Preparacin de Lysates-Mini Kit, Continuacin

Lisado de sangre
Utilizar el protocolo siguiente para preparar el lisado a partir de muestras de sangre
(nucleadas o No nucleados).
Nota: Si est procesando> 200 l de muestra de sangre, debe comprar
PureLink Litio Genmico / Tampn de Unin y Proteinasa K adicionales
(Pgina 43 ).
1. Coloque un bao de agua o un bloque de calor a 55 C.
2. En un tubo de microcentrfuga estril, aada 200 l de muestra de sangre fresca o
congelada (si Utilizando <200 l de muestra de sangre, ajustar el volumen de la
muestra a 200 L usando PBS).Para el procesamiento de muestras de sangre> 200 l
y 1 ml,
En consecuencia.
3. Aadir 20 L de proteinasa K (suministrado con el kit) a la muestra.
4. Agregue 20 L de RNasa A (suministrada con el kit) a la muestra, mezcle bien por
breve Vrtex, e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
5. Aadir 200 l de Lisis Genmica PureLink / Binding Buffer y mezclar bien por
Vrtex para obtener una solucin homognea.
6. Incubar a 55 C durante 10 minutos para promover la digestin de protenas.
7. Aadir 200 l de etanol 96-100% al lisado. Mezclar bien vortexando 5 segundos
para producir una solucin homognea.
8. Proceder de inmediato a Binding DNA (pgina 23 ).
Manchas de sangre
Utilice el siguiente protocolo para preparar el lisado de manchas de sangre secas.
1. Coloque un bao de agua o un bloque de calor a 55 C.
2. Coloque 2-5 punzones de mancha de sangre seca (2-3 mm de tamao) en un estril
Tubo de microcentrfuga.
3. Aadir 180 L de PureLink Genomic Digestion Buffer y 20 L de Proteinase K
(Suministrado con el kit) al tubo. Mezclar bien vortexando. Asegrese de que las
piezas estn Completamente sumergido en tampn.
4. Incubar a 55 C con vrtex ocasional durante 30 minutos.
5. Centrifugar la muestra a velocidad mxima durante 2-3 minutos en la habitacin
Temperatura para granular fibras de papel. Transferir la muestra a un lugar limpio y
estril. Tubo de microcentrfuga.
6. Aadir 20 L de ARNasa A (suministrada en el kit) al lisado, mezclar bien por breve
Vrtex, e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
7. Aadir 200 l de Lisis Genmica PureLink / Binding Buffer y mezclar bien por
Vrtex para obtener una solucin homognea.
8. Aadir 200 l de etanol 96-100% al lisado. Mezclar bien por vortex durante 5
segundos Para dar una solucin homognea.
Nota: Al procesar mltiples muestras, puede preparar un buffer maestro / Etanol
Mezcla mezclando 200 l de Lisis / Bfer y 200 l 96-100%
Etanol para cada muestra.
9. Proceda de inmediato a Binding DNA (pgina 23 )

Preparacin de Lysates-Mini Kit, Continuacin

Clulas de levadura
Lisado
Utilice el siguiente protocolo para preparar el lisado de las clulas de levadura.
1. Coloque 2 baos de agua o bloques de calor a 37 C y 55 C, respectivamente.
2. Prepare Zymolase Buffer fresco (consulte la pgina 15 ). Necesita 500 l de buffer
por muestra.
3. Cosechar hasta 5 10 7 clulas de levadura por centrifugacin. Si est utilizando
una celda congelada Pellet, contine con el Paso 4.
4. Resuspender el sedimento celular en 500 l de Zymolase Buffer. Aadir 15
unidades de Zymolase (Litiasis) e incubar a 37 C durante 1 hora para generar
esferoplastos.
5. Centrifugar a 3000 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para
Esferoplastos. Deseche el sobrenadante.
6. Resuspender los esferoplastos en 180 L de PureLink Genomic Digestion Buffer.
Aadir 20 L de proteinasa K (suministrado con el kit). Mezclar bien con vrtice breve.
7. Incubar a 55 C durante 45 minutos.
8. Aadir 20 L de ARNasa A (suministrada en el kit) al lisado, mezclar bien por breve
Vrtex, e incubar a temperatura ambiente durante 2 minutos.
9. Aadir 200 l de Lisis Genmica PureLink / Binding Buffer y mezclar bien por
breve Vrtex para obtener una solucin homognea.
10. Aadir 200 l de etanol 96-100% al lisado. Mezclar bien por vortex durante 5
segundos Para dar una solucin homognea.
Nota: Al procesar mltiples muestras, puede preparar un buffer maestro /
Etanol Mezcla mezclando 200 l de Lisis / Bfer y 200 l 96-100%
Etanol para cada muestra.
11. Proceda de inmediato al ADN de unin (pgina 23 ).
Bucal humano
Lisado de esponja
Utilice el siguiente protocolo para preparar el lisado de hisopos de clulas bucales
humanas.
1. Coloque un bao de agua o un bloque de calor a 55 C.
2. Coloque el hisopo bucal en un tubo de microcentrfuga estril de 2 ml. Aadir 400 l
(Para algodn y hisopo de Dacron) o 600 L (para Omni Swab) PBS a la muestra.
3. Aadir 20 L de proteinasa K en un tubo de microcentrfuga estril capaz de
Manteniendo tres veces el volumen de lisado (por ejemplo, si planea procesar 600 L
de lisado, utilizar un tubo de microcentrfuga capaz de contener 1800 l).
4. Transferir 200-600 l de lisado de hisopo al tubo de microcentrfuga que contiene
Proteinasa K (Etapa 3). Mezclar bien pipeteando.
5. Aadir un volumen igual de PureLink Genomic Lysis / Binding Buffer a la Lisar y
mezclar bien mediante vrtice corto.
Por ejemplo, si est procesando 200 L de lisado, agregue 200 L de PureLink Lisis
Genmica / Tampn de Unin.
6. Incubar a 55 C durante al menos 10 minutos.
7. Centrifugar brevemente para recoger cualquier lisado de las tapas del tubo.
8. Aadir 200 l de etanol 96-100% al tubo. Mezclar bien por vortex durante 5
segundos Para dar una solucin homognea.
9. Proceda de inmediato a Binding DNA (pgina 23

