
uma relao slido:lquido de 1:8 g:g, 100 mg de cido sulfrico/g de matria seca e um
tempo de reao de 17 minutos. Vale a pena ressaltar que, alm de proporcionar os melhores
resultados, esta condio foi tambm a mais economicamente vivel dentre todas as que
foram avaliadas, uma vez que necessitou de uma menor quantidade de cido e um tempo de
reao mais curto, requerendo, portanto, um menor consumo de energia.
O hidrolisado de bagao de malte utilizado nesta etapa foi produzido nas condies de
hidrlise previamente otimizadas. A composio qumica deste hidrolisado na forma original
(diludo) e concentrado, est apresentada na Tabela 4.10. Nota-se que durante a etapa de
concentrao do hidrolisado, o teor dos acares foi aumentado proporcionalmente ao fator de
concentrao utilizado (aproximadamente 4 vezes), mostrando que no houve degradao de
acares durante a realizao deste processo. As concentraes de cido actico e compostos
fenlicos tambm foram aumentadas, mas no proporcionalmente ao fator de concentrao
empregado, sugerindo que estes compostos podem ter sido parcialmente volatilizados ou
degradados durante a etapa de concentrao do hidrolisado. O mesmo pode ter ocorrido para o
hidroximetilfurfural, cujo teor no hidrolisado no foi alterado aps o processo de
concentrao. Por outro lado, o teor de furfural foi diminudo significativamente, o que
justificvel uma vez que este composto voltil a 70C sob vcuo (PERRY; GREEN, 1997).
Tabela 4.10 - Composio qumica do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte nas formas
diluda (original) e concentrada.
Componentes Concentrao no hidrolisado de bagao de malte (g/l)
Diludo Concentrado
Glicose 1,51 6,08
Xilose 22,97 88,62
Arabinose 10,24 40,70
cido actico 1,25 3,83
Furfural 0,66 0,01
Hidroximetilfurfural 0,10 0,10
Compostos fenlicos 4,01 10,38
5
Clulas (g/l)
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo de fermentao (h)
MSD diludo hidrolisado diludo
MSD concentrado hidrolisado concentrado
Tabela 4.11 - Parmetros fermentativos obtidos durante o cultivo da levedura Candida guilliermondii
em hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte e em meio semidefinido.
Meio de fermentaoa Parmetros fermentativosb
YX/S YP/X YP/S QP QS
(g/g) (g/g) (g/g) (g/l.h) (g/l.h) (%)
Semidefinido diludo 0,14 2,59 0,54 0,37 0,68 58,9
Hidrolisado diludo 0,20 2,34 0,65 0,38 0,62 70,9
Semidefinido concentrado 0,05 10,21 0,76 0,66 1,08 82,9
Hidrolisado concentrado 0,10 2,28 0,37 0,13 0,38 40,3
a
Meios diludos: 20 g/l de xilose; Meios concentrados: 85 g/l de xilose.
b
YX/S = fator de converso de substrato (xilose + glicose) em clulas; YP/X = fator de rendimento de
xilitol por massa celular; YP/S = fator de rendimento de xilitol por xilose consumida; QP =
produtividade volumtrica em xilitol; QS = velocidade especfica de consumo de xilose; = eficincia
de produo de xilitol (% do valor mximo terico = 0,917 g/g).
90
80
70
60
Xilose (g/l)
50
40
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo de fermentao (h)
MSD diludo hidrolisado diludo
MSD concentrado hidrolisado concentrado
Figura 4.4 - Consumo de xilose pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diludo)
ou 85 g/l de xilose (concentrado).
88
60
50
40
Xilitol (g/l)
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Tempo de fermentao (h)
MSD diludo hidrolisado diludo
MSD concentrado hidrolisado concentrado
Figura 4.5 - Produo de xilitol pela levedura Candida guilliermondii em hidrolisado hemicelulsico
de bagao de malte e em meio semidefinido (MSD), contendo 20 g/l de xilose (diludo)
ou 85 g/l de xilose (concentrado).
sido esgotada. No meio que no continha arabinose, a levedura consumiu xilitol ao trmino da
xilose. Este fato explica a diferena observada na concentrao de xilitol obtida ao final das
fermentaes (Figura 4.6). Apesar de no ter sido consumida pela levedura durante a
fermentao de xilose, a presena de arabinose no meio de fermentao no interferiu no
crescimento celular, consumo de xilose e na produo de xilitol, conforme pode ser observado
na Figura 4.6.
90 7
75 6
60
Xilose e Xilitol (g/l)
Clulas (g/l)
45 4
30 3
15
2
0
1
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 4.6 - Desempenho da levedura Candida guilliermondii em meio semidefinido preparado com
(smbolos abertos) ou sem (smbolos fechados) arabinose. Crescimento celular (, ),
consumo de xilose (, ) e produo de xilitol (, ).
Tabela 4.12 - Composio dos hidrolisados de bagao de malte empregados como meio de
fermentao para produo de xilitol.
Composto Concentrao no hidrolisado (g/l)
atravs deste tratamento, enquanto que a concentrao de compostos fenlicos e cido actico
foi reduzida em 48% e 60%, respectivamente (Tabela 4.12). Uma concentrao ainda mais
baixa destes compostos foi obtida quando o hidrolisado concentrado foi diludo e
posteriormente suplementado com acares (HCDS). Em HCDS, a concentrao de
compostos fenlicos e cido actico foi 68% e 72% menor do que em hidrolisado
concentrado, sendo similar concentrao encontrada nos hidrolisados diludos (original, HD,
e suplementado com acares, HDS). No entanto, a presena de furfural e hidroximetilfurfural
nos hidrolisados diludos constitui a principal diferena entre estes e o HCDS.
Tabela 4.13 - Parmetros fermentativos e concentrao final de clulas obtidas durante a produo de
xilitol a partir dos hidrolisados de bagao de malte.
Hidrolisadoa Parmetros fermentativosb
0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10
90 10 70 10
A B
60
75
8 8
50
60
Xilitol (g/l)
6 40 6
Xilose (g/l)
45
30
4 4
30
20
15 2 10 2
0 0
0 0
0 15 30 45 60 75 90 105 0 15 30 45 60 75 90 105
Figura 4.7 - Consumo de xilose (A) e produo de xilitol (B) pela levedura Candida guilliermondii em
hidrolisado de bagao de malte: HDS (), HC (), HCT () e HCDS ().
Tabela 4.14 - Concentrao de alguns compostos fenlicos identificados nos hidrolisados de bagao de
malte.
Composto Concentrao no hidrolisado (g/l)
Comparando a fermentao do HCT com a do HDS observa-se que houve uma grande
diferena nos resultados do processo fermentativo, as quais refletiram principalmente em um
aumento de 4,8 vezes em QP (de 0,18 para 0,86 g/l.h, respectivamente), e de 3,5 vezes em
YP/X (de 2,83 para 10,0 g/g, respectivamente). Analisando a composio destes hidrolisados
(Tabela 4.12), a diferena observada em suas fermentabilidades pode ser atribuda a maior
concentrao de compostos fenlicos totais em HCT. De fato, dentre os compostos txicos
identificados no hidrolisado de bagao de malte, os compostos fenlicos parecem ser os mais
txicos ao microrganismo devido a elevada concentrao em que se encontram presentes. Por
outro lado, como o cido actico em concentraes maiores que 3 g/l txico para a levedura
96
Candida guilliermondii (FELIPE et al., 1995), provvel que este cido tambm tenha
influenciado na elevada toxicidade observada para o hidrolisado concentrado. Porm, deve-se
considerar tambm que, apesar de que o cido actico estava presente nos meios HCT, HDS e
HCDS em concentraes consideradas no txicas para o metabolismo do microrganismo, a
presena de compostos fenlicos nestes meios pode potencializar a toxicidade do cido
actico como conseqncia de um efeito sinergstico entre estes compostos.
Esta etapa do trabalho teve como objetivo otimizar as condies de hidrlise alcalina do
bagao de malte visando a obteno de uma polpa rica em celulose. Nestes ensaios, foi
utilizado como matria-prima o material slido resultante aps a remoo da hemicelulose
(celulignina) nas condies otimizadas de hidrlise cida. Segundo vrios autores, a remoo
desta frao prvia a hidrlise alcalina de grande interesse, por vrias razes: 1. a
hemicelulose tambm atacada durante o processo de hidrlise alcalina, contribuindo,
portanto, para um maior consumo do reagente qumico (FENGEL; WEGENER, 1989;
GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996; ZHAO et al., 2002); 2. a remoo da hemicelulose
aumenta a porosidade do material, facilitando a difuso e impregnao do hidrxido de sdio
na etapa posterior, melhorando desta forma a deslignificao (remoo da lignina) e a
uniformidade da polpa obtida (ZHAO et al., 2002); 3. a hemicelulose uma valiosa fonte de
xilose, acar que pode ser utilizado para obteno de produtos de valor agregado, tais como
xilitol (MUSSATTO; ROBERTO, 2004b) ou etanol (FERRARI et al., 2004). Logo, com a
dissoluo desta frao no licor alcalino, potenciais aplicaes para o material lignocelulsico
seriam perdidas.
Anlises da composio qumica do bagao de malte antes e aps o processo de
hidrlise cida foram realizadas com o objetivo de monitorar o rendimento de biomassa
recuperada, bem como as perdas de celulose, hemicelulose e lignina ocorridas (Tabela 4.15).
De acordo com esta anlise, o rendimento de biomassa recuperada aps o pr-tratamento
cido do material foi da ordem de 48,55% (p/p). A hemicelulose foi a principal frao
97
removida, restando 3,83 g a partir de cada 28,4 g presente no material original. Por outro lado,
a estrutura da celulose permaneceu praticamente inalterada, uma vez que foi observada uma
reduo de apenas 0,3 g (de 16,8 g para 16,5 g) nesta frao aps o pr-tratamento. A
porcentagem de lignina solubilizada neste estgio (14% p/p) foi maior do que a porcentagem
de celulose solubilizada, porm muito menor do que o valor observado para a hemicelulose.
Isto j era esperado, pois segundo McMillan (1994), a celulose e a lignina so mais resistentes
ao ataque com cidos diludos do que a hemicelulose, embora uma pequena parte da lignina
(aproximadamente 10% p/p) possa ser solubilizada em meio cido. Uma elevada remoo,
similar quela obtida para a hemicelulose (cerca de 85% p/p), foi observada tambm para a
frao restante do material (denominada por outros, correspondente a protenas, extrativos e
cinzas) restando apenas 4,32 g a partir de cada 27 g tratadas. Devido elevada remoo destas
duas fraes a partir do bagao de malte original, o resduo slido obtido tornou-se
enriquecido em celulose e lignina, conforme pode ser observado em sua composio qumica,
apresentada na Tabela 4.15.
Tabela 4.15 - Composio qumica do bagao de malte nas formas original (BO) e pr-tratado com
cido sulfrico diludo (BPT), massa recuperada e perda de cada frao aps o pr-
tratamento cido.
Frao Composio (g/100 g) Massa recuperadaa Perdas
1989; GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996). No presente trabalho, o meio reacional foi
imediatamente resfriado em banho de gelo ao trmino da reao, com o objetivo de impedir a
hidrlise alcalina e a reao de peeling da celulose, as quais devem ser evitadas por dois
motivos: 1. a hidrlise alcalina pode romper a cadeia polimrica da celulose, diminuindo
drasticamente seu tamanho (BERGGREN et al., 2003; KNILL; KENNEDY, 2003); 2. a
reao de peeling promove a remoo das unidades de acares redutores finais da cadeia
polissacardica, o que tambm indesejvel (BERGGREN et al., 2003; GRACE; LEOPOLD;
MALCOLM, 1996; KNILL; KENNEDY, 2003). Mesmo tomando este cuidado, a celulose
pode ser parcialmente degradada sob condies severas de reao. Logo, a realizao de
estudos que estabeleam as melhores condies de polpao necessria para minimizar a
degradao da celulose, maximizando a solubilizao da lignina durante a hidrlise alcalina.
No presente trabalho, um planejamento experimental foi proposto para avaliar o efeito
das variveis utilizadas na hidrlise alcalina do bagao de malte e estabelecer as melhores
condies para realizao deste processo. A composio qumica das polpas obtidas para cada
condio de hidrlise avaliada est apresentada na Tabela 4.16. Observa-se nesta tabela que o
teor de celulose nas polpas variou fortemente dependendo da condio de hidrlise utilizada
(de 43,6% p/p no ensaio 5, a 72,1% p/p no ensaio 8) e, embora a maior parte dos tratamentos
tenha promovido perdas insignificantes desta frao (< 1,8% p/p), perdas de at 23,3% p/p no
teor de celulose foram observadas durante o tratamento alcalino. A Tabela 4.16 mostra
tambm que todas as polpas obtidas apresentavam um resduo de hemicelulose, que variou de
5,6 a 10,7% p/p. Durante o tratamento alcalino do talo de milho, palha de centeio e palha de
arroz, Xiao, Sun e Sun (2001) tambm obtiveram polpas com resduos de hemicelulose
correspondentes a 7,7, 9,9 e 5,0% p/p, respectivamente.
