Laboratorio N5: Accin Bacteriosttica selectiva del cristal violeta

1.- Objetivo:

Conocer la accin bacteriosttica que tiene el cristal violeta en el crecimiento

del Escherichia coli y Bacillus subtilis.
Observar el efecto del cristal violeta, en diferentes concentraciones, sobre el
crecimiento de microorganismos.

2.- Fundamento Terico:

Cristal Violeta:

Cristal violeta o violeta de genciana es un colorante triarilmetano. El colorante

se utiliza como un mtodo gramos mancha y en cortes histolgicos de clasificacin de
las bacterias. Cristal violeta tiene propiedades antibacterianas, antifngicas y
antihelmntico y anteriormente fue importante como un antisptico tpico. El uso
mdico del colorante ha sido sustituido en gran parte por los frmacos ms modernos,
aunque todava est en la lista de la Organizacin Mundial de la Salud.

Seleccin de un agente qumico antimicrobiano:

Algunos de los factores que deben tenerse en consideracin al hacer la seleccin de

un agente qumico antimicrobiano para su aplicacin prctica son:

a) Naturaleza del material que se va a tratar: Un agente qumico usado para

desinfectar utensilios contaminados puede ser muy poco satisfactorio para su
aplicacin sobre la piel, es decir, puede daar seriamente las clulas de los tejidos. En
consecuencia, la sustancia seleccionada debe ser compatible con el material al cual
se plica.

b) Tipo de microorganismo: No todos los microorganismos son igualmente

susceptibles a la accin inhibidora o mortfera de un agente qumico especfico. Por
ello, debe saberse que el agente seleccionado es efectivo contra el tipo de
microorganismos que hay que destruir. Por ejemplo, las esporas son ms resistentes que
las clulas vegetativas. Las bacterias Gram-positivas y las Gram-negativas se
diferencian en su susceptibilidad; Escherichia coli (Gram-negativa) es mucho ms
resistente a los desinfectantes catinicos que Staphylococcus aureus (gram
positivo).Diferentes cepas de la misma especie varan tambin en cuanto a su
susceptibilidad a un agente antimicrobiano determinado.

c) Condiciones ambientales: La temperatura, pH, tiempo, concentracin y

presencia de materia orgnica extraa, pueden tener influencia sobre la tasa y la
efectividad de la destruccin microbiana. El uso con xito de un agente
antimicrobiano requiere el conocimiento de la influencia de estas condiciones sobre el
agente determinado, de manera que pueda ser empleado bajo las condiciones ms
favorables.

Aplicaciones.

El principal uso del violeta de metilo (por volumen bruto usado mundialmente)
es el de tintura textil de color prpura y para dar tonos violeta oscuro en pinturas
y tinta de impresin.

El violeta de metilo 2B (llamado sencillamente violeta de metilo) es usado en

qumica como un indicador de pH para probar los intervalos de pH de 0 a 1,0.
En el extremo cido de su intervalo de medicin, toma un color amarillo. En el
 alcalino, se hace violeta azulado. El Violeta de metilo puede ser suministrado
como papel de prueba de pH, o puede ser suministrado como cristales puros y
disueltos en la muestra a ser probada.

En medicina, el violeta de metilo 10B es conocido como violeta de genciana y

es el ingrediente activo en el colorante de Gram, usado para clasificar bacterias.
El violeta de genciana destruye clulas, y es usado en desinfectante de
intensidad moderada externo. El violeta de genciana es muy venenoso para la
mayora de los animales, cachorros y gatos incluidos; no debe ser usado para
desinfeccin de la piel de estos animales.

El violeta de metilo tiene tambin la habilidad de conectarse al ADN. Por lo

tanto, en ciencias biomdicas, es usado para ensayos de viabilidad celular. La
conexin al ADN puede tambin causar rupturas en el proceso de replicacin
del ADN, el cual puede llevar a mutaciones y cncer.

Normalmente es formulado para uso como indicador de pH en la variedad de

violeta de metilo como una solucin de 0,01 a 0,05 % en m/v y en la variedad de
violeta de cristal como una solucin de 0,02 % en m/v en agua.

