Resumos Exp So

/SSN 1516-781X
Dezembro, 2005
tt
Jornada Acadmica
da Embrapa Soja
RESUMOS EXPANDIDOS
6.00878
I D I Il IlI IH I D I I I
REPBLICA FEDERATIVA DO BRASIL
Luiz Incio Lula da Silva
Presidente
MINISTRIO DA AGRICULTURA, PECU RIA E ABASTECIMENTO
Robeflo Rodrigues
Ministro
Enipa
EMPRESA BRASILEIRA DE PESQUISA AGROPECU RIA
CONSELHO DE ADMINISTRAO
Luis Carlos Guedes Pinto
Presidente
Silvio Crestana
Vice-Presidente
Alexandre Kalil Pires
Cl udia Assuno dos Santos Viegas
Emesto Paterniani
Hlio Tollini
Membros
DIRETORIA-EXECUTIVA
Silvio Crestana
Diretor-Presidente
Jos Geraldo Eugnio de Frana
Kepler Euclides Filho
Tatiana Deane de Abreu S
Diretores-Executivos
EMBRAPA SOJA
Vania Beatriz Rodrigues Castiglioni
Chefe Geral
Joo Flvio Veloso Silva
Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Norman Neumaier
Chefe Adjunto de Comunicao e Negcios
Heveraldo Camargo Meio
Chefe Adjunto de Administrao
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rea de Negcios Tecrolgicos da Embrapa Soja
Caixa Postal 231 - CEP 86001-970
Telefone (43) 3377 6000 Fax (43) 3371 6100 Londrina, PR
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As informaes contidas neste documento somente
podero ser reproduzidas com a autorizao expressa
do Comit de Publicaes da Embrapa Soja
ISSN 1518-781X
E a Dezembro, 2005
Empresa Brasileira de Pesqoisa .4gropecodria
Centro Nacional de Pesquisa de Soja
Ministrio da A Mico/tufo. Peco ria e Abastecimento
Documentos 268
Jornada Acadmica da
Embrapa Soja
Resumos Expandidos
Londrina, PR
2005
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Exemplares desta publicao podem ser adquiridos na

Embrapa Soja
Rodovia Carlos Joo Strass - Acesso Orlando Amaral
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86001-970 - Londrina, PR 1.K1
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ii
Comit de Publicaes da Embrapa Soja
Presidente: Joo Flvio Veloso Silva
Secretria executiva: Regina Maria Vi/Ias Bas de Campos Leite
Membros: Alexandre Magno Brighenti dos Santos
Antonio Ricardo Panizzi
Clara Beatriz Hoffmann-Campo
Dcio Luiz Gazzoni
George Gardner Brown
Ivan Carlos Corso
Lo Pires Ferreira
Waldir Pereira Dias
Coordenador de editorao: Odilon Ferreira Saraiva
Normalizao bibliogrfica: Ademir Benedito A/ves de Lima
Editorao eletrnica: Neide Makiko Furukawa
Capa: Danilo Estevo
1 impresso 12/2005: tiragem: 300 exemplares
Todos os direitos reservados.

A reproduo no autorizada desta publicao, no todo ou em
parte, constitui violao dos direitos autorais (Lei n9.610).
Jornada Acadmica da Embrapa Soja (2005, Londrina,

PR). Resumos expandidos. Londrina: Embrapa Soja,
2005.
175p. (Documentos / Embrapa Soja, ISSN 1516-
781X; n.268)
1 Soja-Pesquisa. 2.Pesquisa agricola. l.Titulo.