Alm de um resduo de hemicelulose, todas as polpas produzidas a partir do bagao de
malte tambm continham um resduo de lignina, que variou de 10,4% p/p (ensaio 8) a
28,5% p/p (ensaio 1) (Tabela 4.16). De fato, resduos de hemicelulose e lignina podem ser
encontrados em polpas obtidas por tratamento alcalino porque parte destas fraes encontra-se
fortemente ligada celulose, sendo, portanto, muito resistentes ao processo de hidrlise. De
acordo com McKinney (citado por GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996) algumas
pentosanas so resistentes ao tratamento alcalino porque durante este processo ocorre uma
reao de transglicosilao, onde parte da hemicelulose que quimicamente ligada lignina
por ligaes glicosdicas passa a formar ligaes glicosdicas com a celulose. Por outro lado, a
dificuldade em remover os ltimos traos de lignina durante a reao com NaOH pode ser
99
explicada de duas formas: 1. uma pequena frao da lignina fortemente ligada aos
carboidratos por ligao qumica; 2. os ltimos traos de lignina reagem entre si ou com os
carboidratos, formando produtos que so difceis de serem dissolvidos no licor alcalino
(GRACE; LEOPOLD; MALCOLM, 1996).
Tabela 4.16 - Composio qumica das polpas de bagao de malte e perdas de celulose e lignina aps o
tratamento de hidrlise alcalina sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveis Composio da polpa (% p/p) Perda durante a
independentesa polpao (% p/p)
Vale a pena observar que, mesmo nas condies mais brandas de reao utilizadas
(NaOH 1% p/v, 80C, 30 min - ensaio 1) obteve-se uma significativa dissoluo da lignina
(60,5% p/p), a qual correspondeu a uma reduo no teor de lignina do material de 49,2% p/p
(no bagao de malte pr-tratado) para 28,5% p/p (na polpa obtida aps a deslignificao).
Valor similar de dissoluo da lignina (68,8% p/p) foi obtido durante o tratamento da palha de
centeio com uma soluo de NaOH 4% p/v, a 30 C por 18 h (XIAO; SUN; SUN, 2001).
Porm, apesar de no presente trabalho terem sido utilizadas temperaturas mais elevadas de
reao (80-120C), as condies aqui empregadas podem ser mais econmicas e menos
agressivas ao meio ambiente, pois requerem um menor tempo de reao e uma soluo de
NaOH menos concentrada.
100
Tabela 4.17 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e resultados do teste t de Student, para os
teores de celulose e lignina residual nas polpas obtidas a partir do bagao de malte.
Variveis Lignina residual (% p/p) Teor de celulose (% p/p)
independentes
e interaes EE E t EE SE t
X1 -3,550 1,638 2,167c 5,875 0,768 7,647a
X2 -6,000 1,638 3,662b 10,425 0,768 13,569a
X3 -5,650 1,638 3,448b 3,625 0,768 4,718a
X1X2 -2,950 1,638 1,800 -1,775 0,768 2,310c
X1X3 -1,300 1,638 0,793 5,725 0,768 7,451a
X2X3 -1,250 1,638 0,763 6,475 0,768 8,427a
a
p<0,01; b p<0,05; c p<0,10. X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
Tabela 4.18 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus respectivos R2,
ajustados aos dados experimentais para as respostas de lignina residual e teor de
celulose nas polpas obtidas.
Resposta Equaes do modeloa R2
Lignina residual ( y 1 em %) y 1 = 22,018 1,775X1 3,0X2 2,825X3 0,90
1,475X1X2 0,650X1X3 0,625X2X3
Teor de celulose ( y 2 em %) y 2 = 56,200 + 2,937X1 + 5,212X2 + 1,812X3 0,99
0,887X1X2 + 2,862X1X3 + 3,237X2X3
a
X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
76
32
28 70
LIGNINA RESIDUAL (%)
CELULOSE (%)
24 64
20 58
16 52
12 46
120 2,0
CO
110 1,75
NC
30
TE
EN
M
100 45 1,5 80
TR
PE
90
A
)
RA
60 min
90 O(
O
1,25 100
TU
75
( C)
o
EA
RA
110
Na
80 ER TUR
A
o
90 D
(C
1,0
O
PO 120 ERA
H
M P
)
TE TEM
(%
)
Figura 4.8 - Superfcies de resposta para os teores de lignina residual e de celulose (% p/p) nas polpas
de bagao de malte, em funo das variveis operacionais empregadas no processo de
hidrlise alcalina.
Figura 4.9 - Micrografia eletrnica de varredura (ampliao: 45 vezes) e aspecto visual das partculas
do bagao de malte nas formas: original (A), pr-tratado com cido diludo (B) e aps a
hidrlise alcalina (C).
104
cumrico tambm podem ser explicadas, uma vez que estes so os cidos fenlicos presentes
em maior quantidade no gro de cevada, estando concentrados principalmente na casca do
gro (MAILLARD; BERSET, 1995; WHITE; XING, 1997) e o bagao de malte composto
basicamente por esta frao do gro de cevada original. O cido ferlico tambm o cido
fenlico encontrado em maior quantidade em outros gros de cereais, tais como centeio
(ANDREASEN et al., 2000), trigo (LEMPEREUR; ROUAU; ABECASSIS, 1997), arroz e
milho (ADOM; LIU, 2002).
Tabela 4.19 - Porcentagem de lignina solubilizada e concentrao de cidos fenlicos no licor obtido a
partir da hidrlise alcalina do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveisa LSb Concentrao de cidos fenlicos no licor (mg/l)
A Tabela 4.19 mostra que houve uma grande variao nas concentraes dos cidos
ferlico (74,20 a 145,3 mg/l) e p-cumrico (67,10 a 138,8 mg/l) nos licores obtidos, em
funo das condies de reao utilizadas. Por esta razo, uma anlise estatstica foi realizada
para avaliar a influncia das variveis operacionais empregadas na hidrlise alcalina do
bagao de malte, na liberao destes cidos. Os grficos de Pareto apresentados na Figura
4.10 representam os efeitos estimados de cada varivel estudada, bem como da interao entre
elas, nas concentraes dos cidos ferlico e p-cumrico obtidas no licor alcalino. Observa-se
107
atravs destes grficos que todas as variveis estudadas influenciaram na liberao destes dois
cidos a partir do bagao de malte, sendo que todas apresentaram efeito positivo. Tal efeito
significa que quanto maior a concentrao de NaOH, a temperatura e o tempo de reao
empregados na hidrlise alcalina, maior foi a liberao de cido ferlico e p-cumrico a partir
do material. Quando todas as variveis foram utilizadas em seu nvel superior (concentrao
de NaOH de 2,0% p/v), temperatura de 120C e tempo de reao de 90 min ensaio 8),
90,2% p/p da lignina presente no bagao de malte foi solubilizada.
A cido ferlico
p=0,05
Tempo (X 3) 7,65
X1X2 3,26
X2X3 2,27
X1X3 0,39
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Efeito estimado (Valor absoluto)
B cido p-cumrico
p=0,05
Tempo (X 3) 2,82
X1X3 -0,26
X2X3 0,23
X1X2 0,13
0 1 2 3 4 5 6
Efeito estimado (Valor absoluto)
Figura 4.10 - Grficos de Pareto para o efeito das variveis: concentrao de NaOH, temperatura e
tempo de reao, nas respostas: concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de
cido p-cumrico (B) nos licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte.
Efeitos acima da linha de p=0,05 so significativos ao nvel de 95% de confiana.
108
Tabela 4.20 - Equaes do modelo para a hidrlise alcalina do bagao de malte e seus respectivos R2,
ajustados aos dados experimentais para as respostas de concentrao de cido ferlico e
concentrao de cido p-cumrico no licor alcalino obtido.
Resposta Equaes do modeloa R2
cido ferlico ( y 1 em mg/l) y 1 = 99,59 + 9,84X1 + 13,04X2 + 11,59X3 + 0,99
4,94X1X2 + 3,44X2X3
cido p-cumrico ( y 2 em mg/l) y 2 = 103,69 + 12,36X1 + 11,342X2 + 8,09X3 0,92
a
X1 = concentrao de NaOH; X2 = temperatura; X3 = tempo de reao.
109
A cido ferlico
160
150
Valores previstos (mg/l)
140
130
120
110
100
90
80
70
60
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160
B cido p-cumrico
150
140
Valores previstos (mg/l)
130
120
110
100
90
80
70
60
50
50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Figura 4.11 - Valores previstos pelo modelo linear em funo dos valores observados para as respostas
de concentrao de cido ferlico (A) e concentrao de cido p-cumrico (B) nos
licores obtidos por hidrlise alcalina do bagao de malte.
110
A polpa de celulose obtida nas condies otimizadas de hidrlise alcalina foi utilizada
nesta etapa do trabalho como substrato para obteno de glicose. No entanto, como a reao
de hidrlise alcalina foi conduzida em um banho termostatizado diferente daquele onde foram
realizados os experimentos do planejamento experimental, a polpa de celulose aqui obtida
apresentou uma composio qumica diferente daquela obtida anteriormente. A composio
desta polpa foi de (% p/p): 90,5% celulose, 1,1% hemicelulose e 8,2% de lignina; enquanto
que a composio da polpa obtida anteriormente na melhor condio de hidrlise foi de
111
Tabela 4.21 - Rendimento em glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise enzimtica
do bagao de malte, sob diferentes condies operacionais.
Ensaio Variveis Respostas
Nota-se na Tabela 4.21 que ambas as respostas variaram de acordo com as condies de
processo utilizadas. Uma anlise de estimativa dos efeitos foi ento realizada para identificar
as variveis de maior influncia no processo de hidrlise. De acordo com esta anlise (Tabela
112
4.22), apenas a varivel relao enzima/substrato apresentou efeito significativo (p<0,01) para
ambas as respostas. Tal efeito, de sinal positivo, indica que o aumento no valor desta varivel
favoreceu o rendimento em glicose e o rendimento total de hidrlise da celulose em glicose +
celobiose. As outras duas variveis estudadas (agitao e concentrao de substrato) no
apresentaram efeito significativo, mesmo a um nvel de 90% de confiana, para o rendimento
em glicose; mas para o rendimento total de hidrlise, a varivel concentrao de substrato
apresentou um efeito significativo a 90% de confiana e de sinal negativo, indicando que
quanto menor a concentrao de substrato utilizada, maior foi o rendimento total de hidrlise
obtido.
Tabela 4.22 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student, para o rendimento em
glicose e rendimento total (glicose + celobiose) da hidrlise enzimtica do bagao
malte.
Variveis Rendimento em glicose (%) Rendimento total de hidrlise (%)
independentes e
interaes EE E t EE SE t
X1 -9,525 8,641 -1,102 -7,905 6,335 -1,248
X2 53,110 8,641 6,146*** 39,400 6,335 6,220***
X3 -13,765 8,641 -1,593 -16,050 6,335 -2,534*
X1X2 3,900 8,641 0,451 1,145 6,335 0,181
X1X3 4,225 8,641 0,489 4,405 6,335 0,695
X2X3 -2,530 8,641 -0,293 3,900 6,335 0,616
*** Valor significativo a 99% de confiana; *Valor significativo a 90% de confiana.
X1 = agitao; X2 = relao enzima/substrato; X3 = concentrao de substrato.
Tabela 4.23 - Anlise de varincia com erro total e teste da curvatura, para o rendimento em glicose e
rendimento total da hidrlise enzimtica do bagao malte.
Varivel Rendimento em glicose
SQ GL MQ F p
Curvatura 741,926 1 741,926 621,551 0,000***
X1 181,451 1 181,451 152,011 0,000***
X2 5641,344 1 5641,344 4726,055 0,000***
X3 378,950 1 378,950 317,467 0,000***
X1X2 30,420 1 30,420 25,484 0,007***
X1X3 35,701 1 35,701 29,909 0,005***
X2X3 12,802 1 12,802 10,725 0,031**
Erro 4,775 4 1,194
Total 7027,370 11
SQ GL MQ F p
Curvatura 397,232 1 397,232 389,649 0,000***
X1 124,978 1 124,978 122,592 0,000***
X2 3104,720 1 3104,720 3045,448 0,000***
X3 515,205 1 515,205 505,369 0,000***
X1X2 2,622 1 2,622 2,572 0,184
X1X3 38,808 1 38,808 38,067 0,004**
X2X3 30,420 1 30,420 29,839 0,005***
Erro 4,078 4 1,019
Total 4218,063 11
X1 = agitao; X2 = relao enzima/substrato; X3 = concentrao de substrato.
GL = graus de liberdade; SQ = soma quadrtica; MQ = mdia quadrtica.
*** Valor significativo a 99% de confiana; **Valor significativo a 95% de confiana.
R2 = 0,99 para ambos, rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise.
114
Tabela 4.24 - Equaes do modelo para a hidrlise enzimtica do bagao de malte e seus respectivos
R2, ajustados aos dados experimentais para as respostas de rendimento em glicose e
rendimento total (glicose + celobiose) de hidrlise.
