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MANUAL DE MEDIOS Y
REACTIVOS DEL
LABORATORIO DE MICOLOGIA
RED DE MICOLOGIA
GCBA
INDICE
7.- HEMOCULTIVOS
7.1 TUBOS PARA LA RECOLECCIN DE HEMOCULTIVOS.......................................... pg.46
Principio
El KOH disuelve la queratina y aclara la preparacin sin afectar la morfologa de
los elementos fngicos, permitiendo una mejor visualizacin de los mismos.
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripcin de la tcnica
Colocar una gota de KOH 40% en el centro de un portaobjetos limpio, ubicar la
muestra en el KOH y cubrir con cubreobjetos. Dejar digerir 10 min. El efecto
aclarante se acelera calentando la preparacin suavemente a la llama hasta el
desprendimiento de las primeras burbujas.
Resultado
Los dermatofitos se observan como hifas hialinas, tabicadas y ramificadas de 4 a 6
m de dimetro. Las levaduras se visualizan como elementos esfricos u ovalados
(blastosporos) que pueden presentar brote y/o seudohifas. Los hongos miceliales
se ven como hifas hialinas o pigmentadas, tabicadas o no, de dimetro irregular
segn el hongo al que corresponde.
Principio
dem 1.1. La tinta azul negra pigmenta la pared de los hongos y permite una mejor
visualizacin de los mismos.
(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como Permanente y Quink-
Parker
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripcin de la tcnica
dem 1.1
Resultado
Los filamentos y levaduras toman la tinta y aparecen color azul. Es particularmente
til para la deteccin de Malassezia spp en escamas cutneas.
Principio
dem 1.2.a. Para mantener los preparados por varios dias, se debe incluir glicerina
Solucin de trabajo:
Solucin I------------------------------------------------------------ 1,5 ml
Cartucho de Tinta negra permanente(Quink Parker)---- 1,0 ml
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(*) Puede ser otro color de tinta, pero debe ser como Permanente y Quink-
Parker
Control de Calidad
dem 1.2.a
Descripcin de la tcnica
dem 1.2.a
Resultado
dem 1.2.a
Principio
dem 1.1. El agregado de DMS reduce o elimina la necesidad de calentar el
preparado
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripcin de la tcnica
dem 1.1 realizando la primera observacin, sin calentar el preparado a la llama.
Resultado
dem 1.1
Principio
El CFW es un colorante fluorocrmico no especfico, que se une a la quitina y
celulosa de la pared de los hongos. Tiene el inconveniente de exigir para la
observacin del preparado, la utilizacin de un microscopio de fluorescencia. Ha
sido recomendado para el estudio de las muestras poco parasitadas. De los
diversos fluorocromos usados, el Blankophor tiene la ventaja de disolverse con
facilidad en el KOH.
Control de Calidad
Seguir el procedimiento utilizando una Candida albicans ATCC. Se debe observar
una fluorescencia brillante de las clulas de levaduras. Eliminado:
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripcin de la tcnica
Mezclar una gota de solucin A con una gota de solucin B sobre un portaobjetos,
ubicar la muestra y colocar un cubreobjetos. Calentar suavemente sobre la llama,
incubar de 5 a 10 min y observar el preparado con microscopio de fluorescencia,
bajo luz UV, rango 300 a 440nm (segn la marca del microscopio empleado).
Resultado
Las formas fngicas exhiben en su permetro fluorescencia azul brillante
Principio
La TCH es til para observar la presencia de la cpsula de Cryptococcus spp (Cn),
basada en la coloracin negativa. La cpsula repele las partculas de carbn de la
TCH dando un halo claro, bien demarcado alrededor de cada clula capsulada.
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Tinta china---------------------------------------------------------- 5 ml
Solucin fisiolgica ----------------------------------------------- 5 ml
Tween 80 --------------------------------------------------------- 0.1 ml
Solucin de mertiolato-borato de sodio -------------- 0.1 ml (*)
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 400x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias.
Descripcin de la tcnica
Colocar una gota de TCH y luego una gota del sedimento (fluido corporal, orina,
LCR) en un portaobjetos limpio, mezclar y cubrir con cubreobjetos. Examinar al
microscopio con objetivo de 10x, 20x y confirmar con 40x.
