El xido de grafeno alivia la ecotoxicidad

del cobre en la microalga de agua

dulce Scenedesmus obliquus
Abstract
La aplicacin industrial extensiva de xido de grafeno (GO), ha aumentado su riesgo de
exposicin a diversos organismos acuticos y su potencial para afectar la toxicidad de
otros contaminantes ambientales. En este estudio, se investig la toxicidad combinada de
GO y cobre en la microalga de agua dulce Scenedesmus obliquus , utilizando el modelo
MIXTOX. Los efectos de la exposicin a baja concentracin (1 mg / L) a GO se investigaron
con concentraciones ambientalmente relevantes de cobre utilizando una prueba de
toxicidad subaguda de 12 das, con tratamiento previo y posterior al GO. Los resultados
mostraron que hubo efectos antagonistas significativos entre el GO y el cobre en S.
obliquus y se encontr que GO reduca la ecotoxicidad del cobre incluso a concentraciones
bajas y ambientalmente relevantes (1 mg / l).

Grficamente abstracto

Palabras claves
Toxicidad combinada, Cobre, xido de grafeno, Microalga

1. Introduccin
El xido de grafeno (GO), un derivado oxidado del grafeno, posee interesantes
caractersticas de nanoestructura, con propiedades fsicas, qumicas, elctricas y
mecnicas inusuales ( Boukhvalov y Katsnelson, 2008 ). GO se utiliza en una amplia gama
de aplicaciones tecnolgicas, como la electrnica y la biotecnologa ( Eda et al., 2008;
Zhang et al., 2010 ) y el aumento en la produccin y aplicacin de estructuras GO,
aumenta el nivel de exposicin a los seres humanos y El entorno natural que nos
rodea. Como tal, los efectos txicos potenciales de GO deben ser establecidos.
Varios estudios han demostrado que GO ejerce efectos toxicolgicos en varios organismos
( Jastrzbska y Olszyna, 2015 ), aunque los mecanismos toxicolgicos causales
permanecen poco claros. Por ejemplo, cuando Escherichia coli se expusieron a GO
nanosheets, se observ una actividad antibacteriana significativa ( Akhavan y Ghaderi,
2010; Hu et al., 2010; Liu et al., 2011 ). Adems, un estudio realizado por Ahme y
Rodrigues (2013) , encontr que la presencia de GO en lodos activados influy
significativamente en la actividad metablica bacteriana, la viabilidad bacteriana y la
eliminacin biolgica de nutrientes.
Recientemente evaluamos los efectos ecotoxicolgicos de GO en protozoos gracilis
Euglena , estableciendo un 96 h mediana concentracin efectiva (CE 50 ) de 3,76 0,74 mg
/ L ( Hu et al., 2015 ), con la citotoxicidad de GO hacia clulas tales como humana Clulas
epiteliales basales alveolares (A549), tambin se ha informado previamente ( Hu et al.,
2011 ).
En general, se han realizado estudios previos sobre las propiedades toxicolgicas de GO en
cultivos microbianos puros bajo condiciones de laboratorio controladas. Sin embargo, los
sistemas acuticos naturales son ms complejos que estos sistemas experimentales
simplificados. Los altos niveles de contaminantes orgnicos e inorgnicos son cada vez
ms liberados en el medio acutico debido a las actividades industriales y GO puede
interactuar potencialmente con estos contaminantes que afectan su actividad o toxicidad
para los organismos acuticos. Adems, no siempre se liberan varios contaminantes en los
ambientes simultneamente, lo que significa que puede ocurrir una amplia gama de
combinaciones qumicas diferentes durante un periodo prolongado de tiempo. Por lo
tanto, se debe investigar la toxicidad combinada de GO y otras combinaciones de
contaminantes y diferentes secuencias de exposicin, para evaluar el potencial de impacto
de GO en ambiente natural.
El cobre (Cu 2+ ) es un micronutriente esencial para las plantas y las algas y se puede
detectar comnmente en los ambientes acuticos. Los compuestos de cobre han sido