II. Srie.
ODO 633.34072
Embrapa 2005
Agradecimento
Ao Sr. John Bowman, pelo estmulo rea acadmica e por tornar

esta obra possvel.
Apresentao
A Embrapa Soja comemorou, em 2005,30 anos de atividades. Nessa
trajetria, a Instituio e seus parceiros geraram e difundiram inmeras
tecnologias para os sistemas de produo da de soja, girassol e trigo.
Alm de atuar com enfoque no desenvolvimento sustentvel dessas cul-
turas, a Embrapa Soja tem colaborado na formao de estudantes de
graduao e ps-graduao, por meio de um programa de estgios que
possibilita a presena dinmica de alunos em vrios setores e reas da
Em presa.
As comemoraes do aniversrio da Embrapa Soja contaram com
atividades para seus diversos pblicos. Para os estagirios, foi organiza-
da a Jornada Acadmica, com o objetivo de fortalecer a integrao entre
a Empresa, os estudantes e a comunidade.
Para participar da Jornada, os estudantes prepararam resumos ex-
pandidos sobre as atividades que realizam no estgio, sob orientao de
seus professores edo pesquisadores e tcnicos da Embrapa Soja. Esses
trabalhos tambm foram apresentados oralmente e em sesso pster, e
obtiveram excelente repercusso junto aos participantes do evento.
Esta publicao rene os resumos expandidos dos trabalhos apre-
sentados na JornadaAcadmica. a comprovao do esforo da Embrapa
Soja e dos estudantes para demonstrar a importncia de suas tarefas e
de seu aprendizado durante o estgio.
Em nome da Embrapa Soja, parabenizamos a todos que participa-
ram do evento apresentando trabalhos, e expressamos aqui reconheci-
mento e agradecimento aos nossos estagirios, pelas contribuies que
tm trazido Empresa. principalmente por meio desses estudantes que
a Embrapa Soja mantm sua ligao com o meio acadmico, cuja ener-
gia, aliada curiosidade e sede de aprendizagem, contribuem para
manter um ambiente sempre vivo e interativo.
Joo Fl via Veios o Silva

Chefe Adjunto de Pesquisa & Desenvolvimento
Embrapa Soja
Sumrio
Efeito de diferentes manejos de solo e de culturas na diversidade

gentica de rizbios microssimbiontes da soja. Alan Alves Pereira;
Rubens J. Campo; Julio Cezar Franchini; Eleno Torres;
Mariangela Hungria . ............................................................................... 11
Efeito da adubao com enxofre e sulfato de amnio sobre o
percevejo castanho, Scaptocoris castanes Perty (Cydnidae),
em casa de vegetao. Antnio A. dos Santos; Lenita Jacob
Oliveira. .................................................................................................. 17
Marcadores microsatlites associados a cultivares de soja.
Camila L. Nunes; Nilson Vieira; Carlos Alberto Arrabal Arias;
Ricardo Vilela Abdelnoor; Alvaro Manoel Rodrigues Almeida . ............. 22
Seqenciamento do plasmdeo simbitico da estirpe CFN 299
de Rhizobiurn tropicL Daisy Rickli Binde; Ligia Maria de Oliveira
Chueire; lsmael Hernandez Lucas; Mansa Fabiana Nicols; Ana
Tereza Ribeiro Vasconcelos; Luiz de Paula Conzaga; Esperanza
Martinez-Romero; Fernando Comes Barcellos; Minam Francisca
da Silva; Jos Eduardo Garcia; Mariangela Hungria . ........................... 29
Efeito da palha, da umidade e da esterilizao do solo na
produo de esclercios de Sclerotium ro/fsii Sacc. Daniele Cortezi;
T. Mituti; Ivani O. Negro Lopes; Alexandre Jos Cattelan; Paulo
Roberto Galerani; Eleno Torres; Alvaro Manoel Rodrigues Almeida. ... 35
Desenvolvimento tecnolgicos do requeijo " cremoso de soja.
Elielma C.X. Colla; Solange A,O. Neves; Vera de Toledo Benassi . ..... 40
Efeito antagonista de clulas e exsudatos de Chromobacterium
violaceum contra fungos patognicos de sementes de soja e
contra a lagarta da soja Anticarsia gemmatalis Hubner
(Lepidoptera: Noctuidae). Eriana Serpa Barreto; Rodrigo Masel
Capeletti Cioato; Marliton Rocha Barreto; Mariangela Hungria. ........... 44
Panorama genmico de Rhizobium tropici estirpe PRF 81 (Semia
4080). Fabiana Cisele da Silva Pinto; Ligia Maria de Oliveira
Chueire; Ana Tereza Ribeiro Vasconcelos; Mansa Fabiana
Nicolas; Luiz Gonzaga; Emilene Andr; Mariangela Hungria . .............. 50
Embrapa Soja. Documentos, 268
Diversidade de rizbios que nodulam o feijoeiro (Phaseolu.s

