Casa abierta al tiempo

UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA

UNIDA0 IZTAPALAPA

-’DIVISIÓN DE CIENCIAS BIOLÓGICAS Y DE LA SALUD

DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGíA

J’EFECTO DE BAP Y AIA EN EL ESTABLEC~MIENTODE CULTIVOS in

vitro DE EXPLANTES NODALES DE Prosopis leevigata (MUQUITE)

/ALUMNO:GUILLERMO LARA ORTIZ

MATRICULA: 91234314

PARA LA OBTENCIÓN DEL GRADO DE:

J’LlCENCiATURA EN BlOLOGiA EXPERIMENTAL

4-7
ASESOR Dr. FRANCISCO CRUZ SOSA

MARZO DEL 2001

INTRODUCCION

El cultivo de tejidos vegetales es un proceso de cultivo invitro de cualquier

parte de la planta, desde una célula, un tejido, hasta un Órgano bajo
condiciones asépticas, aunque se ha sugerido un uso mas restringido del
concepto. Esta técnica comprende en primer témino el aislamiento de
alguna sección de la planta (explante), para posteriormente colocar esta
sección en un medio de cuttivo (con nutrientes y fitoregutadores) que
garanticen la expresión de sus potenciales intrincecos o inducidos
(Thorpe, 1981). Además es necesario proporcionar a este sistema (medio-
inóculo) las condiciones ambientales específicas (principalmente de
temperatura y fotoperiodo) que faciliten la multiplicación celular. El
procedimiento de inoculación del explante en el medio debe efectuarse en
un campo aséptico e implica la desinfección del expfante y la esteriiiación
del medio de cultwo para evitar contaminación por bacteriasis,algas,
hongos y otros contaminantes (Casselts, 2993).
El cultivo de tejlsios vegetales es de gran utifidad en el eSkKfi0 de aspectos
fisiolOgicos bioquimicos, genéticos y estructurales relacionados con las
pfantas (Wetherefl, 1985.).

Micropropagación

La micropropagación es la propagación vegetativa invitro de una espacie

de interes (económico o científico) u€itizando las diferentes técnicas de
cultivo de tejidos (principalmente cuNvo de callos, de células en
suspensión, de órganos, merisfmos y de protoplastos }, con et fin de
obtener el mayor n ú m posible de ptántulas con el mismo genotipo de fa
planta de la cual se tomó ei tejido,( Torres,1989 1,por lo tanto, los factores
que afectan el decarrollo ewtosa de un cuttivo de fejiios son también muy
importantes en la micropropagación. Dentro de bs fadores más
importantes que debemos considerar son (Hughes, I981).

0 Constitución del medio: Macro y micronutrientes, fuentes de c a b n o y

energía, vitaminas, fitoregukdores (p-incipalmente auxinas y cíticinínas
y otros m p & o s arg&nicascomo aminoácidos y myo-inosifoi.
0 El explante: Tamaño, fuente del explante, edad f&obgca del mismo y
de la planta madre.
6 Luz: Fotoperioda, Longitudde onda e intensidad de luz
Temperatura.: La óptima para la especie, fa cual debe defeminarse.
Respecto a los fitoreguladores, los primeros estudios realizados por Skoog
y MIilleF indicaron que las p~aporcianes de auxinas y cibcininas
determinaban el tipo y extensión de la organogenesis (proliferación y
diferenciación celular por la cual se forman los órganos de una planta de
novo), teniendo este hallazgo una gran influencia en las investigaciones
subsecuentes. En general una relación alta citocinina/auxina promueve la
formación de brotes (retoños), y una relación baja la formación de raíz,
aunque no existe una relación universal para inducir algun tipo de
morfogénesis. Hay una gran variabilidad de los niveles de auxinas y
citacininas requeridas para obtener organagénesis en losdiferentes taxa y
diferentes genotipos, por lo tanto estos niveles deben ser determinados en
cada especie o variedad, adernas los requerimientos de fitoregutadores
pueden variar en una misma planta dependiendo del tipo de tejido u
Órgano que se utilice (Hugues, 1981. Murashige, 1974.).

La micropropagación se puede dividir en tres fases, aunque algunos

investigadores consideran das más ( üebergh and Maene, 1981) :

0 Fase O Precultívo de materiales parentales.

0 Fase 1 Establecimiento o iniciación de cultivos acépticoc.
Fase 2 Multiplicación.
Fase 3 Enraizamiento y preadaptación de microcortes in vitro.
Fase 4 Transplante a tierra y adaptación.

