Professora autora/conteudista:

Talita Trevizani Rocchetti

 vedada, terminantemente, a cpia do material didtico sob qualquer
forma, o seu fornecimento para fotocpia ou gravao, para alunos
ou terceiros, bem como o seu fornecimento para divulgao em
locais pblicos, telessalas ou qualquer outra forma de divulgao
pblica, sob pena de responsabilizao civil e criminal.


SUMRIO
Introduo e seus componentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Introduo biologia molecular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
Organismos eucariontes e procariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Organismos procariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5
Organismos eucariontes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
Molculas fundamentais na expresso gnica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
cidos nucleicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
Protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10
Dogma central da biologia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
Replicao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
Transcrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
Traduo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Metodologias aplicadas biologia celular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
Extraes de DNA, RNA e protenas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
Quantificao do material extrado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
Reaes de polimerizao em cadeia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Componentes da reao de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
Desenho dos primers ou iniciadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

Anlise e aplicao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Anlise em eletroforese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
Eletroforese em gel de agarose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
Eletroforese em gel de poliacrilamida . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
Variaes na metodologia da PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Multiplex PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
Nested PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
PCR transcriptase reversa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
PCR em tempo real . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
Sequenciamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Sequenciamento por Mtodo de Sanger . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
Sequenciamento de Nova Gerao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
Biologia molecular aplicada em diagnstico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
Kits disponveis e Plataformas disponvei para o uso em laboratrios . . . . . . . . . . . . 38

Concluso: . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Glossrio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

Referncias bibliogrficas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42


INTRODUO E SEUS COMPONENTES

Introduo biologia molecular

Em 1953, na Inglaterra, dois pesquisadores, James Watson e Francis Crick, elaboraram um
modelo para a molcula de DNA (cido desoxirribonucleico) em que definiram sua estrutura, sua
composio qumica e seu arranjo espacial em dupla hlice. Esse fato deu novos rumos cincia e
permitiu o desenvolvimento de uma nova rea, a biologia molecular, que se tornou uma ferramenta
importantssima nos dias de hoje.

A partir desse marco histrico, os cientistas elaboraram tcnicas pelas quais pudessem estudar
e manipular o material gentico. Seu uso abrange muitos setores da rea de biolgicas, como
medicina, biologia e biomedicina. Na rea da sade, sua utilizao aperfeioou o estudo de doenas
genticas, tcnicas de tratamento e diagnstico. A biologia molecular cada vez mais utilizada no
diagnstico clnico. Um nmero crescente de doenas pode ser detectado e monitorado em tempo
hbil, proporcionando rapidez e eficincia a esse setor. O crescente uso dessa tcnica em anlises
clnicas fez com que seu aprendizado se tornasse essencial para a formao dos profissionais
dessa rea.

Figura 1 Cientista em anlise

Fonte: shutterstock.com / Alexander Raths

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O foco do estudo em biologia molecular o material gentico e sua expresso no organismo.

No possvel aprender biologia molecular sem antes rever conceitos como clulas, organelas
celulares, tipos de clulas e as relaes entre DNA, RNA (cido desoxirribonucleico) e sntese proteica.

Organismos eucariontes e procariontes

Para que se possa manipular o material contido em uma clula, devemos conhec-la. Os
organismos so classificados de vrias formas, como em reinos (Monera, Protistas, Fungos, Animais
e Vegetais) ou em nvel celular, sendo classificados em eucariontes e procariontes conforme suas
diferenas na estrutura celular.

Organismos procariontes

Do grego pro (antes) e karyon (ncleo), so organismos que no apresentam ncleo nas clulas.
Apenas o reino monera (bactrias e algas azuis) classificado como procarionte. A principal
caracterstica que os difere dos eucariontes a ausncia do envoltrio nuclear.

A importncia de se saber a diferena entre um organismo eucarionte e um procarionte deve-

se ao fato de que, em biologia molecular, trabalhamos com o material gentico de um organismo,
isto , seu DNA e a protena que ser expressa por um determinado gene. Logo, a diferenciao
entre esses dois organismos fundamental para este trabalho, j que eles apresentam como maior
diferena o compartimento que pode ou no isolar o componente gentico e diferir o processo de
expresso gnica.

J que nosso interesse so as anlises clnicas, iremos focar nossa observao nas bactrias.
Esses microrganismos unicelulares apresentam estrutura simples. So classificados como Gram-
positivos ou Gram-negativos, de acordo com a parede celular. Bactrias Gram-positivas apresentam
parede celular mais espessa, porm mais simples. Bactrias Gram-negativas apresentam parede
celular menos espessa, mas tm uma membrana externa que a recobre, tornando sua estrutura
mais complexa (figura 1).

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Figura 2 Microrganismos unicelulares

Fonte: https://image.slidesharecdn.com/aulademicrobiologia-ppt-131220065223-
phpapp02/95/aula-de-microbiologia-ppt-12-638.jpg?cb=1387522454

Esses microrganismos apresentam uma membrana plasmtica de estrutura lipoproteica e

um protoplasma onde encontramos ribossomos, RNA e um DNA nico circular, no apresentando
envoltrio nuclear. Alm desse DNA, algumas bactrias apresentam um DNA circular pequeno
denominado plasmdio.

Organismos eucariontes

Organismos eucariontes (do grego eu verdadeiro e karyon - ncleo) so providos de membrana

celular. So representantes desse grupo os fungos, os protistas (protozorios), os vegetais e os
animais. Podem ser organismos unicelulares ou pluricelulares, e as clulas so especializadas
(neurnios, clulas sseas etc.). Iremos ater-nos s clulas humanas, j que o objetivo deste curso
prover conhecimento para desenvolver estudos na rea da sade. Clulas de organismos eucariontes
(no caso, humanas) apresentam muitas organelas (ribossomos, mitocndria, retculo endoplasmtico,
lisossomos etc.), que esto distribudas no citoplasma. As humanas tm 22 pares de cromossomos
autossomos e um par de cromossomos sexuais (homem XY e mulher XX), envolvidos pelo ncleo,
e uma membrana plasmtica lipoproteica.

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Figura 3 Clula Procarionte

Fonte: https://static.todamateria.com.br/upload/55/14/5514b71582eb7-celulas-procariontes-inserir-imagem.jpg

SAIBA MAIS

O envoltrio nuclear uma estrutura que envolve o ncleo das clulas dos seres eucariontes, formado
por duas membranas (interna e externa). As membranas delimitam um espao entre elas denominado
espao perinuclear. A membrana externa e continua com o REG. As membranas so interrompidas
por poros. Conhea mais acessando o link: http://biologiacelulareestrutural.blogspot.com.br/2011/11/
envoltorio-nuclear.html

Molculas fundamentais na expresso gnica

Independentemente se o organismo eucarionte ou procarionte, ambos apresentam, em comum,
algumas particularidades que so essenciais biologia molecular. Em seus cromossomos, encontra-
se seu genoma, isto , toda informao hereditria que est codificada em seu DNA (constituinte
qumico fundamental dos cromossomos), nos quais encontramos os genes, isto , a poro onde
se encontra a informao para a expresso de uma protena. Vejamos agora a composio qumica
e estrutural dessas substncias fundamentais para a expresso de um gene.

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cidos nucleicos

Todos os seres vivos contm dois tipos de cidos nucleicos, o cido desoxirribonucleico (DNA)
e o cido ribonucleico (RNA). Os vrus apresentam apenas um tipo de cido nucleico, DNA ou RNA,
porm sua definio como um organismo vivo ainda gera muita polmica, pois so parasitas
intracelulares obrigatrios e no apresentam a maquinaria necessria para se replicar e expressar
seus genes.

Toda molcula de cido nucleico apresenta em sua composio um grupo fosfato, um acar e
uma base nitrogenada, denominados de monmeros ou nucleotdeos dos cidos nucleicos (figura
2B). O grupo fosfato em questo o cido fosfrico, PO4H3. Ele libera ons H+, ficando com a carga
negativa (PO4-3), dando funo cida e carga negativa a esses cidos nucleicos. O acar uma
pentose, composta por um anel de cinco carbonos. No DNA, a pentose (desoxirribose) apresenta um
oxignio a menos que a ribose (RNA) (figura 2A). As bases podem ser purinas (adenina, guanina),
formadas por dois anis fundidos, ou pirimidinas (citosina, timina ou uracila), formadas por um anel
aromtico (figura 2D). Citosina, guanina e adenina so encontradas em ambos os cidos nucleicos,
porm a timina encontrada apenas no DNA e a uracila, apenas no RNA.