vulgaris L.) em solos dos cerrados. Fabio Plotegher; lda
Carvalho Mendes; Mariangela Hungria. ................................................ 56
Avaliao da eficincia na fixao biolgica do nitrognio com a
cultura da soja e caracterizao genotipica e da diversidade de
estirpes de Bradyrhizobium japonicum. Fernando Gomes
Barceilos; Pmela Menna; Jesiane Siefnia da Silva Batista;
MariangelaHungria. .............................................................................. 62
Seleo de substrato artificial para criao de percevejos-pragas
da soja. Flvia Augusta Cloclet da Silva; Antonio Ricardo Panizzi . ...... 68
Diversidade de rizbios que nodulam o feijoeiro (P/aseo/us
vu/garis L.) sob diferentes sistemas de manejo de solo em Campo
Belo do Sul, SC. Glaciela Kaschuk; Julio C.P. Santos; Joo F.
Berton-Junior; Mariangela Hungria. ...................................................... 71
Estudos da distribuio de percevejos, na planta de soja. Hellen
Cristina Romagnolo Pereira; Beatriz S. Corra-Ferreira . ..................... 77
Diversidade de estirpes de Bradyrhizobium japonicum e
Bradyrhizobiurn efkanii estabelecidas por inoculao em solos
dos cerrados. Jesiane Stefnia da Silva Batista; Fernando Gomes
Barcellos; Pmela Menna; leda Carvalho Mendes; Mariangela
Hungria. ................................................................................................. 81
Anlise sensorial descritiva de extratos de soja em p. Josemeyre
Bonifcio da Silva; Ilana Felberg; Sandra Helena P. Ferreira;
Mercedes Concrdia Carro-Panizzi; Soo Young Lee. ......................... 87
Teste de Elisa para a determinao da ocupao nodular. Giovana
Bortoti; Kellen Banhos do Carmo; Alexandre Jos Cattelan . ............... 94
Panorama genmico da estirpe de Bradyrhizobiurnjaponicurn
CPAC 15, recomendada para o uso em inoculantes comerciais
para a cultura da soja. Leandro Pereira Godoy; Ligia Maria de
Oliveira Chueire; Fernando Gomes Barcellos; Ana Tereza Ribeiro
Vasconcelos; Luiz de Paula Gonzaga; Mansa Fabiana Nicols;
Mariangela Hungria. .......................... .................................................... 98
Dinmica da matria orgnica em vrios sistemas de manejo e
rotao de culturas em Londrina. Leticia C. Babujia; Thais P.
Correa; Rosinei A. Souza; Jlio Cezar Franchini. ............................... 104
Jornada acadmica da Embrapa Soja
Relaes pblicas como ferramenta estratgica no

relacionamento entre a Embrapa Soja e os seus diversos pblicos.
Flvia Monti Arone; Ludmila Maia Mendes; Gilceana Soares
MoreiraGalerani . ................................................................................. 109
Identificao de QTL associados fixao biolgica do nitrognio
em soja. Maria Aparecida dos Santos; Mansa Fabiana Nicols;
Taila Carolina Santini Vedovati; Mariangela Hungria. .......................... 113
Biologia da lagarta-da-soja em dieta enriquecida com diferentes
concentraes de rutina e genistina. Mariana C. Salvador; Sandra
H. Miyakubo; Srgio Henrique da Silva; Maria Cristina Neves de
Oliveira; Clara Beatriz Hoffmann-Campo. ............................................ 118
Uso de marcadores moleculares em soja visando identificar
caracteres da fixao biolgica do nitrognio. Michele Asai; Maria
Aparecida dos Santos; Mansa Fabiana Nicols; Mariangela
Hungria. ............................................................................................... 123
Anlise filogentica de rizbios, utilizados em inoculantes
comerciais brasileiros, com base no seqenciamento do gene
ribossomal 16S. Pmela Menna; Fernando Comes Barcellos;
Jesiane Stefnia da Silva Batista; Eliane Bangel; Rubens Jos
Campo; Mariangela Hungria . .............................................................. 128
Parmetros microbiolgicos como indicadores de qualidade do
solo em sistemas de manejo e rotao de culturas. Rosinei
Aparecida de Souza; Letcia Carlos Babujia; Thais Portantiolo
Correa; Eleno Torres; Julio Cezar Franchini; Maniangela Hungria . .... 134
Identificao de um isolado de carlavirus em Arachis pintai Krap
& Greg. Tatiana Mituti; Daniele Cortezi; Camila L. Nunes; Elliot W.
Kitajima; Priscila Belintani; Jos O. Gaspar; Alvaro Manoel
RodriguesAlmeida. ............................................................................. .140
Distribuio de carbono e estabilidade de agregados em amostras
indeformadas de diferentes sistemas de manejo de solo. Thais P.
Correa; Letcia C. Babujia; Rosinei A. Souza; Eleno Torres;
Jlio Cezar Franchini . .......................................................................... 145
Grupos de desenvolvimento humano: uma proposta para a
promoo da auto-anlise e autogesto na Embrapa Soja. Danieli
de Cssia Barreto; Vivian Maria Stabile Fumo; Talita Soares
10 Embrapa Soja. Documentos, 268
Lopes; Camila Lombardi Padovezi; Rosely Jung Pisicchio;

