LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Marco Terico

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es

observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el
laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el medio
de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado
ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. Para que las bacterias crezcan
adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie
de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno
adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo
debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar
exento de todo microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias
patgenas requieren nutrientes complejos similares en composicin a los lquidos
orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la base de muchos medios de cultivo es una
infusin de extractos de carne y Peptona a la que se aadirn otros ingredientes. El
agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de
cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica
al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l. La
Gelatina es otro agente solidificante pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran
numerosos materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre
completa, bilis, etc. Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos
fundamentales: para incrementar el valor nutritivo del medio y para detectar
reacciones de fermentacin de los microorganismos que ayuden a identificarlos. El
suero y la sangre completa se aaden para promover el crecimiento de
los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que actan
como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como
inhibidores del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa
como indicador ya que es rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de
Genciana se usa como inhibidor ya que impide el crecimiento de la mayora de las
bacterias Gram-positivas).

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 1

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros

componentes que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los
microorganismos. Puesto que la diversidad metablica de los microorganismos es
enorme, la variedad de medios de cultivo es tambin muy grande. La mayora de
los medios de cultivo se comercializan en forma de liofilizados que es preciso
rehidratar. La preparacin de un medio de cultivo se reduce en general a pesar la
cantidad de medio y redisolverla en agua destilada (libre de inhibidores del
crecimiento) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las sustancias termolbiles
se esterilizan por filtracin y se aaden al resto de los componentes previamente
esterilizados en la autoclave. Los constituyentes habituales de los medios de cultivo
son:

Agar: Se utiliza como agente solidificante. Es un polisacrido que se obtiene

de ciertas algas marinas. Las bacterias no son capaces de degradarlo.

Azcares. Son una fuente de carbono para los microorganismos. Los ms

empleados son la glucosa, la lactosa y la sacarosa.

Extractos. Son preparados de ciertos rganos o tejidos animales o vegetales

obtenidos con agua y calor. Ej.: extracto de carne, de levadura, de malta, etc.

Peptonas. Son protenas hidrolizadas, se obtienen por digestin qumica o

enzimtica de protenas animales o vegetales.

Fluidos corporales. Sangre completa, sangre desfibrinada, plasma o suero

sanguneo son aadidos a los medios empleados para el cultivo de algunos
microorganismos patgenos.

Sistemas amortiguadores. Son sales que se aaden al medio para mantener

el pH dentro del rango ptimo del crecimiento bacteriano. Ej.: fosfatos
bisdicos o bipotsicos.

Indicadores de pH. Son indicadores cido-base que se aaden para detectar

cambios de pH en el medio.

Agentes Reductores. Sustancias que se aaden al medio para crear las

condiciones que permitan el desarrollo de los grmenes microaerfilos o
anaerobios. Ej.: cistena y tioglicolato.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 2

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Agentes selectivos. Sustancias como el cristal violeta, las sales biliares etc.
que a determinadas concentraciones en el medio actan como agentes
selectivos frente a determinados microorganismos.

Tipos bsicos de medios de cultivo

Atendiendo a su estado fsico:

Lquidos: Se denominan caldos y se preparan en tubos o Erlenmeyer

Slidos: Son aquellos que contienen un agente solidificante entre sus

componentes, normalmente agar. Se preparan en placas de Petri o en tubos
en slant (tubos con la superficie del medio inclinada).

Semislidos: contienen 7,5 g de agar /litro de caldo. Se utilizan para

determinar la motilidad de las especies en estudio. Actualmente se
encuentran disponibles comercialmente con el agregado de agar.

Atendiendo a su utilidad prctica:

Medios para aislamientos primarios:

Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad de

organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos con
materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u otros
factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar Sangre,
Schaeadler, etc.)

Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta selectividad) se aaden

sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos grupos de bacterias,
permitiendo a la vez el crecimiento de otras. Variando la sustancia aadida,
se vara el tipo y grado de selectividad (Mac Conkey, Kanamicina-
Vancomicina)

Enriquecidos: ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva

normal potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con
Vitamina K).

Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales que

satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias, ayudando a su
identificacin (Lowenstein).

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 3

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Condiciones generales para el cultivo de

microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve
afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos,
son ajenos por completo al propio medio.

Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener,

como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos
casos sern necesarias ciertas vitaminas y otra sustancia inductoras del
crecimiento. Siempre han de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer
de donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas que tengan
lugar. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin embargo, la
preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaba la prdida de los factores nutritivos lbiles.

Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a los medios es

utilizar peptona que, adems, representa una fuente fcilmente asequible de
nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y
otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas
bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos
medios sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser
necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio,
manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente
de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos
colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por
sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 4

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo

productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en
estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran
inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente
a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros
tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso
universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de
medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno
normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn
adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio,
los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas
parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera
delas citadas condiciones.

Condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es

imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en
los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las
estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que
se deseque el medio.

Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en

presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los
microorganismos fotosintticos.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 5

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

PH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento delos

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH
neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe
olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos
metablicos normales.

Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y

43C. Otros como los psicrfilos crecen a 0C y los termfilas a 80C o incluso a
temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos
humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C,
y los saprofitos tienen rangos ms amplios.

Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la
aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el
crecimiento microbiano normal del o de los especmenes inoculados en dichos
medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que
utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante)

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 6

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

II MARCO EXPERIMENTAL

II.1 MATERIALES Y EQUIPOS

-3 Placas Petri.

-1 Asa de siembra.

-Agar nutritivo.

-Placa calefactora elctrica.

-Incubadora.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 7

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

II.2 PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1.- Se procedi a diluir el medio en calor, un preparado de Agar (Agar nutritivo cuyo
color es ms o menos beige claro).

2.- Luego se coloc una pequea cantidad del Agar nutritivo en 3 placas Petri, para
luego dejar que se solidifique:

Muestra A) Se agreg a la primera placa previamente limpia, dejamos que

solidifique para luego dejarla al medio ambiente por alrededor de 15 min. Esto
significar que el medio ambiente ser nuestro inoculo.

Muestra B) Se agrego a la segunda placa luego dejamos que se solidifique, esta

vez la placa sin limpiar.

Muestra C) Se agreg a la tercera placa previamente limpia para luego dejar que
se solidifique. Con el asa de siembra cogemos un inoculo de la colonia que creca
en la superficie de una palta, para luego colocarlo y esparcirlo sobre la placa Petri.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 8

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

3.- Luego se procedi a guardar las placas tapadas boca abajo dentro de la
incubadora.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 9

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

II.3 MORFOLOGA COLONIAL:

De acuerdo a la observacin de los resultados:

Muestra A):

Logramos observar la formacin de 4 colonias pequesimas que en tamao en

comparacin del rea de trabajo es casi despreciable. Poseen las siguientes
caractersticas:

- Colonias blancas (aspecto seco) de forma circular, elevacin convexa y de borde

entera.

Muestra B):

-Observamos una formacin de colonias de mohos ms apreciable que el de la

muestra A.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 10

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

-Colonias blancas de aspecto seco: a) colonias puntiformes, b) colonias de formas

circulares de elevacin convexa y de borde entero y c) colonias de forma
filamentosa de elevacin convexa y borde filamentoso.

Muestra C):

-Observamos en la placa sembrada por el inoculo extrada de la palta, una densa

formacin de colonias.

-Colonias color amarillo pardusco de aspecto hmedo (variedad y densidad):

variedad de colonias de forma irregular y rizoide de elevaciones planas y
monticulares de bordes ondulados y filamentosos. Algunas colonias circulares
blancas.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 11

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

RECOMENDACIONES

-Tener muy en cuenta la adecuada vestimenta, higiene y seguridad en las prcticas

de laboratorio.

-Para la siembra siempre hacerlo alrededor de un mechero encendido para evitar

las posibles contaminaciones.

-Esterilizar previamente los equipos para poder minimizar cualquier error en los
resultados.

-Tener presente la gua y la ficha tcnica para realizar correctamente la experiencia.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 12

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

CUESTIONARIO

1. Qu cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo slido en

caja de Petri?

Las placas de Petri son recipientes pequeos de base plana que estn hechos de
plstico o vidrio transparente. Estn constituidas de dos mitades: una tapa y una
base, las cuales encajan entre s. Esto protege el contenido del aire contaminado
indeseable, pero tambin permite que escapen los gases que producen las
bacterias.
Las placas de Petri deben estar bien esterilizadas antes de usarlas para cultivar
bacterias; de otro modo, los resultados del experimento podran verse afectados.
Las placas de Petri recin compradas deben venir esterilizadas y selladas en
empaques de plstico.
Saca la placa de Petri de su paquete y separa las dos mitades. Con mucho cuidado,
vierte la solucin de agar caliente en la mitad inferior de la placa de Petri, solo lo
suficiente para formar una capa por encima del fondo de la placa.
Vuelve a colocar rpido la mitad superior de la placa de Petri para evitar que las
bacterias transmitidas por el aire contaminen el experimento. Reserva la placa de
Petri durante 30 minutos a 2 horas, hasta que la solucin de agar se enfre y se
endurezca (cuando est lista, se parecer a gelatina cuajada).