A polimerizao dos monmeros, isto , a ligao entre eles para formar tanto uma molcula
de DNA quanto uma de RNA, d-se por meio de ligaes fosfodister, nas quais o grupo hidroxila
(OH), ligado ao carbono 3 da pentose, removido e o oxignio do grupo fosfato, ligado ao carbono
5, assume o lugar. Esse grupo OH, mais outro tomo de H+ livre, formam uma molcula de gua.
por esse motivo que a extenso dos cidos nucleicos se d na direo 5-3 (figura 3).

A molcula de RNA apresenta fita simples. J a de DNA, fita dupla (figura 3). Entre as duas
fitas em paralelo, ocorrem ligaes de ponte de hidrognio entre as bases nitrogenadas. Uma base
pirimdica liga-se a uma base purnica, de forma que adenina se liga a timina por duas ligaes
de pontes de hidrognio e citosina se liga a guanina por trs pontes de hidrognio, estabelecendo
assim uma ligao mais forte que a das bases anteriormente descritas (figura 4).

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 Figura 4 Molculas

Fonte: http://santhdalcin.blogspot.com.br/p/biologia-2-colegial.html

Figura 5 Molcula de gua

Fonte: http://coral.ufsm.br/blg220/hide/estrutnucleot1.htm.

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Figura 6- Base pirimdica ligando-se com base purnica

Fonte: http://kurtkraut.net/blog/2005/12/

CURIOSIDADE

Os microrganismos apresentam uma imensa diversidade gentica e

desempenham funes nicas e cruciais na manuteno de ecossistemas, como

componentes fundamentais de cadeias alimentares e ciclos biogeoqumicos

Apesar de sua grande importncia na manutenoda biosfera, estima-se que menos de 10% dos
microrganismos existentes no planeta tenham sido caracterizados e descritos (Staley, 1998). Acesse
o link e saiba mais nesse estudo realizado pelo Centro de Referencia em Informao Ambiental
CRIA - http://www.faecpr.edu.br/site/documentos/recursos_microbiologicos_biotecnologia.pdf

Protenas

Protenas so formadas por monmeros denominados aminocidos. Um aminocido um

cido orgnico que apresenta basicamente um carbono ligado a um grupo hidroxila (-COOH), um
grupo amina (-NH2), um H e um resduo lateral (R) que diferencia um do outro. Existem 20 tipos de
aminocidos, os quais podem ser de carter cido, bsico, neutro hidroflico (atrao por H2O) e
neutro hidrofbico (repulso por H2O). O tipo presente em uma protena confere o tipo de conformao
que ela vai apresentar.

Alguns aminocidos podem ser sintetizados pelo organismo e so chamados de no essenciais,

outros so adquiridos a partir da alimentao, chamados de essenciais. A combinao entre eles

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para formar uma protena ocorre por ligaes peptdicas entre o grupo amina de um aminocido e
o grupo carboxila de outro. Assim, uma protena formada por polipeptdios (muitos aminocidos
formando ligaes peptdicas entre si). Uma protena que apresenta 300 aa (aminocidos) possui
aproximadamente 300 KDa (quilodaltons).

As protenas podem apresentar quatro nveis de organizao estrutural:

Estrutura primria: corresponde a sequncias de aa que formam uma determinada protena.

Como dito anteriormente, elas podem apresentar cargas eltricas (cido negativo, bsico positivo,
neutro, porm hidroflico ou hidrofbico), e isso ir definir os outros nveis de estruturao.

Estrutura secundria: essa estruturao refere-se configurao espacial da protena. De

acordo com a posio dos aminocidos na cadeia, as protenas podem se arranjar e formar duas
estruturas secundrias: a (alfa) hlice, que apresenta uma forma cilndrica, ou a forma de uma
folha dobrada, denominada folha (beta) pregueada.

Estrutura terciria: refere-se a novas dobraduras que ocorrem na estrutura secundria, dando
uma conformao tridimensional protena.

Estrutura quaternria: resulta da interao de dois ou mais polipeptdeos e origina uma molcula
de grande complexidade.

Dogma central da biologia

Do ponto de vista da biologia molecular, a sequncia de DNA contm a informao para produzir
uma molcula de RNA mensageiro para que possa ser produzida uma protena. Apenas 1% de
todo o DNA apresenta genes que podem ser expressos em protenas, molculas essenciais ao
funcionamento do organismo. Todos os organismos seguem o dogma central da biologia. Este se
refere capacidade do DNA de se replicar e poder assim passar as informaes hereditrias s
clulas filhas; de ser transcrito em um RNA ao qual apenas o gene, mais precisamente a poro
codificante do DNA, passado para que possa ser traduzido em uma protena. Algumas diferenas
ocorrem entre organismos eucariontes e procariontes.

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Figura 7 DNA

FONTE: shutterstock.com / honglouwawa

Replicao
Dentre a enorme diversidade de organismos que existem, todos compartilham uma propriedade
bsica, a de se reproduzir, assexuada ou sexuadamente. a partir da replicao do DNA, quando
um cromossomo se duplica, que novas clulas filhas so formadas, na diviso celular denominada
mitose, ou que os gametas formam-se, a partir da meiose.

A replicao do DNA inicia-se com a separao das duas fitas da dupla hlice, sendo essa
separao reversvel. As fitas de DNA serviro de molde para que outras novas sejam formadas.
Em bactrias, o DNA circular, logo, uma enzima denominada desoxirribonuclease rompe essa
estrutura, expondo uma extremidade.

As etapas da replicao so:

Primeiramente, uma enzima, a topoisomerase, desfaz o enovelamento do DNA, deixando-o livre

para a replicao, enquanto a girase desenrola essa molcula.

Uma segunda enzima, a helicase, quebra as pontes de hidrognio que h entre as duplas fitas,
separando-as, formando assim as forquilhas de replicao. Protenas denominadas SSBP se ligam
ao DNA e estabilizam-no, mantendo-o desenrolado.

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Uma RNA polimerase especial, denominada primase, sintetiza um RNA pequeno e complementar
fita de DNA para que sirva de iniciador de replicao a outra enzima, a DNA polimerase III. Esta,
por si s, no consegue iniciar a replicao sem que haja esse molde inicial.

A DNA polimerase III percorre o DNA inserindo as bases complementares s fitas moldes. Para
cada timina, inserida uma adenina, e vice-versa; para cada guanina, inserida uma citosina, e
vice-versa. O primer formado (RNA) substitudo pela DNA polimerase I.

Como dito anteriormente a extenso do cido nucleico ocorre na direo 5- 3. Uma das fitas
moldes, fita lder, ir formar uma fita de DNA complementar contnua, e a outra fita complementar,
lenta, ir formar um DNA descontnuo, fragmentado. A esses fragmentos denominamos fragmentos
de Okasaki (figura 8).

Para que ocorra a unio desses fragmentos, uma enzima denominada ligase realiza a ligao
entre eles, formando uma fita de DNA contnuo.

Assim que a replicao termina, a topoisomerase enovela novamente o DNA.

Figura 8 fragmentos de Okasaki

Fonte: http://www.sistemanervoso.com/pagina.php?secao=5&materia_id=95&materiaver=1

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Transcrio
A transcrio consiste na formao de um RNA mensageiro (RNAm) que levar a mensagem
da formao de uma protena. Para que ocorra a transcrio, uma protena indutora, ou fator de
transcrio, liga-se sequncia promotora do gene que ser transcrito, denominada caixa TATA. A
partir da, a RNA polimerase pode formar um RNAm complementar fita de DNA. Porm, como dito
anteriormente, no lugar de timina, h uracila no RNA, ento, quando o DNA apresentar adenina, no
RNA ser inserida uma uracila. Esse RNAm formado denominado imaturo, pois apresenta tanto
a sequncia no codificante do DNA, denominada ntron e que no pode ser traduzida na protena,
quanto a poro codificante, denominada xon.