Resultados
La presencia de levaduras con o sin brote, con halo claro alrededor de la clula
fngica que indica presencia de cpsula. Se debe tener en cuenta que los glbulos
blancos pueden repeler las partculas de carbn de la TCH, pero presentan un
halo irregular con granulaciones internas y membrana nuclear, y la imagen no se
observa tan ntida como la pared del Cn.
Principio
Esta coloracin es til para bsqueda de levaduras intracelulares, como la fase
tisular del Histoplasma capsulatum (Hc) y Penicillium marneffei (Pm); observar los
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Control de Calidad
No est estandarizado, sin embargo puede utilizarse un frotis de sangre y
observar la coloracin de los glbulos blancos que tendrn un citoplasma celeste
claro (mononucleares) y violeta rosado (polimorfonucleares) con sus
granulaciones caractersticas
Descripcin de la tcnica
Fijar la muestra con metanol por 1 min., luego inundar el extendido con la dilucin
de Giemsa por 20 min. Lavar el preparado con abundante agua de la canilla y
dejar secar al aire.
Resultado
Permite observar levaduras pequeas y ovales en el interior de los macrfagos.
En el caso de Hc las levaduras se tien en casquete de color azul, con un halo
claro debido a que la pared del hongo no se colorea con este colorante. En Pm las
clulas fngicas presentan en su interior un tabicamiento transversal. En los
pacientes inmunosuprimidos graves, se pueden observar estos elementos fuera
de los macrfagos. Para Pj esta coloracin tie solamente los cuerpos
intraqusticos (CI) (ascosporos) o formas trficas, observndose el citoplasma de
color celeste y pequeos ncleos de color rojo-prpura. La pared del quiste (asco)
no se tie y se ve un halo claro alrededor de los CI, observndose generalmente
en grupos o clusters y ocasionalmente en macrfagos. El porcentaje de
sensibilidad de esta tcnica para detectar Pj vara del 70 al 92% segn diferentes
autores y dependiendo del material respiratorio analizado.
Principio
Esta coloracin es utilizada para clasificar microorganismos en base a su tamao,
forma, morfologa celular y reaccin de Gram.
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Solucin B (Lugol)
Yodo --------------------------------------------------------------------1g
Yoduro de potasio ---------------------------------------------------2g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p ----------------------------------------- 240 ml
Bicarbonato de sodio 5% --------------------------------------60 ml
Conservar en botella de vidrio color caramelo
Solucin C (Decolorante)
Etanol 95% --------------------------------------------------------70 ml
Acetona ------------------------------------------------------------30 ml
Solucin D (Contracolor)
Safranina O (*) -------------------------------------------------------1g
Etanol 95% --------------------------------------------------------40 ml
Disolver el colorante en el alcohol
Agua destilada-------------------------------------------------- 400 ml
(*) se puede reemplazar por fucsina fenicada diluda 1/50
Control de calidad
Gram Negativo: Escherichia coli ATCC 25922
Gram Positivo: Staphylococcus aureus ATCC 25923
Descripcin de la tcnica
Preparar extendidos delgados. Fijar el material con calor metanol. Colorear con
la Solucin A por 30 segundos, lavar con agua corriente. Inundar con la Solucin
B, dejar 30 segundos y lavar con agua corriente. Decolorar 10 segundos con
Solucin C, dependiendo del grosor del preparado, lavar con agua corriente. Teir
con Solucin D durante 30 segundos, lavar con agua corriente. Secar el extendido
al aire.
Resultado
Gram positivo: Azul violeta
Gram negativo: Fucsia (de rosa a rojo)
Los hongos son Gram positivos (Ej. Candida spp) pero algunos se colorean
parcialmente (Ej. Cryptococcus neoformans), otros se observan como Gram
variable (Ej. Blastomyces dermatitidis) Gram negativo (Ej. Pneumocystis spp y
Zygomycetes).
Principio
El AM tie la pared del hongo permitiendo una fcil visualizacin. Se utiliza para la
bsqueda de Malassezia spp.
Control de Calidad
Colorear una preparacin con clulas siguiendo el procedimiento y observar con
400x. Se observan clulas teidas de azul (ncleos y citoplasma) con un fondo
celeste claro
Descripcin de la tcnica
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Preparar el extendido con el producto del raspado de la lesin y suero para pegar
las escamas. Dejar secar al aire. Inundar el preparado lentamente (para no
despegar el material) con el colorante AM, dejar durante 1 minuto. Lavar el
extendido suavemente por inmersin en agua, dejar secar al aire y observar con
objetivo de 40x y de inmersin.
