PONTIFICIA UNIVERSIDAD CATLICA DE VALPARASO

FACULTAD DE INGENIERA
ESCUELA DE INGENIERA BIOQUMICA

DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA:

-GLUCOSIDASA
Bioqumica QUI-343

Alumnos: Franco Boggiano - 18.554.144-4

Flavia Oneto - 19.151.101-8
Curso: QUI-343
Profesor: Diego Daz Ojeda
Fundamentos de las tcnicas:

Las enzimas son protenas que presentan actividad cataltica especfica, es decir, aumentan la
velocidad de reacciones especficas. La actividad cataltica de una enzima es una propiedad que se
mide por el aumento de la velocidad de reaccin en presencia de la enzima con relacin a la reaccin
no catalizada en un sistema qumico dado.

La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la concentracin del

producto o la disminucin de la concentracin del sustrato de la reaccin en el tiempo.

Existen diferentes mtodos que permiten cuantificar la concentracin de reactantes y/o productos.
Entre los mtodos analticos fsicos destacan los pticos, que se basan en la absorcin de radiacin
electromagntica en la regin visible y ultravioleta. Determinando el coeficiente de extincin de un
compuesto se estima la velocidad sobre la base de las medidas experimentales de absorbancia en
un tiempo dado.

En este caso se determinar la cintica de la enzima -glucosidasa, utilizando un sustrato artificial,

el p-nitrofenil- -D-glucopiranosido (pNPG). Se calcular la velocidad de la hidrlisis de este sustrato
midiendo la formacin de un producto de la reaccin, el p-nitrofenolato (pNP). El pNP es de color
amarillo en un medio alcalino y presenta un mximo de absorcin alrededor de 405 nm, por lo tanto,
es posible construir una curva de calibrado basada en concentraciones conocidas ascendentes de
este compuesto, versus su absorbancia, lo que nos permite calcular el coeficiente de extincin del
producto.

Luego, es posible determinar la velocidad de reaccin utilizando la siguiente ecuacin:

(UI/ml)
Objetivos

Objetivo general:

Determinar la actividad enzimtica de la -glucosidasa.

Objetivos especficos:

Construir una curva de calibrado para el pNP y obtener el coeficiente de extincin.

Utilizar como modelo experimental la enzima -glucosidasa mediante mtodo discontinuo.

Calcular la velocidad de la reaccin de acuerdo a la ecuacin indicada al inicio.

Clculos y resultados:

Curva de calibrado para el p-nitrofenolato (pNP):

Tubo pNP 0,2 mM (ml) Tampn (mL) Na2CO3 (mL) [pNP] (mM) A405nm
1 (blanco) 0,0 1,0 2,0 0,00000 0,000
2 0,1 0,9 2,0 0,00667 0,147
3 0,2 0,8 2,0 0,01334 0,328
4 0,3 0,7 2,0 0,02000 0,468
5 0,4 0,6 2,0 0,02667 0,606
6 0,5 0,5 2,0 0,03334 0,760
7 0,6 0,4 2,0 0,04000 0,866

Grfico absorbancia v/s concentracin

1
0.9
0.8
y = 21.975x + 0.014
0.7 R = 0.9967
Absorbancia

0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045
Concentracin de pNP (mM)

La ecuacin de la recta es:

y = 21,975x + 0,014
y su pendiente corresponde al coeficiente de extincin () multiplicado por la longitud del paso
ptico ().

Como = 1 , () = 21,975 1 1
Los datos para la obtencin de la velocidad de la reaccin catalizada por la B-glucosidasa se
presentan en la siguiente tabla:

Tubo Sustrato Na2CO3 [ml] Solucin Solucin Absorbancia

[ml] enzimtica [ml] Tampn [ml] a 405 [nm]
Blanco 0,9 2,0 0,1 0 0
Control 0,9 2,0 0,1 0 0,004
Ensayo 0,9 2,0 0,1 3,0 1,172

Haciendo uso de la siguiente ecuacin para obtener la velocidad de reaccin:

donde:

= 1,172 C0 = 0,004

= 21,975 [1 ] = 5 []

V/v est dado por:

. + .
.