LucilaGazzola. .................................................................................... 150
Determinao de enzimas de lipoxigenase em soja crua e tratada
de cultivares brasileiros. Andreia O. Santana; Wladimir
S. Crancianinov; Adriana M. Freitas; Mercedes Concrdia
Carro-Panizzi . .................................................................................... 155
Avaliao do teor de inibidor de tripsina de kunitz e de isoflavonas
em gros de soja germinados da cultivar BRS 213. Wladimir S.
Crancianinov; Adriana M. Freitas; Andreia C. Santana; Jos
Marcos Gontijo Mandarino; Mercedes Concrdia Carro-Panizzi...... 158
Composio qumica de gros de soja em estdio R-7 danificados
por percevejo da soja. Wladimir S. Crancianinov; Adriana M.
Freitas; Andreia O. Santana; Jos Marcos Gontijo Mandarino;
Mercedes Concrdia Carro-Panizzi. ................................................. 162
Composio qumica de soja verde para consumo como hortalia.
Wladimir S. Crancianinov; Adriana M. Freitas; Clverson R.
Urrutia; Andreia C. Santana; Jos Marcos Gontijo Mandarino;
Mercedes Concrdia Carro-Panizzi . ................................................. 165
Comparao entre dois mtodos para a extrao de isoflavonas
em cultivares de soja. Wladimir S. Crancianinov; Adriana M.
Freitas; Andreia C. Santana; Jos Marcos Gontijo Mandarino;
Mercedes Concrdia Carro-Panizzi . ................................................. 169
Determinao do inibidor de tripsina de kunitz em soja crua e
tratada de cultivares brasileiras. Wladimir S. Crancianinov;
Andreia C. Santana; Adriana M. Freitas; Jos Marcos Gontijo
Mandarino; Vera de Toledo Benassi....................................................173
Jornada acadmica da Enbrapa Soja
Efeito de diferentes manejos de solo e de

culturas na diversidade gentica de rizbios
- microssimbiontes da soja
Alan Alves Pereira 1 ; Rubens J. Campo 2 JuIio Cezar Franchini 2 Eleno Tor-
; . ;
res2 ; Mariangela Hungria 2 Bolsista de especializao da Embrapa; 2 Embrapa

. 1
Soja.
Introduo
O Paran sempre ocupou posio de liderana na adoo de prticas

conservacionistas do solo, contudo, o efeito dos diferentes manejos na
biodiversidade microbiana do solo ainda pouco conhecido. A soja ocupa
posio de destaque no Brasil e no Paran e a viabilidade econmica da
cultura est diretamente relacionada ao processo de fixao biolgica do
N2 (FBN), em que a simbiose com bactrias conhecidas coletivamente
como rizbios (Bradyhrizobium japonicum e B. elkanii) consegue suprir as
necessidades da planta em nitrognio (N). Estima-se que a economia
resultante do processo de FBN com a soja seja da ordem de 3 bilhes de
dlares por safra, que deixam de ser gastos com fertilizantes nitrogenados.
Alm disso, a FBN contribui para diminuir o uso de fontes energticas
no-renovveis, necessrias para a sntese de fertilizantes nitrogenados,
bem como para a menor poluio de lagos, rios e lenis freticos com
nitrato e a menor emisso de gases com efeito estufa.
O objetivo desse estudo foi verificar o efeito do manejo do solo e das
culturas na diversidade de rizbios microssimbiontes da cultura da soja.
O ensaio utilizado para este estudo vem sendo conduzido h dez anos na
Fazenda Experimental da Embrapa Soja, em Londrina, em delineamento
experimental em blocos ao acaso, com quatro repeties, incluindo os
tratamentos de plantio direto (PD) ou plantio convencional (PC), com su-
cesso das culturas soja e trigo (Triticum ae.stivum), ou rotao com diver-
sas espcies: nabo forrageiro (Raphanus .sativus)/milho (Zea mays)/aveia
12 Embrapa Soja. Documentos. 268
preta (Avena str/gosa)/soja/trigo/soja/trigo/soja. Nesse ensaio, foram rea-