Principio
Se utiliza para la deteccin de los microorganismos cido-resistentes (Ej. Nocardia
spp) y permite diferenciarlos de otros Actinomycetes.
Solucin B: Decolorante
Acido sulfrico concentrado------------------------------------ 1 ml
Agua destilada----------------------------------------------------99 ml
Agregar el cido al agua, no viceversa
Solucin C: Contracolor
Azul de metileno ------------------------------------------------- 2.5 g
Etanol 95% ------------------------------------------------------ 100 ml
Descripcin de la tcnica
Preparar el extendido y fijarlo a la llama, cubrir luego con papel de filtro. Inundar el
portaobjeto con la solucin A durante 5 minutos. Volcar el exceso de colorante y
lavar con agua corriente. Decolorar con la solucin B y lavar con agua. Colocar la
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solucin C por 1 minuto, lavar con agua corriente y dejar secar al aire. Observar
con objetivo de inmersin (100x).
Resultado
Los microorganismos cido resistentes se tien de color rosa a rojo. Sirve tambin
para detectar esporas sexuadas en los cultivos de levaduras.
Principio
Tie las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y de otros hongos.
Esta coloracin es muy til en la deteccin de Actinomycetes anaerobios
(Actinomyces spp) y aerobios (Nocardia, Actinomadura, Streptomyces,
Nocardiopsis, Rhodococcus, Arachnia y Dermatophylus)
B2
Cristal Violeta -------------------------------------------------------- 5 g
Etanol 95% --------------------------------------------------------10 ml
Solucin C: Yodo
Yodo ----------------------------------------------------------------- 1 g
Yoduro de potasio ------------------------------------------------ 2 g
Disolver completamente en 5 ml de agua destilada
Agua destilada c.s.p. ------------------------------------------------- 300 ml
Solucin D: Anilina
Aceite de anilina -------------------------------------------------- 5 ml
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Xileno ---------------------------------------------------------------- 5 ml
Descripcin de la tcnica
Fijar los frotis y secar al aire. Colorear con Solucin A por 5 minutos y lavar con
agua corriente. Teir con Solucin B 5 minutos y lavar con la Solucin C, dejar el
yodo 5 minutos. Lavar con agua y absorber el extendido con papel secante, secar
al aire. Decolorar con Solucin D, moviendo el portaobjeto suavemente hasta que
no salga color prpura. La utilizacin de una segunda decoloracin ayuda a la
evaluacin de la coloracin. Enjuagar con xileno, secar al aire y examinar el
preparado con objetivo de inmersin (100x).
Resultados
Las paredes de los quistes (ascos) de Pneumocystis spp y el resto de los hongos,
se tien de color azul-violeta irregular. Los quistes se observan como estructuras
circulares o en forma de taza, de 5m de tamao. Las estructuras internas no se
colorean. El fondo aparece de color rosado y los ncleos celulares se tien de
rosa, pero algunos pueden retener el cristal violeta y confundirlos con quistes
(ascos) de (Pj). En nuestra experiencia, el porcentaje de sensibilidad con esta
tcnica es semejante a la coloracin de Giemsa.
Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacridos. Tiene la ventaja
de teir a los hongos muertos, situacin que no ocurre con el PAS y otras
coloraciones histolgicas.
A) Soluciones de stock
Pueden conservarse por tiempo indefinido
Solucin I:
Metenamina (Hexametilentetramina Urotropina) ---------3g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin II:
Nitrato de plata ------------------------------------------------------ 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
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Solucin IIl:
Acido crmico-------------------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin IV:
Brax ( uso fotogrfico) ------------------------------------------- 5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin V:
Bisulfito de sodio---------------------------------------------------- 1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin VI:
Cloruro de oro ---------------------------------------------------- 0.1 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin VII:
Tiosulfato de sodio (Hipo) ------------------------------------- 2.5 g
Agua destilada c.s.p.------------------------------------------ 100 ml
Solucin VIII:
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Solucin IX
Alumbre de hierro1 g
Agua destilada c.s.p.100 ml
Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.