En el rea de fsica, por su alta hiperrabilizidad, el violeta-cristal se utiliza como

un trazador fluorescente y en experimentos de emisin de efectos de ptica no-
lineal. Por ejemplo en la generacin del segundo-armnico-ptico. De hecho su
estructura multipolar (octupolar) representa una excelente ruta para observar
efectos pticos no-lineales en comparacin con los compuestos dipolares.

Estructura.

3.- Procedimiento:

a) Mantener 4 tubos con agar nutritivo fundido en bao mara a 45C.

b) Transferir 1 mL De la solucin acuosa de cristal violeta de 1:1000 a uno de los
tubos con 9mL de agua. Esto da una dilucin de 1:10000.
c) Usando la misma pipeta, trasferir 1 mL de la dilucin 1:10000 a una placa Petri y
1mL al segundo tubo con 9mL de agua. Esto da una dilucin de 1:100000.
d) Transferir 1mL de la dilucin 1:1000000 a una placa Petri.
e) Verter el agar fundido en las tres placas Petri y mezclar bien el colorante con el
agar frotando suavemente la placa, para obtener una distribucin uniforme de
colorante.
 f) Verter el contenido del ltimo tubo de agar en la placa Petri sin colorante para
que sirva de control.
g) Cuando ha solidificado el agar, invertir las placas y dividir cada una en dos
partes iguales con un lpiz de cera.
h) Marcar cada mitad con nombre del organismo con el que se va a sembrar por
el mtodo de estras.
i) Rayar en estras la mitad de una placa Petri con una gotita, tomada con el asa
del inoculador, del cultivo de B.Subtilis y la otra mitad igualmente con una
gotita del cultivo de E. Coli.
j) Proceder en igual forma con las dems placas Petri.

Tuos de prueba
con 9 mL de agua
1:10000 destilada.

1:100000 1:100000
Cristal Violeta 1mL 1mL
1mL

Placas Petri estriles.

Sin 1:10000 1:100000 1:1000000

colorante

Invertir las placas e incubarlas a

37C por 48 horas.

4.- Resultados:

Grupo N1 Grupo N2 Grupo N3 Grupo N4 Grupo N5

A B A B A B A B A B

1/10000 - + + - + + - - + +

1/100000 + - + + + + + + + +

1/1000000 + - + + + + + + + +

Sin
+ + + + + + + - + +
colorante
(+) Hay crecimiento
(-) No Hay crecimiento
 Grupo Colonia A Colonia B
Gram (+) Gram (-)
N 1
Estafilococos Estreptococos
Gram (-)
N 2 No pudo identificar
Estreptococos
Gram (-) Gram (-)
N 3
Estreptobacilos Estafilococos
Gram (-) Gram (-)
N 4
Estafilococos Dibiococos
Gram (-) Gram (-)
N5
Bacilos Estafilococos

Colorante Concentracin E. Coli B. Subtilis

1/10000 - -

Central Violeta 1/100000 + -

1/1000000 + +

Control Sin colorante + +

5.- Discusiones y observaciones:

Los resultados de los grupos no concuerdan con la teora de inhibicin y accin

bacteriosttica del cristal violeta en la mayora de casos.
Los resultados del experimento no fueron los esperados, lo que pudo deberse a
una incorrecta manipulacin de los instrumentos, no seguir debidamente las
indicaciones y no tener cuidado de la contaminacin al momento de
realizarse el experimento.

6.- Conclusiones:

El efecto del cristal violeta a diferentes concentraciones nos muestra que no es

eficiente en este experimento, ya que bacterias gram + y gram - se
desarrollaron aun cuando el colorante debi haber actuado. La placa sin
colorante muestra el crecimiento de bacterias del mismo modo que una placa
con concentraciones diferentes de colorantes.
Mediante la ayuda de la tcnica de la tincin de Gram se puede identificar
qu tipos de bacterias podran ser inhibidas a diferentes concentraciones de
cristal violeta.