Esse RNAm imaturo passa primeiramente por um processo de splicing, no qual esses introns so
removidos. A segunda etapa de maturao do RNAm, que serve como um sinal para que, quando
for transportado para o citoplasma, no seja degradado, a incorporao de uma cauda poli A na
extremidade 3 e de um quepe na extremidade 5 (figura 6). Assim que passa por essas etapas, o
RNAm pode ser transportado para o citoplasma, onde ser traduzido em uma protena.

Figura 9 - RNAm

Fonte: http://e-escola.ist.utl.pt/topico.asp?id=227

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Nessa etapa de transcrio, a diferena entre organismos eucariotos e procariotos que, nestes,
a maturao do RNAm no necessria, j que transcrio e traduo ocorrem no citoplasma e h
poucos ntrons em bactrias, j que seu genoma pequeno e praticamente todo expresso.

Traduo
Quando o RNAm transferido para o citoplasma, este ir se acoplar a um ribossomo para
ser ento traduzido. Ribossomos so organelas celulares tanto de clulas eucariontes quanto
procariontes, e sua funo a sntese de protenas. Essas organelas so compostas por protenas
e RNA ribossmico (RNAr) e formadas por uma subunidade maior e uma menor.

Procariotos 70S

Subunidade maior 50S rRNA 23S

- rRNA 5S

32 protenas diferentes

Subunidade menor 30S rRNA 16S

21 protenas diferentes

Eucariotos 80S

Subunidade maior 60S rRNA 28S

- rRNA 5,8S

- rRNA 5S

50 protenas diferentes

Subunidade menor 40S rRNA 18S

30 protenas diferentes

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Os nmeros da subunidade so referentes ao tempo de sedimentao quando centrifugados.

Um ribossomo s funcional quando suas subunidades esto unidas. Na subunidade maior,

encontrado um stio denominado A (aminoacil), no qual exposto o cdon para que um RNA
transportador (RNAt) possa entrar, e um stio P (peptidil), no qual ocorre a ligao de um aminocido
com o outro. Cdon corresponde trinca de nucleotdeos do RNAm.

O RNAt constitudo de uma fita com 80 nucleotdeos em forma de cruz, em cuja extremidade
inferior existem trs nucleotdeos (anticdon) que so complementares aos cdons do RNAm. Na
extremidade superior, encontra-se o stio de ligao ao aminocido. Para cada cdon, h um RNAt
correspondente que carrega determinado aminocido. O cdigo gentico corresponde traduo
dos nucleotdeos em aminocidos, e estes seguem as seguintes leis:

Degenerao um mesmo aminocido pode ser codificado por vrios cdons diferentes.
No ambiguidade cada cdon corresponde a somente um aminocido.
Universalidade o cdigo gentico o mesmo nos mais diversos organismos (exceo:
protozorios ciliados e mitocndrias).

A traduo ocorre nas seguintes etapas:

O ribossomo percorre o RNAm at localizar o cdon de iniciao.

Quando encontrado, o primeiro cdon exposto no stio A para que o RNAt que apresenta o
anticdon complementar seja acoplado.
O ribossomo ento se desloca, livrando o stio A. O RNAt (carregando o aminocido correspondente
a esse cdon) acoplado ao cdon do RNAm deslocado ao stio P.
Um novo RNAt liga-se ao cdon exposto no stio A.
Quando esse segundo RNAt deslocado ao stio P, o aminocido do RNAt que ocupava esse
stio deslocado para o stio E e liberado. O aminocido desse RNAt liberado liga-se por uma
ligao peptdica ao aminocido do RNAt agora posicionado no stio P, expondo novamente
o stio A.

Esse mecanismo ocorre at o momento em que o cdon de terminao - STOP (figura 8)

encontrado e a sntese finalizada. O RNAm degradado, e as subunidades dos ribossomos se
separam.

Em organismos procariontes, a transcrio e a traduo ocorrem ao mesmo tempo, isto ,

concomitantemente.

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 Figura 10 Cdigo Gentico

Fonte: http://www.ufpe.br/biolmol/Genetica-Medicina/sintese_proteica.htm.

SAIBA MAIS

Traduo proteica - Nesse vdeo de animao educativa mostra o mecanismo de sntese proteica -
http://www.youtube.com/watch?v=cD4i-0weH4U&feature=fvwp&NR=1

Metodologias aplicadas biologia celular

A partir do momento em que se tem o conhecimento dos conceitos de DNA, RNA e protenas
e do dogma central da biologia, torna-se possvel o entendimento das metodologias usadas em
biologia molecular para se estudar e manipular o genoma de um organismo. Iremos manter nosso
foco no estudo dessas metodologias para uso direcionado s anlises clnicas, sendo o nosso
interesse o genoma humano e o de microrganismos patognicos.

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CURIOSIDADE

Visando a busca constante do esporte de alto rendimento e a melhora no desempenho do atleta,

vrias estratgias tm sido pensadas com o propsito de se utilizar a biologia molecular como
ferramenta na pr-seleo e na seleo de talentos esportivos, na manipulao gentica visando ao
aumento ou diminuio da produo de determinadas substncias pelo organismo, na prescrio
do treinamento e na recuperao de leses. Portanto o objetivo desta reviso apresentar o DNA
como regulador do funcionamento do organismo e de que forma alteraes no perfil gentico, tanto
espontneas como induzidas artificialmente, podem modular respostas fisiolgicas e morfolgicas
por alterar a expresso de determinadas protenas. Ser dada especial ateno descrio dos
procedimentos utilizados para a manipulao gentica, nos baixos riscos associados e nas
estratgias que tm sido desenvolvidas com o objetivo de detect-la. Com base em conhecimentos
cientficos, coerncia e bom senso, diversas vises devem ser expostas e amplamente discutidas
para ser definido o que permitido e o que proibido nas competies esportivas. Veja a matria
completa no endereo: http://www.revista.cbce.org.br/index.php/RBCE/article/view/301/538

Extraes de DNA, RNA e protenas

A extrao do material de estudo, seja ele cido nucleico ou protena, a primeira etapa necessria
para a anlise em biologia molecular. Essa etapa fundamental para obter alta eficincia nas
subsequentes, como a PCR (reao de polimerizao em cadeia). O tipo de extrao a ser usado
depende do material que ser processado. Hoje, h disponveis no mercado kits de extrao,
elaborados por empresas especializadas, direcionados para cada um desses materiais. Caso seja
avaliado um tecido, este necessariamente ter que passar por uma etapa inicial de triturao, para
que seja feito seu rompimento. Independentemente do mtodo de extrao e do tipo de clula que
ser processado, a extrao passar por quatro etapas: rompimento da membrana plasmtica,
purificao, precipitao e reidratao.

Rompimento da membrana: a membrana plasmtica composta por lipdeos e protenas. Para

romp-la, utiliza-se uma soluo detergente, da mesma forma que usamos um detergente para
limpar uma frigideira. Caso a clula apresente uma parede celular, como o caso de bactrias,
faz-se um tratamento inicial com enzima, agitao ou presso para romper essa estrutura.
Purificao: com o rompimento da membrana plasmtica, o material intracelular extravasa,
formando um sulco compostos por protenas, cidos nucleicos e restos celulares. Nessa etapa,
o material que se tem interesse de isolar purificado. Caso se queira isolar cidos nucleicos
para estudo com biologia molecular, o que ocorre na maior parte dos casos, necessria a
remoo dos restos celulares e das protenas.

Usa-se nessa etapa uma enzima, uma proteinase, para degradar os componentes proteicos.

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Uma prxima etapa o uso de fenol, j que protena solvel nele e cido nucleico, no. Nesse
momento, ocorre a separao em fases, uma com cido nucleico diludo em soluo aquosa e outra
com protena diluda no fenol. Caso se queira usar a protena, essa fase protena-fenol removida.