Descripcin de la tcnica
Si se utilizan cortes histolgicos, se deben desparafinar. Oxidar con el cido
crmico (Solucin III) por 1 hora, este paso se realiza colocando los portaobjetos
sobre varillas y la droga no debe recuperarse luego de su uso. Lavar durante 10
minutos con agua corriente, cuidadosamente para evitar el desprendimiento del
material (utilizar un vaso de Coplin y que el agua caiga sobre la parte trasera del
portaobjetos). Enjuagar con agua destilada.
Colocar las preparaciones sobre varillas y agar agar bisulfito de sodio (Solucin
IV) durante 1 minuto, lavar con agua corriente (en vaso de Coplin) por 10 minutos,
enjuagar varias veces con agua destilada. Colorear con la solucin de trabajo de
metenamina plata durante 1 hora aproximadamente en estufa a 50 C hasta que
los cortes tomen un color pardo dorado. Este paso es clave para el resultado de la
tcnica, por lo tanto es necesario controlar cada 15 minutos para evitar la
sobrecoloracin. Enjuagar repetidas veces con agua destilada, deshidratar
pasando por xilol y montar.
Pasos optativos
Resultados
Los hongos se colorean de pardo dorado u oscuro debido a la impregnacin
argntica. Esta tcnica ha sido tradicionalmente considerada Gold Standard para
la visualizacin de los quistes (ascos) de Pj, los cuales se colorean de marrn
oscuro a negro y se observan con un pliegue interno (doble coma) de color negro.
Las bacterias y algunos elementos tisulares (especialmente fibras elsticas)
pueden teirse de negro o gris. Los cuerpos amilceos, frecuentemente en los
materiales respiratorios, tambin son argentfilos y pueden confundirse con
Cryptococcus y Paracoccidioides. En caso de utilizar virado, todos los hongos se
tien de negro y el resto de los tejido se decoloran ligeramente.
Principio
Idem 1.11.a
Solucin I:
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Brax al 5% (p/v) ------------------------------------------------- 6 ml
Control de Calidad
Colorear un preparado de Candida spp.
Descripcin de la tcnica
Fijar el preparado con metanol hasta secado al aire (no lavar). Colocar cido
crmico al 10% sobre la muestra durante 15 minutos, luego lavar con agua
corriente. Si se utilizan cortes histolgicos parafinados, oxidar con cido crmico al
5% (p/v) durante 1 hora, posteriormente lavar 10 minutos con agua corriente y
enjuagar con agua destilada. Si se observa la muestra de color amarillo, agregar
bisulfito de sodio al 1% (p/v) durante 1 minuto, esto es para eliminar el exceso de
cido crmico. Lavar con agua destilada 4 5 veces. Sumergir en la solucin
colorante de metenamina-plata y calentar en microondas a una potencia de 60%
durante 20 segundos, 5 6 veces hasta que la muestra tome color pardo. Si no se
dispone de microondas agregar solucin colorante sobre la muestra y calentar con
hisopo hasta color pardo- dorado. Lavar con agua corriente, agregar tiosulfato de
sodio al 2% durante 2 a 5 minutos, para eliminar el exceso de plata, finalmente
lavar con agua corriente y contracolorear con solucin de verde luz diludo 1/20
durante 5 minutos. Se puede elegir otros contrastes como los azules rojos, pero
este es el recomendado, deshidratar, pasar por xilol 10 segundos secar y montar.
Luego observar con objetivo de 40x 100x.
Principio
Colorea la pared del hongo por la afinidad con los polisacridos.
Solucin B:
Azul de O-toluidina ---------------------------------------------0.64 g
Agua destilada----------------------------------------------------30 ml
cido clorhdrico fumante--------------------------------------- 1 ml
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Etanol absoluto---------------------------------------------------70 ml
Colocar en un frasco color caramelo y bajo campano el azul de O- toluidina y el
agua, agitar vigorosamente hasta disolver el colorante y agregar en este orden: 1
ml de cido clorhdrico y 70 ml de etanol absoluto. Esta solucin se mantiene
estable durante 1 ao a temperatura ambiente.
Control de Calidad
Colorear un preparado con suspensin de Candida albicans, observar a 40x las
clulas de levaduras se observan de color violeta-prpura
Descripcin de la tcnica
Fijar los extendidos con alcohol etlico absoluto durante 1 minuto, secar 5 minutos.
