UNIVERSIDAD NACIONAL DE INGENIERA

FACULTAD DE INGENIERA QUMICA Y TEXTIL

ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

LABORATORIO DE BIOQUMICA Y MICROBIOLOGA

Profesora : Dra. Jessica NIETO JUAREZ

Fecha : 09 / 06 / 2017
Cdigo curso : PI721-A

Laboratorio N 7 :

MANEJO Y OBSERVACIN EN EL MICROSCOPIO PTICO

1. OBJETIVO GENERAL:
Es familiarizar al estudiante con las partes, el manejo y los cuidados que deben tener al
momento de utilizar el microscopio. As como, la preparacin de muestras biolgicas in
vivo (fresca) e in vitro (tincin) para la observacin microscpica.

2. INTRODUCCIN
Algunos seres vivos pueden observarse a simple vista. Sin embargo, existen
organismos tan pequeos (alrededor de 0.1 mm) que a simple vista no pueden ser
percibidos, por lo que se requiere para su observacin instrumentos de precisin como
el microscopio.
El microscopio es un instrumento que permite la observacin de objetos y detalles de
estructuras tan pequeas que no pueden ser percibidas a simple vista. Su funcin es de
amplificar la imagen del objeto, para analizar la estructura, forma y tamao de
diferente tipos de muestras. Siendo un instrumento delicado y se debe usarse con
mucha precaucin (leer anexo).
En microbiologa, el microscopio cumple dos funciones bsicas: (i) la deteccin inicial
de microorganismos y (ii) la identificacin pre-liminar o definitiva de los mismos.
En esta prctica de laboratorio se va observar detalles estructurales de clulas
vegetales, humanas, hongos y protozoarios. Para ello, se utilizar el microscopio
compuesto, ya que es una herramienta til y bsica en la investigacin de rutina.

Recordando la clasificacin los seres vivos o reinos de la naturaleza, en 1969, el

ecologista Robert H. Whittaker propuso cinco reinos para agrupar a todas las formas
de vida, siendo stos: Reino Plantae, Reino Animalia, Reino Fungi, Reino Protista y
Reino Monera, como se puede ver en el siguiente esquema (Figura 1).

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SERES VIVOS

Se clasifican en:

REINOS DE LA NATURALEZA

Siendo estos:

MONERA PROTISTA FUNGI ANIMALIA PLANTAE

Son:

Procariotas Eucariotas Eucariotas Eucariotas Eucariotas

Ejemplo:

Figura 1. Clasificacin de los seres vivos

3. PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL Pinza metlica o de madera
Portaobjetos Papel absorbente
Cubreobjetos Caja de fosforo
Asa de siembra Cuchillo o bistur o escalpelo
02 vidrio de reloj Pincel de cerdas gruesas
01 pipeta Pasteur con goma Tijera
01 jeringa estril Piceta

REACTIVOS EQUIPO
Azul de metileno Microscopio compuesto
Lugol

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MUESTRA
Cebolla
Elodea
Alimento contaminado por hongo (pan, verdura, fruta, etc)
Agua de pecera
Suspensin de suelo de jardn

PROCEDIMIENTO
1. LIMPIEZA, MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO
Acudir a la sala donde se ubican los microscopios, mirar el microscopio asignado a
usted, ubicar y describir las partes que lo conforman (Figura 4, ver anexo).
NOTA: Si tiene que movilizar el microscopio de un lugar a otro, la manera correcta
de hacerlo es siempre usando las dos manos, una mano para agarrar el brazo con
firmeza y la otra en la base (Figura 2). Nunca levantar por la parte que mantiene
las lentes.

Figura 2. Manera correcta para

mover el microscopio

Verificar si el microscopio sobre la mesa de trabajo presenta alguna irregularidad

(mal estado del cable, falta de objetivos, etc.) y si fuera el caso, notificarlo a la
profesora.
Comprobar que las lentes del ocular y de los objetivos estn limpios. Si no fuera el
caso, limpiar cuidadosamente con papel especial para ptica o un bulbo inyector
de aire. NO TOCAR las lentes con los dedos.
Limpiar la parte mecnica con un pincel de cerdas gruesas.
Conectar el microscopio a la toma de corriente, con el objetivo de menor aumento
en posicin de empleo.
Colocar la preparacin de la muestra sobre la platina y sujetarla con las pinzas.
Enfocar de la siguiente manera:
a) Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin de muestra, empleando
para ello el tornillo macromtrico. No realizar dicha operacin mirando por el

