amplificacion de

ADN (PCR)
 Amplificacin de ADN
Aunque las libreras son muy eficaces y
utilizadas comnmente para clonar e identificar
un gen que nos interesa
La Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) es
una forma ms rpida de realizar la clonacin que
construir y revisar una librera
La PCR generalmente es una tcnica de eleccin

Fue desarrollada a mediados de los 1980s por Kary

Mullis
1993 se le otorg el Premio Nobel en Qumica
La PCR result ser una tcnica revolucionaria que ha
tenido gran impacto en muchas reas de biologa
molecular
 Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Hoy en da es la tcnica de mayor uso en la
biotecnologa
Deriva su nombre de uno de sus componentes
clave
La ADN polimerasa que se usa para amplificar (replicar)
un fragmento de ADN mediante replicacin enzimtica in
vitro

Conforme progresa una PCR

El ADN que se genera es utilizado en s mismo como templete
para la replicacin
Esto inicia una reaccin en cadena en el cual el fragmento
original de ADN se amplifica exponencialmente
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Con la PCR es posible
amplificar un solo fragmento o
unas cuantas copias de l en
varias rdenes de magnitud
generando millones de copias
del fragmento de ADN

La PCR puede ser llevada a

cabo sin restricciones en cuanto
a la forma del ADN

Puede ser modificada

extensamente para llevar a cabo
una gran variedad de
manipulaciones genticas
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Casi todos los usos de la PCR utilizan una
ADN polimerasa termoestable

Por ejemplo la Taq polimerasa que es

una enzima derivada de la bacteria
Thermus aquaticus.

Esta ADN polimerasa agrega

enzimticamente una nueva cadena de
ADN utilizando los componentes del
ADN
Los nucletidos, utilizando una
cadena sencilla de ADN como patrn
y oligonucletidos (cebadores,
primers, iniciadores) requeridos para
iniciar la sntesis de ADN
http://bitesizebio.com/wp-content/uploads/2007/10/pcr.gif
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
La gran mayora de los mtodos de PCR
usan termociclado
Calentar y enfriar alternadamente la
muestra de PCR mediante una serie
definida de pasos de temperatura

Estos diversos pasos son necesarios para

separar fsicamente las cadenas de una
doble hlice de ADN (fundido o
desnaturalizacin del ADN)
As como permitir la sntesis de ADN
mediante la ADN polimerasa para amplificar
selectivamente el ADN blanco

El poder y selectividad de la PCR se debe

principalmente a la seleccin de
cebadores que son altamente
complementarios a la regin que se quiere
amplificar
www.flmnh.ufl.edu/cowries/PCR.gif
As como tambin de las condiciones de
http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
 Reaccin en Cadena de la
Polimerasa (PCR)
Animacin de PCR:
Cold Spring Harbor: Dolan Learning Center
http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/pcr.html

Video chistoso sobre la PCR (remake de We Are the

World)

http://bio-rad.cnpg.com/lsca/videos/ScientistsForBett
erPCR/

http://en.wikipedia.org/wiki/Polymerase_chain_reaction
 PCR Transcriptasa
Reversa (RT-PCR)
Tcnica molecular que permite amplificar un fragmento definido de
cido ribonucleico (ARN)

La cadena de ARN se transcribe en su complementos de ADN o ADN

complementario
Luego se amplifica el ADN que resulta mediante una PCR simple
Esto puede llevarse a cabo tanto en 1 como en 2 pasos

La reaccin en cadena de la polimerasa en s misma es utilizada para

amplificar partes especficas de una molcula de ADN
Mediante la ADN polimerasa en gradientes de temperatura

La PCR de transcriptasa reversa no debe confundirse con la reaccin

en cadena de la polimerasa en tiempo real que tambin se
comercializa como RT-PCR
 PCR Transcriptasa
Reversa (RT-PCR)
En el primer paso de la RT-PCR que se conoce como reaccin de primera
cadena

Se forma el ADN complementario a partir de ARN mensajero utilizando dNTPs y una

polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa reversa) en el proceso de la
transcripcin reversa

