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UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Per, DECANA DE AMRICA)

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS

E.A.P DE GENTICA Y BIOTECNOLOGA


Laboratorio de Biologa Molecular
Practica N2: Caracterizacin Espectrofotomtrica del ADN
Laboratorio de Biologa Molecular 2017-II

ndice

Introduccin..2

Resultados y Discusin3

Conclusiones

Referencias Bibliogrficas.

2
Laboratorio de Biologa Molecular 2017-II

Introduccin

Cuando se trabaja con ADN, en la mayora de los casos, es importante realizar una
cuantificacin de la cantidad de ADN que se obtiene. La cuantificacin del ADN se puede llevar
a cabo de diversas maneras, por ejemplo, una de ellas es la estimacin de la intensidad de una
banda en geles de agarosa en el que se ha teido el ADN con algn colorante como el Bromuro
de Etidio, Syber Green o Gel Red, o como en el caso de esta prctica, usando espectrofotometra
de luz ultravioleta.

La espectrofotometra es el mtodo ms rpido, verstil y fcil de usar, lo que lo convierte en


el mtodo de anlisis ptico ms usado hoy da. Es usada para identificar compuestos
dependiendo su espectro de absorcin y tambin a conocer la concentracin de un material o
sustancia, esto ltimo nos permite conocer la concentracin de compuestos, seguir el curso de
reacciones qumicas y enzimticas, as como determinar enzima y protenas incluso cidos
nucleicos. Como sabemos un espectrofotmetro es un equipo de laboratorio que mide la
cantidad de luz que pasa por medio de una longitud de onda especfica. La cantidad de luz
absorbida por un medio debe ser proporcional a la concentracin del soluto presente, la
concentracin del soluto puede ser determinada en el laboratorio mediante la medicin de su
absorcin de luz a una longitud de onda especfica, en nuestra prctica mediremos a distintas
longitudes de onda en diferentes sustratos. Las muestras en estos equipos se utilizan en estado
lquido y se colocan en el compartimiento de las muestras de celdas transparentes.

La extraccin y purificacin de cidos nucleicos constituye la etapa primordial de la mayora


de estudios con biologa molecular, dependiendo de la efectividad de la extraccin se lograrn
realizar distintas metodologas de anlisis de estas molculas. Hay tcnicas como la de PCR
que pueden verse afectadas por inhibicin, causada por otras molculas que pueden estar en la
muestra. Somma, M. (2010)

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Resultados y Discusin
Anlisis espectrofotomtrico de ADN

Se realiz una primera dilucin con relacin 1:5 de los DNA vegetal y DNA animal
obtenidos en la prctica anterior en solucin C, para medir las absorbancias de dichas
diluciones a 260nm, lo cual nos mostr los siguientes resultados:

Tabla1.

Absorbancia a 260nm
de la dilucin 1
DNA animal 0,745
DNA 0,391
vegetal

DNA vegetal: muestra obtenida de Pisum sativum

DNA animal: muestra obtenida de gnadas de Argopecten

Al ADN vegetal y animal le adicionamos solucin C y medimos la absorbancia y


obtuvimos los datos de la Tabla 1.

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Ya obtenida las dos diluciones a una absorbancia cercana a 0.500, se prepar una
batera de tubos los cuales presentaron el siguiente contenido:

Tabla 2.

Muestra B 1 2 3 4
Solucin C (mL) 2.0 -- -- -- --
ADN Argopecten -- 1.0 1.0 -- --
diluido (mL)
ADN Pisum diluido -- -- -- 1.0 1.0
(mL)
Agua destilada (mL) -- 1.0 -- 1.0 --
NaOH (mL) -- -- 1.0 -- 1.0

Se obtuvieron los siguientes resultados a distintas absorbancias:

Tabla 3.

A 260nm A 280nm
ADN Animal H2 O 0,438 0,228
NaOH 0,464 --
ADN Vegetal H2 O 0,212 0,136
NaOH 0,205 --

Con los datos obtenidos se realizaron los siguientes anlisis para poder caracterizar al
DNA:

A) Estado del DNA:

Se hall el porcentaje de incremento de absorbancia a 260nm comparando las


soluciones de agua destilada con hidrxido de sodio obtenidas anteriormente:

Para el tubo 2 vs 1 (DNA animal):

0.4640.438
[ ]x100- 100 =94.6%
0.438

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Para el tubo 4 vs 3 DNA vegetal:

0.2050.212
[ ]x100- 100 =-10
0.212

Debido a que el porcentaje de incremento fue menor al 30 %, el DNA vegetal y DNA


animal se encontraron denaturados o en otro caso, en ellos persisten ARN en las
soluciones.

b) Concentracin de la muestra:

Debido a que los DNA se encontraron en estado denaturado, se consider la siguiente


relacin:

1 mg/mL DNA = 27 unidades de absorbancia a 260nm Para as obtener los siguientes


resultados (Usando la Tabla 1.)