Resposta Equaes do modeloa R2
Rendimento em glicose y 1 = 59,65 4,76X1 + 26,55X2 6,88X3 + 0,89
( y 1 em %) 1,95X1X2 + 2,11X1X3 1,26 X2X3
Rendimento total de hidrlise y 2 = 72,57 3,95X1 + 19,70X2 8,02X3 + 0,90
( y 2 em %) 0,57X1X2 + 2,20X1X3 1,95 X2X3
a
X1 = agitao; X2 = relao enzima/substrato; X3 = concentrao de substrato.
Atravs das equaes obtidas do modelo (Tabela 4.24) foi possvel construir uma
representao tridimensional da superfcie de resposta para o rendimento em glicose e para o
rendimento total de hidrlise, na regio estudada (Figura 4.12). Estas figuras mostram
claramente que ambas as respostas foram bem ajustadas a uma superfcie plana e que os
maiores valores de rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise podem ser obtidos
utilizando o nvel superior de relao enzima/substrato (45 FPU/g) e inferior de concentrao
de substrato (2% p/v) e agitao (100 rpm).
115
100
RENDIMENTO EM GL
90
80
70
60
50
40
ICOSE
30
33,560 20
39,639 (%)
45,719 8,0
51,798 45
SU 6,5 )
57,878 BS 35 U/g
TR 5,0 FP
63,957
AT 25 T O(
70,037 3,5 RA
O 15 ST
76,116 (%
/S UB
82,196 p/ 2,0 5 A
v) ZIM
88,275 EN
above
acima
110
RENDIMENTO TOTAL
100
90
80
70
60
50
47,939
(%)
40
52,980
58,021 8
63,062 SU 6,5 45
68,103 BS 35 )
TR U/g
73,144 5
25 ( FP
AT O
78,185 O 3,5 AT
(% 15 TR
83,226 U BS
88,267 p/ 2 5 A/S
v) IM
Z
93,307 EN
above
acima
Figura 4.12 - Superfcies de resposta descrita pelos modelos para o rendimento em glicose ( y 1 ) e o
rendimento total (glicose + celobiose) ( y 2 ) da hidrlise enzimtica do bagao de malte.
mistura reacional devido alta viscosidade da suspenso (INGESSON et al., 2004; WEN;
LIAO; CHEN, 2004). Outros fatores que podem contribuir para um baixo grau de converso
da celulose quando se utiliza altas concentraes de substrato, principalmente quando so
empregadas baixas quantidades de enzima, incluem diferentes tipos de inativao da enzima e
uma adsoro no especfica das enzimas na molcula de lignina (VLASENKO et al., 1997).
A hidrlise enzimtica do bagao de malte tambm foi influenciada pela relao
enzima/substrato empregada de forma que, quanto maior a carga de enzimas utilizada, maior
foi o rendimento de hidrlise obtido (Tabela 4.22). Na verdade, esta foi a varivel de maior
influncia na hidrlise enzimtica do bagao de malte, sendo que seu aumento de 5 para 45
FPU/g de substrato proporcionou um aumento de 53,1% e 39,4% no rendimento em glicose e
no rendimento total de hidrlise, respectivamente. Durante a hidrlise enzimtica da madeira
de lamo, Sattler et al. (1989) tambm observaram um aumento (31%) no rendimento de
converso da celulose quando a relao enzima/substrato foi aumentada de 5 para 50 FPU/g
de substrato. De fato, o favorecimento da hidrlise enzimtica devido ao aumento da relao
enzima/substrato j foi observado para diferentes substratos celulsicos, obtidos a partir de
madeira dura (GAN; ALLEN; TAYLOR, 2002), madeira mole (PAN et al., 2005), bagao de
cana-de-acar (MANONMANI; SREEKANTIAH, 1987), cascas de arroz (YEZ;
ALONSO; PARAJ, 2006) e palha de arroz (KAUR; ARNEJA; SINGH, 1998; VLASENKO
et al., 1997). No entanto, a quantidade de enzimas requerida para se atingir uma completa
converso da celulose em glicose varia para cada matria-prima utilizada. Por exemplo,
durante a hidrlise enzimtica de madeira, a mxima converso de celulose em glicose foi
obtida utilizando uma relao enzima/substrato de 11,4 FPU/g. O aumento na quantidade de
enzimas no favoreceu o processo de hidrlise e no afetou o rendimento final em glicose
(EKLUND; GALBE; ZACCHI, 1990). Por outro lado, durante a hidrlise enzimtica da palha
de arroz pr-tratada por exploso a vapor, foi necessrio o uso de 100 FPU/g de substrato para
hidrolisar completamente a celulose (VLASENKO et al., 1997). No presente trabalho, uma
relao enzima/substrato de 45 FPU/g foi suficiente para promover uma hidrlise completa da
celulose a partir do bagao de malte.
118
70
60
Concentrao de glicose (g/l)
50
40
30
15 FPU/g
25 FPU/g
20
35 FPU/g
45 FPU/g
10 55 FPU/g
65 FPU/g
75 FPU/g
0 85 FPU/g
0 20 40 60 80 100
Tempo de hidrlise (h)
Figura 4.13 - Perfil da liberao de glicose durante a hidrlise enzimtica do bagao de malte a 45C,
100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato, utilizando diferentes relaes de
enzima/substrato (15 a 85 FPU/g).
90
85
Rendimento de hidrlise (%)
80
75
70
65
60
55
50
Rendimento em glicose
45 Rendimento total de hidrlise
40
10 20 30 40 50 60 70 80 90
Figura 4.14 - Efeito da relao enzima/substrato nos rendimentos de hidrlise da celulose do bagao
de malte a 45C, 100 rpm e 8% p/v de concentrao de substrato.
120
Apesar da converso da celulose ter sido incompleta, alguns dos hidrolisados obtidos
nestes experimentos apresentaram uma concentrao de glicose de aproximadamente 59 g/l,
valor mais adequado para uso em processos fermentativos. Porm, alm de glicose estes
hidrolisados tambm continham celobiose em concentraes variando de 6,7 a 7,9 g/l. Uma
alternativa para reduzir a concentrao deste composto no hidrolisado seria a suplementao
do extrato enzimtico com a enzima -glicosidase, a qual atua na converso da celobiose em
glicose (CAO; TAN, 2002). Porm, o alto custo envolvido com a adio de uma outra enzima
no processo, pode no justificar a adio de -glicosidase para converter esta baixa
concentrao de celobiose. De acordo com Chen, Xia e Xue (2007) o custo da enzima
contribui significativamente no custo total do processo de converso de biomassas e, portanto,
a quantidade de enzima utilizada no processo deve ser minimizada o mximo possvel. Alm
disso, dependendo do processo fermentativo a ser realizado, a presena de celobiose no meio
de fermentao pode no interferir no desempenho do microrganismo. Alguns autores
verificaram inclusive consumo de celobiose quando o hidrolisado de madeira foi utilizado
como meio de fermentao para a produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii
NRRL B-445 (MOLDES; ALONSO; PARAJ, 1999).
Estes ensaios foram realizados com o objetivo de avaliar a influncia das fraes de
hemicelulose e lignina na hidrlise enzimtica do bagao de malte e assim verificar a
necessidade de se submeter o material a duas etapas prvias de tratamento para poder atingir
elevados rendimentos de hidrlise. Trs amostras com diferentes composies qumicas foram
preparadas a partir deste material e utilizadas como substrato nos experimentos de hidrlise:
1. bagao de malte na forma original; 2. bagao de malte obtido aps o processo de hidrlise
cida (celulignina); 3. bagao de malte obtido aps as seqncias de hidrlise cida e alcalina
(polpa celulsica). Conforme se observa na Tabela 4.25, o bagao de malte original
composto principalmente por hemicelulose e lignina. Na amostra tratada com cido
(celulignina) a lignina a frao presente em maior quantidade, enquanto que a polpa
basicamente constituda por celulose.
121
Tabela 4.25 - Composio qumica das amostras de bagao de malte empregadas no processo de
hidrlise enzimtica.
Componente Composio qumica (g/100 g)
20
(A)
18
14
G li - O riginal
12 G li - C elulignina
G li - Polpa celulsica
10 C el - O riginal
C el - C elulignina
8 C el - Polpa celulsica
-2
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
100
(B)
90
Rendimento total de hidrlise, YT (%)
80
Rendimento em glicose, YG (%)
70
60
YT - O riginal
50 YT - C elulignina
YT - Polpa celulsica
YG - O riginal
40
YG - C elulignina
YG - Polpa celulsica
30
20
10
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Figura 4.15 - Hidrlise enzimtica das amostras de bagao de malte original, celulignina e polpa
celulsica. (A) Concentrao de glicose e celobiose nos hidrolisados obtidos; (B)
Rendimento em glicose e rendimento total de hidrlise para cada amostra utilizada.
necessrio promover uma remoo total das fraes de hemicelulose e lignina da amostra,
para se atingir elevados rendimentos durante a hidrlise enzimtica da celulose. Alguns
autores tambm relataram que no necessrio remover completamente a lignina do material
para que a hidrlise enzimtica da celulose seja completa (GREGG; SADDLER, 1996). Neste
caso, uma anlise econmica poderia ser til para avaliar se os melhores resultados obtidos no
rendimento da hidrlise enzimtica a partir da polpa celulsica justificariam o custo envolvido
com a realizao da etapa de tratamento alcalino da celulignina, antes da hidrlise enzimtica.
De um ponto de vista ambiental a no realizao desta etapa seria benfica, pois a degradao
da lignina durante a hidrlise alcalina gera um licor rico em compostos fenlicos, dentre os
quais, muitos so txicos e precisam ser removidos antes da descarga deste efluente no meio
ambiente (KARAM; NICELL, 1997).
tambm interessante notar que a partir da celulignina do bagao de malte, mas
principalmente a partir da polpa celulsica, a hidrlise enzimtica da celulose apresentou uma
fase inicial logartmica associada com uma rpida liberao de glicose, seguida por uma
diminuio na velocidade de produo deste acar medida que a reao avanou (Figura
4.15A). Para explicar este comportamento, alguns autores sugeriram que durante a hidrlise
enzimtica da celulose, as enzimas celulolticas degradam rapidamente a frao amorfa mais
acessvel do substrato. Com o progresso da hidrlise, a celulose torna-se mais resistente
hidrlise como resultado do aumento da cristalinidade (GHARPURAY; LEE; FAN, 1983;
GREGG; SADDLER, 1996; PURI, 1984). Outros fatores associados com a natureza do
sistema enzimtico utilizado tambm tm sido sugeridos para explicar a diminuio da
velocidade da hidrlise da celulose. Estes incluem a inativao trmica das enzimas, a
adsoro irreversvel ou ligao no especfica das celulases e a inibio das enzimas pelo
produto da reao (GREGG; SADDLER, 1996; MORIYAMA; SAIDA, 1986; RAMOS;
NAZHAD; SADDLER, 1993).
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 4.16 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das amostras de
bagao de malte. Material original antes (A) e aps (B) a hidrlise enzimtica;
Celulignina antes (C) e aps (D) a hidrlise enzimtica; Polpa celulsica antes (E) e
aps (F) a hidrlise enzimtica. Ampliao: 300 vezes.
126
A Figura 4.16A mostra que o bagao de malte na sua forma original apresenta uma
estrutura de fibras rgidas e altamente ordenadas. Com a remoo da hemicelulose, a estrutura
deste material foi modificada, mas a estrutura principal no foi rompida (Figura 4.16C).
Quando a lignina tambm foi removida (Figura 4.16E), a estrutura do material foi fortemente
modificada resultando em uma estrutura muito diferente das outras duas, original e
celulignina. Neste caso, as fibras de celulose tornaram-se totalmente expostas, o que
aumentou a rea superficial e a porosidade do material. Conseqentemente, essas fibras
encontram-se mais susceptveis ao das enzimas do que as outras duas amostras de bagao
de malte. Ooshima, Burns e Converse (1990) tambm observaram que quanto mais severo o
pr-tratamento utilizado, maior a rea superficial da celulose disponvel para as enzimas.
Aps a hidrlise enzimtica, observa-se que a estrutura do material original
praticamente no foi modificada (Figura 4.16B), confirmando a baixa eficincia de hidrlise
obtida. A imagem da celulignina hidrolisada (Figura 4.16D) mostra uma maior destruio das
fibras neste caso quando comparada com as fibras hidrolisadas a partir do material original, o
que justifica o melhor desempenho da hidrlise a partir da celulignina do que a partir da
amostra original. As fibras hidrolisadas a partir da polpa celulsica do bagao de malte foram
completamente destrudas (Figura 4.16F), o que explica os altos valores de rendimento em
glicose e rendimento total de hidrlise, atingidos a partir deste substrato. Nota-se ainda neste
caso que as fibras de celulose tornaram-se mais estreitas e curtas, sugerindo um ataque
longitudinal e lateral das fibras.
de hidrlise cida e alcalina, uma vez que a concentrao de glicose nos hidrolisados
enzimticos correspondeu a 23%, 74% e 86% do mximo que poderia ser obtido para o
material na forma original, celulignina e polpa celulsica, respectivamente.
Tabela 4.26 - Composio de carboidratos nos hidrolisados enzimticos produzidos a partir do bagao
de malte nas formas original, celulignina e polpa celulsica.