ampliamente utilizados en los procesos industriales y en la agricultura durante un largo
perodo de tiempo, lo que resulta en elevadas concentraciones de cobre en ciertas reas
del medio acuoso. Varios estudios han demostrado que los altos niveles de exposicin al
cobre pueden conducir a toxicidad aguda ( Flemming y Trevors, 1989; Gaetke y Chow,
2003 ) y existen pruebas que demuestran el riesgo significativo de exposicin combinada a
mltiples metales pesados ( Fernndez y Beiras, 2001, Liu et al., 2007 ), o combinaciones
de metales y contaminantes orgnicos ( Gatidou y Thomaidis, 2007, Kim et al., 2006, Yang
et al., 2008 ) sobre diversos organismos. Sin embargo, la toxicidad combinada de los
nanomateriales y del cobre ha mostrado algunas inconsistencias notables entre los
estudios. Fan et al. (2011) encontraron que el nano-TiO 2 aument significativamente
la toxicidad de Cu 2+ a Daphnia magna al aumentar la bioacumulacin de Cu 2+ , mientras
que en contraste, Rosenfeldt et al. (2015) inform que el nano-TiO 2 redujo la toxicidad
de Cu 2+ en Daphnia magna dependiendo de las fases cristalinas (anatasa, rutilo y la
mezcla) de las nanopartculas, lo que sugiere que la disminucin de la toxicidad fue
impulsada por la adsorcin de cobre a Superficies de nanopartculas. Mostr algunas
incoherencias notables entre los estudios. Fan et al. (2011) encontraron que el nano-
TiO 2 aument significativamente la toxicidad de Cu 2+ a Daphnia magna al aumentar
la bioacumulacin de Cu 2+ , mientras que en contraste, Rosenfeldt et al. (2015)informaron
de que nano-TiO 2 redujo el Cu 2+ toxicidad en Daphnia magna en funcin de las fases
cristalinas (anatasa, rutilo, y la mezcla) de las nanopartculas, lo que sugiere que el
descenso de la toxicidad fue impulsado por la adsorcin de cobre para Superficies de
nanopartculas. Mostr algunas incoherencias notables entre los estudios. Fan et
al. (2011) encontraron que el nano-TiO 2 aument significativamente la toxicidad
de Cu 2+ a Daphnia magna al aumentar la bioacumulacin de Cu 2+ , mientras que en
contraste, Rosenfeldt et al. (2015) inform que el nano-TiO 2 redujo la toxicidad
de Cu 2+ en Daphnia magna dependiendo de las fases cristalinas (anatasa, rutilo y la
mezcla) de las nanopartculas, lo que sugiere que la disminucin de la toxicidad fue
impulsada por la adsorcin del cobre a Superficies de nanopartculas. (2011) encontraron
que el nano-TiO 2 aument significativamente la toxicidad de Cu 2+ a Daphnia magna al
aumentar la bioacumulacin de Cu 2+ , mientras que en contraste, Rosenfeldt et
al. (2015) inform que el nano-TiO 2 redujo la toxicidad de Cu 2+ en Daphnia
magna dependiendo de las fases cristalinas (anatasa, rutilo y la mezcla) de las
nanopartculas, lo que sugiere que la disminucin de la toxicidad fue impulsada por la
adsorcin de cobre a Superficies de nanopartculas. (2011) encontraron que el nano-
TiO 2 aument significativamente la toxicidad de Cu 2+ a Daphnia magna al aumentar
la bioacumulacin de Cu 2+ , mientras que en contraste, Rosenfeldt et al. (2015) inform
que el nano-TiO 2 redujo la toxicidad de Cu 2+ en Daphnia magna dependiendo de las fases
cristalinas (anatasa, rutilo y la mezcla) de las nanopartculas, lo que sugiere que la
disminucin de la toxicidad fue impulsada por la adsorcin de cobre a Superficies de
nanopartculas.
El objetivo de este estudio fue investigar los efectos combinados de GO y Cu 2+sobre la
microalga de agua dulce Scenedesmus obliquus , que domina la comunidad del
fitoplancton y es un modelo de prueba establecido en estudios de ecotoxicidad basados
en la evaluacin de la inhibicin del crecimiento ( Lewis, 1995 ). Tambin determinamos la
influencia de GO en una concentracin ambientalmente relevante sobre la ecotoxicidad
del cobre a S. obliquus.