Existe una gran variedad de especies arbóreas de importancia económica

en casi todo el territoria mexicana. Su cultivo requiere de tiempos
prolongados debido a que por lo general el ciclo de vida de los árboles es
en términos generales muy largo y para su utilización comercial es
necesario el transcurso de hasta 20 aiios o más. El empleo de la
propagación vegetativa es una opción para hacer proliferar árboles
adultos seteccionados por tener ciertas características fenotípicas. ,Aún
cuando este proceso es difícil y toma bastante tiempo, empleando
técnicas de cultivo de tejidos para la propagación vegetativa de plantas
herbáceas se ha log~adoobtener buenos resdtadoc para este mismo fin,
en especies maderables (Jones,l983).

Si bien, existen ya métodos de cuitivo de tejidos que se han aplicado con

&ita en muchos especies de árbc4e-s cultivables, es necesarii efectuar,
cuando se va a trabajar con una especie específica y de la cual no se
tienen antecedentec de trabajos ctmdares, los estudbs perttnentes para
establecer las condiciones más favorables que permitan la
micropropagación de dicha especie(Orozco,1996).

ANTECEDENTES

Las técnicas de propagación masiva de diferentes especies con interés

comx&, biotecfwk5gco y eco+@w &recen varias ventajas con
respecto a las convencionales. Dentro de este contexto, estas técnicas
ofrecen una alternativa real de micropropagacion para una planta como P.
laevgata (Orazc0,1996), la cuai tiene prácticamente un uso generaúzado
de todas las partes que la constituyen (madera, flores semillas, raíces,
etc)., to que ta crrrívierte en un r-emrso natural muy importante
(combustible, medicinal, alimenticio, artesanal, agropecuario, etc.) (García
y Galindo, 1996).

Existen actualmente en la literatura trabajos sobre micropropagación de

especiec del g&?m PlpsopIs.,stendo la &nka ntás uklizada la del
cultivo de segmentos nodales, en medio MS como medio de
establecimiento y muItipficacion, asi como la utfiización de ácido
indolbutírim @El) para la inducción de raíces adulroticias (Qrozcal996).

Yachpai y Arya (1984), propagaron P.cinecaria mediante el cultivo de

yemas, utilizando diferentes auxinas: ácido naftalenacético (ANA), ácido
indolbutírico (AIB) y ácido indolacético (AIA), cultivadas en medio MS
suplementado Con 0.05 mg/L de cinetina, observando que la formación de
callo es recurrente en cada una de las combinaciones probadas. Además
de que AIB no favorecía la emergencia de brotes.

lmplementando una técnica diferente al cultivo de segmentos nodales,

Woods, en 1985, utüka como fuente de explantes hipocótüos, raíces y
brotes terminales de plántulas de f.alba, todas provenientes de semillas
germinadas, in wtm; como resultado de sus investigaciones encontro que
los hipocótiloc en su totalidad formaban callo al igual que las raíces, por
otra parte se logró establecer el cultivo de brotes, sin embargo, al iniciar la
fase de muttiphcaciónesta tuvo un recuttab0 ftegativo (Woods,1985).

Tabone, et al (1986), tomando Corno explantes yemas laterales, cultivaron

P. alba, encontrando que una combinación de 15 mg/L de BAP y 5 mg/L
de AIA favorece la proliferación y desarrollo de yemas.

Arya y Shekhawat (1986), micropagaron plantas de P. cineraria,

obteniendo en sus experimentos que la combinación más favorable para
el desarrollo de los explantes (yemas axilares y terminales) fué la que
comprendía 0.05 mg/L de cinetina y 3.0 mg/L de AJA. También
encuentran que al sustituir la cinetina por 2-4 mg/L de 2,443 se producen
raíces adventicias en los explantes y que al utilizar una concentración
mayor de 2,443 se induce la formación de callo.

En 1989, Bathchelor y sus colaboradores lograron la micropropagación a

partir de explantes nodales de P. sineraria, P. tamarugo, P. chilensis.

Balboa y Arce en 1991 utilizando segmentos nodales como explantes y

medio MS suplementado con 5.0 mg/L y 10.0 mg/L de cisteína, lograron
micropagar P. chilensis.