Componente Concentrao de carboidratos no hidrolisado (g/l)
obtido a partir da polpa celulsica, somente celobiose foi detectada em mistura com a glicose.
Em termos de proporo, nota-se que a xilose estava presente no hidrolisado original, em uma
relao de 1/1 com a glicose. Porm, no hidrolisado da celulignina, esta proporo foi
reduzida para 1/9,4 e no hidrolisado da polpa celulsica no foi detectada a presena de
xilose. Esta diminuio na relao xilose/glicose se deve liberao da xilose durante as
etapas de pr-tratamento do bagao de malte. A mesma explicao pode ser dada para
justificar a presena de arabinose apenas no hidrolisado do bagao de malte original (Tabela
4.26). Por outro lado, a presena de celobiose foi verificada nos hidrolisados obtidos a partir
da celulignina e da polpa de celulose, mas no a partir do material original. Alm disso,
quanto mais pr-tratado o material, maior a concentrao de celobiose obtida no hidrolisado
(Tabela 4.26) o que sugere um efeito maior de inibio das enzimas neste hidrolisado,
afetando a capacidade de converso da celobiose em glicose. Tal efeito pode estar relacionado
com a alta concentrao de glicose obtida neste meio.
A presena de compostos txicos ao metabolismo microbiano (hidroximetilfurfural,
furfural, cido actico e compostos fenlicos) no foi detectada nos hidrolisados produzidos.
Este fato pode ser atribudo alta especificidade das enzimas celulase (BEGUIN; AUBERT,
1994), e tambm s condies brandas de reao empregadas. A ausncia de compostos
txicos de fundamental importncia para o emprego do hidrolisado em processos de
bioconverso, pois a maior limitao do uso de hidrolisados para esta finalidade se deve
inibio causada pelos compostos txicos nele presentes (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a).
a capacidade do microrganismo em converter glicose a cido lctico. Tal efeito pode estar
relacionado com a presena de nutrientes no meio de fermentao. O hidrolisado celulsico
de bagao de malte foi utilizado como meio de fermentao na forma em que foi produzido,
isto , sem suplementao adicional de nutrientes. Como a polpa de celulose que foi
hidrolisada enzimaticamente continha uma pequena frao (0,3% p/p) composta por protenas
e minerais, possvel que parte destas substncias tenham sido solubilizadas durante o
processo de hidrlise enzimtica, proporcionando desta forma alguma fonte nutricional para o
desenvolvimento do microrganismo. No entanto, esta quantidade de nutrientes solubilizada
pode no ter sido suficiente para os microrganismos quando o nvel de inculo foi aumentado.
Isto teria afetado o desempenho das clulas em converter glicose a cido lctico, justificando
a queda observada nos valores de YP/X.
0,8
10
QP (g/l.h)
0,7
0,6 8
YP/X (g/g)
0,5
6
0,4
YP/S (g/g);
0,3 4
0,2
2
0,1
0,0 0
0 10,5 2 3 40,75 5 6 71,0 8
Figura 4.17 - Efeito da concentrao inicial de inculo nos parmetros fermentativos da produo de
cido lctico por Lactobacillus delbrueckii a partir do hidrolisado celulsico de bagao
de malte.
Por outro lado, quanto maior o nvel de inculo utilizado, maior a quantidade de clulas
disponveis para realizar este processo de bioconverso. Por esta razo, o aumento da carga do
inculo de 0,5 para 1,0 g/l foi capaz de mascarar esta menor capacidade da clula em
converter glicose a cido lctico, uma vez que o fator de rendimento do processo (YP/S) foi
aumentado em 20%. Conclui-se ento com estes resultados que, quando se utilizou um
131
inculo com 1 g/l de clulas, o fator de rendimento em cido lctico por substrato consumido
foi maior do que nos outros experimentos devido ao maior nmero de clulas presentes no
meio de fermentao. Durante a produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii a
partir de resduo de abacaxi, Idris e Suzana (2006) tambm verificaram uma relao entre a
concentrao de clulas e a produo de cido lctico, de forma que a produo deste cido
foi favorecida quando a concentrao celular utilizada foi aumentada. O aumento do nvel de
inculo de 104 para 106 esporos/ml tambm favoreceu a produo de cido lctico por uma
espcie mutante do fungo Rhizopus (MIURA et al., 2003).
Em relao produtividade volumtrica em cido lctico (QP) observa-se na Figura
4.17 que o valor deste parmetro foi idntico em todos os experimentos. Isto significa que em
um tempo de fermentao de 48 h as clulas produziram a mesma quantidade de cido lctico
em todos os meios avaliados. Um comportamento similar foi observado por Gomez e Goma
(1986) durante a fermentao para produo de cido lctico a partir de glicose empregando
diferentes nveis de inculo (0,4, 2,5 e 3,6 g/l). De acordo com estes autores, um tempo de
fermentao de 50 h foi suficiente para que todos os meios de fermentao atingissem a
mesma concentrao final de cido lctico, devido queda do pH do meio de fermentao.
Durante a fermentao para produo de cido lctico, na medida em que o cido lctico
formado e excretado para fora da clula, o pH do meio de fermentao diminui causando uma
inibio no crescimento do microrganismo, reduzindo ento o rendimento de formao de
produto (SILVA; MANCILHA, 1991). Logo, no presente trabalho, um tempo de 48 h foi
longo o suficiente para permitir que as clulas produzissem, em todos os meios de
fermentao, a mesma quantidade de cido lctico capaz de proporcionar a queda do pH at
este valor limite onde o metabolismo do microrganismo foi afetado. Por este motivo, todas as
fermentaes apresentaram valores similares de pH final e de produtividade volumtrica. De
acordo com Hofvendahl e Hahn-Hgerdal (2000), o pH timo para produo de cido lctico
varia entre 5,0 e 7,0. Valores abaixo deste limite afetam negativamente o desempenho do
microrganismo, determinando o final da fermentao.
132
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
(A) 55 55 (B) 15 15
50 50
12 12
45 45
9
Glicose (g/l)
35 35 6 6
30 30
3 3
25 25
0 0
20 20
15 15 -3 -3
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
Tempo de fermentao (h) Tempo de fermentao (h)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 0 10 20 30 40 50 60 70 80
(C) 2,5 2,5
(D) 6,0 6,0
5,5 5,5
2,0 2,0
5,0 5,0
Clulas (g/l)
4,0 4,0
1,0 1,0
3,5 3,5
(GARDE et al., 2002), madeira (PARAJ; ALONSO; SANTOS, 1996; WEE et al., 2006),
bagao de mandioca e bagao de cana-de-acar (JOHN; NAMPOOTHIRI; PANDEY, 2006).
A adio de extrato de levedura ao hidrolisado de bagao de malte proporcionou um
aumento de 27% na produo de cido lctico. Por outro lado, quando o hidrolisado foi
suplementado com os nutrientes do meio MRS, o aumento na produo de cido lctico foi de
67%. Resultados similares a estes foram tambm observados em outros trabalhos sobre
produo de cido lctico, conforme relatado por Hofvendahl e Hahn-Hgerdal (2000). Estes
autores compararam diversos estudos sobre a produo de cido lctico onde os meios de
fermentao foram suplementados com diferentes tipos de nutrientes. Alm de observar um
efeito positivo da suplementao nutricional na produo deste cido, eles tambm
verificaram que a adio dos nutrientes do meio MRS tem proporcionado melhores resultados
de fermentao do que a adio de extrato de levedura apenas. Isto poderia ser explicado pelo
fato de que o meio MRS uma mistura mais completa de nutrientes, pois tambm contm
extrato de levedura e ainda acrescido de extrato de carne, peptona entre outros nutrientes.
De acordo com Kwon et al. (2000), quanto mais completa a mistura de nutrientes adicionada
ao meio de fermentao, maior ser a produtividade volumtrica em cido lctico.
Um fato interessante observado foi que os resultados de consumo de glicose e produo
de cido lctico a partir do hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio MRS foram
superiores queles obtidos no prprio meio MRS (Figuras 4.18A e B). Isto sugere que o
hidrolisado celulsico de bagao de malte apresenta algum componente em sua composio
que no foi identificado, mas que atuou sinergisticamente com os nutrientes do meio MRS
favorecendo a produo de cido lctico.
O crescimento celular tambm foi favorecido em meios suplementados com nutrientes,
porm, neste caso, os resultados foram similares em ambos os hidrolisados suplementados,
com extrato de levedura ou com os nutrientes do meio MRS (Figura 4.18C). A partir dos
meios suplementados, o crescimento do microrganismo foi inicialmente rpido, mas
praticamente cessou aps 12 h de fermentao. Por outro lado, no meio no suplementado, o
crescimento do microrganismo foi muito pequeno, no havendo uma fase inicial exponencial,
como aquela observada nos outros meios.
importante ressaltar que todos estes ensaios foram realizados sem controle do pH do
meio de fermentao, o que claramente afetou o desempenho do processo. A Figura 4.18D
mostra que durante as primeiras 12 h de fermentao houve uma forte queda do pH (de 6,0
para 4,4) em todos os meios, devido produo de cido lctico. Conseqentemente, o
135
0,9 0,9
Meio 1 Meio 1
0,8 Meio 2 0,8 Meio 2
Meio 3 Meio 3
Yp/s (g/g); Qp (g/l.h)
0,6 0,6
0,5 0,5
0,4 0,4
0,3 0,3
0,2 0,2
0,1 0,1
0,0 0,0
Yp/s Qp Yp/s Qp
Figura 4.19 - Efeito da suplementao nutricional do hidrolisado celulsico de bagao de malte nos
parmetros fermentativos (YP/S e QP) da produo de cido lctico por Lactobacillus
delbrueckii. Meio 1: hidrolisado no suplementado; Meio 2: hidrolisado suplementado
com extrato de levedura; Meio 3: hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio
MRS; Meio 4: MRS com a mesma concentrao inicial de glicose do hidrolisado.
Estes resultados permitem concluir que a produo de cido lctico por Lactobacillus
delbrueckii em hidrolisado celulsico de bagao de malte pode ser realizada com elevados
valores de rendimento (0,70 g/g) e produtividade volumtrica (0,79 g/l.h) quando o
hidrolisado suplementado com nutrientes. Porm, como o pH de fermentao no foi
controlado, uma grande quantidade de glicose (33 a 43 g/l) permaneceu nos meios,
comprometendo a produtividade do processo e a posterior purificao do caldo fermentado.
4.10.2 Efeito do pH
A Figura 4.20 apresenta os perfis de consumo de glicose e produo de cido lctico nas
fermentaes realizadas com e sem o controle do pH. Observa-se que durante as primeiras
12 h de processo, ambas as fermentaes, com e sem controle de pH, apresentaram resultados
bastante similares. Isto ocorreu tanto em hidrolisado como no meio MRS. Porm, a partir
deste tempo o consumo de glicose e a produo de cido lctico foram influenciados pelo pH
do meio de fermentao. Quando o pH foi mantido em 6,0, as fermentaes prosseguiram at
o tempo final considerado (60 h); enquanto que quando o pH no foi controlado, as
fermentaes praticamente terminaram aps 12 h de processo, devido queda do pH para um
valor de aproximadamente 4,6. De acordo com alguns autores, os cidos fracos, como por
exemplo, o cido lctico, so realmente capazes de inibir o crescimento bacteriano
dependendo do pH do meio de fermentao. Na medida em que o cido lctico excretado
para fora da clula, ele diminui o pH externo. Com a queda do pH, este cido, que est
presente na forma no dissociada, tem a sua passagem facilitada atravs da membrana
plasmtica. Desta forma, o cido entra novamente na clula e ao encontrar um pH interno
igual a 7,4, ele se dissocia liberando prtons H+ . A clula passa ento a gastar energia na
forma de ATP para expulsar estes prtons do seu interior. Quanto maior a quantidade de cido
formado, mais o pH externo diminui e uma quantidade maior de cido entra novamente na
clula e se dissocia. Logo, maior ser o gasto de energia da clula para manter sua integridade
fsica. Isto ocorre at certo limite onde a clula no apresenta mais energia suficiente para
bombear os prtons para fora. Ento o crescimento pra e a clula pode chegar morte
(HOFVENDAHL; HAHN-HGERDAL, 1997; KASHKET, 1987).
Na fermentao do hidrolisado no suplementado, com controle de pH, a produo de
cido lctico foi de 12,76 g/l, valor 62% superior ao obtido no final da fermentao sem
controle de pH (7,87 g/l) (Figura 4.20B). Por outro lado, em hidrolisado suplementado e com
controle de pH, a produo de cido lctico atingiu 35,54 g/l, enquanto que a mxima
concentrao obtida neste meio sem controle de pH, foi de 13,02 g/l. Estes valores
representam um aumento de 170% na produo de cido lctico quando o pH do hidrolisado
suplementado foi controlado. Comparando as fermentaes em hidrolisado, fica claro
novamente que a suplementao nutricional promoveu um aumento na eficincia de
converso da glicose a cido lctico.