Sumergir los vidrios en la Solucin A durante 10 minuto homogeneizar cada 5
minutos para mezclar) y lavar suavemente con agua fra durante 5 minutos. Cubrir
los extendidos con la Solucin B durante 12 minutos y luego lavar con metanol
95% por 10 segundos, pasar los extendidos por etanol absoluto otros 10
segundos, aclarar con xilol 10 segundos, secar al aire y examinar con objetivo de
inmersin (100x).
Resultados
La pared qustica (asco) del Pneumocystis se colorea de violeta-prpura y se
observa un pliegue interno (doble coma) teido de violeta oscuro.
Principio
Utiliza anticuerpos monoclonales marcados con isotiocianato de fluorescena:
tcnica de IFD (inmunofluorescencia directa). Estos anticuerpos estn dirigidos
contra la pared celular y antgenos del microorganismo. Se debe utilizar un
microscopio de Inmunofluorescencia para su observacin.
Control de Calidad
Segn instrucciones del fabricante del reactivo comercial
Descripcin de la tcnica
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Resultado
Se observa la morfologa caracterstica del Pneumocystis en color verde manzana
fluorescente y el fondo del preparado se observa rojizo. La sensibilidad de la
tcnica para esputos inducidos es del 90% aproximadamente.
Principio
Colorea la pared del hongo por afinidad a las mucoprotenas y mucopolisacridos.
Solucin E: Anaranjado G
Anaranjado G -------------------------------------------------------- 2 g
cido fosfotngstico sol. acuosa 5%---------------------- 100 ml
Dejar en reposo y utilizar el sobrenadante.
Descripcin de la tcnica
Lavar los cortes en alcohol 70%, sumergirlos en Solucin A 5 minutos y lavar con
alcohol 70%. Llevarlos al bao reductor con la Solucin B 1 minuto y lavar con
alcohol 70%. Sumergir en Solucin C durante 20 minutos y lavar con agua
corriente durante 10 minutos. Teir con Solucin D de 5 a 6 minutos. Diferenciar
en alcohol cido al 1%, lavar con agua corriente 30 minutos. Colorear el fondo con
la Solucin E durante 10 segundos. Lavar en agua hasta que los cortes queden de
color amarillo plido (30 segundos). Deshidratar, pasar por xilol, agregando lquido
de montar y cubrir con un cubreobjetos.
Resultados
Las mucoprotenas y mucopolisacridos neutros se tien de color rojo prpura
intenso. Permite visualizar con mayor detalle la pared de Coccidioides spp y
contrastarlo con los esporos. En la histoplasmosis es la tcnica por eleccin para
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cortes histolgicos, debido a que se observa con nitidez la pared del hongo en
negativo, en contraste con la membrana plasmtica bien teida. Colorea bien la
cpsula gelatinosa de Cryptococcus neoformans. En paracoccidioidomicosis,
aspergilosis, candidiasis y maduromicetomas los resultados son muy buenos pero
no alcanzan a superar los obtenidos con la coloracin de metenamina-plata.
Principio
Colorea los mucopolisacridos de la cpsula de Cryptococcus spp en los cortes
histolgicos.
Solucin C: Amarillo-Metanil
Amarillo-metanil -------------------------------------------------25 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
cido actico glacial ----------------------------------------- 0.25 ml
Descripcin de la tcnica
Resultados
La mucina se colorea en rosa intenso rojo, los ncleos en negro y otros
elementos en amarillo.
Principio
Colorea loa mucopolisacridos de la cpsula de Cryptococcus spp en los cortes
histolgicos.
Solucin A:
Alcian blue BG al 1% (solucin acuosa) -------------------50 ml
cido actico al 1% (solucin acuosa) ---------------------50 ml
Filtrar
Timol ---------------------------------------------------------------15 mg
Solucin B:
Fast red 5 B ------------------------------------------------------50 mg
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Solucin C:
cido fosfomolbdico ----------------------------------------------- 1 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
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Descripcin de la tcnica
Tener preparados cortes parafinados. Pasar los cortes del agua al hemalumbre
dejndolos actuar 10 a 15 minutos, lavar hasta obtener un color azul, teir con la
Solucin A durante 10 minutos y enjuagar con agua destilada. Agregar la Solucin
C por 10 minutos, lavar rpidamente en agua destilada y teir con la Solucin B
durante 10 a 15 minutos, enjuagar y montar.