7.- Recomendaciones:

Verter adecuadamente las concentraciones de cristal violeta sobre la placa

Petri, en caso no hacerlo, no verter la cantidad que resta cuando el agar ya
est solidificando.
Manejar adecuadamente los instrumentos, inocular correctamente y tener en
cuenta la higiene al momento de realizar el experimento.
8.- Bibliografa:

http://lasaludfamiliar.com/caja-de-cerebro/conocimiento-3077.html

Preguntas

1.- Qu es un agente bacteriosttico?

Es una sustancia qumica que inhibe el crecimiento y la reproduccin de

bacterias sin matarlas realmente.

Es aquel que aunque no produce la muerte a una bacteria, impide su

reproduccin; la bacteria envejece y muere sin dejar descendencia. Un efecto
bacteriosttico est producido por sustancias bacteriostticas. Estas sustancias son
secretadas por los organismos como medios defensivos contra las bacterias.

2.- Qu quiere decir una accin bacteriosttica selectiva?, indique algunas

aplicaciones.

En general, la accin bacteriosttica selectiva es semejante a la reaccin de

Gram, aunque se presenten unas cuantas excepciones resaltantes. Eso quiere decir
que los organismos Gram positivos se ms susceptibles a la accin de estos colorantes
que las bacterias Gram negativas.

Aplicaciones:

No mdico:

Cristal violeta no se utiliza como un colorante textil. En su lugar, se utiliza para la

coloracin de papel y como un componente de color azul marino y negra para la
impresin, bolgrafos y las impresoras de chorro de tinta. Tambin se utiliza para
colourize productos diversos tales como fertilizantes, anticongelantes, detergentes, y
chaquetas de cuero.

El colorante tambin se utiliza como una mancha histolgico, particularmente

en el mtodo de Gram para la clasificacin de las bacterias.

Al llevar a cabo electroforesis en gel de ADN, violeta cristal se puede utilizar

como un ADN no txico mancha como una alternativa a fluorescentes, colorantes
intercalantes tales como bromuro de etidio. Usado de esta manera que puede estar
incorporada en el gel de agarosa o se aplica despus de que se termine el proceso
de electroforesis. Usado a una concentracin 0,001% y se dej para teir un gel
despus de la electroforesis durante 30 minutos, se puede detectar tan poco como
16ng de ADN. A travs del uso de una tincin de contraste de color naranja de metilo
y un mtodo de tincin ms compleja, la sensibilidad se puede mejorar an ms a 8
ng de ADN. Cuando violeta cristal se utiliza como una alternativa a las manchas
fluorescentes, que no es necesario el uso de iluminacin ultravioleta, lo que ha hecho
de cristal violeta popular como un medio de evitar la destruccin de ADN inducida por
UV cuando se realiza la clonacin del ADN in vitro.

Mdico

Violeta de genciana tiene propiedades antibacterianas, antifngicas y

antihelmntico. Se utiliza mdicamente para estas propiedades, en particular, para la
odontologa, y tambin se conoce como "pyoctanin". Se utiliza normalmente para:

Con motivo de la piel para la preparacin de la ciruga y las pruebas de alergia

La tia, por ejemplo, El pie de atleta, comezn de deportista, y tia

 Candida albicans y las infecciones relacionadas; por ejemplo, candidiasis,
infecciones por hongos

lceras en la boca

El imptigo, que se utiliza sobre todo antes de la llegada de los antibiticos,

pero sigue siendo til para las personas que puedan tener alergia a la penicilina, ya
que limpia las heridas abiertas y evita la propagacin del contagio

Abrasin; Tambin tiene uno de los mejores agentes para "costras" hasta una
abrasin o escribe "fresa" de llanto herida donde la carne se desgasta de distancia. Se
evitar la infeccin en casi cualquier herida o quemadura y ayuda rpidamente el
epitelio forma una costra. No se quema cuando se aplica y decoloracin temporal de
la piel es un efecto secundario de menor importancia.