Os parmetros fermentativos obtidos nestas fermentaes esto apresentados na Tabela
4.27. Observa-se nesta tabela que houve uma grande quantidade de glicose residual em todos
os meios sem controle de pH, o que demonstra que o consumo de glicose pelo microrganismo
138
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
55 55 40 40
50
(A) 50 35
(B) 35
45 45 30 30
40 40 25 25
35 35 20 20
30 30 15 15
25 25 10 10
20 20 5 5
15 15 0 0
10 10 -5 -5
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Figura 4.20 - Efeito do controle de pH no consumo de glicose (A) e produo de cido lctico (B) por
Lactobacillus delbrueckii em meios: Hidrolisado no suplementado () sem controle de
pH e () com controle de pH; Hidrolisado suplementado com os nutrientes do meio
MRS () sem controle de pH e (U) com controle de pH; Meio MRS com a mesma
concentrao inicial de glicose do hidrolisado () sem controle de pH e () com
controle de pH.
Tabela 4.27 - Parmetros fermentativos e concentrao de glicose nos meios de fermentao para a
produo de cido lctico por Lactobacillus delbrueckii.
Hidrolisado no Hidrolisado MRS
suplementado suplementado
Sem Com Sem Com Sem Com
controle controle controle controle controle controle
de pH de pH de pH de pH de pH de pH
Os valores de fator de rendimento em cido lctico (YP/S) foram elevados (0,82 g/g)
em todos os experimentos (Tabela 4.27), sugerindo que o microrganismo foi capaz de
converter quase toda a glicose consumida em cido lctico, independente do meio de
fermentao utilizado. Os valores mais baixos foram observados nos meios sem controle de
pH. Em hidrolisado suplementado, os valores de YP/S obtidos foram similares em ambos os
meios, com e sem o controle do pH de fermentao, embora a produo de cido lctico tenha
sido quase trs vezes maior no meio onde o pH foi controlado. Isto significa que a produo
de cido lctico foi afetada no meio sem controle de pH porque o consumo de glicose pelo
microrganismo foi prejudicado. Com relao produo de cido lctico por grama de clula,
os valores de YP/X mostram claramente que o controle de pH foi fundamental para que
houvesse uma maior formao de produto por clula.
Alm de ser utilizada como matria-prima para obteno de glicose por hidrlise
enzimtica, a polpa de celulose obtida na condio otimizada de hidrlise alcalina foi tambm
submetida a um processo de branqueamento para verificar sua possibilidade de emprego na
produo de papel ou de derivados de celulose. Para comparao, uma polpa de celulose foi
tambm produzida a partir do bagao de malte original e submetida ao mesmo procedimento
de branqueamento, visando avaliar o efeito do pr-tratamento cido na qualidade da polpa
branqueada.
A composio qumica das duas polpas de celulose utilizadas nestes experimentos est
apresentada na Tabela 4.28. Nota-se nesta tabela que as polpas apresentaram composies
qumicas diferentes em funo dos tratamentos a que foram submetidas.
De acordo com alguns autores, para se produzir papis de alta qualidade necessrio
promover uma elevada remoo da hemicelulose e da lignina do material (sem interferir na
estrutura da celulose), pois a presena destas fraes diminui a qualidade dos papis, sendo
que a lignina interfere ainda na etapa de fabricao (CHEN et al., 2001; GRACE; LEOPOLD;
140
MALCOLM, 1996). O processo de hidrlise alcalina utilizado no presente trabalho, foi capaz
de remover seletivamente as fraes de hemicelulose e lignina, a partir dos dois materiais
utilizados. Quando aplicado ao material original, a remoo destas fraes foi superior a 78%
p/p enquanto que a celulose praticamente no foi atacada (remoo de 3,0% p/p). Como
conseqncia, o teor de celulose neste material foi aumentado em 3,2 vezes aps a polpao,
atingindo 54,3% p/p. Quando o processo de hidrlise alcalina foi aplicado ao material pr-
tratado, obteve-se um aumento similar no teor de celulose (2,7 vezes) devido tambm
elevada remoo de hemicelulose e de lignina (>94% p/p) e baixa remoo de celulose
( 10% p/p). No entanto, como o material pr-tratado apresentava um teor de celulose
(34% p/p) quase duas vezes maior do que o do bagao de malte original (16,8% p/p), sua
polpa tambm atingiu um teor de celulose aproximadamente duas vezes maior do que o da
polpa do bagao de malte original (Tabela 4.28).
Tabela 4.28 - Rendimento e caractersticas das polpas de celulose obtidas por hidrlise alcalina do
bagao de malte nas formas original e pr-tratado com cido sulfrico diludo.
Caractersticas Polpa do bagao de malte Polpa do bagao de malte
original pr-tratado
No Branqueada No Branqueada
branqueada branqueada
Celulose (% p/p) 54,3 60,8 90,5 95,7
Hemicelulose (% p/p) 20,4 13,7 1,0 0
Lignina (% p/p) 14,4 12,6 8,1 3,4
Cinzas (% p/p) 3,1 1,4 0,4 0,3
Rendimentoa (%) 30,1 78,8 33,5 88,9
Nmero kappa 48,4 40,2 27,9 11,2
Viscosidade (cp) 13,7 10,9 12,5 3,1
Alvura (%) 27,2 39,1 33,8 71,3
a
calculado para cada processo individualmente.
obtida por hidrlise alcalina do bagao de malte original (30,1 g/100 g). Apesar do maior
rendimento, a polpa de BMO apresentou uma qualidade inferior da polpa de BMP, uma vez
que seu nmero kappa foi mais elevado e sua alvura foi menor (Tabela 4.28). Um rendimento
similar de polpa (27,9%) foi encontrado por Khristova, Kordsachia e Khider (2005) aps a
hidrlise alcalina das folhas de tamareira. Nesse caso, os autores atriburam o baixo
rendimento de polpao ao baixo teor de celulose (30,3% p/p) e aos elevados teores de lignina
(31,2% p/p) e extrativos (21,2% p/p) presentes na matria-prima. Considerando este fato, os
baixos rendimentos obtidos para as polpas de bagao de malte tambm so justificveis, uma
vez que os materiais submetidos hidrlise alcalina tambm apresentavam baixo teor de
celulose (16,8% p/p e 34% p/p para BMO e BMP, respectivamente), e elevado teor de lignina
(27,8% p/p e 49,2% p/p para BMO e BMP, respectivamente).
A D
B E
C F
Figura 4.21 - Fotomicrografias obtidas por microscopia eletrnica de varredura das amostras de
bagao de malte original (A), polpa do bagao original no branqueada (B), polpa do
bagao original branqueada (C); bagao de malte pr-tratado (D), polpa do bagao
pr-tratado no branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado branqueada (F).
Ampliao: 300 vezes.
144
A D
B E
C F
Figura 4.22 - Aparncia das amostras de bagao de malte original (A), polpa do bagao original no
branqueada (B), polpa do bagao original branqueada (C); bagao de malte pr-tratado
(D), polpa do bagao pr-tratado no branqueada (E), polpa do bagao pr-tratado
branqueada (F).
Estes resultados sugerem, portanto, que apenas a polpa de celulose obtida a partir do
bagao de malte pr-tratado apresenta potencial para aplicao em processos industriais,
podendo ser utilizada, por exemplo, para a produo de derivados de celulose, tais como
viscose, acetato de celulose e celofane. Isto porque, de acordo com Caraschi, Filho e Curvelo
(1996), polpas branqueadas de baixo rendimento (30 a 35%), com um alto contedo de
celulose pura (>85%) e baixo contedo de poliose (1 a 10%) e lignina (<0,05%) so
adequadas para esta finalidade. Por outro lado, a realizao de alguns testes adicionais de
resistncia trao, resistncia ao rasgo, entre outros, seria til para verificar a possibilidade
de emprego desta polpa na produo de papis.
foi observado um acrscimo de 13% na massa de lignina removida, porm, este incremento na
remoo foi cerca de 5 vezes menor quando comparado ao aumento observado na faixa de
pH entre 7,71 e 4,3.
Tabela 4.29 - Volume de cido sulfrico adicionado nas amostras do licor alcalino de bagao de malte,
caracterizao do licor obtido e quantificao da massa de lignina precipitada.
Amostra VH2SO4 98% pH Lignina Remoo de Massa
(ml) solvel (g/l) lignina (%) precipitada (g)
1 original - 12,56 12,44 - 0,0301
2 0,14 10,61 12,42 0,16 0,0361
3 0,16 9,90 12,40 0,32 0,0373
4 0,18 7,71 12,40 0,32 0,0383
5 0,20 5,98 10,49 15,67 0,0909
6 0,22 4,30 3,92 68,49 0,2939
7 0,24 3,23 2,63 78,86 0,3100
8 0,26 2,62 2,45 80,30 0,3202
9 0,28 2,48 2,33 81,27 0,3209
10 0,30 2,15 2,31 81,43 0,3208
0,35 90
massa precipitada
0,30 remoo de lignina 75
Massa precipitada (g)
0,25
60
0,20
45
0,15
30
0,10
15
0,05
0
0,00
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
pH
Figura 4.23 - Massa precipitada e remoo de lignina em funo da reduo do pH do licor alcalino de
bagao de malte.
147
No mais baixo valor de pH avaliado (2,15), 81,43% da lignina solubilizada no licor foi
recuperada (Tabela 4.29). Um rendimento similar de recuperao de lignina (87,8%) foi
obtido por Santos e Curvelo (2001) quando reduziram de 13,6 para 3,0, o pH do licor alcalino
de madeira de eucalipto. No entanto, este valor de remoo 10% superior ao obtido no
presente trabalho para o valor de pH de 3,23 (78,86% de recuperao). De acordo com
Rohella et al. (1996), a composio da lignina solubilizada varia de uma biomassa para outra
e tambm com o processo de polpao utilizado. Isto explicaria as diferenas observadas entre
os resultados do presente trabalho e aqueles obtidos por Santos e Curvelo (2001), uma vez
que alm de terem sido utilizadas matrias-primas diferentes, o licor alcalino de bagao de
malte foi obtido por polpao soda (hidrlise alcalina) enquanto que o licor obtido por estes
autores foi obtido pelo processo de polpao Kraft.
Segundo Villar, Caperos e Garca-Ochoa (2001), o emprego de cidos para precipitao
da lignina o mtodo mais utilizado para recuperar a lignina Kraft a partir do licor de
polpao, sendo capaz de proporcionar 100% de recuperao quando o pH reduzido para
uma faixa de valores entre 2,0 e 3,0. No presente trabalho, a lignina solubilizada no licor
obtido por polpao soda do bagao de malte no foi totalmente recuperada quando o pH foi
acidificado at 2,15, confirmando que realmente o processo de polpao utilizado pode
influenciar na posterior recuperao da lignina a partir do licor.
Embora a lignina no tenha sido totalmente recuperada, o valor de remoo obtido em
pH 2,15 (81,43%) foi elevado e pode ser comparado com outros j descritos na literatura. Por
exemplo, Sun, Tomkinson e Bolton (1999) utilizaram H3PO4 (9,68 N) para reduzir o pH do
licor alcalino obtido a partir do bagao de dend. Neste processo eles observaram que com a
reduo do pH de 13,8 para 2,0 foi possvel recuperar 1 g de lignina para cada 100 ml de licor
acidificado. Entretanto, alm de lignina o precipitado continha produtos provenientes da
degradao de polissacardeos uma vez que o material submetido polpao no havia sido
pr-tratado. No presente trabalho, o rendimento de massa recuperada em pH 2,15 foi de 1,6
g/100 ml de licor acidificado, e esta massa foi composta basicamente pela lignina, pois a
frao hemicelulsica do material j havia sido quase totalmente solubilizada durante o pr-
tratamento cido e a celulose praticamente no foi atacada durante o processo de hidrlise
alcalina. Considerando estes fatos, a massa de lignina recuperada no presente trabalho foi
quase duas vezes maior do que a obtida por Sun, Tomkinson e Bolton (1999), o que
justificvel dado que o bagao de malte contm 27,8% p/p de lignina enquanto que o bagao
de dend contm apenas 14,2% p/p. Portanto, estes resultados sugerem que a eficincia de
148
recuperao da lignina solubilizada no licor alcalino foi similar quando se utilizou cido
sulfrico concentrado (presente trabalho) ou cido fosfrico 9,68 N (SUN; TOMKINSON;
BOLTON, 1999).
Como conseqncia da remoo da lignina, observou-se uma forte alterao na cor do
licor. Nota-se na Figura 4.24 que o licor na sua forma original (1) apresentava uma cor
marrom escura e medida que o pH foi reduzido, sua cor passou a se tornar mais clara, de
forma que no mais baixo valor de pH avaliado (2,15 amostra 10), o licor apresentou uma cor
amarela clara. Segundo Fengel e Wegener (1989), a cor escura do licor alcalino proveniente
dos grupos funcionais cromforos (quinonas, fenlicos, entre outros) gerados a partir da
degradao da lignina, os quais so solveis em meio alcalino, mas no em meio cido.
Figura 4.24 - Efeito da reduo do pH (de 12,56 - amostra 1, para 2,15 - amostra 10) na cor do licor
alcalino de bagao de malte.
