1

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BASICAS

LABORATORIO DE BIOQUMICA 502504

GUA No: 3.2. DETERMINACIN DE PROTEINA BRUTA POR EL MTODO DE KJELDAHL

I. EL PROBLEMA

Determinar el contenido de protena bruta presente en muestras de harina de pescado, harina

de soya y/o harina de trigo comerciales.

II. FUNDAMENTO TERICO

Como se ha discutido, las protenas constituyen un grupo de biomelculas muy importante,

puesto que son las responsables de muchas funciones biolgicas: Como la formacin de
tejidos y la actividad enzimtica.

Conocer los contenidos de protenas presentes en los tejidos, ha sido objeto de varios estudios
y en consecuencia se han desarrollado muchas tcnicas de anlisis.

Existen varios mtodos mediante los cuales se puede determinar el contenido de protena
bruta, protena real y nitrgeno no proteico en muestras tanto de origen vegetal como de origen
animal.

MTODOS ESPECTROFOTOMTRICOS

Estos mtodos son particularmente tiles en la valoracin del contenido de protena real,
puesto que se basan en la formacin de complejos coloreados entre algunos aminocidos
proteicos el enlace peptdico, con reactivos especficos.

Dentro de los mtodos clsicos estn el que emplea el reactivo del biuret, el cual se
fundamenta en la formacin de un complejo coordinado entre los iones cpricos del reactivo y
el enlace peptdico de la protena, reaccin que transcurre en medio alcalino. Tambin es de
uso frecuente el mtodo que emplea la espectrofotometra con base en la reactivo de Folin.

En los dos casos anteriores, se elaboran curvas de calibracin con una protena patrn,
normalmente la albmina de huevo o la albmina bovina estabilizada estndar, y en las
mismas condiciones de reaccin se hace el desarrollo de la coloracin para la muestra que se
est analizando.

MTODOS VOLUMTRICOS

Dentro de estos mtodos est el de Kjeldahl, el cual se fundamenta en la conversin del

nitrgeno total presente en la muestra a sales de amonio que son posteriormente valoradas por
volumetra cido base.
 2

El mtodo de Kjeldahl consta de tres etapas que en su orden son: digestin de la muestra,
destilacin con arrastre de vapor del amoniaco producido y valoracin cido base de este
amoniaco.

En la primera etapa, el hidrgeno y el oxgeno proteico, son oxidados hasta dixido de carbono
y agua, mientras que el nitrgeno es convertido en sulfato de amonio, por la accin de un
agente oxidante en medio cido y con la ayuda de un catalizador. Se han desarrollado
diferentes variantes en las cuales cambia el catalizador el agente oxidante, pero en todos los
casos, el objetivo final de la etapa de digestin es el de convertir el nitrgeno proteico en
sulfato de amonio.

En la etapa siguiente, mediante la accin de una base fuerte, generalmente hidrxido de sodio
al 40%, se libera el amonaco de la sal de amonio. Cuando la valoracin se va a efectuar por
retroceso, el amoniaco liberado se arrastra con vapor y se recoge sobre un volumen
exactamente medido de un cido estndar. Una variante utilizada comnmente, consiste en
recibir el amoniaco (hidrxido de amonio) sobre cido brico aproximadamente al 4% de tal
manera que se forma borato de amonio, el cual se titula directamente.

En la etapa final, se hace la valoracin de acuerdo con el proceso empleado para la

recoleccin. As por ejemplo, si el hidrxido de amonio, se recibi sobre un volumen
exactamente medido de un cido estndar, la titulacin se hace con una base valorada y en
presencia de un indicador adecuado, de tal manera que se determina el cido que no reaccion
con el hidrxido de amonio destilado y por diferencia, se calcula el hidrxido de amonio
producido.

En la variante de Steyemark, el hidrxido de amonio se recoge sobre cido brico no valorado

y luego se titula directamente el borato de amonio que se forma, con un cido estndar.

Reacciones mtodo Kjeldahl Variante Steyemark

Digestin: Protena(s) + H2SO4(c) + Catalizador(s) CO2(g) + H2O(g)+ NH4HSO4(ac)

Liberacin del NH3: NH4HSO4(ac) + 2NaOH(ac) NH3(g) + Na2SO4(ac) + H2O(g)

Arrastre con vapor: NH3(g) + H2O(g) NH4OH(ac)

Recoleccin: NH4OH(ac) + H3BO4(ac) NH4H2BO4 + H2O

Titulacin: NH4H2BO4(ac) + HCI(ac) NH4CI(ac) + H3BO4(ac)

III. BUSQUEDA DE INFORMACIN

Elabore el preinforme, segn lo pre-establecido desde primer semestre y que contenga los
resultados de las siguientes consultas:

Composicin promedio en porcentaje de carbohidratos, lpidos y protenas la harina de

trigo, harina de pescado y harina de soya.
Composicin promedio de las diferentes fracciones proteicas que constituyen cada una
de las protenas presentes en cada harina a analizar.
Composicin promedio en aminocidos esenciales de cada una de las protenas a
analizar
 3

IV. MATERIAL EQUIPOS Y RECTIVOS

Material biolgico:

Harina de trigo. 5g
Harina de soya 5g
Harina de pescado 5g

Material y equipo de laboratorio, de uso general

Balanza analtica
Equipo de digestin y destilacin para Kjeldahl
Material por grupo de trabajo

Baln para kjeldahl 1

Erlenmeyer de 500 mL 1
Probeta de 100 mL 1
Probeta de 200 mL 1
Vidrio de reloj 1
Esptula 1

Reactivos

H2SO4 R. A
NaOH 40%
H3BO4 4%
HCI 0.1 N
Catalizador en pastillas (de 1 g), que contienen la siguiente mezcla catalizadora:
Mezcla catalizadora: K2SO4 97 %
CuSO 5H2O 1.5 %
Selenio 1.5 %
cido Brico al 4% con indicador de Tashiro:

Preparacin. A un litro de cido brico al 4% agregar 5 mL de indicador de Tashiro, (que se

prepara segn se describe a continuacin) y ajustar el pH a 4.2

Indicador de Tashiro:
Disolver 0.5 g de rojo de metilo y 1 g de verde de bromocresol, en 100 mL de etanol del 96%.

