BIOQUMICA CLNICA

PRCTICAS

Prof. Lidn Badenes

Dept. Ciencias Biomdicas.
lidon.badenes@uch.ceu.es
 Determinacin de glucosa.
Mtodo GOD-POD.
Mtodo colorimtrico
La glucosa oxidasa (GOD) cataliza la oxidacin de glucosa a cido
glucnico. El perxido de hidrgeno (H2O2), producido se detecta mediante
un aceptor cromognico de Oxgeno, fenol-ampirona en presencia de
peroxidasa (POD)

Beta-D-Glucosa + O2 + H2O GOD cido glucnico + H2O2

H2O2 + Fenol + Ampirona POD Quinona + H2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de

glucosa presente en la muestra ensayada

Factor de conversin: md/dl x 0.0555 = mmol/l

Valores de normalidad: 60 110 mg/dl
 Determinacin de Colesterol
Mtodo CHOD- POD
Mtodo colorimtrico
El colesterol presente en la muestra origina un compuesto coloreado segn
la reaccin siguiente.

steres colesterol + H2O CHE Colesterol + cidos grasos

Colesterol + O2 CHOD 4-Colestenona + H2O2
2 H2O2 + Fenol + 4-Aminofenazona POD Quinonimina + 4H2O

La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de

colesterol presente en la muestra ensayada

CHOD: Colesterol-oxidasa
CHE : Colesterol estearasa
POD : Peroxidasa
Factor de conversin: mg/dl x 0.0258 = mmol/l
Valores de normalidad: Hasta 220 mg/dl
 Determinacin HDL-colesterol.
Mtodo Directo. Lquido Enzimtico
Mtodo colorimtrico

Determinacin directa del HDLc (Colesterol de Lipoproteinas de alta

densidad) sin necesidad de pre-tratamiento o centrifugado de la muestra.
La determinacin se realiza en dos pasos.

1- Eliminacin de lipoproteinas no-HDL

Esteres colesterol CHE Colesterol + cidos grasos
Colesterol + O2 CHOD 4-Colestenona + H2O2
2H2O2 Catalasa 2H2O + O2

2 Medicin de HDLc
Esteres colesterol CHE Colesterol + cidos grasos
Colesterol + O2 CHOD 4-Colestenona + H2O2
2H2O2 + HDAOS + 4-AA POD Quinonimina + 4H2O
 La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin del
HDLc presente en la muestra ensayada

CHE: Colesterol esterasa

CHOD:Colesterol oxidasa
POD: Peroxidasa
HDAOS: N-(2-hidroxi-3-sulfopropil)-3,5-dimetoxianilina

Factor de conversin: mg/dl x 0.0259 = mmol/l

Valores de normalidad: Hombres: 35 55 mg/dl
Mujeres : 45 65 mg/dl
Valorar ndices de riesgo.
 Determinacin de Triglicridos
Mtodo GPO-POD
Mtodo colorimtrico
Los Triglicridos incubados con lipoproteinlipasa (LPL) liberan
glicerol y cidos grasos libres.

El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y

ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-
fosfato (G3P) y adenosina-5 difosfato (ADP).

El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato (DAP) y

perxido de hidrgeno (H2O2) por GPO

Al final el perxido de hidrogeno (H2O2) reacciona con 4-

aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reaccin catalizada por la
peroxidasa (POD) dando una coloracin roja
Triglicridos + H2O LPL Glicerol+ cidos grasos libres
Glicerol + ATP Glicerol quinasa G3P + ADP
G3P + O2 GPO DAP + H2O2
H2O2 + 4-AF + P-Clorofenol POD Quinona + H2O

Factor de conversin: mg/dl x 0.0113 = mmol/l

Valores de normalidad: 40 150 mg/dl
 CREATININA

Se basa en la reaccin de Jaff, en la cual la creatinina, en medio

alcalino, reacciona con el picrato sdico formando un producto de
coloracin rojo-anaranjado que se valora espectrofotomtricamente.
El incremento cintico del complejo coloreado es proporcional a la
concentracin de creatinina en la muestra

Acido pcrico + creatinina ---------------- compuesto coloreado.