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 13

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

2. De los siguientes medios, mencionar en que consiste su capacidad

diferencial o selectiva y que tipo de microorganismos crecen en ellos? Agar
rosa de bengala y agar papa dextrosa.

Agar rosa de bengala Agar papa dextrosa

Medio ideal para Sirve para el
la mxima aislamiento de
Capacidad diferencial o recuperacin de hongos.
selectiva hongos. El bajo ph 3.5
Utilizado para evita el
encontrar ciertos crecimiento de
tipos de las bacterias.
organismos, en
muchos de estos.
Tipos de mohos y levaduras Hongos y levaduras
microorganismos que
crecen en ellos

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 14

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

3. Cul es la funcin de los colorantes e indicadores en los medios de

cultivos?

El rojo fenol se usa como

indicador ya que es rojo en ph
bsico y amarilo en ph acido
Detectar la formacin de
cidos

Funcin de colorantes e
indicadores en los medios
de cultivos
La violeta de Genciana
Inhibidores de crecimiento sirve como inhibidor ya
de unas bacterias y no de que impide el crecimiento
otras de la mayora de las
bacterias Gram-positivas.

4. De los medios usados indica cules son especficos para mohos y cules
para bacterias y por qu?

En la experiencia slo se utiliz agar nutritivo el cual favoreci el crecimiento

bacteriano:

Es un medio de cultivo universal para microorganismos poco exigentes en cuanto a

sus necesidades nutritivas con su frmula original o adicionada de indicadores,
carbohidratos, sales, lquidos orgnicos, etc.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 15

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

AGAR SABORAUD GLUCOSADO

Medio selectivo para el recuento y deteccin de mohos y levaduras en agua y

bebidas por la tcnica de filtracin en membrana.

Esta formulacin rica en nutrientes, adems de su elevado contenido en dextrosa

son la base para el crecimiento de mohos y levaduras. El bajo pH (4.6) evita el
crecimiento de las bacterias. El verde de bromocresol es el indicador de pH y facilita
la diferenciacin y cuenta de colonias de mohos. Las colonias son verdes debido a
la difusin del verde de bromocresol (reaccin alcalina). Los productos finales de
las colonias que difunden al medio ms la reduccin del pH provocan que el
colorante vire a amarillo.

El agar Sabouraud es un medio de cultivo que por sus caractersticas funciona

como medio de enriquecimiento para hongos y que en caso de
contener cloranfenicol u otro antibitico, se convierte en un medio selectivo para los
mismos. El medio contiene peptonas1 y una elevada concentracin de glucosa que
favorece el crecimiento de los hongos sobre las bacterias.

FORMULA EN GRAMOS POR LITRO DE AGUA DESTILADA

Agar 12.0
Polipetona CAS 10.0
Diastasa 0.05
Sulfato de magnesio 2.1
Extracto de levadura 9.0
Tiamina 0.05
Fosfato de potasio 2.0
Glucosa 50.0
Verde de bromocresol 0.026

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 16

 LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

5. Cundo se siembran hongos en medio lquidos, describe cmo es el

crecimiento con y sin agitacin?

En los medios lquidos se recurre a la agitacin para que el hongo se distribuya por
todo el medio para propagarse y obtener una mejor produccin y lectura, de lo
contrario solamente habr crecimiento en la parte superior condensndose en slo
unas partes los cuales harn dificultoso la observacin e ineficiente la produccin.

6. En qu caso se siembra en medio semislidos? Cules son las

precauciones que se debe tomar?

Estos medios semislidos se emplean para estudiar la movilidad de los

microorganismos y para favorecer la separacin de estos con diferentes
requerimientos de oxgeno.

Las precauciones de estos casos deben ser los siguientes:

- Los materiales a usar deben estar esterilizados correctamente.

- El medio debe ser calentado hasta que sea lquido a una temperatura no
mayor a 42C.
- Cuando es agregado el inculo, se debe homogenizar y dejar solidificar.

7. Anota la morfologa de un moho y de una bacteria indicando de qu medio

lo obtuviste.

Se observ la siguiente morfologa

- Colonias blancas (aspecto seco) de forma circular, elevacin convexa y de borde

entera.

- Colonias puntiformes, b) colonias de formas circulares de elevacin convexa y de

borde entero y c) colonias de forma filamentosa de elevacin convexa y borde
filamentoso.

Se usa como cultivo el agar nutritivo.

Universidad Nacional del Callao Preparacin de medios y siembra de bacterias 17