Usa-se posteriormente clorofrmio, que remove o fenol, e NaCl2 (cloreto de sdio), que mantm
as protenas dissolvidas e no permite que se precipitem com o cido nucleico no fundo do tubo.

Precipitao: nessa etapa, usa-se etanol para precipitar o DNA, pois este insolvel a esse
reagente. Quanto mais gelado o etanol estiver, mais insolvel o DNA ser. Retira-se o lcool
aps uma centrifugao, e o pellet formado no fundo do tubo. Vale ressaltar que usamos
o termo pellet quando o DNA precipitado. Quando temos restos celulares, usamos o termo
debris celular.
Reidratao: aps a retirada do lcool e a precipitao do DNA no fundo do tubo, necessria
reidratao para que seja formada uma soluo que possa ser utilizada nas reaes. Usa-se
gua ultrapura, mili-Q ou gua destilada, estreis e livres de nucleases (enzimas que degradam
os cidos nucleicos). O DNA pode ser armazenado a 20 C, porm RNA e protenas, que so
molculas instveis e se degradam facilmente, so armazenados a temperaturas inferiores
(70 C).

Quantificao do material extrado

Aps a realizao da extrao, importante quantificar esse material para confirmar se ela foi
bem-sucedida. Para isso, usada a espectrofotometria, uma tcnica que mede as concentraes
de solues a partir de sua interao com a luz emitida pelo aparelho, chamado espectrofotmetro.
Esse aparelho compara a quantidade de luz emitida ou absorvida e a relaciona com a possvel
concentrao da substncia na amostra. Usamos como medida a densidade tica (OD) da substncia,
que corresponde capacidade do material de absorver luz (absorbncia). Uma fonte de luz branca
emitida pelo aparelho e, passando por um prisma, refratada nas cores que a compem. Dependendo
da luz que a substncia absorver (comprimento de onda varivel), chega-se absorbncia da amostra.

cidos nucleicos apresentam OD de 260 nm, e protenas de 280 nm. Caso se queira medir a
quantidade de cido nucleico de uma amostra, deve-se informar o aparelho, para que ele diga a
quantidade de material com essa absorbncia encontrada na soluo. Uma boa extrao aquela
na qual todo material, exceto o cido nucleico, foi removido, por exemplo, protena. Para isso, o
aparelho faz uma relao entre a quantidade de OD 260 nm encontrada e a de 280 nm. A relao
entre elas pode ser mensurvel e definida. Caso a relao OD 260 nm/280 nm seja:

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1,751,80: significa que, na soluo, temos entre 1,75 e 1,80 vez mais cido nucleico que
protena. Essa amostra apresenta boa qualidade.
< 1,75: significa que o material apresenta muita protena, logo, sua eficincia nas reaes
subsequentes pode no ser boa.
2: essa a melhor relao, a ideal. Temos uma quantidade de duas vezes ou mais cidos
nucleicos, logo, a quantidade de protena no ser suficiente para interferir na eficincia das
prximas reaes.

ACONTECEU

Os produtos para extrao de DNA envolvem 3 etapas bsicas. Acesse o link e conhea essas etapas.

http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=5253

Reaes de polimerizao em cadeia

A reao de polimerizao em cadeia (PCR), inventada por Kerry Mullis em 1983, consiste em
uma tcnica que possibilita que uma determinada parte do genoma de qualquer organismo seja
amplificada em milhes de cpias, facilitando sua anlise. Essa tcnica amplamente usada
em pesquisas, permitindo o desenvolvimento do diagnstico molecular na rea da sade, sendo
mais sensvel e especfica do que as convencionais. Ela s se tornou realidade aps o isolamento
e purificao da enzima TaqDNA polimerase, a partir da bactria termoflica Thermus aquaticus
(SAIKI et al, 1988).

Componentes da reao de PCR

Amostra de DNA extrada: servir de fita molde para a reao.
Taq polimerase (DNA polimerase): enzima que catalisa a ligao de um nucleotdeo com o
outro a partir da ligao fosfodister.
Nucleotdeos (dNTPs: dATPs, dTTPs, dCTPs e dGTPs).
Cloreto de magnsio (MgCl): cofator necessrio para o funcionamento da Taq polimerase.
Oligonucleotdeos iniciadores: primers (veremos na seo de desenho de primers).
gua: necessria para completar o volume requisitado da reao.
Tampo (buffer): contm sais e mantm um pH ideal para a reao.

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Desenho dos primers ou iniciadores

O desenho dos iniciadores pode ser feito de duas formas: coletando a sequncia do gene que
se quer estudar em um banco de genoma ou coletando os iniciadores em algum trabalho prvio. O
banco de genoma mais importante da atualidade o Gene Bank, explicado no saiba mais logo abaixo:

SAIBA MAIS

O GenBank um banco de dados de Nucleotdeos do NLM/NCBI, localizado no National Institutes of

Health (NIH), armazenando informao sobre sequncias nucleoddicas de aproximadamente 260.000
espcies (Benson et al, 2013; PMID: 23193287). O GenBank faz parte de uma rede de colaborao
juntamente com o European Molecular Biology Laboratory (EMBL) e o DNA DataBank of Japan
(DDBJ). Mais informaes a respeito do GenBank no link: http://www.genebio.ufba.br/?page_id=303

Esse banco foi criado durante o Projeto Genoma pelo governo norte-americano. Nesse projeto,
centros de todo o mundo iniciaram o processo de sequenciar todo o genoma humano, facilitando
o intercmbio mtuo, para que ocorresse a divulgao das regies j estudadas e sequenciadas.
Hoje, temos disponveis genes de vrias espcies, no s humanos. Quando se insere um gene, tanto
pela sequncia de nucleotdeos que formada quanto pelo nome que foi dado a ela, pode-se ter
acesso a sua localizao no cromossomo, a espcie a que pertence e at a protena que expressa
(sequncia de aminocidos).

Caso os iniciadores para o gene sejam retirados de um trabalho (artigo) que j descreve sua
utilizao, podem ser conferidos nesse site, para a verificao de se so especficos apenas para
ele. Caso se queira desenhar iniciadores para esse gene usando a sequncia de nucleotdeos,
deve-se no mesmo endereo procurar pelo nome do gene e adquirir a sequncia correspondente.
Abaixo, est representada uma sequncia de um gene, PhoE, usado para identificao molecular
da bactria Gram-negativa Klebsiella pneumoniae.

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Essa sequncia representa apenas uma da dupla fita do DNA, logo tem uma fita complementar.
Devemos desenhar o primer que ir anelar nela e servir de iniciador para a Taq polimerase tanto
nela quanto na complementar. Um primer ideal apresenta de 18 a 24 nucleotdeos, e quanto menor
o nmero de C e G, melhor ser sua eficincia. Isso porque citosina e guanina formam trs pontes
de hidrognio, e assim aumenta a fora necessria para que anele na fita de DNA.

O primer que anela nessa fita molde chamado de primer sense ou primer forward. O que anela
na fita complementar chamado de primer anti-sense ou primer reverse.

Desejamos desenhar o primer forward na regio em destaque do gene:

Se o primer ir anelar nessa sequncia, deve ser complementar a ela.

Fita molde de DNA: 5 GCACCTTGTTAAGCTATGATTT 3.

Primer forward:CGTGGAACAATTCGATACTAAA.

Repare que o primer ser complementar fita de DNA ilustrada, e, assim, a extenso ser na
direo 5para 3:

O primer reverse ir anelar a fita complementar desse DNA. E desejamos desenhar esse primer
na regio abaixo em destaque:

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Esse primer ser exatamente a sequncia em destaque, porm invertida na ordem.

Fazemos essa mudana na direo para que o primer seja desenhado para estender o DNA na
direo correta.

Por que o primer a prpria sequncia da fita molde?

Veja qual a sequncia complementar a essa que temos na regio onde queremos desenhar
o primer reverse:

Por que o primer reverse a sequncia invertida?

Veja o que aconteceria se no invertssemos a sequncia:

AGCACCTAATGTTTTAGTTG

Sequncia no invertida

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Direo da extenso do DNA

O tamanho do produto de amplificao ser a soma dos nucleotdeos abrangidos entre os dois
primers. Nesse caso, 413 pb (letras em destaque).