En medicina forense, se utiliz la violeta de genciana para desarrollar huellas

dactilares. Cristal violeta tambin se utiliza como una mancha de tejido en la
preparacin de secciones de microscopa de luz.

En el laboratorio, las soluciones que contienen cristal violeta y formalina se

utilizan a menudo para fijar simultneamente y teir las clulas cultivadas en cultivo de
tejidos para su conservacin y que sean fcilmente visibles, ya que la mayora de las
clulas son incoloros. Tambin se utiliza a veces como una forma barata de poner
marcas de identificacin en ratones de laboratorio ya que muchas cepas de ratones
de laboratorio son albinos lo que el color prpura se queda en su piel durante varias
semanas.

En la perforacin del cuerpo, violeta de genciana se utiliza comnmente para

marcar la ubicacin de la colocacin de piercings, incluyendo perforaciones
superficiales.

Bibliografa:

http://lasaludfamiliar.com/caja-de-cerebro/conocimiento-3077.html
https://es.wikipedia.org/wiki/Bacteriost%C3%A1tico
http://www.iqb.es/diccio/a/agente.htm
Accin oligodinmica de los Metales Pesados

1.- Objetivos:

Observar el efecto de la accin oligodinmica de metales pesados sobre el

crecimiento de microorganismos.

2.- Fundamento Terico:

Metales Pesados:

El trmino de metal pesado refiere a cualquier elemento qumico metlico que

tenga una relativa alta densidad y sea txico o venenoso en concentraciones bajas.
Los ejemplos de metales pesados incluyen el mercurio (Hg), cadmio (Cd) el arsnico
(As), el cromo (Cr), el talio (Tl), y el plomo (Pb).Los metales pesados son componentes
naturales de la corteza de tierra. No pueden ser degradados o ser destruidos. En un
grado pequeo se incorporan a nuestros cuerpos va el alimento, el agua potable y el
aire. Como elementos de rastro, algunos metales pesados (e.g. cobre, selenio, cinc)
son esenciales mantener el metabolismo del cuerpo humano. Sin embargo, en
concentraciones ms altas pueden conducir al envenenamiento. El envenenamiento
por metal pesado podra resultar, por ejemplo, de la contaminacin del agua potable
(e.g. tuberas del plomo), las altas concentraciones en el aire cerca de fuentes de la
emisin, o producto va la cadena de alimento.

Los metales pesados son peligrosos porque tienden a bioacumularse. La

bioacumulacin significa un aumento en la concentracin de un producto qumico en
un organismo biolgico en un cierto plazo, comparada a la concentracin del
producto qumico en el ambiente. Se analizan (metabolizado) o se excretan los
compuestos acumulan en cosas vivas cualquier momento se toman y se almacenan
ms rpidamente que ellos.

Los metales pesados pueden entrar un abastecimiento de agua por medio de

residuos industriales y de deposita corrientes, los lagos, los ros, etc.

Los riesgos ambientales y de salud

Continuacin vamos a describir los efectos de los metales pesados en el ambiente Los
tres contaminantes ms importantes son Plomo, Cadmio y Mercurio.

Los efectos del antimonio en el ambiente

El antimonio es un metal usado en el compuesto del trixido de antimonio, es

un retardador de la llama. Puede tambin ser encontrado en bateras, pigmentos, y
cermica y cristal .La exposicin a los altos niveles del antimonio por perodos del
tiempo cortos causa nusea, vmitos, y diarrea. Hay poca informacin sobre los
efectos de la exposicin a largo plazo del antimonio, pero es un agente carcingeno
humano sospechado. La mayora de los compuestos del antimonio no son
bioacumulambles en la vida acutica.

Los efectos del cadmio en el ambiente

El Cadmio deriva sus caractersticas toxicolgicas de su semejanza qumica con

el cinc un microalimento esencial para las plantas, los animales y los seres humanos. El
cadmio es biopersintente y, absorbido una vez por un organismo, sigue siendo
residente por muchos aos (dcadas del excedente para los seres humanos) aunque
se excreta eventualmente.