Resultados
Los ncleos teidos en rojo prpura, los grnulos de mastocitos, mucina,
sustancia basal de los cartlagos y ciertos tipos de fibras conjuntivas se observan
en verde azulado. Las fibras de colgeno y huesos se tien en rojo cereza y el
citoplasma y msculo en amarillo plido.
Principio
Esta solucin es muy til para examinar el material fngico tomado de los cultivos.
El fenol mata el hongo, el cido lctico es un agente aclarante que preserva la
estructura del hongo, la glicerina previene la desecacin y el azul de algodn o
cotton blue colorea la quitina y celulosa del hongo.
Mezclar bien
Solucin B
Azul cotton de Poirrier -----------------------------------------0.05 g
(o Azul de Anilina)
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Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias
Principio
Este lquido resulta til para montar el material fngico tomado de los medios de
cultivo
Control de Calidad
Colocar una gota del reactivo entre porta y cubre, observar con 40x, chequear
ausencia de esporas de hongos y bacterias
Cloranfenicol --------------------------------------------------------- 1 g
Estreptomicina* -------------------------------------------------- 0.5 g
Agua destilada estril----------------------------------------- 100 ml
Se mantiene en heladera. Se adiciona a los medios de cultivo en concentracin
final de 100 g / ml
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Cicloheximida----------------------------------------------------- 1 mg
Acetona pura------------------------------------------------------- 3 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Disolver la cicloheximida en acetona pura y luego agregar agua destilada.
Tener mucho cuidado por la toxicidad de la cicloheximida
Consideraciones generales
Los medios de aislamiento primario deben tener un pH: entre 6.5 y 7.2. Las
condiciones cidas que se utilizan en algunos medios de cultivo, son para inhibir el
crecimiento bacteriano, pero tambin disminuye el desarrollo de algunos hongos.
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Principio
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 40 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml
Mezclar los ingredientes y hacerlos hervir hasta disolucin completa. Esterilizar a
121C durante 15 min., distribuir en tubos solidificar en plano inclinado
Modificacin: Aadir SMA (100 g/ml)
Control de calidad
Aspecto: medio slido, mbar, transparente
pH final a 25C: 5.6 0.2
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o total en el medio con cloranfenicol
Principio
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
pHfinal: 6.8-7.0
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 120 C, 15 minutos, enfriar los tubos en posicin inclinada
(pico de flauta, sin fondo).
Control de Calidad
Aspecto: medio slido, mbar, transparente
PH final a 25C: 7.0 0.2
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Disolver los ingredientes calentando hasta ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de
ensayo y autoclavar a 121 C 15 minutos. Enfriar los tubos en posicin inclinada.
Licuar la banana con leche, disolver los restantes ingredientes calentando hasta
su ebullicin, distribuir 7 ml por tubo de ensayo y autoclavar a 121 C, 15 minutos.
Enfriar los tubos en posicin inclinada.
Papa pelada-------------------------------------------------------- 20 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada c.s.p.---------------------------------------- 1000 ml
Pelar y rallar la papa, disolver la glucosa en el agua y agregar los dems
ingredientes. Hervir 20 minutos y filtrar por gasa y rectificar volumen a 1000 ml.
Fraccionar 7 ml por tubo y esterilizar a 121 C durante 15 min, enfriar los tubos en
posicin inclinada.
Control de Calidad
Aspecto: mbar claro a semitransparente, sin precipitado (cuando no est
adicionado de sangre)
PH final a 25C: 7.4 0.2
Candida albicans: crece bien
Neisseria meningitidis ATCC 13090: crecimiento aceptable a bueno
Sporothrix schenckii: conversin a levadura a 37C
Glucosa -----------------------------------------------------------1.25 g
Peptona --------------------------------------------------------------- 5 g
Cloruro de sodio ------------------------------------------------2.50 g
Extracto de carne --------------------------------------------------- 5 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 10 g
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Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Calentar hasta disolver los componentes, autoclavar a 121 C durante 15 min.,
distribuir en placas de petri
Control de Calidad
Microsporum canis: abundante produccin de macroconidios.
Sacarosa------------------------------------------------------------ 30 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 15 g
Agua deionizada ---------------------------------------------1.000 ml
Calentar hasta disolver todos los componentes, esterilizar a 121C durante 15
min., distribuir en placas de Petri
Control de Calidad
Apariencia: mbar plido, slido transparente.
pH final a 25 C: 7.3 0.2
Aspergillus flavus: crece colonia amarilla-verde
Control de Calidad
Aspecto: Agar firme, amarillento, transparente.