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ocular, pues se corre el riesgo de clavar el objetivo en la preparacin con el

consiguiente destrozo de ambos.
b) Luego, con el tornillo micromtrico, aqu si se gira el tornillo observando por el
ocular hasta obtener un enfoque ntido de la imagen.
Una vez, enfocado la imagen, pasar al objetivo de mayor aumento (por ejemplo:
40x). Subir ligeramente el condensador. La imagen debe estar casi enfocada, afine
el foco con el tornillo micromtrico. Si la imagen no est ni medianamente
enfocada, es preferible volver a un enfoque con el objetivo de menor aumento.
Empleo del objetivo de inmersin (100x):
a) Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre
ste y el objetivo de 40x.
b) Colocar una gota de aceite de inmersin sobre el cubreobjetos (si la muestra es
un extendido fijado, coloque la gota de aceite directamente sobre la lmina).
c) Terminar de girar el revlver hasta la posicin del objeto de inmersin (100x),
asegurarse de que ste no toque la preparacin.
d) Enfocar cuidadosamente con el tornillo micromtrico. Recuerde que la
distancia entre el objetivo y la preparacin es mnima.
e) Una vez que se ha puesto el aceite de inmersin sobre la preparacin de la
muestra ya no puede volver a colocar los objetivos de menor y mayor aumento
(10x, 40x) sobre ese campo. Por lo tanto, si desea enfocar otro campo, debe
retirar el objetivo de inmersin girando el revlver hacia el objetivo de menor
aumento, seleccionando otro campo y empezando a enfocar desde ste ltimo.
f) Al finalizar la observacin de una preparacin, y antes de retirarla de la platina,
se debe colocar el objetivo de menor aumento. Nunca retire la preparacin con
el objetivo de inmersin en posicin de observacin.
g) Retirar la preparacin y limpie el objetivo de inmersin cuidadosamente con
un papel especial para ptica. Comprobar tambin que el objetivo de 40x est
limpio.

Figura 3. Diagrama del camino de la

luz en el microscopio

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2. PREPARACIN DE LA MUESTRA
Muestra en fresco
Limpiar el portaobjeto y cubreobjeto con el algodn impregnado de alcohol.
Etiquetar en la parte del borde y atrs del portaobjeto.
Toma de las muestras:
a) Lquidas
Con ayuda de una pipeta Pasteur colocar una gota de la muestra en el centro
de un portaobjeto limpio y cubrirlo con un cubreobjeto, segn las indicaciones
de la profesora. Nota: Al cubrir la muestra evitar que no se formen burbujas de
aire.
Observar en el microscopio con los objetivos de menor aumento y el de mayor
aumento (por ejemplo: 4x y 10x).
Dibujar lo observado.
b) Alimento contaminado con hongos
Colocar en el centro de un portaobjeto, con la ayuda de la pipeta Pasteur una
gota de agua destilada.
Tomar con el asa de siembra, en forma de ngulo recto y en condiciones
aspticas una pequea porcin del hongo y suspenderla en la gota de agua.
Nota: el asa de siembra se debe calentar al rojo vivo sobre la flama del
mechero (antes y despus de la preparacin de la muestra).
Colocar el cubreobjeto sobre la preparacin. Observar en el microscopio como
en el caso anterior. Dibujar lo observado.
c) Cebolla
Cortar por la mitad y desprender con una pinza la epidermis (capa interna),
que es la tela delgada y transparente.
Colocar una gota de agua en el centro de un portaobjeto y sobre ella extender
la epidermis (evitar que se enrosque). Luego, cubrir la muestra con un
cubreobjeto.
Observar en el microscopio como en el caso anterior y Dibujar lo observado.
En otro portaobjeto, extender de nuevo la epidermis y agregar una o dos gotas
de reactivo de azul de metileno, hasta que la muestra est totalmente
cubierta. Dejar que reaccione con el reactivo por 5 minutos, para que la
muestra se tie. Luego, con la ayuda de la pipeta Pasteur, enjuagar con agua
destilada hasta que no suelte colorante, para retirar el exceso de tincin.
Finalmente, poner una gota de agua sobre la piel de la cebolla, y sobre ella,
cubrir con un cubreobjeto.
Observar en el microscopio con menor y mayor aumento y Dibujar lo
observado.