Primer forward

Primer reverse

Agora que temos nosso DNA extrado e os primers desenhados, os reagentes sero adicionados, e
o PCR, inserido em um aparelho termociclador. Uma reao de PCR pode ser realizada em microtubos
de 0,2 L - 10-3(1 ml = 1.000 L) ou 0,5 L. A quantidade dos reagentes segue algumas regras:

A quantidade de MgCl ser de quatro a cinco vezes a quantidade de Taq polimerase, pois esta
precisa do primeiro como cofator para funcionar.
A quantidade de dNTP 0,5 L para cada par de primers.
A quantidade de DNA normalmente10% do volume da reao, isto , se o total de reagentes
for 25 L, 2,5 L ser de DNA.
O volume da reao pode variar, porm ela completada com gua pura (livre de nucleases
e estril).

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Os tubos com os reagentes e o DNA so colocados em um aparelho termociclador, no qual

variaes de temperatura iro ocorrer, levando, assim, amplificao do gene que se quer estudar.

Etapas da PCR (figura 11):

Desnaturao: a primeira etapa de uma PCR. Nela, ocorre abertura das duplas fitas de DNA.
A temperatura para que isso ocorra in vitro (fora do organismo) entre 90 C e 98 C, e o processo
pode durar de 10 segundos a 1 minuto. A temperatura e o tempo variam de acordo com o produto
que ser amplificado.

Anelamento: a segunda etapa da PCR. Nela, os primers iro anelar na regio ao DNA onde so
complementares. A temperatura em que isso ir ocorrer depende da quantidade de C e G no primer.
Hoje em dia, as empresas que confeccionam os primers mandam o valor da sua temperatura de
melting. Esta se refere temperatura em que aproximadamente metade dos primers esto anelados
ao DNA e a outra metade, no. A temperatura de anelamento 5 C menor que aquela em que eles
se separam. Ela normalmente varia entre 52 C e 62 C, e o tempo, de 30 segundos a 1 minuto. Isso
tambm depende do tamanho do primer.

Extenso: a terceira etapa da PCR. Nela, a Taq polimerase ir inserir os nucleotdeos

complementares fita de DNA. A temperatura pode variar de 72 C a 74 C, e o tempo de 1 minuto
a cada 1 kb (1.000 bases) do produto de amplificao. Logo, o tempo de acordo com o tamanho
do gene em estudo.

Um ciclo da PCR corresponde a cada vez que a amostra passou pelas trs etapas. Se cada
dupla hlice de DNA pode ser separada em duas fitas, e cada uma servir de molde para uma nova
fita, a quantidade de produtos formados segue a razo exponencial 2. Essa quantidade, no final
da reao, segue a expresso 2n (n nmero de ciclos). Logo, uma PCR que realiza 30 ciclos ter no
final 230 = 1.073.741.824 (1 bilho, 73 milhes, 741 mil, 824 produtos de amplificao). Isso supondo
que haja apenas uma molcula de DNA na reao, o que no verdade.

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Figura 11 Etapas da PCR

Fonte: http://geneticavirtual.webnode.com.br/genetica-virtual-home/topicos-extras/marcadores-
moleculares/marcadores-baseados-em-rea%C3%A7%C3%A3o-da-polimerase-em-cadeia-pcr/

SAIBA MAIS

Nesse vdeo em 3D tem como objetivo introduzir noes bsicas de Gentica e conceitos
fundamentais para o entendimento e interpretao da gentica mendeliana. Acesse o link e conhea
https://youtu.be/5YlfZwzRPa4

http://www.youtube.com/watch?v=B5dVik3VTtc

ANLISE E APLICAO

Anlise em eletroforese
Ao final de uma PCR, teremos apenas um tubo com DNA dentro. No somos capazes de analisar
dessa forma. Um mtodo que tornou possvel essa visualizao a eletroforese. Esse mtodo
eficiente para separar protenas e cidos nucleicos. A partir da gerao de uma corrente eltrica, as
molculas migram para polos opostos sua carga eltrica (exemplo: molculas negativas migram
em direo ao polo positivo) e so separadas de acordo com seu peso molecular. O mtodo pode

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ser de dois tipos: eletroforese em gel de agarose, usada para cidos nucleicos, e eletroforese em
gel de poliacrilamida, usada para protenas.

Eletroforese em gel de agarose

Para anlise de cidos nucleicos, usamos a eletroforese em gel de agarose. Vejamos por etapas.

Primeiramente, um gel de agarose produzido quando esse polissacardeo diludo em tampo

(solvente neutro, sem apresentar carga eltrica por no ter nem pH cido, nem pH bsico). Enquanto
quente, o gel distribudo numa cmara da cuba de eletroforese para solidificar (quando esfria,
solidifica). Nesse momento, colocado um pente para que espaos sejam formados nesse gel,
onde o DNA ser inserido.

Quando polimerizado, o gel submerso em tampo dentro da cuba, o que facilitar a passagem
da corrente. Aos produtos de PCR que sero includos no poo formado no gel, adicionada uma
substncia denominada loading, que dar colorao ao DNA e peso para que se desloque para o
fundo e no flutue no tampo, alm de funcionar como marcador de corrida, mostrando onde o
DNA estar posicionado.

A cuba ento ligada a uma fonte que fornea energia necessria para a corrida. Uma voltagem
e uma corrente eltrica sero aplicadas por um determinado tempo ao gel, para que o DNA possa
migrar. Com a corrente eltrica, o DNA migra nesse gel em direo ao polo positivo. Como dito
anteriormente, ele tem carga negativa devido ao cido fosfrico dissociado. A agarose forma uma
malha que dificulta a migrao do DNA, proporcionando a separao deste de acordo com seu
peso molecular.

A voltagem da corrente que ser aplicada a essa corrida depende da velocidade em que se deseja
que o DNA migre. A concentrao do gel que ser formado depende do tamanho do produto de
amplificao. Quanto maior este, menos concentrado deve ser o gel, para que no haja dificuldade
na migrao, e menor deve ser a voltagem da corrida. A corrente eltrica varia de acordo com a
qualidade do tampo. Se este for muito utilizado, necessria uma corrente maior.

Sob uma mesma voltagem e concentrao de agarose, fragmentos mais leves migram mais
rpido. Logo, eles chegam antes ao polo positivo e posicionam-se na base do gel.

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Para que o DNA seja visualizado, corado com brometo de etdio, uma substncia mutagnica,
que se intercala no DNA e o torna fluorescente na luz ultravioleta (fotoiluminador). O vdeo abaixo
mostra o posicionamento de fragmentos de pesos diferentes, quando submetidos s mesmas
condies de corrida, e a visualizao aps corados com brometo.

SAIBA MAIS

Nesse vdeo complementar, poder conferir uma experincia com gel de agarose http://www.youtube.
com/watch?v=qLHsEkiGJOw

Eletroforese em gel de poliacrilamida

Usa-se esse tipo de eletroforese para analisar protenas. A poliacrilamida formada pela
polimerizao de acrilamida e bisacrilamida, formando assim uma rede porosa. Protenas apresentam
carga eltrica varivel, em funo dos diferentes aminocidos que as compem. Para que todas
fiquem com carga negativa, usa-se a tcnica SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis). O
SDS um detergente aninico (isto , carregado negativamente) que se liga aos resduos positivos
das protenas, deixando-as com carga final negativa. Assim, as protenas migram para o polo positivo
da cuba de eletroforese. A velocidade da migrao depende do peso molecular, da voltagem e da
corrente eltrica, da mesma forma que ocorre com a eletroforese em agarose.

Figura 12 - Imagens naturais da protena Calpain 1 humana

Fonte: http://www.abcam.com/Calpain-1-protein-Active-ab91019.html

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Variaes na metodologia da PCR

A partir do uso rotineiro da PCR, outros mtodos e aplicaes puderam ser elaborados. Vejamos
abaixo alguns deles e sua melhor aplicao.