2. Material y mtodos
GO Nanosheets (Nanjing XFNANO Materials Tech Co., Ltd., China) y se obtuvieron cultivos
de S. obliquus de la Universidad de Nanjing, China, se cultivaron y se mantuvieron
en matraces Erlenmeyer de 500 ml que contenan 150 ml de medio HB-4 (A1)
Segn Kuang et al. (2003) . Las muestras se caracterizaron por microscopa de fuerza
atmica (AFM, Veeco Multimode VIII, CEECO, EE.UU.) y microscopa electrnica de
transmisin (TEM, JEM-1400, JEOL, Japn).

2.1. Ensayos de toxicidad aguda

Los ensayos de inhibicin del crecimiento se realizaron de acuerdo con la directriz
estndar 201 de la OCDE ( OCDE, 2006 ). La concentracin celular inicial fue de 5
10 3 clulas / ml. Se trat una dispersin de stock de GO durante 15 minutos mediante
sonicacin (HN92-II D, Shanghai, China, 200 W, pulsos de 10 s y intervalos de 5 s) y luego
se aadieron a matraces de 250 ml con 100 ml de solucin de cultivo para conseguir un
GO rango de concentracin de 0, 1, 2, 4, 8, 16, 32 y 64 mg / L para la prueba de toxicidad
GO. Para los ensayos de toxicidad de cobre, CuCl 2 2H 2 O se aadi a la solucin de
cultivo para formar un Cu a partir 2+ intervalo de concentracin de 0, 0,16, 0,32, 0,64, 1,28,
2,56, y 5,12 mg / L. Se utiliz un ciclo de luz / oscuridad de 12 h / 12 h con una irradiacin
de fotones de 85-90 mol / m ^ { 2}s, proporcionada por luces de fluorescencia blancas
frescas. Los matraces se sacudieron tres veces al da y los nmeros de clulas se
determinaron por triplicado con un hemocitmetro a intervalos de 24 h despus de
una exposicin basal de 96 horas de exposicin a GO o Cu 2+ . El 96 h EC 50 se estableci a
travs de la regresin no lineal utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San
Diego, CA, EE.UU.). Las clulas tratadas con GO 8 mg / L durante 96 h fueron seleccionadas
para la investigacin de la apariencia de algas bajo un microscopio ptico (Eclipse Ni,
Nikon, Japn). Proporcionado por luces de fluorescencia blancas frescas. Los matraces se
sacudieron tres veces al da y los nmeros de clulas se determinaron por triplicado con
un hemocitmetro a intervalos de 24 h despus de una exposicin basal de 96 horas de
exposicin a GO o Cu 2+ . El 96 h EC 50 se estableci a travs de la regresin no lineal
utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Las clulas
tratadas con GO 8 mg / L durante 96 h fueron seleccionadas para la investigacin de la
apariencia de algas bajo un microscopio ptico (Eclipse Ni, Nikon, Japn). Proporcionado
por luces de fluorescencia blancas frescas. Los matraces se sacudieron tres veces al da y
los nmeros de clulas se determinaron por triplicado con un hemocitmetro a intervalos
de 24 h despus de una exposicin basal de 96 horas de exposicin a GO o Cu 2+ . El 96 h
EC 50 se estableci a travs de la regresin no lineal utilizando GraphPad Prism 5
(GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Las clulas tratadas con GO 8 mg / L durante
96 h fueron seleccionadas para la investigacin de la apariencia de algas bajo un
microscopio ptico (Eclipse Ni, Nikon, Japn). El 96 h EC 50 se estableci a travs de la
regresin no lineal utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA,
EE.UU.). Las clulas tratadas con GO 8 mg / L durante 96 h fueron seleccionadas para la
investigacin de la apariencia de algas bajo un microscopio ptico (Eclipse Ni, Nikon,
Japn). El 96 h EC 50 se estableci a travs de la regresin no lineal utilizando GraphPad
Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Las clulas tratadas con GO 8 mg / L
durante 96 h fueron seleccionadas para la investigacin de la apariencia de algas bajo un
microscopio ptico (Eclipse Ni, Nikon, Japn).