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d) Elodea
Remover una hoja de la planta acutica con la yema de la mano y colocarlo en
la parte central de un portaobjeto limpio.
Agregar una gota de agua de su propio medio y cubrirlo con un cubreobjeto.
Observar en el microscopio con menor y mayor aumento.
Dibujar lo observado.
e) Mucosa bucal
Colocar en el centro de un portaobjeto, con la ayuda de la pipeta Pasteur una
gota de agua destilada.
Raspar con un hisopo o palillo la mucosa interna de la mejilla de la boca de un
voluntario y depositar el producto extrado en la gota de agua.
Realizar una extensin uniforme con la ayuda de un palillo y con la ayuda de
una pinza, calentar suavemente el portaobjeto, pasando por la llama del
mechero hasta la desecacin de la extensin. As queda fijada al portaobjeto.
Colocar el portaobjeto sobre una luna de reloj y adicionar gotas de azul de
metileno sobre la extensin. Dejar 5 minutos.
Despus de teir, lavar con chorros de agua destilada hasta decoloracin, y
retirar el exceso de agua con un papel absorbente, dejando que empape con el
agua sin arrastrar.
Colocar el portaobjeto con la muestra preparada en la platina del microscopio
y observar en menor y mayor aumento.

OBSERVACIONES
En las observaciones al microscopio, el estudiante debe fijarse en:
Que forma tiene las clulas?
Que partes de la clula alcanzan a distinguirse?
Como estn organizadas en la clula?
Cul es la diferencia de las clulas observadas (en tamao, forma, estructura, etc)?
Que pasa cuando se tie la muestra, mejora la imagen? para qu sirve?

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ANEXO

CLASES, PARTES, MANTENCIN Y PRECAUCIN DEL MCIROSCOPIO

Los microscopios se clasifican en:

Microscopios pticos: cuya fuente de iluminacin es la luz.
Microscopios electrnicos: cuya fuente de iluminacin es un haz de electrones.

I. MICROSCOPIO PTICO: Se clasifican en:

a) Microscopio simple: presenta solo una lente
b) Microscopio compuesto: utiliza un sistema de lentes pticos que va
amplificando la imagen sucesivamente y comprende:
Microscopio de campo luminoso
Microscopio de campo oscuro
Microscopio de fluorescencia
Microscopio de contraste de fases

Microscopio de campo luminoso: Es el ms utilizado para microscopa de

rutina. La preparacin de la muestra se observa en su color natural o en
algunos casos, se puede usar tinciones. En este caso, la luz pasa directamente
sobre la muestra, observndose que la muestra es ms oscura y el campo que
lo rodea es claro.
Microscopio de campo oscuro: Es similar al microscopio de campo claro. La luz
no pasa directamente sobre la muestra, sino que ilumina oblicuamente la
preparacin de la muestra. En este caso, la muestra se observa brillantemente
iluminada sobre un campo o fondo oscuro.
Microscopio de fluorescencia: Est compuesto por una fuente de luz UV y
varios filtros. Es decir, cuando el objeto es iluminado con rayos de una
determinada longitud de onda, las molculas la absorben y emiten luz con una
longitud de onda mayor. Se usa para examinar muestras teidas con
colorantes fluorescentes. Esta tcnica permite la identificacin rpida de
algunos microorganismos.
Microscopio de contraste de fases: Se basa en modificaciones de la trayectoria
de la luz, los cuales producen contrastes notables en la muestra. Observando
la muestra con diferentes grados de brillo y oscuridad. Por ejemplo, la parte
densa de la muestra aparece brillante, mientras que las partes ms livianas
aparecen oscuras. Se utiliza para visualizar estructuras celulares sin necesidad
de usar colorantes o matar a los microorganismos.

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II. MICROSCOPIO ELECTRNICO: Se clasifican en:

a) Microscopio electrnico de barrido (SEM): Permite la observacin de clulas
enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que aparecen los relieves
originales y las superficies externas. Los electrones son dirigidos a la superficie
de la muestra y forman imgenes tridimensionales, entregando informacin
morfolgica de la muestra analizada. Tiene una amplificacin entre 1,000 a
200,000 aumentos.
b) Microscopio electrnico de Transmisin (TEM): No explora superficies, el haz
de electrones atraviesa la muestra y la sombra de detalles finos o ultra-
estructura es capturada en una pantalla para producir imgenes
bidimensionales. Si necesita cortes finos o ultrafinos.

El microscopio compuesto es el ms comn y utilizado para observar y determinar su

tamao, forma y estructura de los organismos. En esta prctica de laboratorio se
utiliza el microscopio ptico compuesto, el cual est formado por tres sistemas:
(1) sistema de iluminacin: corresponde a la fuente de luz que est formado por la
lmpara, el diafragma de campo y el condensador.
(2) sistema ptico: est formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y
oculares que permiten agrandar la imagen, siendo estos los objetivos, el tubo y el
ocular.
(3) sistema mecnico: est formado por botones que permiten realizar el movimiento
y cambio de las lentes, as como el enfoque de la preparacin, siendo estos la base,
estativo, los tornillos micromtrico y micromtrico, la platina y el revlver.