lizadas vrias avaliaes das propriedades quimicas e fsicas do solo,
contudo, pouco se sabe sobre o efeito do manejo do solo e das culturas
na diversidade microbiana do solo.
Material e Mtodos
Foram coletados ndulos das raizes de dez plantas de soja por parcela,
procedendo-se ao isolamento de rizbios de 30 ndulos por parcela, es-
colhidos ao acaso. Usando tcnicas microbiolgicas bsicas, procedeu-
se ao isolamento, purificao, caracterizao morfolgica e
estocagem dos rizbios. A seguir, foi efetuada a extrao de DNA, segun-
do Fernandes et ai. (2003). O DNA foi amplificado pela tcnica de PCR
("polymerase chain reaction", reao em cadeia de polimerase) com o
"primer" BOX-Al R, que amplifica regies repetitivas e conservadas do
DNA, normalmente no espao intergnico, segundo protocolo de
Fernandes et ai. (2003). O DNA tambm foi amplificado com o "primers"
para a regio do 16S rRNA, seguido pelo corte com trs enzimas de res-
trio, utilizadas individualmente, Hpall, Hhai e Ddel. Essa tcnica de-
nominada de RFLP ("restriction fragment lenght polymorphism",
polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrio)-PCR e as an-
lises foram conduzidas segundo Fernandes et ai. (2003).
Os perfis de DNA amplificados foram submetidos anlise de agrupa-
mento, usando o programa Bionumerics (Applied Mathematics, Blgica),
com o algor[tmo UPGMA ("unweighted pair-group method with arithmetic
mean") e o coeficiente de Jaccard, que considera a presena de bandas.
Resultados
A soja uma planta extica, originada da China, que foi introduzida no

Brasil provavelmente em 1882, na Bahia, mas o cultivo em larga escala
no Paran iniciou-se apenas na dcada de 1960. Os solos brasileiros no
possuem, originalmente, rizbios capazes de nodular a soja de modo efi-
caz, de modo que algumas poucas estirpes foram introduzidas via
Jornada acadmica da Embrapa Soja 13
inoculantes. Os inoculantes utilizados em Londrina desde a expanso da

cultura introduziram um mximo de dez estirpes, contudo, a diversidade
gentica observada nos isolados de rizbio deste ensaio foi bastante ele-
vada. Considerando-se a anlise por BOX-PCR, em que seria possvel
verificar a variabilidade entre estirpes, no tratamento PC com sucesso
soja/trigo, os perfis de DNA obtidos resultaram em um agrupamento final
com uma similaridade gentica de 12%. No caso do PC com rotao de
culturas, o nvel de similaridade foi de 25%. No PD com sucesso, as
estirpes foram agrupadas em um nvel final de similaridade de 46%, en-
quanto no PC com rotao de culturas foi de 25%. Considerando-se o
nvel de similaridade de 70%, no qual pode-se definir que as estirpes so
bastante distintas, as relaes de perfis de ONA distintos/perfis de ONA
obtidos foram de: 9132 (PC-R), 12143 (PC-S), 11/37 (PD-R) e 8153 (PD-S).
Alm disso, os perfis obtidos em cada tratamento foram distintos dos de-
mais tratamentos e, quando todas as estirpes foram analisadas em con-
junto, constatou-se diversidade gentica elevada (Fig. 1). Considerando
a anlise por RFLP-PCR da regio do DNA que codifica o gene 16S rRNA,
tambm se constatou grande variabilidade gentica. Essa anlise permi-
te a definio de espcies. As duas nicas espcies de microssimbiontes
da soja que foram introduzidas no solo foram B. japonicum e B. e/kanii.
Contudo, considerando o nivel de similaridade de 70% na anlise de agru-
pamento, constatou-se que 19 espcies provveis foram isoladas (Fig. 2).
A variabilidade gentica entre rizbios adaptados pode resultar da trans-
ferncia lateral de genes, bem como da recombinao gnica, perda e
ganho de genes, que esto ocorrendo em uma taxa bastante elevada nas
condies tropicais.
Consideraes Finais
A diversidade gentica dos rizbios microssimbiontes da soja foi conside-