2.2. Ensayo de toxicidad combinada

Para el ensayo de toxicidad combinada , se utilizaron cultivos iniciales con una
concentracin de clulas de 5 x 10 3 clulas / ml y las concentraciones nominales
combinadas de GO y Cu2 + se calcularon sobre la base de las resistencias txicas esperadas
de 0,5 (0,125 + 0,375; 0,25 + 0,25 0,375 + 0,125), 0,75 (0,125 + 0,625, 0,25 + 0,5, 0,375 +
0,375, 0,5 + 0,25, 0,625 + 0,125), 1 (0,125 + 0,875, 0,25 + 0,75, 0,375 + 0,625, 0,5 + 0,5,
0,625 + 0,375 0,75 + 0,25; 0,875 + 0,125), y 1,5 (0,75 + 0,75; 1 + 0,5; 0,5 + 1) unidades
txicas ( TU GO + TU Cu ). El parmetro c / CE 50denota la unidad txica, donde c es la
concentracin de un producto qumico en la mezcla. Los matraces se sacudieron tres
veces al da y se determin el crecimiento con un hemocitmetro, A intervalos de 24 h,
durante un periodo de 96 h. Los datos se analizaron utilizando el modelo MIXTOX descrito
anteriormente por Jonker et al. (2005) con el modo conceptual de Accin Independiente
(IA) utilizado para derivar los patrones de respuesta del crecimiento de algas y los valores
del parmetro a por debajo y ms all de cero, indicando sinergismo y antagonismo,
respectivamente.

2.3. Prueba de toxicidad subaguda

La prueba de toxicidad subaguda de 12-d incluye 3 tipos de tratamientos. El tratamiento 1
utiliz concentraciones iniciales de Cu2 + de 0, 0,32 y 1,28 mg / L (es decir, 0, 5 y 20 M). El
tratamiento 2 utiliz concentraciones de Cu2 + similares a las aplicadas en el tratamiento
1, con GO aadido a cada matraz despus de 24 horas de exposicin para obtener una
concentracin nominal de 1 mg / l. En el tratamiento 3, se aadi primero 1 mg / L de GO
al matraz y 24 horas ms tarde se inici la exposicin al Cu 2+ como se describe en el
tratamiento 1. Despus de un perodo de exposicin de 12 d, se registraron los nmeros
de clulas en cada tratamiento.
Para el ensayo de clorofila, se recogieron 5 ml de cultivos a 12-d y se centrifugaron (5198
x g durante 15 min). El precipitado resultante se volvi a suspender y se extrajo en 5 ml de
acetona al 90% (oscuridad a 4C durante 24 h). Los extractos brutos se centrifugaron
(5198 x g durante 15 min) y los sobrenadantes se analizaron para determinar la densidad
ptica a 645 nm y longitudes de onda de 663 nm. Las concentraciones de clorofila a y
clorofila b se calcularon de acuerdo con las ecuaciones reportadas por Jeffrey y Humphrey
(1975) .
Para determinar las concentraciones de cobre restantes en el cultivo, se recogieron 5 ml
de cultivo despus de 12 dy se centrifugaron (5198 x g durante 15 min). El sobrenadante
se filtr ( filtro de polisulfona 0,45 \ mu m) y se acidific con HNO _ { 3} , permitiendo que
la concentracin de cobre fuera establecida por ICP - MS (iCAP Q, Thermo, USA). Se
realizaron simultneamente tratamientos de control paralelo sin ningn cultivo de
microalgas y se determin tambin la concentracin de cobre.
Adems, se investig el contenido de cobre extracelular e intracelular de acuerdo con una
versin modificada del mtodo informado por Zhou et al. (2012) . Se centrifugaron 30 ml
del cultivo de algas (5198 x g durante 10 min) y las clulas de algas concentradas y los
agregados GO se resuspendieron en 5 ml de EDTA 0,02 M y se agit inmediatamente
durante 30 s para eliminar el cobre extracelular adsorbido sobre el Paredes celulares y
GO. Despus de otra centrifugacin (10 min a 9432 g), 250 l de HNO concentrado 3 se
aadi al sobrenadante (4,75 ml) y se utiliza para determinar la concentracin de cobre
extracelular. Los precipitados se hicieron cocer durante la noche en un horno de mufla
(TDRG, Yixing, China) a 900C y se disolvi en 8 ml de HNO _ { 3} al 5% mol / L con el fin de
determinar la concentracin intracelular de cobre mediante ICP - MS. Las concentraciones
de cobre extracelular e intracelular se presentan en g / clula.
 2.4. Anlisis estadstico
Los resultados se presentan en trminos de medias aritmticas y sus correspondientes
desviaciones estndar ( n = 3 en todos los estudios, n = 5 para la prueba de inhibicin del
crecimiento). Las diferencias entre los tratamientos se analizaron para determinar la
significancia utilizando un anlisis de varianza unidireccional (ANOVA) con el software
Origen 7.0. Segn las pruebas de comparaciones mltiples de Tukey, P <0,05 y ** P <0,01
se consideraron significativos y altamente significativos, respectivamente.