Para DNA Animal:

1/10 . 0.745A

**1 . 7.45A

1mg/ml .. 27 U de absorbancia

X . 7.45 U de absorbancia

X = 0.276 mg/ml

Para DNA Vegetal:

1/10 . 0.391A

**1 . 3.91A

1mg/ml .. 27 U de absorbancia

X . 3.91 U de absorbancia

X = 0.145mg/ml
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** El producto por dos y cinco se derivan del nmero de diluciones y la dilucin 1:5
realizada al inicio de la prctica.

Tabla 4.

Absorbancia Concentracin
A 260nm (gm/mL)
ADN animal 0.438 0.276
ADN vegetal 0.212 0.145

2. Rendimiento:

Calculamos la concentracin de ADN en cada caso

Para DNA Animal:

0.276 mg/ml x 5 ml = 1.38 mg

Para DNA Vegetal :

0.145 mg/ml x 5 ml = 0.725 mg

Tabla 5.

Muestra Masa de la Concentracion de ADN Rendimiento(Masa/Concentracion)


muestra
Gnadas de Argopecten 1.25gr 1.38 mg
Argopecten
Pisum sativum 8.06gr 0.725 mg

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C.Grado de pureza:

Para ello se encontr la relacin de absorbancias a 260 y 280 nm en cada muestra.

Tabla 6.

Abs 260 Abs 280 Abs 260/ Abs 280

DNA animal 0.438 0.228 1.92

DNA vegetal 0.212 0.136 1.56

Como nos menciona la gua debemos obtener valores cercanos a 2,de no ser asi esto indica la
presencia de contaminantes en el caso del ADN animal obtenemos un valor bastante cercano a 2.Lo
que indicara un ADN no contaminado pero como observamos en a)estado del ADN nuestro ADN se
animal estara desnaturado pero no estara contaminado.

En el caso del ADN vegetal obtenemos un valor menor a 1.8 lo que nos indicara la presencia de
protenas que son los principales contaminantes del ADN esto se podra deber a que cuando
realizamos la practica quizs no aplicamos la suficiente sustancia B para la correcta deshidratacin de
las protenas o no se retir el precipitado(protenas)correctamente.

Procedemos a hallar la concentracin de protenas contaminantes utilizando la siguiente


relacin:

Protena (mg/mL)= 1.55 (abs280)-0.76 (abs260) El resultado obtenido fue el siguiente:

DNA animal:

1.55 (0,228)-0.76 (0,438) = 0,02052

DNA vegetal:

1.55 (0,136)-0.76 (0,212) = 0,04968

Tabla 7.

Protena contaminante Masa de la proteina


(mg/mL)
ADN animal 0,02052 0.4104
ADN vegetal 0,04968 0.9936

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Accin de nucleasas

a. Sobre sustrato natural ( solucion de DNA )

Tabla 8.

Muestra B 1
Buffer Ph 9.0 (ml ) 3.0 1.4
DNA ( ml ) 1.5

Para evaluar el efecto adcionamos 0.1 ml de Nucleasa e incubamos durante 15 minutos

Tabla 9.

Muestra Absorbancia a 260nm


DNA sin accionde la nucleasa 0.398
DNA con accion de la nucleasa 0.421

b. Sobre sustrato sinttico(bis-PnFF)

Para ello preparamos la siguiente batera de tubos

Tabla 10.

Tubo B 1 2
Sustrato sinttico 0.5 0.5 0.5
Buffer pH 8.5(mL) 0.5 0.4 0.4
Nucleasa(2mg/mL) - 0.1 0.1

Registramos las siguientes absorbancias a 400 nm enlos dos tiempos de incubacin (se
agreg NaOH cumpliendo dicho tiempo logrando detener la reaccin), obteniendo los
siguientes resultados:

Tabla 11.

Absorbancia T1 (3 min) T2 (6 min)


400 nm 0.154 0.271

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En el tubo 2 la enzima tuvo ms tiempo para actuar por ello hay mayor
presencia de producto eso se demuestra en la coloracin ya que este
presenta una coloracin amarilla ms fuerte y en el tubo uno el amarillo es
ms tenue. Y en la tabla 11 a medida que aumente la prescencia de
producto tambien ser mayor la absorbancia.