Nota-se tambm na Figura 4.24 que apesar de na amostra 5 (pH 5,98) j ter ocorrido
uma remoo de 15,67% da lignina, a cor do licor ainda no tinha sido alterada, sendo to
escura quanto na amostra original (amostra 1). Provavelmente, os compostos que conferem
cor ao licor ainda no tinham sido precipitados nesta faixa pH (entre 12,56 e 5,98). Na
amostra 6 (pH 4,30), 68,49% da lignina foi precipitada, causando alterao na cor do licor. A
queda do pH de 4,3 para 3,23 (amostra 7) tambm influenciou na cor do licor, que se tornou
amarela e pouco se alterou com a posterior reduo do pH para 2,15 (amostra 10). Estes
resultados sugerem, portanto, que os grupos cromforos que conferem cor ao licor alcalino,
foram removidos principalmente na faixa de pH entre 5,98 (amostra 5) e 3,23 (amostra 7).
149
Depois de recuperada do licor alcalino, a lignina foi utilizada como matria-prima para
a produo de carvo ativado. O processo de ativao foi realizado empregando diferentes
relaes entre H3PO4/lignina e temperaturas de carbonizao, de acordo com um
planejamento fatorial completo 22. Os carves obtidos nestas condies foram utilizados para
destoxificao do hidrolisado hemicelulsico de bagao de malte, uma vez que este contm
uma srie de metais e compostos fenlicos e permitiria, portanto, avaliar o desempenho dos
carves na remoo de diversos componentes. Os resultados obtidos nestes experimentos de
destoxificao esto apresentados na Tabela 4.30. Observa-se nesta tabela que todos os
carves produzidos foram capazes de remover metais e compostos fenlicos a partir do
hidrolisado, sendo que dentre os metais, nquel, ferro, cromo e silcio foram os mais
removidos. No entanto, a capacidade de adsoro variou para cada carvo. A remoo de
nquel, por exemplo, foi total quando se utilizou o carvo produzido na mais alta temperatura,
empregando a maior relao cido/lignina (amostra 4). Por outro lado, este mesmo carvo foi
pouco eficiente para a remoo de magnsio e silcio.
Tabela 4.30 - Remoo de metais, cor e compostos fenlicos a partir do hidrolisado hemicelulsico de
bagao de malte, por adsoro nos carves ativados preparados a partir da lignina.
Amostra Variveisa Remoo (%)
Ni Ca Mg Zn Fe Cr Al Si
1 1 300 65,1 0,2 1,3 4,5 53,9 54,7 10,6 31,6 60,4 22,6
2 3 300 65,9 21,1 7,8 1,1 39,5 35,6 7,6 38,1 61,4 15,7
3 1 600 3,2 27,9 4,6 0,1 61,5 17,3 16,3 33,5 61,5 12,0
4 3 600 100,0 29,3 1,9 14,9 70,7 39,7 30,5 16,3 64,4 33,3
5 2 450 61,2 15,9 4,3 7,5 66,9 21,2 12,1 38,8 62,9 25,5
6 2 450 65,1 23,3 3,0 9,3 67,7 20,5 21,2 38,0 61,1 25,5
Comercial 0,0 26,5 0,3 3,6 77,6 10,8 19,5 1,1 70,3 50,8
a
A/L = relao cido/lignina (g/g); T = temperatura de carbonizao (C)
Uma anlise estatstica foi realizada para os compostos removidos em maior quantidade
a partir do hidrolisado (nquel, ferro, cromo e silcio). De acordo com esta anlise, a remoo
de nquel foi influenciada principalmente pela relao cido/lignina empregada no processo
150
de ativao, sendo que o efeito desta varivel foi positivo e significativo a 99% de confiana.
Isto significa que a remoo deste composto foi maior nos carves produzidos com a mais alta
relao cido/lignina. No entanto, esta varivel no apresentou efeito principal significativo
para nenhuma das outras respostas avaliadas (Tabela 4.31).
Tabela 4.31 - Estimativa dos efeitos (EE), erros-padro (E) e teste t de Student para a remoo de
nquel, ferro, cromo e silcio a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de
malte, por adsoro nos carves ativados preparados a partir da lignina.
Variveis Remoo de Nquel (%) Remoo de Ferro (%)
independentes e
interaes EE E t EE SE t
Curvatura 9,200 4,776 1,926 21,800 0,980 22,249**
X1 48,800 2,758 17,696*** -2,600 0,566 -4,596
X2 -13,900 2,758 -5,040 19,400 0,566 34,295**
X1X2 48,000 2,758 17,406*** 11,800 0,566 20,860**
mais eficiente para a remoo de ferro, cor e fenlicos. No entanto, de uma forma geral, os
carves produzidos apresentaram um poder de adsoro comparvel ou at mesmo superior
ao do carvo comercial, demonstrando que eles apresentam potencial para serem utilizados
em substituio aos carves encontrados no mercado.
152
5 CONCLUSES
A arabinana do bagao de malte hidrolisada mais facilmente com cido diludo do que a
xilana. Para todas as condies avaliadas, tanto no processo em autoclave como em reator,
as eficincias de hidrlise desta molcula foram superiores a 93%.
A hidrlise alcalina do bagao de malte pr-tratado com cido sulfrico diludo foi um
procedimento altamente eficiente para solubilizar a lignina do material, sendo til tanto
para a produo de polpa de celulose, como para a liberao de cidos fenlicos.
De uma forma geral, conclui-se que o bagao de malte um subproduto industrial com
grande potencial para aproveitamento como matria-prima em processos qumicos e
biotecnolgicos.
155
REFERNCIAS
ABRANTES, S.; AMARAL, E.; COSTA, A.P.; SHATALOV, A.A.; DUARTE, A.P.
Hydrogen peroxide bleaching of Arundo donax L. kraft-anthraquinone pulp - Effect of a
chelating stage. Industrial Crops and Products, v.25, p.288-293, 2007.
ADLER, E. Lignin chemistry Past, present and future. Wood Science and Technology,
v.11, p.169218,1977.
ADOM, K.K.; LIU, R.H. Antioxidant activity of grains. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.50, p.6182-6187, 2002.
AGUILAR, R.; RAMREZ, J.A.; GARROTE, G.; VZQUEZ, M. Kinetic study of the acid
hydrolysis of sugar cane bagasse. Journal of Food Engineering, v.55, p.309-318, 2002.
ALLEN, B.R.; COUSIN, M.J.; PIERCE, G.E. Pretreatment Methods for the Degradation
of Lignin. Columbus: Battelle Columbus Laboratories, 1980. 176 p.
BAI, D-M.; JIA, M-Z.; ZHAO, X-M.; BAN, R.; SHEN, F.; LI, X-G.; XU, S-M. L(+)-lactic
acid production by pellet-form Rhizopus oryzae R1021 in a stirred tank fermentor. Chemical
Engineering Science, v.58, p.785791, 2003.
BAR, A. Xylitol. In: O'BREIN NABORS, L.; GELARDI, R.C. (ed.). Alternative
Sweeteners. 2nd ed. New York: Marcel Dekker, 1991. p.349-379.
BARTOLOM, B.; FAULDS, C.B.; WILLIAMSON, G. Enzymic release of ferulic acid from
barley spent grain. Journal of Cereal Science, v. 25, p.285-288, 1997.
BARTOLOM, B.; GMEZ-CORDOVS, C.; SANCHO, A.I.; DEZ, N.; FERREIRA, P.;
SOLIVERI, J.; COPA-PATIO, J.L. Growth and release of hydroxycinnamic acids from
brewers spent grain by Streptomyces avermitilis CECT 3339. Enzyme and Microbial
Technology, v.32, p.140-144, 2003.
BARTOLOM, B.; SANTOS, M.; JIMNEZ, J.J.; DEL NOZAL, M.J.; GMEZ-
CORDOVS, C. Pentoses and hydroxycinnamic acids in brewers spent grain. Journal of
Cereal Science, v.36, p.51-58, 2002.
BEGUIN, G.; AUBERT, J.P. The biological degradation of cellulose. FEMS Microbiology
Reviews, v.13, p.25-28, 1994.
BERLIN, A.; GILKES, N.; KURABI, A.; BURA, R.; TU, M.B.; KILBURN, D.; SADDLER,
J.N. Weak lignin-binding enzymes A novel approach to improve activity of cellulases for
hydrolysis of lignocellulosics. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.121, p.163-170,
2005.
BIERMANN, C.J. Handbook of Pulping and Papermaking. 2nd ed. San Diego: Academic
Press, 1996. 754 p.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry,
v.72, p.248-254, 1976.
BROWNING, B.L. Methods of Wood Chemistry. New York: Wiley, 1967. 882 p.
CARVALHEIRO, F.; DUARTE, L.C.; LOPES, S.; PARAJ, J.C.; PEREIRA, H.; GRIO,
F.M. Evaluation of the detoxification of brewerys spent grain hydrolysate for xylitol
production by Debaryomyces hansenii CCMI 941. Process Biochemistry, v.40, p.1215-1223,
2005.
CARVALHEIRO, F.; ESTEVES, M.P.; PARAJ, J.C.; PEREIRA, H.; GRIO, F.M.
Production of oligosaccharides by autohydrolysis of brewerys spent grain. Bioresource
Technology, v.91, p.93-100, 2004b.
CHEN, M.; XIA, L.; XUE P. Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol production from
cellulosic hydrolysate. International Biodeterioration & Biodegradation, v.59, p.85-89,
2007.
CRUZ, J.M.; DOMNGUEZ, J.M.; DOMNGUEZ, H.; PARAJ, J.C. Antioxidant and
antimicrobial effects of extracts from hydrolysates of lignocellulosic materials. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v.49, p.2459-2464, 2001.
CRUZ, J.M.; DOMNGUEZ, J.M.; DOMNGUEZ, H.; PARAJ, J.C. Xylitol production
from barley bran hydrolysates by continuous fermentation with Debaryomyces hansenii.
Biotechnology Letters, v.22, p.1895-1898, 2000.
CRUZ, J.M.; DOMNGUEZ, J.M.; DOMNGUEZ, H.; PARAJ, J.C. Solvent extraction of
hemicellulosic wood hydrolysates: A procedure useful for obtaining both detoxified
fermentation media and polyphenols with antioxidant activity. Food Chemistry, v.67, p.147-
153, 1999.
158
CURRELI, N.; AGELLI, M.; PISU, B.; RESCIGNO, A.; SANJUST, E.; RINALDI, A.
Complete and efficient enzymic hydrolysis of pretreated wheat straw. Process Biochemistry,
v.37, p.937-941, 2002.
DATTA, R.; TSAI, S.P.; BONSIGNOR, P.; MOON, S.; FRANK, J. Technological and
economical potential of polylactic acid and lactic acid derivatives. FEMS Microbiology
Reviews, v.16, p.221231, 1995.
DIAO, Y.; WALAWENDER, W.P.; FAN, L.P. Activated carbons prepared from phosphoric
acid activation of grain sorghum. Bioresource Technology, v.81, p.45-52, 2002.
DOMINGUEZ, J.M.; CAO, N.; GONG, C.S.; TSAO, G.T. Dilute acid hemicellulose
hydrolysates from corn cobs for xylitol production by yeast. Bioresource Technology, v.61,
p.85-90, 1997.
DUFF, S.J.B.; MURRAY, W.D. Bioconversion of forest products industry waste cellulosics
to fuel ethanol: A review. Bioresource Technology, v.55, p.133, 1996.
DUVNJAK, Z.; BUDIMIR, A.; SUSKOVIC, J. Effect of spent grains from beer production
on production of -amylase by Bacillus subtilis 21+. Prehrambeno-Tehnoloska Revija
v.21, p.97-101, 1983.
FELIPE, M.G.A.; MANCILHA, I.M.; VITOLO, M.; ROBERTO, I.C.; SILVA, S.S.; ROSA,
S.A. Preparation of xylitol by fermentation of a hydrolysate of hemicellulose obtained from
sugarcane bagasse. Brazilian Archives of Biology and Technology, v.36, p.103-114, 1993.
FELIPE, M.G.A.; VEIRA, M.V.; VITOLO, M.; MANCILHA, I.M.; ROBERTO, I.C.;
SILVA, S.S. Effect of acetic acid on xylose fermentation to xylitol by Candida
guilliermondii. Journal of Basic Microbiology, v.35, p.171-177, 1995.
FERRARI, M.D.; NEIROTTI, E.; ALBORNOZ, C.; SAUCEDO, E. Ethanol production from
eucalyptus wood hemicellulosic hydrolysate by Pichia stipitis. Biotechnology and
Bioengineering, v.40, p.753-759, 2004.
FRANCIS, F.; SABU, A.; NAMPOOTHIRI, K.M.; RAMACHANDRAN, S.; GHOSH, S.;
SZAKACS, G.; PANDEY, A. Use of response surface methodology for optimizing process
parameters for the production of -amylase by Aspergillus oryzae. Biochemical Engineering
Journal, v.15, p.107-115, 2003.
GAN, Q.; ALLEN, S.J.; TAYLOR, G. Design and operation of an integrated membrane
reactor for enzymatic cellulose hydrolysis. Biochemical Engineering Journal, v.12, p.223-
229, 2002.
GARDE, A.; JONSSON, G.; SCHMIDT, A.S.; AHRING, B.K. Lactic acid production from
wheat straw hemicellulose hydrolysate by Lactobacillus pentosus and Lactobacillus brevis.