Orozco en 1996 utilizó como explantes segmentos nodales de P. laevigata

utilizó una citocinina (bencilaminopurina, BAP) en tres diferentes
combinaciones, con dos auxinas (ácido naftalenacético,ANA y con ácido
indolbutírico,AIB) también en tres diferentes concentraciones.
Encontrándose los siguientes resultados: primero, en todos los
tratamientos probados hubo formación de callo, incluyendo los controles
(carentes de fitorregulador). También se encontró que las condiciones
más favorables para la obtención del mayor número de brotes son cuando
el medio está suplementado con 5.0 mg/L de BAP y 1.O mg/L de ANA (4
brotes en promedio). Por otra parte los resultados encontrados arrojaron la
hipótesis de que BAP por si misma está promoviendo la proliferación de
brotes. Por Último, ninguna de las combinaciones de reguladores de
crecimiento vegetal probadas en este trabajo promovió la formación de
raíces adventicias. Este trabajo, puede ser considerado como iniciador en
el estudio de las condiciones requeridas para desarrollar la
micropropagación de P./aevigata,sin embargo, es necesario ampliar estos
estudios y corroborar, en primer lugar, la hipótesis que de él se
desprende, además es importante aumentar el espectro de
fitorreguladores utilizados y determinar cuales de ellos son los más
convenientes para lograr este proceso.
JUSTlFlCAClON

La explotación comercial de un recurso natural por lo general promueve

una presión muchas veces mayor a la capacidad de autoregeneración de
ese recurso. En el caso del mezquite, no obstante ser ya un recurso de
uso extensivo, se abre la posibilidad de ser utilizado en la industria
alimenticia ya que la resina o exudado que produce puede funcionar como
un sustituto más económico de la goma arábiga. Por lo tanto, es
importante establecer las primeras fases que permitan en un momento
dado la micropropagación de esta especie y con el auxilio de esta técnica
evitar en Io posible un desequilibrio ecológico (Woods,l985) en los
hábitats en los que el mezquite está inserto. Además, a través del cultivo
de tejidos puede obtenerse valiosa información acerca de su fisiología,
bioquímica y genética (Sanchez,l985. Street,l977).

OBJETIVO GENERAL

Establecer cultivos in vifm a partir de explantes nodales de P. laevigata

con fines de propagación, usando corno fitoreguladores bencilaminopurina
(BAP) y ácido indolacético (AIA).

OBJETIVO PARTICULAR

Determinación del efecto organogénico de los fitoreguladores

bencilaminopunna (BAP) y ácido indolacético (AIA) en explantes nodales
de P. laevigata.

METODOLOGIA.

Establecimiento de cultivos in vitro

1. Selección y desinfección de explantes: se utilizarán explantes nodales,

provenientes de plantas de mezquite cultivadas en invernadero con una
edad promedio de 6 meses. Los explantes contarán con dos nudos cada
uno, se lavarán con detergente y agua corriente, posteriormente se
sumergirán en una solución de etanol al 70% por un minuto. Una vez
drenado el etanol, los explantes se volverán a desinfectar en una solución
de hipoclorito de sodio comercial sin diluir, durante I O min Pasados 10
min. se procederá a enjuagar cinco veces los explantes con agua
destilada estéril (Dodds and Lorin,1985) (Tisserat,1985).

2. Medios de cultivo, inoculación e incubación: terminada la desinfestación

, se cortan los extremos de los explantes para eliminar el tejido dañado
por la solución de hipoclorito de sodio. Posteriormente se colocarán en
una solución antioxidante durante 15 min., Esta solución consta de 50
mg/L de ácido ascórbico + 100 mgíL de ácido cítrico (Bachelor et
a1.,1985).

Después de haber sido desinfestadas y tratadas con antioxidantes, los

explantes se sembrarán en medio de cultivo MS (SIGMA-5519),
suplementado con sacarosa (3.0%), glutamina (1.6 SIL), ácido ascórbico
(50 rng/L),ácido cítrico (I00 mg/L), agar (0.8%) y diferentes
concentraciones de BAP y AIA (ver los rangos en las tablas 1 y 2),
probándose en total 20 tratamientos diferentes (Bachelor et al.,l989). El
medio de cultivo se ajusta a un pH de 5.7-5.8, esterilizándose a 12’1°C
durante 15 min.

Se utilizarán tubos de cultivo (25x150 mm), con tapas de plástico (Sigma);

colocándose un explante por recipiente. La incubación se llevara a cabo a
25°C f 3”C, con un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad, bajo
una intensidad luminosa de 2000 lux (27 mmol m-* s-’)(Fowler and
Rayns,1993. Bidwel,l979).