3. Resultados y discusin
Se obtuvo una dispersin GO homognea visible mediante sonicacin del medio de cultivo
y permaneci estable durante ms de 3 das. Las muestras GO fueron examinadas por
TEM para determinar la forma y el tamao, mostrando que los fragmentos GO eran
heterogneos y variaban entre 1 y 10 m de tamao ( Figura 1). La imagen del AFM
mostr que el grosor de las hojas era ~ 0.7 nm ( Fig. 2 ), con toda otra informacin
detallada sobre las caractersticas de las muestras de GO preparadas descritas en nuestros
informes anteriores ( Hu et al., 2015 ). Los resultados de los espectros XPS mostraron que
el contenido de oxgeno era aproximadamente de 32% en masa y que la estructura GO
inclua lminas GO mono y multicapa y establecieron que el potencial zeta de dos
muestras GO era aproximadamente -20 mV.

Fig.1. Imgenes TEM tpicas de xido de grafeno, despus de la suspensin por sonicacin (15 min a 200 W,
10 s pulsos, y 5 s intervalos).
Para investigar la toxicidad combinada de GO y cobre en S. oblicuo , se determin primero
el individuo CE 50 mediante la prueba de inhibicin del crecimiento tanto para ir y
cobre. Las 96 h CE 50 valores establecidos para GO y cobre hacia S. oblicuofueron 21,2
0,5 y 0,77 0,06 mg / L, respectivamente ( Fig. A1 ). En comparacin con los
protozoarios E. gracilis , S. obliquus mostr una menor sensibilidad a la exposicin
GO. Una razn posible para esto es que las paredes celulares externas de la microalga
pueden proteger eficazmente las clulas de GO en los medios de cultivo.
El efecto de sombreado de GO tambin podra ser un factor importante en su mecanismo
de toxicidad acutica, ya que cuando la concentracin de GO supera los 5 mg / L, el color
de la cultura se profundiza, obstaculizando severamente la capacidad de adquisicin de
luz de la microalga Mediante estudios utilizando el efecto de sombreado causado por la
aglomeracin GO, para evaluar la toxicidad de GO en las algas Raphidocelis
subcapitata ( Nogueira et al., 2015 ). Cuando GO (1 mg / L) existi en el medio, el valor
de 96 h CE 50 de cobre a S. obliquus fue de 0,94 0,09 mg / L, lo que indica una reduccin
de la toxicidad del cobre con un porcentaje del 22,1% (es decir, 0,94 - 0,77) / 0,94).
El modelo MIXTOX intenta examinar los efectos de la toxicidad combinada en escenarios
de exposicin ms realistas, investigando las interacciones dependientes de la dosis y
dependientes de la dosis. Las proporciones de GO y cobre en el tratamiento 1 fueron de
0,125: 0,875, 0,25: 0,75, 0,375: 0,625, 0,5: 0,5, 0,625: 0,375, 0,75: 0,25 y 0,875: 0,125. Los
resultados de la prueba de toxicidad combinada mostraron un > 0, indicando una relacin
antagonista entre GO y cobre ( Tabla A1 ).
Para establecer si la presencia de concentraciones bajas de GO influye en la interaccin
entre el cobre y la microalga, se realiz una prueba de toxicidad subaguda con secuencias
de exposicin escalonadas. Como se muestra en las Figs. 3 y 4 , en comparacin con los
controles, todos los tratamientos mostraron consistentemente disminucin del
crecimiento de algas despus de 24 horas de exposicin. Cabe destacar que 1 mg / L de
GO no tuvo efectos adversos sobre la microalga ( Figura 4A). En S. obliquus , la toxicidad
de 5 M de cobre fue significativamente inhibida ( P<0.05) por el tratamiento con 1 mg / L
de GO, independientemente de la presencia o ausencia de GO de pretratamiento de la
microalga. Cuando las concentraciones de cobre se incrementaron a
20 M, Pretratamiento con 1 mg / L GO redujo la toxicidad del cobre a la microalga. El
contenido total de clorofila mostrado en la Fig. 4 B, est de acuerdo con los nmeros de
las algas.
Fig. 2. AFM image of GO nanosheets on a mica surface.
Fig.3. 12-d subacute toxicidad test de crecimiento curvas, para Scenedesmus obliquus bajo diferentes
exposiciones a GO +/- cobre.