Determinamos la actividad especfica de la nucleasa empleada usando la siguiente


relacin:

A.E=Cantidad de producto liberado (M)/unidad de tiempo


(min)/cantidad de enzima usada (mg)

CANTIDAD DE PRODUCTO LIBERADO

*Considerando que el factor de calibracin (p-nitrofenol)= 6 M

Producto liberado = absorbancia x factor de calibracin

Tubo 1:

Producto liberado = 0,154 x 6 M = 0.924

Tubo 2:

Producto liberado = 0,271 x 6 M = 1.


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CANTIDAD DE ENZIMA USADA

2 mg 1 mL

x mg 0,1 mL

X = 0,2 mg

Tabla 12.

Producto liberado Tiempo Enzima usada Actividad especifica


(M) (min) (mg) (M.min-1.mg-1)
Tubo 1 0.924 3 0,2 1.54
Tubo 2 1.62 6 0,2 1.35

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Discusin de resultados

Estado de DNA

A partir de experimentos clsicos realizados en la dcada de 1950, se obtuvieron importantes datos


sobre las propiedades de la doble hlice, en los que se estudi la desnaturalizacin del ADN en una
variedad de condiciones. En estos experimentos, se monitoriz la desnaturalizacin del ADN
midiendo la absorbancia de luz ultravioleta atravesada a travs de una solucin de ADN. El ADN
absorbe la luz ultravioleta al mximo a una longitud de onda de 260 nm. Las bases las principales son
responsables de esta absorcin. Cuando la temperatura de una solucin de ADN se eleva hasta cerca
del punto de ebullicin del agua, la densidad ptica, llamada absorcin a 260 nm, aumenta
notablemente, fenmeno conocido como hipercromicidad. La explicacin de este aumento es que el
dplex de ADN absorbe menos luz ultravioleta (en un 30%- 40%) que las cadenas de ADN
individuales. Esta hipocroma se debe al apilamiento de bases, lo que disminuye la capacidad de las
bases, en el dplex de ADN. para absorber la luz ultravioleta (1), este hecho se produce en lmites de
temperatura estrechos, lo cual indica que el colapso de una parte de la estrucutra dplex del ADN
desestabiliza el resto , un fenmeno conocido como proceso cooperativo.(2)

Sin embargo nuestros resultados ( de todos los grupos) no se muestran acorde a la teora, esto puede
ser debido a diversos factores, los cuales mencionaremos a continuacin:

La falta de experiencia de los alumnos en la extraccin del ADN, lo cual pudo ocasionar que no
procedieran de la manera correcta durante el agregado del etanol y el enrollamiento del ADN ,
contaminando de esa manera la muestra. As mismo, estabilidad de la doble hlice del ADN depende
de varios factores como la naturaleza del solvente , las identidades y las concentraciones de los iones
en solucin y el pH. (2)

b. Concentracin de la muestra

Tanto la muestra de ADN animal como la de ADN vegetal se encuentran en estado


denaturado, por cual usamos esta equivalencia para hallar la concentracin:

1 mg/mL ADN = 27 unidades de absorbancia a 260 nm

Siendo la concentracin para el ADN animal 0.276 mg/ml y para el ADN vegetal 0.144
mg/ml. Tambin se hall el rendimiento del mtodo usado (mediante solventes orgnicos):

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ADN ADN vegetal


animal

Rendimiento (mg/g) 1.104 0.089


(solventes orgnicos)
Existen mltiples
mtodos de extraccin de ADN de tejidos, requeridos para una variedad de aplicaciones en
biologa molecular. El mtodo usado cloroformo: alcohol isoamilico, tiene como
inconvenientes procedimientos laboriosos y varios procesos de centrifugado y
manipulacin, y pipeteo que aumentan el riesgo de contaminacin y de ruptura del ADN.1
El mtodo utilizado en la prctica dio como resultado una concentracin mayor a 0.100
mg/ml, lo cual se considera una buena concentracin.

La extraccin de ADN por un kit comercial y el mtodo salting out tuvieron como resultado
una concentracin promedio de 0.268 mg/ml y 0.439 mg/ml respectivamente, mientras el
mtodo orgnico se obtuvo un promedio de 0.285 mg/ml. El mtodo salting out se obtuvo
una buena concentracin respecto a los otros mtodos utilizados, con mejores resultados con
respecto a la extraccin por el mtodo orgnico. Adems, el mtodo de salting out es ms sencillo
y menos txico que el sistema convencional de fenol - cloroformo o la variacin cloroformo - alcohol
isoamlico.2

El rendimiento del mtodo para el ADN animal 1.104 y para el ADN vegetal 0.089.