Multiplex PCR

PCR multiplex consiste na amplificao de mais de um alvo simultaneamente pela adio de

diferentes conjuntos de primers especficos para cada um no mesmo tubo de reao. Para isso,
devem-se tomar alguns cuidados com os conjuntos escolhidos:

A temperatura de anelamento dos primers usados deve ser semelhante, para que possa ser
padronizada uma nica no aparelho.
Os conjuntos de primers devem gerar produtos com tamanhos moleculares distintos, para
que possam ser diferenciados no gel de eletroforese.
Os primers devem apresentar especificidade de anelamento apenas com uma sequncia-alvo,
para que a amplificao seja somente do gene para o qual foram desenhados.

Apesar de ser uma estratgia de amplificao de uso conveniente para deteco de DNA de
agentes infecciosos, apresenta maior dificuldade no desenvolvimento da metodologia e menor
sensibilidade quando comparada com a amplificao de uma nica sequncia-alvo.

Nested PCR

A tcnica de Nested PCR inclui a amplificao de uma determinada sequncia-alvo em duas

etapas. Na primeira, utiliza-se um conjunto de primers externos e, na segunda, um conjunto de
primers internos, cujo stio de anelamento est inserido internamente ao produto de amplificao da
anterior. Assim, os produtos de amplificao da primeira etapa, que contm o stio de anelamento
dos primers da segunda, que so mais internos, sofrem uma nova reao.

Essa tcnica utilizada para aumentar a sensibilidade da reao quando usamos amostras
que apresentam pouco DNA. Porm, por haver transferncias do material da primeira reao para
a segunda, pode haver contaminao.

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PCR transcriptase reversa

A PCR transcriptase reversa (RT PCR) uma tcnica que se baseia na utilizao de uma
maquinaria existente naturalmente em vrus do tipo retrovrus, como o HIV, que apresentam RNA
ao invs de DNA. Eles tm que converter seu genoma em DNA para que seja ento processado
pela clula do hospedeiro. A enzima usada para essa converso a transcriptase reversa. Ela
chamada reversa por sintetizar DNA a partir de RNA. A essa molcula, damos o nome de cDNA
(DNA complementar). Essa enzima possibilitou aos cientistas o estudo com genoma de eucariotos,
j estes apresentam muitos ntrons (pores no expressas do DNA), e o RNA carrega apenas os
xons. Assim, pode-se avaliar o que realmente o cdigo que ir formar a protena. Alm de estudar
o gene, os pesquisadores usam esse mtodo para quantificar a expresso de determinado gene, j
que o RNAm a molcula que ser traduzido em uma protena.

Nessa tcnica, primeiro realizado um procedimento com a transcriptase reversa, o RNA de

fita simples extrado e um random primer (primer geral, inespecfico). Esse primer apresenta uma
sequncia de timina (TTTTT) que ir anelar nas caudas poli A de todos os RNAm extrados daquela
amostra, no sendo especfico para um tipo. No final dessa reao, teremos cDNA de fita simples.

Posteriormente, realizada uma PCR convencional com o cDNA, formando molculas de DNA de
fita dupla, amplificando assim o nmero de cpias referentes ao gene que se quer estudar (figura 11) .

PCR em tempo real

A tcnica de PCR em tempo real (qPCR) um refinamento da tcnica original de PCR, sendo
considerada um mtodo homogneo de amplificao de DNA. Nela, amplificao e deteco so
realizadas no mesmo tubo de reao, eliminando-se processamentos ps-PCR, como anlise em
eletroforese, diminuindo assim o manuseio de produtos de amplificao e o risco de contaminao
cruzada.

Nesse tipo de PCR, alm dos reagentes usualmente utilizados, so adicionadas sondas especficas
marcadas com fluorforos. Os princpios aplicados para deteco de uma sequncia-alvo por qPCR
so baseados na mensurao de fluorescncia durante a reao. A quantidade do produto formado
monitorada no decorrer da reao por meio da deteco da fluorescncia por diferentes filtros de
captao presentes no aparelho em determinados comprimentos de onda. Trata-se de um mtodo
mais sensvel, em que se poupa tempo de efetuao e no qual o DNA pode ser mensurado. Podem-

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se usar dois tipos de molculas fluorescentes: os intercalantes de DNA e as sondas. O desenho do

experimento e a leitura so feitos de forma diferente.

Intercalante fluorescente

Existem disponveis no mercado muitos tipos de intercalantes de DNA que podem ser usados em
qPCR (SYBR Green, Eva Green, Syto9), porm o SYBR Green o mais utilizado. Esse tipo de molcula
fluorescente intercala-se no DNA de dupla fita. Durante uma reao de PCR, o DNA primeiramente
desnaturado para que a dupla fita se separe. Conforme a nova molcula complementar fita
molde formada pela Taq polimerase, a molcula fluorescente intercala-se juntamente com os
nucleotdeos que so inseridos, e seu sinal detectado. Quanto maior o nmero de molculas de
DNA formadas, mais molculas com SYBR Green intercalado sero apresentadas.

Aps todos os ciclos de amplificao, o aparelho submete a reao a uma curva de dissociao
para se avaliar a temperatura de melting (Tm, temperatura de desnaturao). Essa temperatura
corresponde a 50% das fitas de DNA em dupla fita apresentando o SYBR Green intercalado e 50%
dissociadas com a molcula fluorescente dispersa. Usa-se essa curva porque essa molcula
intercala-se em qualquer dupla fita de DNA e no muito especfica, porm muito sensvel, e, de
acordo com o produto de amplificao, teremos um Tm diferente, pois este varia de acordo com o
tamanho do gene e a quantidade de C e G (figura 13).

Outro coeficiente que avaliado nesse mtodo o ciclo em que foi detectada a fluorescncia. Esta
proporcional quantidade de produto formado em cada ciclo. O nmero de ciclos de amplificao
necessrios para obter uma determinada quantidade de DNA registrado (ciclo threshold- Ct).
Quando o Ct deixa de ser basal, isto , no se refere fluorescncia emitida pelos reagentes e passa
a representar fluorescncia emitida pela amplificao do DNA, considerado pelo aparelho que a
amostra positiva. Assim, quanto mais DNA tivermos na amostra inicial, menor ser o Ct, porque
teremos fluorescncia detectvel mais cedo (figura 11).

A figura abaixo representa o que seriam o Tm e o Ct de uma reao.

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 Figura 13 Anlise de Alta Resoluo Melting (HRM)

Fonte: http://www.gene-quantication.de/hrm-dyes.html

Figura 14 - PCR em tempo real mede na fase exponencial para quanticao mais precisa

Fonte: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/Products-and-Services/Applications/
PCR/real-time-pcr/qpcr-education/qpcr-vs-digital-pcr-vs-traditional-pcr.html

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SAIBA MAIS

Nesse vdeo encontramos o histrico e a utilizao da PCR

Acesse o material nesse link: http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1965

Sondas:

Existem disponveis no mercado vrios tipos de sondas para o uso em qPCR (Molecular Beacon,
TaqMan, Scorpion e sondas adjacentes). Elas diferem quanto ao mecanismo com o qual hibridizam
o DNA. A mais comum a TaqMan. Iremos aprender sobre ela e descrever como ocorre a deteco
da fluorescncia em sondas que se ligam ao DNA (hibridizam) e so clivadas durante a extenso.
A sonda TaqMan desenhada da mesma forma que um primer para que seja complementar
apenas ao gene que se deseja detectar. Ela desenhada para anelar a aproximadamente 20 ou 30
nucleotdeos de distncia do primer, usando o forward como referncia. Usaremos novamente o
exemplo de gene anterior.

Primer forward sonda

Primer reverso

Um exemplo hipottico seria desenhar a sonda no local demarcado na sequncia acima. Logo,
ela seria complementar regio.

Fita molde de DNA: 5 CGCAGCCTACACCAGCTCC 3.

Sonda: GCGTCGGATGTGGTCGAGG.

Uma sonda apresenta uma poro denominada de reprter, a qual emite fluorescncia, e uma
poro denominada de quencher, que resgata a fluorescncia da primeira enquanto esto unidas.
Veja o exemplo na nossa sonda:

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Durante a etapa de anelamento, quando os primers se anelam, a sonda anela-se simultaneamente.