PARTES DE UN MICROSCOPIO (Figura 4)

Sistema mecnico
Base: Pieza metlica que sostiene a todo el aparato.
Brazo: Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio.
Platina: Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en
donde se coloca la preparacin de la muestra que va ser examinada (portaobjeto),
la cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia
abajo con los tornillos macromtrico y micromtrico por medio de un sistema de
engranes. Posee escalas numricas que permiten ubicar fcilmente la posicin de
lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparacin en forma de cruz
(ejes X y Y) para su localizacin.
Pinzas: Sirve para sujetar el portaobjeto.
Tornillo macromtrico: Permite el enfoque mayor.
Tornillo micromtrico: Permite el enfoque con precisin.

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Tubo del ocular: Sostiene el lente del ocular.

Revlver: Es el disco que soporta a los objetivos de distinto aumento.

Sistema de iluminacin
Lmpara: Es la encargada de proporcionar los haces de luz.
Diafragma de campo: Est situada en la base del microscopio y su funcin es la de
regular el dimetro de la emisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de
campo visual, es decir controla la cantidad de luz que atraviesa la preparacin.
Condensador: Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos
luminosos sobre el objeto a observar, el condensador utilizado es capaz de
agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite aprovechar toda la luz
posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.

Sistema ptico
Ocular: Es un sistema de lentes convergentes que est situado en el tubo en la
parte superior (la parte ms cercana al ojo del observador), a travs de los cuales
se obtiene la imagen final. Tiene aumento propio (los aumentos son denominados
con la letra x), normalmente es de 10x, el cual permite obtener una ampliacin
adicional en la imagen. La ampliacin total de la muestra es el producto de las
ampliaciones proporcionadas por el objetivo y el ocular. Dependiendo de que
exista uno o dos oculares, pueden ser mono o binoculares.
Objetivo: Es un sistema de lentes convergentes que se acopla en la parte inferior
del tubo, mediante el revlver, que permite cambiarlos fcilmente. Basado en su
estructura se pueden acoplar varios objetivos, ordenados de forma creciente
segn sus aumentos, en el sentido de las agujas del reloj.

Figura 4. Partes del microscopio

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Generalmente, se utiliza tres tipos de objetivos diferentes:

Bajo aumento (10x): Se usa para una inspeccin general.
Alto aumento (40x): Se emplea para estudiar microorganismos (parsitos y hongos
filamentosos).
De inmersin en aceite (100x): Se emplea para observar bacterias, levaduras (fase
unicelular de los hongos) y detalles morfolgicos de los organismos mayores.

PARTES PARA LA OBSERVACIN EN EL MICROSCOPIO

Portaobjeto: Es una placa delgada de vidrio de forma rectangular sobre el cual se
coloca las muestras biolgicas para su observacin en el microscopio. Sus
dimensiones tpicas son de 75 mm x 25 mm y estn disponibles en cajas de 50
unidades.
Cubreobjeto: Es una fina y pequea hoja de material transparente de forma cuadrada.
Se coloca para cubrir la muestra biolgica que esta sobre un portaobjeto. Sus
dimensiones son de varios tamaos: 18, 20, 22, 24 mm cuadrados, y se suministran en
cajas de 100 unidades.

MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
Al finalizar la observacin microscpica, se debe dejar puesto el objetivo de menor
aumento en la posicin de observacin.
Cuando no se est utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con una
funda para evitar que se ensucien y daen las lentes. Si no se va usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
No se deben tocar nunca las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de ptica.
Nunca dejar el portaobjeto sobre la platina cuando no se est usando el
microscopio.
Para cambiar el objetivo, utilice siempre el revlver.
Despus de utilizar el objetivo de inmersin, se debe limpiar el aceite que queda
en el objetivo con pauelos especiales para ptica (pasar el papel por la lente en
un solo sentido y con suavidad). En caso de que el aceite se haya secado, avisar a
la profesora para limpiarlo con xilol.
Nota: No se debe abusar de este tipo de limpieza, ya que la aplicacin en exceso
de estos disolventes puede daar las lentes.
Nunca forzar los dispositivos giratorios (macromtrico, micromtrico, platina,
revlver y condensador).
No cambiar nunca de objetivo mientras se est observando a travs del ocular.

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