En este
El
estudio
se
utilizaron

1
Gmez Camargo, D., Baena Del Valle, J., Gmez Alegra, C. and Ramos Moreno, . (2013). Comparison of DNA
extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification. Pg.177

2Gmez Camargo, D., Baena Del Valle, J., Gmez Alegra, C. and Ramos Moreno, . (2013). Comparison of DNA
extraction methods from formalin-fixed paraffin sections for RCP amplification. Pg.178

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fundamentalmente los mtodos de extraccin de ADN del fenol-cloroformo y del acetato


de potasio, este ltimo ofrece ventajas sobre el mtodo del fenol-cloroformo (o la
variacin cloroformo- alcohol isoamlico), la principal desventaja de este ltimo es la
cantidad de pasos que lleva, lo que implica mayor manipulacin y muy largo el tiempo
del proceso y resulta tedioso cuando se analiza un gran nmero de muestras. 3

El mtodo de extraccin cloroformo/ alcohol isoamlico mostro un bajo rendimiento y


concentracin en ambas muestras. Lo cual podra deberse a que el ADN se encuentre en
estado denaturado.

c.Grado de puerza

Para nuestras muestras, en ambos casos, se puede observar una contaminacin por protenas
relativamente baja para la muestra animal, pero bastante alta para la muestra vegetal.
Comparando estos resultados obtenidos con la concentracin de DNA en la muestra se
comprueba que nuestra muestra de DNA animal posee pocos contaminantes, sin embargo se
encuentra altamente denaturado y que la muestra de DNA vegetal se encuentra denaturado y
altamente contaminado por protenas, este resultado se puede explicar debido errores en el
desarrollo de la extraccin de DNA en la prctica pasada cuando se agreg la solucin de
cloroformo-alcohol isoamlico y no se agit correctamente provocando que los aminocidos de
la protena desnaturalizada formaran puentes de hidrgeno con el DNA y tambin a la presencia
de pequeos contaminantes en los tubos de ensayo usados en la prctica de hoy.

d.Accion de nucleasa

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e. en sustrato sintetico

Las nucleasas son clasificadas como fosfodiesterasa I siguiendo el portal de recursos


bioinformaticos ExPASy , es decir enzimas de restriccin que actan en lugares especficos del DNA
sin embargo al ser esta molcula de alto peso molecular calcular la accin de la nucleasa a travs de
su actividad especfica resultara complicada

Para tal fines se usa el mtodo de ensayo de la actividad de esta enzima que emplea como sustrato
un ster de fosfato artificial sinttico , el bis p-nitrofenilfosfato , cuyo hidrolisis da lugar a fosfato y a
p-nitrofenol .Este ltimo compuesto adquiere color amarillo a PH alcalino por lo que se puede
cuantificar a 405 nm (1)

A simple vista se pudo constatar la reaccin de la nucleasas , ya que las condiciones de la muestras
con buffer alcalino no vario mucho con la presencia de iones fosfatos de carcter acido lo cual hizo
posible la coloracin amarillo del producto formado . Hecho que tambin se pudo cuantificar
mediante un anlisis espectrofotomtrico

En el caso de la actividad enzimtica se us NaOH 0.1 n como un tipo de inhibidor ya que altera el
buffer alterando a la misma enzima sin embargo segn otras fuentes la reaccin tambin poda ser
detenida al aadir fosfatos que por el exceso de este producto de la reaccin inhibe la actividad
enzimtica (1)

En la prctica se compar las absorbancias en los tubos 1 y 2 los cuales contenan el mismo volumen
de sustrato sinttico , buffer y nucleasas sin embargo se diferenciaban en el tiempo de incubacin . A
partir de este ultimo dato se esperaba que la absorbancia en el tubo 2 fuese el doble al del tubo 1
debido al doble de tiempo de incubacin ( 6 y 3 minutos ) .Los resultados no fueron los esperados lo
cual se podra deber a que no se midi la absorbancia inmediatamente , repercutiendo un mayor
tiempo de incubacin y por lo tanto ms tiempo de reaccin de la enzima en el tubo 1 .

Respecto a la actividad especfica, el cual no debera variar con el tiempo de incubacin , debera ser
lo mismo al haber una relacin directamente proporcional en el tiempo y la absorbancia . Nuestros
resultados difieren puesto que no se obtuvo la relacin 2:1 esperado en las absorbancias

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Conclusiones

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Referencias Bibliogrficas

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