Como aqueles, ela apresenta uma temperatura de anelamento, que deve ser menor que a deles para
que no ocorra a extenso sem estar no DNA. Durante a extenso, a Taq polimerase, ao percorrer o
DNA inserindo nucleotdeos, ir clivar a sonda, separando-a do DNA, e, do mesmo modo, o quencher
do reprter. Dessa forma, este ltimo emitir luz, que ser detectada pelo aparelho. A leitura de
positividade por esse mtodo a deteco da sonda pelo aparelho e o Ct em que ela foi encontrada.
Essa uma tcnica mais especfica para se usar, e, como no mtodo anterior, quanto mais DNA
inicial, antes ser detectado o Ct.

SAIBA MAIS

Vdeo complementar - PCR em tempo real sonda TaqMan http://www.youtube.com/

watch?v=xjpGIJh7JT0

Sequenciamento

Sequenciamento por Mtodo de Sanger

Sequenciar um genoma determinar a ordem de nucleotdeos que forma esse DNA. J foram
usados muitos mtodos para atingir essa finalidade (qumicos e radioativos), porm o mais utilizado
o mtodo de Sanger, chamado tambm de mtodo dideoxi ou mtodo de terminadores de cadeia.
Na dcada de 1970, Frederick Sanger props um mtodo enzimtico para se realizar sequenciamento.
Nele, usa-se um deoxinucleotdeo (dNTP) diferenciado e dideoxinucleotdeo (ddNTP) que, quando
inserido na sequncia de DNA em formao, interrompe a extenso deste. Um ddNTP um dNTP
(nucleotdeo usado em PCR) que no apresenta a hidroxila ligada ao carbono 3 da pentose. Logo,
a ligao fosfodister entre dois monmeros no ocorre, e a reao interrompida. Essa molcula
apresenta outra diferenciao. As bases nitrogenadas (A, T, G, C) so marcadas com fluorescncias
(figura 15).

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Figura 15 Mtodo enzimtico

Fonte: http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/brands/Applied-Biosystems.html?CID=fl-AppliedBiosystems

O sequenciamento difere de um PCR comum porque, alm da adio de um reagente a mais,

o dideoxinucleotideo, tambm usamos apenas um dos primers, forward ou reverse, na reao, de
modo que apenas uma das fitas do DNA servir de molde.

Conforme so formadas molculas de DNA de tamanhos diferentes (mesmo que difiram uma
da outra apenas por um ddNTP terminal), elas migram de acordo com seus pesos moleculares, e
um sensor muito sensvel no aparelho de sequenciamento ir ler a fluorescncia de cada ddNTP.
Isso informado a um software, que ir compor a sequncia. Hoje em dia, aparelhos sofisticados
de sequenciamento apresentam um microcapilar por onde as molculas de DNA se deslocam para
que um laser faa a leitura, porm, quando se usa mtodo semiautomatizado, necessrio realizar
um gel de agarose fino e delicado para esse deslocamento, seguindo a mesma regra de corrida da
eletroforese, e um sensor detecta a fluorescncia.

SAIBA MAIS

Nesse vdeo explicativo, entenderemos o seqenciamento de DNA

Acesse o link e saiba mais clicando aqui: http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1966

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Sequenciamento de Nova Gerao

O sequenciamento de nova gerao (Next Generation Sequencing -NGS- em ingls) refere-se

aos processos de sequenciamento de DNA que utilizam metodologias diferentes da de Sanger, com
objetivo de acelar e baixar o custo do processo de sequnciamento. Baseiam-se no processamento
paralelo massivo de fragmentos de DNA. Enquanto que um sequenciador capilar processa, no
mximo, 96 fragmentos por vez, os sequenciadores de nova gerao podem ler at bilhes de
fragmentos ao mesmo tempo (Varuzza 2013).

Hoje em dia 3 plataformas so as mais conhecidas. O primeiro o sequenciador 454 da Roche

que foi lanado em 2004 sendo que seu uso e aplicao esto em decadncia desde o aparecimento
de novas plataformas. No ano de 2006 e 2007 foram lanados os sequenciadores de nova gerao
da Illumina (MiSeq) e da Life Technologies (ion Torrent) no qual o uso ainda incorporado a pesquisa
e diagnstico.

Cada tecnologia de sequenciamento possui uma estratgia diferente, mas em geral podemos
identificar etapas em comum entre todos os sequenciadores: preparo da amostra, amplificao da
biblioteca e sequenciamento.

Preparo da Amostra: Primeiro o DNA fragmentado por um processo qumico, mecnico ou

enzimtica. Aps a fragmentao, adaptadores, sequncias artificiais conhecidas, so incorporados
aos fragmentos. Depois de ligados esses adaptadores, as amostras so misturadas, amplificadas
e sequenciadas juntas. Aps isso, no processo de sequnciamento, essa parte do adaptador lida
e as amostras so separadas computacionalmente.

Amplificao da Biblioteca: A amplificao de bibliotecas tem como objetivo gerar milhares

de cpias de cada fragmento de DNA produzido na etapa de preparo da amostra. O objetivo dessa
amplificao aumentar a fonte de sinal luminoso que ser detectado na etapa de sequenciamento.
Esse processo de amplificao realizado por PCR.

Sequenciamento: O sequenciador um instrumento que executa uma srie de reaes qumicas.

Estes geram sinais que so detectados e determinam a sequncia de bases template se est sendo
analisado.

A evoluo do sequenciamento de DNA foi muito mais acelerada do que dos processadores
de computadores. A implicao disso que os sequenciadores evoluram muito mais rpido do

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que os computadores que analisam os dados gerados, da a necessidade computacional para lidar
com os dados gerados ter se tornado muito maior. Profissionais esto se especializando na rea
de bioinformtica para que a anlise de todo esse material gerado seja elaborado.

A incorporao do uso de NGS no diagnstico clnico est expandindo rapidamente. Atualmente o

uso para o diagnstico de cncer o foco principal da metodologia. O uso no setor da microbiologia
ainda limitado para a pesquisa. Porm essa realidade ir mudar nos prximos anos, sendo assim
necessrio ao profissional de laboratrio clnico dominar mais essa tecnologia.

Biologia molecular aplicada em diagnstico

crescente o uso de biologia molecular em anlises clnicas. Essa metodologia aparece como
uma ferramenta para complementar os testes fenotpicos, agilizar processos de identificao,
solucionar problemticas como deteco viral e at dar uma cara nova s anlises clnicas quando
usada na deteco de doenas genticas como o cncer. Apesar do evidente benefcio que a biologia
molecular poderia trazer a essa rea, pela sensibilidade, especificidade e rapidez na sua utilizao,
ainda so poucos os laboratrios que apresentam essas metodologias disponveis, pois se trata
de um mtodo caro e que necessita de mo de obra qualificada.

Hoje, encontram-se disponveis kits para o diagnstico rpido em biologia molecular. Porm trata-
se de um mtodo comercial, cujo uso fica restrito a laboratrios de anlises clnicas sofisticados,
requerendo habilidade tcnica para o manuseio, alm de ser caro quando comparado com mtodos
tradicionais. Quando um biomdico se deparar com o uso de biologia molecular num laboratrio,
provavelmente ser naqueles que aderiram a essas plataformas fechadas, isto , metodologias
elaboradas por empresas, o que as torna ainda mais caras. Mesmo que essa seja ainda a realidade,
num futuro no muito distante, estaremos providos de profissionais que sero capazes de, alm de
manipular, validar, inovar e criar mtodos de deteco que podero ser aplicados em laboratrios.

Qualquer que seja a circunstncia do contato com a biologia molecular, importante ao biomdico
ter os conhecimentos bsicos para trabalhar nessa rea. Evidente que no se pode apontar todas
as metodologias disponveis, pois a cada dia elas recebem inovaes. Conforme essas mudanas
aparecem para ser implantadas, segue-se aprimorando metodologias anteriores, por isso a importncia
de conhec-las.