TRATAMIENTOS

Se probará una citocinina (bencilaminopurina, BAP) en cuatro diferentes

concentraciones sin combinar y en combinación con una auxina (ácido
indoladtico, AIA) en 16 diferentes concentraciones, (tablas 1 y 2). En
total, se trabajarán 20 tratamientos, más dos lotes control (carentes de
reguladores decrecimiento)(fowlerand Rayns,1993. Bidwel, 1979).

Los diferentes tratamientos constarán de 1O unidades experimentales (se

considera una unidad experimental a cada uno de los explantes), con dos
repeticiones cada uno.
Variables: A los 40 días de incubación se procederá a medir las siguientes
variables, siendo estas tanto cuantitativas como cualitativas:

-21 Número y longitud de brotes

Número de raíces
2 Presencia de callo

La variable de mayor interés es el número y longitud de brotes ya que es a

partir de ellos, en que sería más fácil (al menos hasta este momento)
llevar a cabo la micropropagación. La cuantificación del número de raíces
y presencia de callo es de interés sólo como instrumento comparativo con
respecto a los trabajos revisados en la

Tabla 1. Combinaciones de BAP

BAP (mglL)

1.o B
5.0 C
10.0 D
* Lote

Tabla2. Combinaciones de BAP y AIA

1.o I J K L
5.0 M N O P
10.0 Q R S T
RESULTADOSY DISCUSION

Tabla 3.Tratamientos con BAP. Porcentaje de explantes nodales

con formación de callo y número y longitud (cm) de brotes
obtenidos despues de 40 días de incubación.

Las cifras presentadas son el resultado de 20 observaciones.

Tabla 4.Tratamientos con BAP y AIA.Porcentaje de explante con

formación de callo, y numero y longitud (cm) de brotes obtenidos
después de 40 días de incubación.

Las cifras presentadas son el promedio de 20 observaciones.

La tabla tres nos muestra los resultados obtenidos al aplicar a explantes

nodales diferentes concentraciones de BAP. En las concentraciones
probadas no se observa una acción organogénica importante, por lo
tanto no apoyan la hipótesis de que la citocinina bencilaminopurina
promueve por si sola la proliferación de brotes.
Con respecto a la producción de callo no se observa un patrón
determinado por el incremento del fitoregulador ya que hay una
producción similar a 0.1 mg/L que a 5.0 mg/L.

La tabla 4 en primer término nos indica las concentraciones empleadas

combinadamente de ambos reguladores de crecimiento. En cuanto al
número y longitud de brotes no se observa una promoción significativa
en ninguno de los dos parámetros cuantificados. La producción de callo
se vio favorecido únicamente en la combinación de 1.0 mg/L. de BAP
con O. 1 mg/L. de AIA una producción importante.

CONCLUSIONES

1. Las concentraciones empleadas de BAP en los cultivos de explantes

nodales de P.leavigafa, no muestran una acción inductora de brotes, en
los tratamientos realizados, descartandose la hipótesis de que este
fitoregulador promueva por si mismo la formación de brotes a estas
concentraciones.

2. Considerando que uno de los objetivos principales de la fase de

establecimiento de un cultivo vegetal in vitro es la obtención del mayor
número de explantes libres de contaminantes, las combinaciones de BAP
y AIA utilizadas en este trab en este trabajo, producen un mínimo de
brotes, por lo que se sugiere efectuar pruebas a otras concentraciones
diferentes con ambas hormonas vegetales para obserbar su efecto y
poder decidir si es viable el uso del AIA como auxina.

CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

Trimestre 96-0
Análisis bibliográfico
* Aprendizaje de técnicas de preparación y esterilización de cultivos de
tejidos vegetales.
 Primer tratamiento con BAP en cuatro diferentes concentraciones, sin
combinar.
I Medición de las diferentes variables a cuantificar.

Trimestre 97-1
Análisis bibliográfico.
6 Segundo tratamiento con BAP en cuatro diferentes concentraciones en
combinación con AIA en 16 diferentes concentraciones.
Medición de las diferentes variables a cuantificar.

Trimestre 97-P
Análisis bibliografico
48 Discusión de resultados. Conclusiones.
9 Elaboración de Reporte Final.

BIBLIOGRAFíA

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ABREVIATURAS.

x 2,4-D Acido 2,4-diclorofenoxiacético

- AIB Acido indolbutírico

4 ' ' ANA Acido -naftalena&tico

+ AIA Acido indolacético

BAP Bencilaminopurina

MS Medio Murashige and Skoog

Género Prosopis

*~ mg/L miligramo por litro