Los efectos del cromo en el ambiente

El cromo se utiliza en el cemento aleaciones del metal y los pigmentos para las
pinturas, el papel, el caucho, y otros materiales. La exposicin baja puede irritar la piel
y causar la ulceracin. La exposicin a largo plazo puede causar dao del rin y en
el hgado, y el dao demasiado prolongado problemas en el sistema circulatorio y el
tejido fino nervioso. El cromo se acumula a menudo en la vida acutica, agregando el
peligro de comer los pescados que pudieron haber sido expuestos a los altos niveles
del cromo.

Los efectos del cobre en el ambiente

El cobre es una sustancia esencial a la vida humana, pero en altas dosis puede
causar anemia, dao del hgado y del rin, y la irritacin del estmago e intestino. La
gente con la enfermedad de Wilson tiene mayor riesgo para los efectos en su salud por
la sobreexposicin al cobre. El cobre aparece normalmente en agua potable de las
tuberas de cobre, tan bien como de los aadidos diseados para controlar el
crecimiento de algas.

Los efectos del plomo en el ambiente

En la exposicin de los seres humanos al plomo pueden dar lugar a una amplia
gama de efectos biolgicos dependiendo el nivel y duracin de la exposicin. Los
diferentes efectos ocurren sobre una amplia gama de dosis, con el feto que se
convierte e infante que es ms sensible que el adulto. Los altos niveles de la exposicin
pueden dar lugar a efectos bioqumicos txicos en los seres humanos que
alternadamente causan problemas en la sntesis de la hemoglobina, de efectos sobre
los riones, del aparato gastrointestinal, del sistema reproductivo, y daos agudos o
crnicos al sistema nervioso.

Los efectos del mercurio en el medio ambiente

Son una sustancia txica que no tiene ninguna funcin sabida en bioqumica
humana o fisiologa y no ocurre naturalmente en organismos vivos. El envenenamiento
inorgnico del mercurio se asocia a los temblores, gingivitis y/o cambios psicolgicos
de menor importancia, junto con el aborto espontneo y malformacin congnita.
Monometilercury causa dao el cerebro y el sistema nervioso central, mientras que la
exposicin fetal y postnatal ha dado lugar al aborto, a la malformacin congnita y a
los cambios del desarrollo en nios jvenes.
Metales pesados y sus compuestos :

La mayora de los metales pesados,bien solos o en ciertos compuestos,son dainos

para los microorganismos.Los ms efectivos son el mercurio,la plata y el cobre.

Metales pesados (Accin oligodinmica).Cantidades extremedamente pequeas de

ciertos metales,en particular de plata,pueden ejercer un efecto letal sobre las
bacterias;esto se conoce como accin oligodinmica por derivarse de dos palabras
griegas:oligos,que significa pequeo , y dynamis que significa poder .El fenmeno
se pone de manifiesto en el laboratorio,colocando un trozo de metal limpio (cobre o
plata,moneda) sobre una placa inoculada.Despus de la incubacin una zona de
inhibicin (no hay crecimiento) rodea al metal.La cantidad de metal necesitada para
este efecto inhibitorio es extremadamente pequea,solo unas cuantas partes por
milln.

Compuestos de metales pesados.Numerosos compuestos de metales pesados tienen

actividad germicida o antisptica.Los ms destacados compuestos antimicrobianos
de metales pesados son los de mercurio,plata y cobre.El cloruro mercrico,que en una
poca fue un popular desinfectante,ya no se utiliza; sin embargo,varios compuestos
orgnicos de mercurio (mertiolato,mercurocromo y metaphen) son utilizados como
antispticos.El nitrato de plata ha sido usado durante mucho tiempo para la
prevencin de las infecciones gonoccicas de los ojos en los recin nacidos.Los
compuestos de cobre son ampliamente utilizados como fungicidas,en la agricultura.
Uno de los modos de accin de los metales pesados y de sus compuestos es mediante
la desnaturalizacin de las protenas.En el caso del cloruro mercrico,la inhibicin va
dirigida a enzimas que contienen grupos sulfhidrlicos.