Factor de conversin: mg/dl x 88.33 = umol/l

Valores de normalidad: Hombres: 0.6 1.2 mg/dl
Mujeres : 0.5 1.0 mg/dl
 Determinacin de Urea

Mtodo: Ureasa-GLDH.Cintico
La ureasa cataliza la hidrlisis de la urea, presente en la muestra, en
amonaco (NH4) y anhdrido carbnico (CO2)
Los iones amonio formados se incorporan al alfa-cetoglutarato por accin
de la glutamato deshidrogenasa (GLDH) con oxidacin paralela de NADH a
NAD+
Urea + H2O + 2H+ Ureasa (NH4+)2 + CO2
NH4+ + alfa-Cetoglutarato + NADH GLDH H2O + NAD+ + L-glutamato

La disminucin de concentracin de NADH en el medio es proporcional a

la concentracin de urea en la muestra ensayada

Factor de conversin: mg/dl x 0.1665 = mmol/l

Valores de normalidad: 15 45 mg/dl
 Determinacin cido rico
Metodo Uricasa-POD

Mtodo colorimtrico
El acido rico es oxidado por la URICASA a alantona y perxido de
hidrgeno (H2O2) que en presencia de peroxidasa (POD), 4-
aminofenazona y 2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS) forma un compuesto
rosceo:

Acido rico + 2 H2O + O2 URICASA Alantona + CO2+ 2H2O

2H2O2 + 4-Aminofenazona +DCPS POD Quinonimina + 4H2O

La intensidad de la quinonaimina es proporcional a la concentracin de

acido rico en la muestra ensayada.
Factor de conversin. mg/dl x 59.5 = umol/l
Valores de normalidad: Hombres: 3.5 7.0 mg/dl
Mujeres : 2.5 6.0 mg/dl
 Determinacin de Proteinas Totales.
Mtod Biuret.

Mtodo colorimtrico.
En medio alcalino, las protenas dan un intenso color violeta
azulado en presencia de sales de cobre . El reactivo contiene
yoduro como antioxidante.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin
de protena total en la muestra ensayada.
Reactivo Biuret.

Unidades: g/dl
Valores de normalidad: 6.0 8.0 g/dl
 Determinacin de gamma-glutamil
transferasa -GT
Mtodo cintico.
La gamma-glutamil transferasa (y-GT) cataliza la transferencia de un grupo
Y-glutamilo de la Y-glutamil-p-nitroanilida al dipptido aceptor glicilglicina,
segn la siguiente reaccin:

L-glutamil-3-carboxi-4-nitroanilida + Glicilglicina -GT glutamil-

glicilglicina + Acido 5-amino-2-nitrobenzoico

La velocidad de formacin del cido 5-amino-2-nitrobenzoico, determinado

fotomtricamente, es proporcional a la concentracin cataltica de y-
Glutamil transferasa (y-GT) en la muestra ensayada
Unidades: UI/l
Valores de Normalidad: Hombres: 11 50 UI/l
Mujeres : 7 32 UI/l
Determinacin de la fosfatasa alcalina (FAL)

Mtodo cintico.
La fosfatasa alcalina (FAL)cataliza la hidrlisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP)
a pH 10.4 liberando p-nitrofenol y fosfato, segn la siguiente reaccin:

p-Nitrofenilfosfato + H2O FAL p-Nitrofenol + Fosfato

La velocidad de formacin del p-Nitrofenol, determinado fotomtricamente,

es proporcional a la concentracin cataltica de fosfatasa alcalina en la
muestra ensayada

Unidades: U/l
Valores de Normalidad: Adultos : 98 279 UI/l
Nios : Hasta 645 UI/l
 Determinacin de GPT/ALT

Mtodo cintico
La alanina aminotransferasa (ALT) inicialmente llamada transaminasa
glutmico pirvica (GPT) cataliza la transferencia reversible de un grupo

amino de la alanina al -Cetoglutarato con formacin de glutamato y
piruvato.
El piruvato producido es reducido a lactato en presencia de lactato
deshidrogenasa (LDH) y NADH
Alanina + -Cetoglutarato ALT Glutamato + Piruvato
Piruvato + NADH + H+ LDH Lactato + NAD+