ravelmente incrementada pelo tempo de cultivo da soja, em todos os sis-
temas de manejo de solo e de culturas estudados. Essa variabilidade pode
representar um "efeito tampo", permitindo a sobrevivncia dos rizbios e
FBN em diversas condies ambientais, mas tambm pode dificultar a
introduo de novas estirpes mais eficientes no solo.
Figura 1. Anlise de agrupamento (UPGMA e coeficiente de Jaccard) dos produtos

obtidos pela anlise de BOX-PCR, de rizbios isolados de ndulos de
soja sob diferentes sistemas de manejo de solo e de culturas.
Jornada acadmica da Em/napa Soja 15
Figura 2. Anlise de agrupamento (UPGMAe coeficiente de Jaccard) dos produtos

obtidos pela anlise de RFLP-PCR da regio gnica do 16S rRNA,
seguida pelo corte com trs enzimas de restrio, de rizbios isolados
de ndulos de soja sob diferentes sistemas de manejo de solo e de
culturas.
Agradecimentos
Projeto parcialmente financiado pela Fundao Araucria (convnio 046/

2003) e pelo CNPq (30124112004-0).
Referncias
FERNANDES, M.F.; FERNANDES, R.RM.; HUNGRIA, M. Caracteriza-

o gentica de rizbios nativos dos tabuleiros costeiros eficientes em
culturas do guandu e caupi. Pesquisa Agropecuria Brasileira, Braslia,
2003. v.38, p.911-920.
Efeito da adubao com enxofre e

sulfato de amnio sobre o percevejo castanho,
Scaptocoris castanea Perty (Cydnidae),
em casa de vegetao
Antnio A. dos Santos 1 ; Lenita Jacob Oliveira 2 Bolsista de especializao da

. 1
Embrapa; 2 Embrapa Soja.
Introduo e Objetivo
O percevejo castanho das raizes, Scaptocoris castanea Perty, uma pra-

ga de hbito subterrneo que causa grandes prejuzos em lavouras de
soja, algodo e pastagens, especialmente nos Cerrados. Observaes
de campo e registros na literatura mostram que a fertilidade do solo um
dos fatores que podem afetar a intensidade dos danos causados por essa
praga. Na literatura, h vrios registros sobre efeitos de fertilizantes
nitrogenados e enxofre em insetos, com efeitos variveis conforme a es-
pcie (Malaguido et ai. 1999)
Estudos realizados em campo, por Malaguido et ai. (1999), mostraram
que o enxofre pode ter um efeito repelente sobre essa praga. Esses auto-
res observaram uma reduo na populao de percevejos, nas camadas
superiores do solo, nas parcelas adubadas com enxofre (50 Kg/ha). Nota-
ram, ainda, que o nmero de percevejos mortos nessas parcelas foi 3,7
vezes maior do que nas parcelas testemunhas, sugerindo que o efeito
direto do adubo sobre a populao do percevejo precisa ser melhor in-
vestigado em condies controladas.
O objetivo deste estudo foi avaliar a influncia do enxofre e dosulfato de
amnio sobre o percevejo castanho, em soja.
Materiais e Mtodos
0 ensaio foi instalado em vasos, em casa de vegetao. 0 delineamento