Fig. 4 . Nmero de clulas (A) y contenido total de clorofila (B) de Scenedesmus obliquusdespus de una
exposicin de 12 d a 1 mg / L de GO +/- cobre. "Cu + GO" se refiere a muestras pretratadas con Cu 2+ 24 h
antes del tratamiento con GO; "GO + Cu" se refiere a muestras pretratadas con GO 24 h antes
del tratamiento con Cu 2+ . * Y ** indican tratamientos significativos ( P <0,05) y altamente significativos
( P <0,01) respectivamente, en comparacin con el tratamiento con Cu 2+ solo para cada grupo.
La pared celular de microalgas est compuesta principalmente de carbohidratos,
protenas y grandes grupos funcionales que contribuyen a la unin a iones metlicos
( Macfie y Welbourn, 2000 ). La captacin de metal por las microalgas vivas tiene lugar en
dos etapas, la adsorcin fsica sobre la superficie celular y la bioacumulacin a travs del
transporte intracelular y la quelacin ( Folgar et al., 2009 ). Por lo tanto, los factores que
interfieren con la adsorcin podran influir en la eficiencia de la absorcin del metal. Zhou
et al. (2012) encontraron que la inhibicin del crecimiento de S. obliquus debido a la
toxicidad del cobre, dependa de la unin de los iones metlicos a la pared celular de las
algas, en lugar de unirse a sitios activos intracelulares.
Debido a la presencia de grupos carboxilo, hidroxilo y epoxi en la superficie de la hoja de
nano GO, podra por lo tanto formar suspensiones relativamente estables y estudios
previos han demostrado que GO adsorbe eficazmente Cu2 + , con una capacidad de
alrededor de 10 veces la de carbono activo ( Yang et al., 2010 ). As, Cu 2 + podra ser
adsorbido eficientemente por GO suspendido en el cultivo, disminuyendo la
biodisponibilidad de Cu 2+ y reduciendo la ecotoxicidad de Cu 2+ a S. obliquus. En el
presente estudio tambin se observ que GO se agreg alrededor de clulas de
microalgas ( Fig. 5 ), que pueden proporcionar un efecto protector de Cu 2 + dao. Es de
notar que Tang et al. (2015) informaron recientemente que GO solo a concentraciones
bajas (<10 mg / L) no mostr toxicidad significativa pero aument significativamente
la toxicidad de Cd2 + . Los autores encontraron que GO en presencia de Cd 2 + fcilmente
unido a las clulas de algas y entr.

Fig.5. Microscopa ptica de imagen de Scenedesmus obliquus tratados con 8 mg / L GO.