La velocidad de disminucin de la concentracin de NADH en el medio
determinado fotomtricamente, es proporcional a la concentracin cataltica
de ALT en la muestra ensayada

Unidades: U/l
Valores de Normalidad : Hombres: Hasta 40 UI/l
Mujeres : Hasta 32 UI/l
 Determinacin de GOT/AST

Mtodo cintico.
La aspartato aminotransferasa (AST) inicialmente llamada transaminasa
glutamato oxaloactica (GOT) cataliza la transferencia reversible de un grupo
amino del aspartato al alfa-Cetoglutarato con formacin de glutamato y
oxalacetato.
El oxalacetato producido es reducido a malato en presencia de
malato deshidrogenasa (MDH) y NADH

Aspartato + -Cetoglutarato AST Glutamato + Oxalacetato

Oxalacetato + NADH + H+ MDH Malato + NAD+

La velocidad de disminucin de la concentracin de NADH en el medio,

determinada fotometricamente, es proporcional a la concentracin cataltica
de AST en la muestra ensayada
Unidades: UI/l
Valores de Normalidad: Hombres: Hasta 38 UI/l
Mujeres: Hasta 31 UI/l
 Bilirrubina total y directa
Mtodo colorimtrico:
La bilirrubina se convierte en azobilirrubina mediante el cido sulfanlico
diazotado, midindose fotomtricamente.
De las dos fracciones presentes en el suero, bilirrubin-glucurnido y
bilirrubina libre ligada a la albmina, solo la primera reacciona en medio
acuoso (bilirrubina directa) precisando la segunda la solubilizacin con
dimetilfulfxido (DMSO) para que reaccione (bilirrubina indirecta).
En la determinacin de la bilirrubina indirecta se determina tambin la
directa, correspondiendo el resultado a la bilirrubina total.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de
bilirrubina presente en la muestra ensayada.

Factor de conversin: mg/dl x 17,1= umol/l

Valores de normalidad: Bilirrubina total : hasta 1 mg/dl
Bilirrubina directa: hasta 0.25 mg/dl
 Hierro
Mtodo colorimtrico
El hierro se disocia del complejo srico hierro-transferrina en medio cido
dbil.
El hierro libre se reduce a in ferroso mediante el cido ascrbico. Los
iones ferrosos en presencia de FerroZine forman un complejo coloreado:

Transferrina (Fe 3+) + e- Acido ascrbico 2 Fe2+ + Transferrina

Fe 2+ Ferrozine Complejo coloreado

La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin de

hierro en la muestra ensayada.
Factor de conversin: ug/dl x 0.17= umol/l
Valores de normalidad: Hombres: 60 - 160 ug/dl
Mujeres: 40 -150 ug/dl
 Calcio
Mtodo colorimtrico (ARSENAZO III)

El calcio, en medio neutro, forma un complejo de color azul con

arsenazo III (cido 1,8 dihidroxi-3,6 disulfo-2,7-naftalenen-bis(azo)-
dibencenarsnico).
La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad
de calcio existente en la muestra.

Factor de conversin: mg/dlx 0.25= mmol/l

Valores de normalidad: Adultos: 8.7 11.2 mg/dl
Nios : 9.5 12.0 mg/dl
Neonatos: 8.0 13.0 mg/dl
 Magnesio
Mtodo colorimtrico (Calmagita)

El magnesio forma un complejo de color prpura al reaccionar con

la calmagita en medio alcalino.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentracin
de magnesio en la muestra ensayada.

Factor de conversin: mg/dl x 0.412 = mmol/l

Valores de normalidad: 1.5 2.5 mg/dl
 Fsforo
Mtodo colorimtrico
El fsforo inorgnico reacciona en medio cido con el molibdato
para dar un complejo fosfomolbdico que se mide
espectrofotomtricamente a 340 nm.

La intensidad del color formado es proporcional a la cantidad de

fsforo en la muestra.

Factor de conversin: mg/dl x 0.32= mmol/l

Valores de normalidad: Adultos:2.8 4.8 mg/dl
Nios: 1 mes a 12 aos: 4.0 7.0 mg/dl