IS Embrapa Soja. Documentos, 268
experimental inteiramente casualizado, com 10 repeties e sete trata-

mentos: sulfato de amnio (95 Kg /h), trs doses de enxofre (25 , SOe 75
Kg/ha), enxofre + K2 0+P2 05 (50+100+ 100 Kg/ha), uma testemunha adu-
bada somente com K 2 0+P2 05 (1 00+100 Kglha) e uma testemunha sem
qualquer adubao. Cada parcela constou de um vaso adubado com a
quantidade de adubo proporcional dose por hectare, contendo duas
plantas. A infestao foi realizada na mesma data da semeadura (211011
2005), com 10 ninfas do percevejo castanho, coletadas a campo em,
Taciba, SP.
As avaliaes foram realizadas aos 7, 14, e 21 dias aps a infestao,

sendo anotadas a altura de cada planta, o comprimento da raiz, e os indi-
vduos vivos e mortos. Na ltima avaliao, mediu-se, tambm, o volume
de cada raiz.
Resultados e Discusso
Como j era esperado, a mdia de percevejos vivos foi diminuindo ao

longo do tempo e, aps 21 dias, a sobrevivncia variou de 25 a 39%, no
havendo, entretanto, diferenas significativas entre os tratamentos em
nenhuma das datas de avaliao (Tabela 1). O desenvolvimento das plan-
tas foi semelhante em todos os tratamentos, indicando que a infestao
com percevejos no parece ter exercido uma presso agressora nas plan-
tas. Apenas em relao ao comprimento da raiz, houve diferena signifi-
cativa entre os tratamentos. As razes das plantas adubadas apenas com
sulfato de amnia foram significativamente mais longas que as das plan-
tas adubadas apenas com fsforo e potssio (Tabela 1). Entretanto, essa
diferena, aparentemente, no teve qualquer relao com tolerncia da
planta ao percevejo castanho.
As condies do ensaio no permitiram avaliar o efeito indireto do adu-

bo sobre a tolerncia das plantas ao inseto, uma vez que o nvel
populacional de percevejos utilizado mostrou-se insuficiente para cau-
sar danos a elas, mesmo no solo sem qualquer adubao. Outro aspec-
to a ser considerado que, a mortalidade dos insetos sete dias aps a
infestao, foi alta em todos os tratamentos, variando de 31 a 45%, e
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indicando que os percevejos, coletados a campo, j poderiam estar de-

bilitados. Para avaliar o possvel efeito da adubao na tolerncia da
planta aos danos causados por percevejos, ser necessrio realizar
outros ensaios, a campo e em casa de vegetao, com diversos nveis
de infestao.
Mesmo considerando a alta mortalidade natural dos percevejos no pre-

sente experimento, os resultados indicam que no houve um efeito dire-
to do enxofre sobre os insetos. Em outro ensaio realizado em 2002,
tambm em casa de vegetao (Oliveira et ai., dados no publicados),
no qual o nvel de infestao foi bem mais alto (20 ninfas/vaso com ape-
nas uma planta de soja), observou-se que nenhum dos adubos utiliza-
dos (sulfato de amnio, uria e enxofre) interferiram na mortalidade dos
percevejos (Tabela 2). Nesse ensaio, o desenvolvimento das plantas
no foi avaliado.
Tabela 2. N 2 de percevejos castanhos mortos em, vasos com soja com

diferentes tipos de adubao, em casa de vegetao. Janeiro de
2002
Tratamento N de percevejos castanhos mortos

Dose/ha
7 DAS 1 15 DAS
Sulfato de amnio 200kg 1,100,22 1,70,26
Enxofre 50kg 1,800,20 2,150,17
testemunha Sem adubao 1,400,31 1,850,33
Uria 60kg 1,350,25 1,80,21
Valor de F 1,325 0,565
Prob. de E2 0,273 ns 0,640'
DAS = dias aps a semeadura
2
Probabibhdade de F: ns = no significativo
A anlise dos resultados dos dois ensaios Ganeiro de 2002 e janeiro de

2004) mostaram que os adubos no apresentam eficincia significativa
na relao a mortalidade do percevejo castanho, mas, mesmo assim, ain-
da so necessrios, trabalhos mais refinados, com um nmero maior de
percevejos por tratamento.
Referncias
MALAGUIDO, A.B.; OLIVEIRA, LJ.; LANTMANN, . Efeito da adubao