A introduo de um novo mtodo de diagnstico em laboratrio clnico necessita de uma validao

analtica e clnica, principalmente com os mtodos in house, para garantir maior confiabilidade ao

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protocolo escolhido. A validao analtica avalia acurcia, preciso, sensibilidade e especificidade do

mtodo, que so indicadores das caractersticas do teste e, por isso, no dependem da prevalncia da
doena ou de doenas correlacionadas com a populao em que ele vai ser utilizado. A sensibilidade
analtica testada medindo o mais baixo limite de deteco do alvo ou do microrganismo desejado.
A especificidade analtica mede a capacidade do teste em detectar outro DNA que no o do
microrganismo desejado.

Cada protocolo de diagnstico molecular, aps ter seus parmetros analticos testados, tambm
deve ter sua validao clnica determinada na populao a que se destina. Essa validao realizada
analisando-se o desempenho do teste em um nmero adequado de pacientes. A utilidade clnica
de um teste de diagnstico para a populao em que ser aplicado pode ser avaliada pelos valores
preditivos (positivo e negativo), que so calculados a partir da anlise dos parmetros de validao
clnica comparados com a prevalncia da doena (ROSSETTI, SILVA e RODRIGUES, 2006).

De acordo com o documento MM3-A2 do Clinical and Laboratory Standard Institute (2006), um
roteiro de avaliao para introduo de novo mtodo de diagnstico deve ser seguido, incluindo
a determinao de sensibilidade analtica (limite de deteco LoD), especificidade analtica,
preciso, cutoff (valor de corte), sensibilidade e especificidade diagnstica, acurcia diagnstica,
valores preditivos e diagnstico.

A Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria ANVISA regulamenta, por meio da RDC 302/05, que
tanto laboratrios clnicos quanto de pesquisa devem validar os mtodos desenvolvidos internamente
fornecendo evidncias quanto ao desempenho.

Kits disponveis e Plataformas disponvei para o uso em laboratrios

Abaixo esto apresentados alguns equipamentos, kits e metodologias disponveis para o uso em
laboratrio de anlises clnicas e em pesquisa. No Brasil, so poucos os laboratrios que utilizam
biologia molecular para diagnstico, quanto mais plataformas fechadas.

Extrao de DNA:

1. NucliSENSeasyMAG
2. QIAcube - Qiagen
3. QIAxtractor- Qiagen

PCR convencional:

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1. SeegeneSeeplex - PCR convencional multiplex:

Seeplex VRE ACE Detection (deteco dos genes vanAe vanB em Enterococcus).
Seeplex MRSA ACE Detection (deteco dos genes mecA e nucespcie-especfico para
Staphylococcus aureus).

PCR em tempo real

1- ROCHE LightCycler:

LightCycler VRE Detection LightCycler MRSA Detection Kit.

LightCycler SeptiFast Test (deteco de 25 patgenos e gene mecA).

2- Cepheids Xpert

Xpert vanA.
Xpert MRSA.

3- M 2000 Abbot

Abbott RealTime HIV

Abbott RealTime CT/NG (Chlamydia trachomatis/Neisseria gonorrhoeae.)

4- BD Max- Becton Dickinson

BD GeneOhm MRSA ACP Assay.

BD GeneOhm VanR-Vancomycin resistance.

5- BioFire FilmArray- Biomerieux

FilmArray Respiratory (RP) Panel

FilmArray Gastrointestinal (GI) Panel
FilmArray Blood Culture (BCID) Panel
FilmArray Meningitis/Encephalitis (ME) Panel

Sequenciamento

1. ABI 3500

MicroSeq 16S rDNA Bacterial Identification System - 500 Database

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CONCLUSO:
Concluiu-se nesse estudo qual o material gentico e sua expresso no organismo. Revendo
conceitos como clulas, organelas celulares, tipos de clulas e as relaes entre DNA, RNA (cido
desoxirribonucleico) e sntese proteica provendo com essas informaes, o conhecimento para
desenvolver estudos na rea da sade

GLOSSRIO
Bases purnicas: As purinas so bases nitrogenadas (denominadas ento bases pricas),
compostos orgnicos heterocclicos. So compostas por um anel pirimidnico fundido a um anel
imidazlico. (fonte: wikipedia)

Envoltrio Nuclear: uma estrutura que envolve o ncleo das clulas dos seres eucariontes,
formado por duas membranas (interna e externa). As membranas delimitam um espao entre elas
denominado espao perinuclear. A membrana externa e continua com o REG. As membranas so
interrompidas por poros. (fonte: http://biologiacelulareestrutural.blogspot.com.br/2011/11/envoltorio-
nuclear.html)

Expresso Gnica: A expresso gnica (portugus europeu) ou expresso gentica (portugus

brasileiro) o processo pelo qual a informao hereditria contida em um gene, tal como a sequncia
de DNA, processada em um produto gnico funcional, tal como protenas ou RNA. (fonte: https://
pt.wikipedia.org/wiki/Express%C3%A3o_g%C3%A9nica)

Grupo carboxila: Grupo carboxila (portugus brasileiro) ou carboxilo (portugus europeu) um

grupamento orgnico (COOH), presente em cidos carboxlicos, derivado da unio do grupamento
carbonila (presente em aldedos e cetonas) com o grupamento hidroxila (presente nas funes
lcool e fenol). O carter cido destes compostos se d justamente pela liberao do H+ que pode
ser visto na extremidade da carboxla. Quanto mais fcil for a liberao desse H+, mais cido ser
o carter do composto. (fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Carboxila)

Helicase: A helicase ou DNA helicase uma enzima que promove a abertura da hlice de DNA,
separando-o em duas fitas simples para que possa sofrer replicao[1]. A helicase quebra as
ligaes de hidrognio entre as bases azotadas (purinas ou pirimidinas) de ambas as cadeias de
DNA, fazendo com que estas se separem. Esta enzima move-se ao longo da cadeia dupla de DNA
utilizando energia da hidrlise de ATP para separar as duas cadeias da molcula

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Ligase: A ligase do DNA (ou DNA ligase) uma enzima que promove a ligao entre os nucleotdeos
de duas molculas de DNA. (fonte: http://wikiciencias.casadasciencias.org/wiki/index.php/Ligase_
do_DNA)

Monmero: Em qumica, um monmero (portugus brasileiro) ou monmero (portugus

europeu) (do grego mono, um e meros, parte) uma pequena molcula que pode ligar-se a
outros monmeros formando molculas maiores denominadas polmeros. Exemplos de monmeros
so os hidrocarbonetos, derivados do petrleo, dos tipos alcanos e alcenos. Os hidrocarbonetos
como o estireno e etileno reagindo em cadeia formam plsticos como o poliestireno (reao em
cadeia do estireno) e polietileno (reao em cadeia do etileno). (fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/
Mon%C3%B4mero)

Organelas: Em biologia celular, organelas, organelos, ou ainda organitos, (pequenos rgos)

so compartimentos delimitados por membrana que tm papeis especficos a desempenhar na
funo global de uma clula. As organelas trabalham de maneira integrada, cada uma assumindo
uma ou mais funes celulares. O nome organela vem da ideia de que estas estruturas so os
rgos da clula, como os rgos so para o corpo (da o nome organela, o sufixo -ela sendo um
diminutivo). (fonte: https://pt.wikipedia.org/wiki/Organelo)

Plasmdio: Plasmdeos ou plasmdios so molculas circulares duplas de DNA capazes de se

reproduzir independentemente do DNA cromossmico. [1] Ocorrem geralmente em bactrias e por
vezes tambm em organismos eucariticos unicelulares (ex: o anel de 2-micra em Saccharomyces
cerevisiae) e clulas de eucariotas superiores. O seu tamanho varia entre poucos milhares a mais
de cem mil pares de bases. [2] Existem entre uma, para grandes plasmdeos, at vrias dezenas de
cpias de um mesmo plasmdeo numa nica clula.

Vrus: Os vrus so seres muito simples e pequenos (medem menos de 0,2 m), formados
basicamente por uma cpsula proteica envolvendo o material gentico, que, dependendo do tipo
de vrus, pode ser o DNA, RNA ou os dois juntos (citomegalovrus). A palavra vrus vem do Latim
virus que significa fludo venenoso ou toxina. (fonte: http://www.sobiologia.com.br/conteudos/
Seresvivos/Ciencias/biovirus.php)

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