Es decir, V/v = 10,0

Fd es el factor de dilucin del ensayo enzimtico para ensayos discontinuos. Sea V = (Vol. Solucin
Enzimtica + Vol. Sustrato), entonces Fd est dado por:
+ . + . .
=

6,0 []
Es decir, Fd = = 6,0
1,0 []

Ahora debe notarse que tanto V/v como Fd son adimensionales y el resto de la ecuacin tiene
unidades:

Al reemplazar se tiene,

1,172 0,004 1 1,0 [] 6,0 []

= 1
= 0,6378
21,975 [ ] 5 [] 0,1 [] 1,0 []
Discusiones
En este ensayo, la actividad enzimtica de la Beta-glucosidasa es determinada por una reaccin en
la cual la Beta-glucosidasa hidroliza p-nitrofenil-b-D-glucopiranosido (pNPG), resultando en la
formacin de un producto colorimtrico a 405 nm, el que es proporcional a la actividad enzimtica
de la Beta-glucosidasa presente.

El ensayo se llev a cabo a pH = 5.0 y 40 [C]. En la bibliografa se puede encontrar gran variedad de
condiciones ptimas que difieren entre s, esto es debido a que tales condiciones dependen, entre
otras razones, del origen de la enzima tanto como del sustrato sobre el que acte, es por esto que
es importante conocer con claridad su origen.

Para el caso de Beta-glucosidasa proveniente de la almendra dulce (Prunus dulcis), productores

como Toyobo indican un pH ptimo de 5.5 y una temperatura de 50-55 [C], pero por el tipo de
sustrato, se suele usar un pH de 5.0. Cabe destacar que otras fuentes, como Enzyme Handbook de
Springer, indican, para el caso del pNPG como sustrato, un pH de 4.0 a 5.0 y una temperatura de 40-
49 [C]

Se cree que las condiciones a las que se llev a cabo el ensayo son bastante cercanas a los
parmetros funcionales ptimos, y por tanto su rendimiento ser cercano al mximo terico.
Muchas fuentes entregan el rendimiento terico en [UI/mg] (cuando se encuentra como un polvo),
hallndose este alrededor de 10 a 30 [UI/mg] para el pNPG. Sin embargo, en el ensayo que se realiz,
la enzima no se encontraba como un cristal, sino que se hallaba inserta en un solvente orgnico
desconocido, por lo que este dato no es de gran utilidad. Otros Kits de ensayo, como el de Abnova,
presentan una grfica de actividad enzimtica vs Absorbancia, pero se indica que esta es lineal hasta
los 0.250 [UI/ml], con una absorbancia de 0.5 (a 405 nm), sin embargo, si a pesar de esto esta se
extrapola se hallan valores cercanos a los hallados en el ensayo realizado.

Otro punto a destacar es que se hall que para condiciones similares el coeficiente de extincin del
pNP suele hallarse entre 18.1 y 18.5 [1/mM], lo cual no es tan alejado del calculado
experimentalmente (21,975 1/mM). Tambin se encontraron valores diferentes para distintos pH
(16,8 1/mM para pH=8; 18,5 1/mM para pH=9,2), lo que nos indica que este parmetro tambin es
sensible a las condiciones a las que se encuentre, especialmente el pH.
Conclusiones

Fue posible construir una curva de calibrado exitosamente con un R2 cercano a 1 (0,9967) para
obtener el coeficiente de extincin molar del pNP. Con este dato junto con las absorbancias del
ensayo enzimtico y del control, se calcul la velocidad de reaccin.

La velocidad de la reaccin determinada nos permiti conocer la cintica de la enzima -glucosidasa,

la cual, si bien no podemos hacer una comparacin con informacin encontrada en literatura (dado
las diferentes unidades) sabemos que se producen pequeas variaciones en los valores y estas
corresponden a las diferentes condiciones de la reaccin.

Esto quiere decir que se debe ser muy cuidadoso al realizar una actividad experimental para
determinar la cintica de una enzima, ya que stas son muy sensibles a los cambios de pH,
temperatura, concentraciones, incluso el origen de la enzima. Por lo tanto, es recomendable
conocer previamente las condiciones ptimas a las cuales una enzima determinada presenta una
mayor actividad. Cabe aadir que el coeficiente de extincin molar tambin puede variar segn las
condiciones y, por ende, modificar el clculo de la velocidad de reaccin.