V. PROCEDIMIENTO

Revisin del equipo

VERIFICAR EL BUEN FUNCIONAMIENTO DE TODO EL EQUIPO KJELDAHL,

DIGESTOR, EXTRACTOR Y DESTILADOR.
LAVAR CON AGUA DESTILADA LOS REFRIGERANTES Y LOS EXTREMOS DE
RECOLECCIN DEL DESTILADO
 4

Digestin

Pesar con precisin de centsima de gramo, la cantidad de muestra segn la siguiente

tabla:

MUESTRA CANTIDAD EN GRAMOS

HARINA DE PESCADO 0.30

HARINA DE SOYA 0.40
HARINA DE TRIGO 0.50
SACAROSA (BLANCO DE REACTIVOS) 0.40

Transferir cada una de las muestras pesadas a sendos balones Kjeldahl previamente
marcados.
Agregar a cada baln que contiene la correspondiente muestra, 20 mL de H2SO4 R. A
Agregar a cada baln2 pastillas de catalizador
Colocar los balones que contienen la mezcla de la muestra, el cido sulfrico y el
catalizador sobre las resistencias del digestor Kjeldahl.
Encender las resistencias de calentamiento y el extractor del equipo Kjeldahl ractor.
Permitir que transcurra la digestin, vigilando que no haya escape de gases y rotando
el baln espordicamente para facilitar la digestin del material que salta a las paredes,
hasta que la mezcla sea transparente. (se toma entre 45 minutos y una hora)
Una vez la mezcla este transparente, apagar las resistencias, SIN APAGAR EL
EXTRACTOR, y dejar enfriar por 15 minutos en el equipo.
Retirar los balones del digestor, y terminar de enfriar cuidadosamente por enfriamiento
exterior del baln al chorro de agua.

Destilacin

Una vez fro el contenido del baln, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO

GAFAS Y GUANTES, 200 mL, medidos con probeta, de agua destilada, a cada uno de
los balones.
Dejar enfriar el baln a temperatura ambiente por 15 minutos.
Mientras transcurre este tiempo de enfriamiento, colocar en el extremo de cada
destilador, un erlenmeyer de 500 mL de capacidad, al que se le han agregado 100 mL
de cido brico que contiene el indicador de Tashiro (solucin de color rojo vino)
Encender las resistencias del destilador Kjeldahl y el sistema de refrigeracin
Terminar el enfriamiento del baln exteriormente al chorro de agua.
Agregar a cada baln, de 10 a 15 perlas para controlar la ebullicin
Una vez fro el contenido del baln, AGREGAR, CUIDADOSAMENTE UTILIZANDO
GAFAS Y GUANTES, 80 mL, medidos con probeta, de solucin de NaOH al 40 %
Instalar cada baln en una hornilla del destilador, ajustar y agitar.
Dejar que transcurra la destilacin hasta recoger aproximadamente entre 150 y 200 mL
de destilado en erlenmeyer de recoleccin, cuyo contenido cambia de color a azl
verdoso a medida que se recoge el amoniaco. (se toma aproximadamente de 10 a 15
minutos)
Recogido el volumen de destilado mencionado anteriormente, retirar los erlenmeyers
colectores.
Apagar las resistencias de calentamiento, SIN APAGAR EL SISTEMA DE
REFRIGERACINEXTRACTOR.

Titulacin.

Colocar en un erlenemeyer aproximadamente 150 mL de cido brico con indicador,

que se utilizar como referencia para el color del punto final de la titulacin.
Titular el contenido de cada destilado con HCl 0.1 N, hasta que el color azul verdoso
cambie nuevamente a rojo vino igual al del el erlenmeyer de referencia.
Leer y anotar el volumen de HCl gastado en cada titulacin.
 5

VI. TABLAS DE DATOS

El estudiante debe elaborar la(s) tabla(s) de datos con base en el (los) procedimiento(s) e
incluirla(s) en el preinforme correspondiente.

VII. PARA EL ANLISIS DE LA PRCTICA.

Calcular el contenido de protena, de cada muestra segn la siguiente ecuacin:

% Proteina = VHCl mL x NHClm.e.q x 14 mg de N x 6.25 100 .

mL x 1 m.e.q x (Peso muestra en mg)

Consultar de donde sale el valor 6.25, de la ecuacin, que es un factor de conversin

de porcentaje de nitrgeno a protena
Consultar otros factores de conversin, de donde salen y cuando se aplican
Analizar los resultados obtenidos, por comparacin con los niveles promedio de
protena consultados para el preinforme. y evaluar, desde el punto de vista de
contenido de protenas, la calidad nutricional de las muestras analizadas,
complementar el anlisis con la consulta hecha en el preinforme sobre composicin en
aminocidos esenciales

Consultar por qu, el valor de protena, determinado por este mtodo, es de protena
bruta y no de protena real.
Complementar segn las instrucciones adicionales del docente.

VII. BIBLIOGRAFA.

- Bernal de Ramrez,I. 1993. Anlisis de alimentos, Academia Colombiana de ciencias

exactas, fsicas y naturales Coleccin Julio Carrizosa Valenzuela, No 2. Bogot.
-