Para entender la influencia de GO en la concentracin de cobre, se determinaron las
concentraciones de cobre en los medios de cultivo de todos los tratamientos y los
resultados se muestran en la Fig. 6 . Con algunas combinaciones, hasta el 93% de cobre
fue adsorbido por GO, lo que sugiere el potencial de excelente capacidad de
adsorcin. Cuando se expone al cobre solo a 5 M, la microalga S. obliquus puede tener
un mayor nivel de absorcin de Cu 2+ por lo tanto sufre ms estrs. Por lo tanto, la tasa de
crecimiento de la microalga en el tratamiento con Cu a 5 M fue significativamente ms
lenta ( P <0,01) que con el pre o post tratamiento con GO ( Fig. 4 ), mostrando un efecto
protector de GO. Aumento de las concentraciones de cobre de 20 M,
Fig.6. Concentraciones de cobre de los medios de cultivo despus de una exposicin de 12 d a GO +/-
Cu 2+ . "Cu 5" y "Cu 20", se refieren a muestras expuestas a concentraciones de Cu 2+ de 5 M y 20 M
respectivamente, y "GO 1" se refiere a muestras expuestas a 1 mg / L de GO. Este ltimo producto qumico
se aadi a los medios de comunicacin despus de 24 horas de exposicin al qumico anteriormente
nombrado; " N " significa que no hay microalga en los medios. Los datos dentro de todas las columnas en
cada figura con una letra en comn no son significativamente diferentes en P <0.01 nivel, n=3.
Fig.7. Concentracin extracelular e intracelular de Cu 2+ de Scenedesmus obliquus despus de una exposicin
de 12 d. "Cu 5", "Cu 20" y "GO 1" se refieren a 5 M de Cu, 20 M de Cu y 1 mg / L de GO,
respectivamente; El ltimo llamado qumico se aadi a los medios de comunicacin despus de 24 horas
de exposicin a la qumica denominada anteriormente. Los datos dentro de todas las columnas en cada
figura con una letra en comn no son significativamente diferentes en P <0.01 nivel, n=3.
Se determinaron las concentraciones extracelulares e intracelulares de cobre de S.
obliquus despus de la exposicin de 12 d. Como se muestra en la Fig. 5 , los agregados
GO y las clulas algales no se separaron fcilmente del complejo celular - GO mediante
centrifugacin. Por lo tanto, las concentraciones extracelulares de cobre expresadas en
este estudio tambin incluyeron el cobre adsorbido en el GO en el complejo celular-GO. La
determinacin del cobre intracelular tambin fue influenciada por los agregados de GO, ya
que el EDTA, usado como un agente eluyente, ha demostrado tener alta eficiencia y
ejercer un bajo nivel de dao biosorbente ( Vijayaraghavan et al., 2006, Wasay et al.,
2001 ). Cuando se expusieron cultivos de microalgas a 5 M (es decir 0,318 mg / L) de
cobre (Cu 5, Cu 5 + GO 1 y GO 1 + Cu 5, Figura 7 A) El contenido de cobre de las clulas era aproximadamente
de 4 x 10 -8 g / clula, que se aproximaba a las de los extracelulares. En consideracin a la

presencia de GO en los tratamientos Cu 5 + GO 1 y GO 1 + Cu 5, menos Cu 2+ se

absorbieron en la pared celular en estos dos tratamientos que en Cu 5. Los efectos del
cobre sobre el crecimiento de S Se sugiri que los obliquusdependen de la unin de iones
en la pared celular de algas, en lugar de unirse a sitios activos intracelulares ( Zhou et al.,
2012 ). Por lo tanto, GO puede actuar como un protector y reducir la toxicidad del
cobre. Cuando se expuso a cobre 20 M (es decir, 1,27 mg / L) ( figura 7 B), el contenido
de cobre intracelular de todo el tratamiento (Cu 20, Cu 20 + GO 1, Y GO 1 + Cu 20) aument a ms de
10 10 -8 g / clula, lo que sugiere mayores niveles de estrs por exposicin al cobre en S.

obliquus . Es de destacar que los contenidos de cobre extracelular de los tratamientos a