Bioresource Technology, v.81, p.217-223, 2002.
GARGULAK, J.D.; LEBO, S.E. Commercial use of lignin-based materials. In: GLASSER,
W.G.; NORTHEY, R.A.; SCHULTZ, T.P. (eds.). Lignin: Historical, Biological, and
Materials Perspectives. Washington: American Chemical Society, 2000. p.305-320.
GARROTE, G.; DOMNGUEZ, H.; PARAJ, J.C. Autohydrolysis of corncob: Study of non-
isothermal operation for xylooligosaccharide production. Journal of Food Engineering,
v.52, p.211-218, 2002.
GOMEZ, J.; GOMA, G. Effect of different inoculum levels of heterogeneous mixed culture in
acidogenic fermentation. Biotechnology Letters, v.8, p.833-836, 1986.
GONZLEZ, J.; CRUZ, J.M.; DOMNGUEZ, H.; PARAJ, J.C. Production of antioxidants
from Eucalyptus globulus wood by solvent extraction of hemicellulose hydrolysates. Food
Chemistry, v.84, p.243-251, 2004.
160
GRACE, T.M.; LEOPOLD, B.; MALCOLM, E.W. Chemical reactions of wood constituents.
In: KOCUREK, M.J. Pulp and Paper Manufacture: Alkaline Pulping, v.5. Atlanta: The
Joint Textbook Committee of the Paper Industry / Tappi / CPPA. 1996, p.23-44.
GREGG, D.J.; SADDLER, J.N. Factors affecting cellulose hydrolysis and the potential of
enzyme recycle to enhance the efficiency of an integrated wood to ethanol process.
Biotechnology and Bioengineering, v.51, p.375-383, 1996.
GUO, Y.; ROCKSTRAW, D.A. Physical and chemical properties of carbons of carbons
synthesized from xylan, cellulose, and Kraft lignin by H3PO4 activation. Carbon, v.44,
p.1464-1475, 2006.
HUIGE, N.J.. Brewery by-products and effluents. In: HARDWICK, W.A. (ed.). Handbook
of Brewing. New York: Marcel Dekker, 1994. p.501-550.
IDRIS, A.; SUZANA, W. Effect of sodium alginate concentration, bead diameter, initial pH
and temperature on lactic acid production from pineapple waste using immobilized
Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry, v.41, p:11171123, 2006.
IGLESIAS, G.; BAO, M.; LAMAS, J.; VEGA, A. Soda pulping of Miscanthus sinensis.
Effects of operational variables on pulp yield and lignin solubilization. Bioresource
Technology, v.58, p.1723, 1996.
INGESSON, H.; ZACCHI, G.; YANG, B.; ESTEGHLALIAN, A.R.; SADDLER, J.N. The
effect of shaking regime on the rate and extent of enzymatic hydrolysis of cellulose. Journal
of Biotechnology, v.88, p.177182, 2001.
IRICK, T.J.; WEST, K.; BROWNELL, H.H.; SCHWALD, W.; SADDLER, J.N. Comparison
of colorimetric and HPLC techniques for quantitating the carbohydrate components of steam
Treated wood. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.17, p.137-149, 1988.
161
JIMNEZ, L.; PREZ, I.; DE LA TORRE, M.J.; GARCA, J.C. The effect of processing
variables on the soda pulping of olive tree wood. Bioresource Technology, v.69, p.95-102,
1999.
JIMNEZ, L.; RAMOS, E.; RODRGUEZ, A.; DE LA TORRE, M.J.; FERRER, J.L.
Optimization of pulping conditions of abaca. An alternative raw material for producing
cellulose pulp. Bioresource Technology, v.96, p.977-983, 2005.
JIN, B.; HUANG, L.P.; LANT, P. Rhizopus arrhizus a producer for simultaneous
saccharification and fermentation of starch waste materials to L(+)-lactic acid. Biotechnology
Letters, v.2, p.19831987, 2003.
JOHN, R.P.; NAMPOOTHIRI, K.M.; PANDEY, A. Solid-state fermentation for L-lactic acid
production from agro wastes using Lactobacillus delbrueckii. Process Biochemistry, v.41,
p.759-763, 2006.
KABEL, M.A.; CARVALHEIRO, F.; GARROTE, G.; AVGERINOS, E.; KOUKIOS, E.;
PARAJ, J.C.; GRIO, F.M.; SCHOLS, H.A.; VORAGEN, A.G.J. Hydrothermally treated
xylan rich by-products yield different classes of xylo-oligosaccharides. Carbohydrate
Polymers, v.50, p.47-56, 2002.
KARAM, J.; NICELL, J.A. Potential applications of enzymes in waste treatment. Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, v.69, p.141-153, 1997.
KAUR, P.P.; ARNEJA, J.S.; SINGH, J. Enzymic hydrolysis of rice straw by crude cellulase
from Trichoderma reesei. Bioresource Technology, v.66, p.267-269, 1998.
KAYA, F.; HEITMANN, J.A.; JOYE, T.W. Influence of lignin and its degradation products
on enzymatic hydrolysis of xylan. Journal of Biotechnology, v.80, p.241-247, 2000.
KENDAL, N.T. Barley and malt. In: HARDWICK, W.A. (ed.). Handbook of Brewing. New
York: Marcel Dekker, 1994. p.109-120.
KHAN, A.W.; LAMB, K.A.; SCHNEIDER, H. Recovery of fermentable sugars from the
brewers' spent grains by the use of fungal enzymes. Process Biochemistry, v.23, p.172-175,
1988.
KHRISTOVA, P.; KORDSACHIA, O.; KHIDER, T. Alkaline pulping with additives of date
palm rachis and leaves from Sudan. Bioresource Technology, v.96, p.79-85, 2005.
162
KIM, S.B.; YUM, D.M.; PARK, S.C. Step-change variation of acid concentration in a
percolation reactor for hydrolysis of hardwood hemicellulose. Bioresource Technology, v.72,
p.289-294, 2000.
KIM, T.; LEE, Y.; KIM, P.; KIM, C.S.; OH, D. Increased xylitol production rate during long
term cell recycle fermentation of Candida tropicalis. Biotechnology Letters, v.26, p.623-
627, 2004.
KWON, S.; LEE, P.C.; LEE, E.G.; CHANG, Y.K.; CHANG, N. Production of lactic acid by
Lactobacillus rhamnosus with vitamin-supplemented soybean hydrolysate. Enzyme and
Microbial Technology, v.26, p.209-215, 2000.
LAPIERRE, L.; BERRY, R.; BOUCHARD, J. The effect of magnesium ions and chelants on
peroxide bleaching. Holzforschung, v.57, p.627-633, 2003.
LAVARACK, B.P.; GRIFFIN, G.J.; RODMAN, D. The acid hydrolysis of sugarcane bagasse
hemicellulose to produce xylose, arabinose, glucose and other products. Biomass and
Bioenergy, v.23, p.367-380, 2002.
LEHTINEN, P.; LAAKSO, S. Effect of extraction conditions on the recovery and potency of
antioxidants in oat fiber. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.46, p.4842-4845,
1998.
LIAO, W.; WEN, Z.; HURLEY, S.; LIU, Y.; LIU, C.; CHEN, S. Effects of hemicellulose and
lignin on enzymatic hydrolysis of cellulose from dairy manure. Applied Biochemistry and
Biotechnology, v.121/124, p.10171029, 2005.
LINKO, M.; HAIKARA, A.; RITALA, A.; PENTTIL, M. Recent advances in the malting
and brewing industry. Journal of Biotechnology, v.65, p.85-98, 1998.
LPEZ, F.; ARIZA, J.; EUGENIO, M.E.; DAZ, J.; PREZ, I.; JIMNEZ, L. Pulping and
bleaching of pulp from olive tree residues. Process Biochemistry, v.37, p.17, 2001.
LPEZ, F.; ARIZA, J.; PREZ, I.; JIMNEZ, L. Comparative study of paper sheets from
olive tree wood pulp obtained by soda, sulphite or kraft pulping. Bioresource Technology,
v.71, p.83-86, 2000.
LPEZ, F.; DAZ, M.J.; EUGENIO, M.E.; ARIZA, J.; RODRGUEZ, A.; JIMNEZ, L.
Optimization of hydrogen peroxide in totally chlorine free bleaching of cellulose pulp from
olive three residues. Bioresource Technology, v.87, p.255261, 2003.
MANCILHA, I.M.; KARIM, M.N. Evaluation of ion exchange resins for removal of
inhibitory compounds from corn stover hydrolyzate for xylitol fermentation. Biotechnology
Progress, v.19, p.1837-1841, 2003.
MANSFIELD, S.D.; MOONEY, C.; SADDLER, J.N. Substrate and enzyme characteristics
that limit cellulose hydrolysis. Biotechnology Progress, v.15, p.804816, 1999.
MARIANI, E. Chromatographic examination of the amino acids of beer and spent grains.
Brasserie et Malterie de Belgique, v.3, p.50-53, 1953.
164
MARTN, C.; GALBE, M.; NILVEBRANT, N-O.; JNSSON, L.J. Comparison of the
fermentability of enzymatic hydrolyzates of sugarcane bagasse pretreated by steam explosion
using different impregnating agents. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.98/100,
p.699716, 2002.
MARTN, C.; KLINKE, H.B.; THOMSEN, A.B. Wet oxidation as a pretreatment method for
enhancing the enzymatic convertibility of sugarcane bagasse. Enzyme and Microbial
Technology, v.40, p.426 432, 2007.
MARTINEZ, A.; RODRIGUEZ, M.E.; YORK, S.W.; PRESTON, J.F.; INGRAM, L.O.
Effects of Ca(OH)2 treatments (overliming) on the composition and toxicity of bagasse
hemicellulose hydrolysates. Biotechnology and Bioengineering, v.69, p.526-536, 2000.
MILLER, G.M. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.
Analytical Chemistry, v.31, p.426-428, 1959.
MIURA, S.; ARIMURA, T.; HOSHINO, M.; KOJIMA, M.; DWIARTI, L.; OKABE, M.
Optimization and scale-up of L-lactic acid fermentation by mutant strain Rhizopus sp. MK-
96-1196 in airlift bioreactors. Journal of Bioscience and Bioengineering, v.96, p.6569,
2003.
MOLDES, A.B.; ALONSO, J.L.; PARAJ, J.C. Cogeneration of cellobiose and glucose from
pretreated wood and bioconversion to lactic acid: A kinetic study. Journal of Bioscience and
Bioengineering, v.87, p.787792, 1999.
MUSSATTO, S.I.; ROBERTO, I.C. Xylitol production from high xylose concentration:
Evaluation of the fermentation in bioreactor under different stirring rates. Journal of Applied
Microbiology, v.95, p.331-337, 2003.
MUSSATTO, S.I.; ROBERTO, I.C. Xylitol: An edulcorant with benefits for human health.
Brazilian Journal of Pharmaceutical Science, v.38, p.401-413, 2002.
MUSSATTO, S.I.; SANTOS, J.C.; ROBERTO, I.C. Effect of pH and activated charcoal
adsorption on hemicellulose hydrolysate detoxification for xylitol production. Journal of
Chemical Technology and Biotechnology, v.79, p.590-596, 2004.
NASCIMENTO, R.P.; COELHO, R.R.R.; MARQUES, S.; ALVES, L.; GRIO, F.M.; BON,
E.P.S.; AMARAL-COLLAO, M.T. Production and partial characterisation of xylanase from
Streptomyces sp. strain AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil. Enzyme and Microbial
Technology, v.31, p.549-555, 2002.
NEUREITER, M.; DANNER, H.; FRHAUF, S.; KROMUS, S.; THOMASSER, C.;
BRAUN, R.; NARODOSLAWSKY, M. Dilute acid hydrolysis of presscakes from silage and
grass to recover hemicellulose-derived sugars. Bioresource Technology, v.92, p.21-29, 2004.
NEUREITER, M.; DANNER, H.; THOMASSER, C.; SAIDI, B.; BRAUN, R. Dilute-acid
hydrolysis of sugarcane bagasse at varying conditions. Applied Biochemistry and
Biotechnology, v.98/100, p.49-58, 2002.
OH, H.; WEE, Y-J.; YUN, J-S.; HAN, S.H.; JUNG, S.; RYU, H-W. Lactic acid production
from agricultural resources as cheap raw material. Bioresource Technology, v.96, p.1492-
1498, 2005.
HGREN, K.; BURA, R.; SADDLER, J.; ZACCHI, G. Effect of hemicellulose and lignin
removal on enzymatic hydrolysis of steam pretreated corn stover. Bioresource Technology,
v.98, p.25032510, 2007.
OJAMO, H.; YLINEN, L.; LINKO, M. Process for the preparation of xylitol from xylose
by cultivating Candida guilliermondii. US Patent WO 88/05467, 28 julho 1988.
OOSHIMA, H.; BURNS, D.S.; CONVERSE, A.O. Adsorption of cellulase from Trichoderma
reesei on cellulose and lignacious residue in wood pretreated by dilute sulfuric acid with
explosive decompression. Biotechnology and Bioengineering, v.36, p.446452, 1990.