Trichophyton mentagrophytes: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: inhibicin parcial o total
Papa rallada-------------------------------------------------------- 10 g
Zanahoria rallada ------------------------------------------------- 20 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Agua ------------------------------------------------------------ 1000 ml
Control de Calidad
Aspecto: Blanco amarillento, no muy slido
pH final: 6.0
Malassezia restricta: Crece
En el medio inhibidor
Malassezia restricta: Crece
Aspergillus flavus: Inhibicin parcial o completa
Staphylococcus epidermidis: Inhibicin parcial o completa
Peptona ------------------------------------------------------------- 10 g
Dextrose ------------------------------------------------------------ 10 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Rojo Fenol ---------------------------------------------------------40 ml
Cl 0.8 M ------------------------------------------------------------- 6 ml
Medio de Cultivo
Peptona --------------------------------------------------------------- 3 g
Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Agua destilada c.s.p. ----------------------------------------- 100 ml
pH final: 6.8-7.0
Fraccionar en tubos y autoclavar a 121C, 15 minutos. Enfriar los tubos en
posicin inclinada.
Solucin de Aceite
Aceite neutro mineral estril. Autoclavar por 2 horas a 121C y luego calentar en
una estufa de secado a 100 C por 1-2 horas para evaporar la humedad
remanente.
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Procedimiento
Glicerol -------------------------------------------------------------30 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Procedimiento
Se utiliza 0.3 a 0.5 ml de un pool de suero fresco, suero bovino equino en tubo
de hemlisis. Tocar una colonia de levadura de la placa de 24 horas y suspenderla
en el suero. Incubar a 35 C por 2 a 3 horas. Ubicar una gota de la suspensin en
un portaobjeto, colocar cubreobjeto y observar en microscopio a 400x
Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. parapsilosis ATCC 66029
Procedimiento
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Tween 80 (polisorbato) ------------------------------------------10ml
Agua destilada------------------------------------------------ 1000 ml
Procedimiento
Los medios 6.3.a.1 y 6.3.a.2 se preparan segn instrucciones del fabricante. El
medio 6.3.a.3 se comercializa directamente en placas. Todos pueden mantenerse
varios das en heladera al abrigo de la luz. Las placas sembradas se incuban a 28
C - 35 C durante 48 a 72 horas.
Procedimiento
Procedimiento
SDA ..65g
Cremophor EL (sigma).10 ml
Agua destiladac.s.p.1000ml
Procedimiento
Peptona .10g
Glucosa .10g
Extracto de levadura..2g
Tween 60..5 ml
Citrato frrico amnico..0.5g
Esculina ..1g
Agar ...15g
Agua destilada ...c.s.p.1000ml
Agar -------------------------------------------------------------------- 2 g
Tween 80 ----------------------------------------------------------- 1 ml
Agua destilada-------------------------------------------------- 100 ml
Autoclavar a 121 C por 20 minutos. Agregar a 56 C 1 ml de leche descremada
en polvo estril.
Control de Calidad
Positivo: C. albicans ATCC 60193
Negativo: C. tropicalis ATCC 66029
Procedimiento
Glucosa --------------------------------------------------------------- 1 g
Creatina -----------------------------------------------------------0.78 g
Agar ----------------------------------------------------------------- 18 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Extracto de semilla de girasol* ----------------------------- 350 ml
Calentar hasta disolucin. Distribuir en frascos con tapa a rosca entre 50 a 100 ml.
Autoclavar a 121 C durante 15 min.
*Preparacin del extracto: Pulverizar las semillas de girasol, pesar 70g del
mismo y suspenderlo en 350ml de agua destilada, hervir y filtrar con gasa.
Autoclavar a 121 C durante 15 min. Mantener en heladera en frasco con cierre
hermtico.
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Control de calidad
C. neoformans ATCC 66031
C. albicans ATCC 60193
Procedimiento
En el momento de utilizar, fundir el medio y plaquear.
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28C durante 96 horas.
Control de calidad
Candida albicans: color blanco
Cryptococcus neoformans: Color marrn
Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 C durante 96 horas.