20 M (con exposicin previa o posterior al GO) superaron los 60 10 -8 g / clula, lo que
fue 6 veces mayor que las concentraciones intracelulares de cobre y fueron
significativamente mayores ( P <0,01) que la del tratamiento a 20 M de Cu solo. En
comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos tratamientos tenan
menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que sugiere que ms Cu 2
+ iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect como contenido

extracelular de cobre. Lo que sugiere mayores niveles de estrs por exposicin al cobre en
S. obliquus . Es de destacar que el contenido de cobre extracelular de los tratamientos a
20 M (con exposicin previa o posterior al GO) excedi de 60 10 -8 g / clula, lo que
fue 6 veces mayor que las concentraciones intracelulares de cobre y fueron
significativamente mayores ( P <0,01) que la del tratamiento a 20 M de Cu solo. En
comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos tratamientos tenan
menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que sugiere que ms Cu 2
+ iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect como contenido
extracelular de cobre. Lo que sugiere mayores niveles de estrs por exposicin al cobre en
S. obliquus . Es de destacar que el contenido de cobre extracelular de los tratamientos a
20 M (con exposicin previa o posterior al GO) excedi de 60 10 -8 g / clula, lo que
fue 6 veces mayor que las concentraciones intracelulares de cobre y fueron
significativamente mayores ( P <0,01) que la del tratamiento a 20 M de Cu solo. En
comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos tratamientos tenan
menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que sugiere que ms Cu 2
+ iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect como contenido

extracelular de cobre. Que el contenido de cobre extracelular de los tratamientos a 20 M

(con exposicin previa o posterior al GO) excedi de 60 10 -8 g / clula, que fue 6 veces
mayor que las concentraciones intracelulares de cobre y significativamente mayor
( P <0,01) que El del tratamiento a 20 M de Cu solo. En comparacin con las exposiciones
con 5 M de cobre, estos dos tratamientos tenan menos clulas viables y relativamente
ms GO aglomeracin, lo que sugiere que ms Cu 2 + iones fueron adsorbidos en GO y, en
consecuencia, se detect como contenido extracelular de cobre. Que el contenido de
cobre extracelular de los tratamientos a 20 M (con exposicin previa o posterior al GO)
excedi de 60 10 -8 g / clula, que fue 6 veces mayor que las concentraciones
intracelulares de cobre y significativamente mayor ( P <0,01) que El del tratamiento a
20 M de Cu solo. En comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos
tratamientos tenan menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que
sugiere que ms Cu 2 + iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect
como contenido extracelular de cobre. Que era 6 veces ms alto que las concentraciones
de cobre intracelular y eran significativamente ms altos ( P <0,01) que el del tratamiento
a 20 M de Cu solo. En comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos
tratamientos tenan menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que
sugiere que ms Cu 2 + iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect
como contenido extracelular de cobre. Que era 6 veces ms alto que las concentraciones
de cobre intracelular y eran significativamente ms altos ( P <0,01) que el del tratamiento
a 20 M de Cu solo. En comparacin con las exposiciones con 5 M de cobre, estos dos
tratamientos tenan menos clulas viables y relativamente ms GO aglomeracin, lo que
sugiere que ms Cu 2 + iones fueron adsorbidos en GO y, en consecuencia, se detect
como contenido extracelular de cobre.
Aunque el presente estudio demostr que GO redujo la toxicidad del cobre a S. obliquus ,
la ecotoxicidad de esta sustancia no debe subestimarse. Los riesgos de los efectos nocivos
de la exposicin a la GO podran aumentarse si se acumulan complejos de contaminantes
GO en animales o seres humanos ( Zhao et al., 2014 ) y el transporte de GO - complejos
contaminantes en el ecosistema acutico y su ecotoxicidad Diferentes modelos y sistemas.
4 . Conclusiones
Los resultados del presente estudio mostraron que hubo efectos antagonistas
significativos entre el GO y el cobre en la microalga de agua dulce S. obliquus . Una prueba
de toxicidad subaguda de 12 das revel que GO a una concentracin ambiental relevante
de 1 mg / L, no ejerca ningn efecto adverso y, en cambio, significativamente ( P <0,05)
inhibi la toxicidad del cobre a S. obliquus con un porcentaje aproximado del 22%. La
adsorcin de Cu 2+ a aglomerados GO suspendidos, en el cultivo o en la superficie de las
algas, puede ser responsable de la disminucin de la biodisponibilidad del cobre y
contribuir a la inhibicin de la toxicidad del Cu 2+ .