166
OU, S.; KWOK, K-C. Ferulic acid: Pharmaceutical functions, preparation and applications in
foods. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.84, p.1261-1269, 2004.
ZTRK, S.; ZBOY, .; CAVIDOGLU, I.; KKSEL, H. Effects of brewers spent grain
on the quality and dietary fibre content of cookies. Journal of the Institute of Brewing,
v.108, p.23-27, 2002.
PAN, X.; XIE, D.; GILKES, N.; GREGG, D.J.; SADDLER, J.N. Strategies to enhance the
enzymatic hydrolysis of pretreated softwood with high residual lignin content. Applied
Biochemistry and Biotechnology, v.121/124, p.1069-1079, 2005.
PARAJ, J.C.; ALONSO, J.L.; SANTOS, V. Lactic acid from wood. Process Biochemistry,
v.31, p.271-280, 1996.
PARAJ, J.C.; DOMINGUEZ, H.; DOMINGUEZ, J.M. Improved xylitol production with
Debaryomyces hansenii Y-7426 from raw or detoxified wood hydrolysates. Enzyme and
Microbial Technology, v.21, p.18-24, 1997.
PARAJ, J.C.; DOMINGUEZ, H.; DOMINGUEZ, J.M. Production of xylitol from raw wood
hydrolysates by Debaryomyces hansenii NRRL Y-7426. Bioprocess Engineering, v.13,
p.125-131, 1995.
PAULI, T.; FITZPATRICK, J.J. Malt combing nuts as a nutrient supplement to whey
permeate for producing lactic by fermentation with Lactobacillus casei. Process
Biochemistry, v.38, p.1-6, 2002.
PERRY, R.H.; GREEN, D.W. Perrys Chemical Engineering Handbook. 7th ed. New
York: McGraw-Hill, 1997. 2460 p.
RAHMAWATI, N.; OHASHI, Y.; HONDA, Y.; KUWAHARA, M.; FACKLER, K.;
MESSNER, K.; WATANABE, T. Pulp bleaching by hydrogen peroxide activated with copper
2,2-dipyridylamine and 4-aminopyridine complexes. Chemical Engineering Journal, v.112,
p.167-171, 2005.
167
RAMOS, L.P.; NAZHAD, M.M.; SADDLER, J.N. Effect of enzymatic hydrolysis on the
morphology and fine structure of pretreated cellulosic residues. Enzyme and Microbial
Technology, v.15, p.821-831, 1993.
RAMOS, L.P.; SADDLER, J.N. Enzyme recycling during fed-batch hydrolysis of cellulose
derived from steam-exploded Eucalyptus viminalis. Applied Biochemistry and
Biotechnology, v.45/46, p.193-207, 1994.
RICHTER, K.; BERTHOLD, C. Biotechnological conversion of sugar and starchy crops into
lactic acid. Journal of Agricultural Engineering Research, v.71, p.181-191, 1998.
ROBERTO, I.C.; FELIPE, M.G.A.; LACIS, L.C.; SILVA, S.S.; MANCILHA, I.M.
Utilization of sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolyzate by Candida guilliermondii for
xylitol production. Bioresource Technology, v.36, p.271-275, 1991a.
SANTOS, F.; CURVELO, A.A.S. Recovery of lignins from kraft liquors. In: BRAZILIAN
SYMPOSIUM ON THE CHEMISTRY OF LIGNINS AND OTHER WOOD
COMPONENTS, 6., 2001, Guaratinguet. Proceedings of the 6th Brazilian Symposium on
the Chemistry of Lignins and other Wood Components, 2001. p.310314.
SANTOS, M.; JIMNEZ, J.J.; BARTOLOM, B.; GMEZ-CORDOVS, C.; DEL NOZAL,
M.J. Variability of brewers spent grain within a brewery. Food Chemistry, v.80, p.17-21,
2003.
168
SATTLER, W.; ESTERBAUER, H.; GLATTER, O.; STEINER, W. The effect of enzyme
concentration on the rate of the hydrolysis of cellulose. Biotechnology and Bioengineering,
v.33, p.12211234, 1989.
SILVA, F.T.; ROCHA, G.J.M.; MOURA, R.M.B. Separation and integral use of sugar cane
bagasse. In: INTERNATIONAL CONFERENCE ON BIOMASS FOR ENERGY AND
INDUSTRY, 5., 1989, Lisboa. Proceedings. London: Elsevier Applied Science, 1990. p.999-
1004.
SUHAS, CARROTT, P.J.M.; RIBEIRO CARROTT, M.M.L. Lignin from natural adsorbent
to activated carbon: A review. Bioresource Technology, v.98, p.2301-2312, 2007.
SUN, J.X.; SUN, X.F.; SUN, R.C.; SU, Y.Q. Fractional extraction and structural
characterization of sugarcane bagasse hemicelluloses. Carbohydrate Polymers, v.56, p.195-
204, 2004.
SUN, J.X.; XU, F.; SUN, X.F.; XIAO, B.; SUN, R.C. Physico-chemical and thermal
characterization of cellulose from barley straw. Polymer Degradation and Stability, v.88,
p.521-531, 2005.
SUN, R.C.; TOMKINSON, J.; MA, P.L.; LIANG, S.F. Comparative study of hemicelluloses
from rice straw by alkali and hydrogen peroxide treatments. Carbohydrate Polymers, v.42,
p.111-122, 2000.
TANAKA, R.; WAN ROSLI, W.D.; MAGARA, K.; IKEDA, T.; HOSOYA, S. Chlorine-free
bleaching of kraft pulp from oil palm empty fruit bunches. Japan Agricultural Research
Quarterly, v.38, p.275279, 2004.
TANAKA, T.; HOSHINA, M.; TANABE, S.; SAKAI, K.; OHTSUBO, S.; TANIGUCHI, M.
Production of D-lactic acid from defatted rice bran by simultaneous saccharification and
fermentation. Bioresource Technology, v.97, p.211217, 2006.
TAPPI Technical Association of the Pulp and Paper Industry. TAPPI Standard Methods.
T 203 om-88, 1991.
TAPPI Technical Association of the Pulp and Paper Industry. TAPPI Standard Methods.
T 236 cm-85, 1985.
169
TAPPI Technical Association of the Pulp and Paper Industry. TAPPI Standard Methods.
T 230 om-82, 1982.
TENGBORG, C.; GALBE, M.; ZACCHI, G. Influence of enzyme loading and physical
parameters on the enzymatic hydrolysis of steam-pretreated softwood. Biotechnology
Progress, v.17, p.110117, 2001.
THEANDER, O.; AMAN, P. Anatomical and chemical characteristics. In: SUNDSTOL, F.;
OWEN, E. (eds.). Straw and Other Fibrous by-Products as Feed. Amsterdam: Elsevier,
1984. p.45-78.
TOWNSLEY, P.M. Preparation of commercial products from brewers waste grain and trub.
MBAA Technical Quarterly, v.16, p.130-134, 1979.
TRAN, A.V.; CHAMBERS, R.P. Red oak wood derived inhibitors in the ethanol
fermentation of xylose by Pichia stipitis CBS 5776. Biotechnology Letters, v.7, p.841-846,
1985.
TUTUS, A. Bleaching of rice straw pulps with hydrogen peroxide. Pakistan Journal of
Biological Sciences, v.7, p.1327-1329, 2004.
van WYK, J.P.H. Paper hydrolysis by cellulase from Penicillium funiculosum and
Trichoderma viride. Bioresource Technology, v.63, p.275-277, 1998.
van ZYL, C.; PRIOR, B.A.; DU PREEZ, J.C. Production of ethanol from sugarcane bagasse
hemicellulose hydrolysate by Pichia stipitis. Applied Biochemistry and Biotechnology,
v.17, p.357-369, 1988.
VENTURINI FILHO, W.G.; CEREDA, M.P. Cerveja. In: LIMA, U.A.; AQUARONE, E.;
BORZANI, W.; SCHMIDELL, W. Biotecnologia Industrial. Volume 4. Biotecnologia na
Produo de Alimentos. So Paulo: Edgar Blcher, 2001. p.91-144.
WALTHER, T.; HENSIRISAK, P.; AGBLEVOR, F.A. The influence of aeration and
hemicellulosic sugars on xylitol production by Candida tropicalis. Bioresource Technology,
v.76, p.213-220, 2001.
WANG, D.; SAKODA, A.; SUZUKI, M. Biological efficiency and nutritional value of
Pleurotus ostreatus cultivated on spent beer grain. Bioresource Technology, v.78, p.293-300,
2001.
WANG, S.H.; FERGUSON, J.F.; McCARTHY, J.L. The decolorization and dechlorination of
kraft bleach plant effluent solutes by use of three fungi: Ganoderma lacidum, Coriolus
versicolor and Hericuim erinaceum. Holzforschung, v.46, p.219-223, 1992.
WEAST, R.C. CRC Handbook of Chemistry and Physics, 64th ed. Flrida:CRC Press,
1984.
WEE, Y-J.; YUN, J-S.; KIM, D.; RYU, H-W. Batch and repeated batch production of L(+)-
lactic acid by Enterococcus faecalis RKY1 using wood hydrolysate and corn steep liquor.
Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, v.33, p.431-435, 2006.
WEN, Z.; LIAO, W.; CHEN, S. Hydrolysis of animal manure lignocellulosics for reducing
sugar production. Bioresource Technology, v.91, p.31-39, 2004.
WHITE, P.J.; XING, Y. Antioxidants from cereals and legumes. In: SHAHIDI, F. (ed.).
Natural antioxidants. Chemistry, Health Effects, and Applications. Illinois: AOCS Press,
1997. p.25-63.
WONG, K.K.Y.; DEVERELL, K.F.; MACKIE, K.L.; CLARK, T.; DONALDSON, L.A. The
relationship between fibre porosity and cellulosic digestibility in steam-explosed Pinus
radiata, Biotechnology and Bioengineering, v.31, p.447456, 1988.
XIAO, B.; SUN, X.F.; SUN, R. Chemical, structural, and thermal characterizations of alkali-
soluble lignins and hemicelluloses, and cellulose from maize stems, rye straw and rice straw.
Polymer Degradation and Stability, v.74, p.307319, 2001.
ZALDIVAR, J.; MARTINEZ, A.; INGRAM, L.O. Effect of alcohol compounds found in
hemicellulose hydrolysate on growth and fermentation of ethanologenic Escherichia coli.
Biotechnology and Bioengineering, v.68, p.524-530, 2000.
ZHAO, J.; LI, X.; QU, Y.; GAO, P. Xylanase pretreatment leads to enhanced soda pulping of
wheat straw. Enzyme and Microbial Technology, v.30, p.734-740, 2002.
172
ANEXOS
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Brewer's Spent Grain: Generation,
Characteristics and Potential Applications. Journal of Cereal Science, v.43, p.1-14, 2006.
MUSSATTO, S.I., ROBERTO, I.C. Acid Hydrolysis and Fermentation of Brewer's Spent
Grain to Produce Xylitol. Journal of the Science of Food and Agriculture, v.85, p.2453-
2460, 2005.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Influence of the Toxic Compounds
Present in Brewer's Spent Grain Hemicellulosic Hydrolysate on Xylose-to-Xylitol
Bioconversion by Candida guilliermondii. Process Biochemistry, v.40, p.3801-3806, 2005.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROCHA, G.J.M., ROBERTO, I.C. Optimum Operating
Conditions for Brewer's Spent Grain Soda Pulping. Carbohydrate Polymers, v.64, p.22-28,
2006.
MUSSATTO, S.I., DRAGONE, G., ROBERTO, I.C. Ferulic and p-Coumaric Acids
Extraction by Alkaline Hydrolysis of Brewer's Spent Grain. Industrial Crops and Products,
v.25, p.231-237, 2007.
MUSSATTO, S.I., FERNANDES, M., ROBERTO, I.C. Lignin Recovery from Brewer's
Spent Grain Black Liquor. Carbohydrate Polymers, in press.
MUSSATTO, S.I., FERNANDES, M., DRAGONE, G., MANCILHA, I.M., ROBERTO, I.C.
Brewers Spent Grain as Raw Material for Lactic Acid Production by Lactobacillus
delbrueckii UFV H2B20. Biotechnology Letters, (aceito).
173
Para complementar este estudo, dando continuidade aos processos qumicos e biotecnolgicos
avaliados para aproveitamento integral do bagao de malte, so dadas as seguintes sugestes:
Realizar uma anlise dos custos envolvidos envolvidos na fermentao para produo de
xilitol a partir do hidrolisado hemicelulsico nas formas diluda e concentrada, para avaliar o
que seria mais vantajoso: utilizar o hidrolisado diludo como meio de fermentao e obter
uma concentrao menor de xilitol, ou, utilizar o hidrolisado concentrado como meio de
fermentao, porm, devendo realizar uma etapa de destoxificao prvia fermentao para
poder obter uma concentrao mais elevada de xilitol.
Realizar testes mecnicos na polpa de celulose branqueada para verificar sua possibilidade de
emprego na produo de papis.
Avaliar outras variveis do processo para produo de carvo ativado visando melhorar a
capacidade de remoo de compostos fenlicos e de alguns metais que foram removidos em
pequena proporo, tais como clcio, magnsio, zinco e alumnio.