Procedimiento de purificacin usando columnas giratorias

Introduccin
El procedimiento de purificacin est diseado para purificar ADN genmico usando
un espn Basado en una columna de centrifugacin en un tiempo total de 10-15
minutos .
Materiales necesitados
Componentes suministrados por el usuario
Lisados preparados como se describe en las pginas 16 - 21
Tubos de microcentrfuga de 1.5 mL, libres de DNasa, estriles para la elucin
Microcentrfuga capaz de centrifugar> 10.000 g
Opcional: agua estril, pH 7.0-8.5, si est utilizando agua para elucin
Componentes suministrados con el kit
Purificadores Genmicos de Lavado PureLink 1 y 2
PureLink Genomic Elution Buffer
PureLink Spin Columns en Tubos de Recoleccin
 Tubos de recoleccin PureLink

Siga las recomendaciones a continuacin para obtener los mejores resultados:

Realizar todos los pasos de centrifugacin a temperatura ambiente

Revise los parmetros de elucin en la pgina 13 para determinar la elucin
adecuada
Volumen para sus necesidades
Realizar un paso de incubacin de 1 minuto con PureLink Genomic Elution Buffer
Asegrese de realizar los pasos de lavado recomendados para obtener los mejores
resultados
Si est utilizando agua para elucin, use siempre agua estril, pH 7.0-8.5
Antes de empezar
Agregue 96-100% de etanol a PureLink Genomic Wash Buffer 1 y PureLink
Genomic Wash Buffer 2 segn las instrucciones de cada etiqueta. Mezclar bien. Marca
En las etiquetas que se agrega etanol. Guarde los tampones de lavado con etanol en
la habitacin temperatura.

DNA de unin
1. Retire una columna PureLink Spin en un tubo de recoleccin del paquete.
2. Aadir el lisado (~ 640 l) preparado con PureLink Genomic Lysis / Binding
Tampn y etanol a la columna PureLink Spin.
3. Centrifugar la columna a 10.000 xg durante 1 minuto a temperatura ambiente.
Nota: Si est procesando> 200 L de material de partida tal como sangre,
Hisopos o saliva preservada Oragene , es necesario realizar una carga mltiple Del
lisado transfiriendo cualquier lisado restante al mismo PureLink Spin Columna
(arriba) y centrifugar a 10.000 xg durante 1 minuto.
4. Deseche el tubo de recogida y coloque la columna de centrifugado en un purificador
PureLink Tubo de recogida suministrado con el kit.
5. Proceda a Lavar DNA

Procedimiento de purificacin con columnas giratorias , continuacin

Lavando ADN
1. Aadir 500 l de Tampn de Lavado 1 preparado con etanol (pgina 23 ) a la
columna.
2. Centrifugar la columna a temperatura ambiente a 10.000 xg durante 1 minuto.
3. Desechar el tubo de recogida y colocar la columna de centrifugacin en un PureLink
limpio Tubo de recogida suministrado con el kit.
4. Aadir 500! L de tampn de lavado 2 preparado con etanol (pgina 23 ) a la
columna.
5. Centrifugar la columna a velocidad mxima durante 3 minutos en la habitacin
temperatura. Desechar el tubo de recogida.
6. Proceder a ADN de elucin .
ADN eluente
1. Colocar la columna de centrifugacin en un tubo estril de microcentrfuga de 1,5
mL.
2. Aadir 25-200 l de PureLink Genomic tampn de elucin a la
columna. VerParmetros de elucin (pgina 13 ) para elegir el volumen de elucin
adecuado para su necesariamente.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 1 minuto. Centrifugar la columna en
Velocidad mxima durante 1 minuto a temperatura ambiente. El tubo contiene
purificada ADN genmico.
4. Para recuperar ms ADN, realizar una segunda etapa de elucin usando la misma
elucin volumen de tampn como primera elucin en otro, tubo de microcentrfuga
estril de 1,5 ml.
5. Centrifugar la columna a velocidad mxima durante 1,5 minutos a temperatura
ambiente temperatura.
El tubo contiene ADN purificado. Retire y deseche la columna.
Almacenamiento de ADN
Guarde el ADN purificado a -20 C o utilizar DNA para la deseada aguas abajo
solicitud.
Para el almacenamiento a largo plazo, almacenar el ADN purificado en
PureLink Genomic elucin Buffer a -20 C como ADN almacenada en el agua est
sujeta a hidrlisis cida.
Para evitar congelaciones y descongelaciones repetidas de ADN, guarde el ADN
purificado 4 C para su uso inmediato o alcuota del ADN y almacenar a -20 C para
largo plazo almacenamiento.