3.- Procedimiento:

Limpiar la laminilla sumergindola dentro de una solucin al 10% de cido

ntrico.

Lavar bien la laminilla con agua para quitarle todo el cido.

Colocar la laminilla en el centro de una placa Petri.

Tomar un tubo con agar nutritivo fundido del bao mara manteniendo a 45C.

Inocular el tubo con agar con una gotita del cultivo de Escherichia coli tomada
con el asa del inoculador.

Rotar el tubo entre las palmas de las manos para obtener una distribucin
uniforme de los organismos.

Verter el agar inoculador dentro de la placa Petri que contiene la laminilla.

Dejar que solidifique el agar.

 De E. Invertir la placa e
Nutritivo
Coli incubarla a 37C por
48horas

4.- Resultados:
5.- Discusin y Observaciones:

Se observ la zona oligodinmica alrededor de la moneda.

Se mostr solamente una zona oligodinmica. Las colonias crecieron tambin

alrededor de la moneda. El crecimiento en toda la placa fue de crecimiento
normal.

6.- Conclusiones:

Se ve una zona oligodinmica, lo que nos indica que los metales pesados
(cobre, zinc) inhiben el crecimiento de bacterias alrededor de estos.

7.- Recomendaciones:

No limpiar las monedas con alcohol para realizar el experimento.

Realizar nuevamente el experimento para obtener resultados lo ms acorde a

la teora.

8.- Bibliografa:

http://www.lenntech.es/metales-pesados.htm

Michael J.Pelczar, Elementos de Microbiologa, Mxico, Editorial Mc-Graw Hill,

1984.
Preguntas:

1.- A qu se debe esta accin oligodinmica?

Su accin se denomina oligodinmica, es decir son activos en muy bajas

concentraciones (ppm). Inactiva especficamente enzimas claves al reaccionar con
grupos SH. Son muy txicos y su actividad disminuye con la existencia de fluidos
biolgicos. Plata: Nitrato de plata. Antisptico. Lavan los ojos de recin nacidos, en
casos concretos, para evitar la ceguera, se usa cuando la madre est infectada de
Neisseria gonorrea.

Mercurio: Cloruro de mercurio. ste elemento es altamente txico y es

inefectivo con materia orgnica, pero afecta a muchos microorganismos. El
mercurocromo es menos txico pero menos efectivo con materia orgnica.

Cobre: Sulfato de cobre. Se usa como alguicida en piscinas. Se adiciona a

pinturas para evitar hongos.

Zinc: Cloruro de zinc en colutorios bucales. El xido de zinc es antifngico en

pinturas. En general ocasionan problemas medioambientales.

2.- Qu aplicacin prctica puede tener?

Pues la accin oligodinmica, pequeas cantidades matan grande
cantidades de bacterias. Se combinan con los grupos sulfihidrilos de las bateras,
produciendo la desnaturalizacin de las protenas.

Plata: Para prevenir la oftalmia neonatorum, es una infeccin acular del bebe
por consecuencia del paso por el conducto vaginal en el parto si la madre tiene
gonorrea.

Mercurio: Es un desinfectante muy antiguo, el cloruro de mercurio ha sido

utilizado mucho tiempo contra las bacterias. Hoy en da no se utiliza porque es txico,
irrita la piel como antisptico. Hoy en da es sustituido por los compuestos orgnicos del
mercurio, como los mecuriocromos y los mentiolatos, un ej. Es la mercromina el
problema de esta es que al lavar la piel desaparece el efecto.

Cobre: En forma de sulfato tenemos el CuSO4, se utiliza en la vid para prevenir

el crecimiento de hongos, es un ingrediente del caldo badoles. Tambin como
ingrediente en pinturas, para evitar el enmohecimiento de las paredes, tiene accin
antifngica y tambin es alguicida.

Hay otros metales como el zinc que son utilizados en colutorios bocales o en las
pinturas.

Bibliografa:

http://dentizta.ccadet.unam.mx/dental/pdfs/definiciones/metalesspesados.pdf

http://html.rincondelvago.com/microbiologia_3.html