La RT-PCR utiliza una caracterstica del ARNm maduro que se conoce como
regin de poliadenilacin 3, comnmente conocida como cola poli(A), como un
sitio de adhesin de cebadores poli(T)

En el caso del ARNm bacteriano, que no tienen la cola poli(A) se generan cebadores
especficos para amplificar la secuencia de ARNm blanco

Estos cebadores se adhieren (alinean) con la punta 3 de todos los ARNm en la

solucin permitiendo que se haga la sntesis 5->3 del ADN complementario
con la enzima de transcriptasa reversa

El ADNc puede tambin se obtenido del ARNm utilizando cebadores

especficos de un gen o cebadores hexamricos aleatorios
PCR en Tiempo Real
Tambin conocida como: Reaccin en Cadena de la Polimerasa
Cuantitativa en Tiempo Real (QRT-PCR) o Reaccin Cintica en
Cadena de la Polimerasa

Permite tanto la deteccin como la cuantificacin (ya sea como nmero

absoluto de copias o cantidad relativa cuando se normaliza a una
entrada de ADN u otros genes normalizantes) de una secuencia
especfica de ADN en una muestra

El procedimiento sigue el principio general de la reaccin en cadena de

la polimerasa
Su caracterstica clave es que el ADN amplificado se cuantifica en tiempo
real conforme se acumula en la reaccin despus de cada ciclo de
amplificacin

Dos de los mtodos comunes de cuantificacin son:

a) el uso de marcadores fluorescentes que se intercalan con el ADN de
doble cadena
B) sondas de oligonucletidos que fluorecen cuando se hibridan con el
ADN complementario
http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction
PCR en Tiempo Real
Frecuentemente la reaccin en cadena
de la polimerasa se combina con la
reaccin en cadena de la transcriptasa
reversa

Para cuantificar una baja abundancia de

ARN mensajero
Le permite al investigador cuantificar la
expresin relativa de un gen en un
momento determinado, en una clula en
particular o en tipo de tejido especfico

v Aunque la reaccin en cadena de la

polimerasa cuantitativa se comercializa
como RT-PCR
v No se debe confundir con la reaccin en
cadena de la transcriptasa reversa
tambin llamada RT-PCR

http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction
PCR en Tiempo Real

Un marcador de ADN se une a la cadena doble de ADN

(ADNdc) en una reaccin de PCR ocasionando
fluorescencia del marcador
Un incremento de producto de ADN durante la PCR
entonces implica un incremento en la intensidad de
fluorescencia que se mide en cada ciclo permitiendo
la cuantificacin de las concentraciones de ADN

Sin embargo los marcadores de ADNdc como el

SYBRGreen se unen a todos los productos ADNdc de
la PCR http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction
PCR en Tiempo Real

1. La reaccin se prepara igual que en una PCR estndar pero con la

adicin de el marcador fluorescente de ADN

2. La reaccin se lleva a cabo en un termociclador que despus de

cada ciclo mide los niveles de fluorescencia con un detector
El marcador solo fluoresce cuando se encuentra unido al ADNdc
(producto de PCR)

De manera similar a diluciones estndar se puede determinar la

concentracin del ADNdc
http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction
Real-Time PCR

De manera diagnstica la PCR en tiempo real se utiliza para detectar

rpidamente la presencia de genes involucradas en enfermedades
infecciosas, cncer y anormalidades genticas

En el mbito de la investigacin, la PCR en tiempo real se utiliza para

obtener mediciones altamente sensibles del nivel de transcripcin de genes
La tecnologa se puede utilizar para determinar cmo cambia la expresin
gentica de un gen a lo largo del tiempo
Como respuesta de cultivos bacterianos o celulares a la administracin de un agente
farmacolgico
El progreso en la diferenciacin celular, o
En respuesta a los cambios de condiciones ambientales

Tambin se utiliza en la Microbiologa Ambiental para cuantificar la

presencia de genes de resistencia en muestras de agua
http://en.wikipedia.org/wiki/Real-time_polymerase_chain_reaction