Hervir durante 30a Bao de Mara. Filtrar a travs de gasa y corregir volumen a 1l
Procedimiento
Sembrar el material o un subcultivo fresco de Agar Sabouraud de la colonia en
estudio, incubar a 28 C durante 96 horas.
Interpretacin
Candida albicans: colonia color blanco o crema, lisa, borde liso.
Observacin microscpica del borde a las 48 h: Clamidosporas (-)
Candida dubliniensis: colonia color pardo amarillenta, rugosa, borde festoneado.
Observacin microscpica del borde a las 48 hs: Clamidosporas (+)
Cryptococcus neoformans: colonia color marrn
Glucosa ------------------------------------------------------------- 10 g
Creatinina---------------------------------------------------------0.78 g
Cloranfenicol -----------------------------------------------------0.05 g
Difenilo (disuelto en 10 ml de etanol 95%) ------------- 100 mg
Guizotia abyssinica----------------------------------------------- 70 g
Agar ------------------------------------------------------------------ 20 g
Agua deionizada --------------------------------------------- 1000 ml
Moler las semillas y aadir 350 ml de agua, esterilizar en autoclave y filtrar. Aadir
agua hasta 1000 ml, agregar el resto de los componentes excepto el difenilo.
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Control de Calidad
C. neoformans: colonias color marrn oscuro
Cryptococcus spp: colonias claras
Base
Agar-agar ----------------------------------------------------------- 20 g
Agua destilada-------------------------------------------------- 700 ml
Esterilizar en autoclave 15 minutos a 1 atm.
Suplemento
Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color rojo en 1-5 das
Solucin A (Suplemento)
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Glicina --------------------------------------------------------------- 10 g
PO H K---------------------------------------------------------------- 1 g
4 2
SO Mg----------------------------------------------------------------- 1 g
4
Tiamina.ClH ------------------------------------------------------- 1 mg
L-canavanina ----------------------------------------------------30 mg
Agua destilada csp -------------------------------------------- 100 ml
Solucin B
Azul de bromotimol sdico ------------------------------------ 0.2 g
Agua destilada----------------------------------------------------50 ml
Base
Mezclar 440 ml de agua destilada, 20 ml de Solucin B y 10 g de agar. Autoclavar
15 minutos a 1 atm.
Para preparar el medio mezclar una parte del Suplemento con 9 partes de la Base
fundida y enfriada a 45C. Envasar en tubos de hemlisis estriles en pico de
flauta.
Control de Calidad
C. neoformans: el medio no vira de color
Cryptococcus gattii: el medio vira al color azul en 1-5 das.
Procedimiento
El medio base se prepara de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Autoclavar
a 120C durante 15 minutos. Adicionar la solucin de urea estril al 40%, al medio
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base fundido y enfriado a 45C. Fraccionar 3 ml por tubo, enfriar los tubos en
posicin inclinada.
Sembrar el agar, incubar a 28C 72 horas.
Control de Calidad
T. mentagrophytes: positivo (rojo)
T. rubrum: negativo (amarillo)
Solucin B
Solucin de urea al 10%
Mantener en heladera
Procedimiento
En el momento de usar, colocar en un tubo de hemlisis 0.5 ml de la Solucin A y
agregar 1 gota de Solucin B. Tomar algunas colonias de levaduras con un hisopo
estril e introducirlo en el tubo, dejar de 3 a 5 min y realizar la lectura final.
Control de Calidad
Procedimiento
Seguir instrucciones del fabricante del producto comercial
Procedimiento
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Saponina-------------------------------------------------------------- 5 g
Polianetol sulfonato de sodio --------------------------------- 0.5 g
Solucin fisiolgica -------------------------------------------- 100 ml
Fraccionar en tubos con tapa a rosca esterilizables en autoclave, 1 ml por tubo.
Autoclavar 15 minutos a 1 atm.
Gel de Agar
Mezclar bien hasta disolucin total del citrato, envasar en un frasco con tapa a
rosca. Mantener a temperatura ambiente.
Agarosa --------------------------------------------------------------- 1 g
PEG 6000------------------------------------------------------------- 1 g
Buffer veronal pH 8.2 ----------------------------------------- 100 ml
Merthiolate 1/100 ----------------------------------------------- 1 ml
MOPS------------------------------------------------------------ 34.53 g
Glucosa ------------------------------------------------------------- 18 g
Agua destilada csp ------------------------------------------ 1000 ml