qumica sobre a populao do percevejo castanho, Scaptocoris castanca
Perty (Cydnidae). In: VII REUNIO SUL-BRASILEIRA SOBRE PRAGAS
DE SOLO, 1999, Piracicaba. Resumos... Piracicaba: FEALO, 1999.
Marcadores microsatlites
associados a cultivares de soja
Camila L. Nunes 1 ; Nilson Vieira 2 ; Carlos Alberto Arrabal Arias 2 ; Ricardo Vilela
Abdelnoor2 lvaro Manoel Rodrigues Almida 2 Estudante de Biologia da
; . 1
UNIFIL; 2 Embrapa Soja.
Introduo
Nos anos 1960, pesquisadores descobriram que, ao centrifugar DNA, em

gradiente de cloreto de csio, havia formao de duas bandas. A primeira,
contendo molculas maiores de DNA, e outra, menor, contendo inmeras
molculas constitudas de longas seqncias repetidas. A banda secun-
dria foi denominada banda satlite e, conseqentemente o DNA nela
presente foi denominado DNA satlite. Jeffreys et ai (1985), encontraram
outras regies do DNA, menores que aquelas denominadas satlites, as
quais continham seqncias repetidas de 15 ou mais nucleotdeos e que
eles denominaram minisathtes.Tambm determinaram que o nmero de
minisathtes variava entre individuos, o que os levou a criar a tcnica de
"DNA-fingerprinting".
Em 1989, outra importante descoberta aconteceu. Trs grupos de pesqui-

sadores (Litt & Luty, 1989; Weber & May, 1989; Tautz, 1989), trabalhando
independentemente, publicaram a ocorrncia de sequncias repetidas no
DNA, porm menores que aquelas descritas por Jeffreys et ai. (1985). No
entanto, entre as trs publicaes, apenas Litt & Luty denominam a nova
descoberta de microsatlites.
Os microsatlites apresentam algumas vantagens no estudo de diversi-

dade gentica:
1. especificidade de um locus (diferentemente de marcadores muiti-/ocus

como os minisatlites ou RAPD);
2. so marcadores codominantes (os indivduos heterozigotos podem ser

separados dos homozigotos, diferentemente de RAPD ou AFLP)
3. altamente polimrfico;
4. faclmente analisado pela tcnica de POR.

Estas vantagens foram consideradas neste estudo, onde se procurou iden-
tificar microsatlites especficos para algumas cultivares de soja e utiliz-
los na identificao de linhagens oriundas de autofecundao, em dialelos
obtidos para estudos de herana de resistncia.
Ao estudar a herana de resistncia ao vrus da necrose da haste da soja

(VNHS), utilizando cruzamentos entre a cv. resistente (Pintado) e a cv.
suscetvel (CD 206), observou-se que a proporo entre plantas suscet-
veis e resistentes sugeriam resistncia determinada por um gene domi-
nante. No entanto, avaliaes posteriores mostraram que algumas plan-
tas assintomticas apresentaram sintomas de forte deformao foliar, fato
que levantou dvidas quanto presena de plantas oriundas de autofe-
cundaes, na obteno dos cruzamentos.
Este trabalho mostrou a importncia dos microsatlites selecionados na

identificao de plantas oriundas de autofecundao ou de cruzamentos
bem sucedidos.
Material e Mtodos
Cruzamentos. Testes iniciais mostraram que a c.v. Pintado e a cv. CD

206 so resistentes e suscetveis, respectivamente, ao vrus da necrose
da haste (VNHS). Cruzamentos foram feitos entre essas duas cultivares e
plantas da gerao E 2 foram inoculadas mecnicamente com o VNHS.
Extrao de DNA. Folhas de plantas de soja, suspeitas de ser originrias
de autocruzamentos, foram maceradas em nitrognio lquido. A extrao
de DNA ser feita conforme descrio de Keim et ai., (1988), a partir de
tecido fohar liofilizado e moido...
Microsatlites. Neste estudo, foram utilizados primers de microsatlites

de soja descritos por Cregan et ai. (1999). Satt341, Satt222, Satt460,
Satt316, Satt591, Satt519, Satt546, Satt274, Satt456, Satt380, Satt184,
S att276.
PCR e Eletroforese. As reaes foram feitas conforme descrito por

Akkaya etal. (1992), com algumas modificaes. O volume final da rea-
o de POR, para cada amostra foi de 10 p1, contendo 1 pi tampo lOx,
0,3 p1 de MgCl 2 (50 mM), 0,52 p1 dNTP5 (2,5 mM), 1 p1 de cada primer R
e F, 0,2 p1 Taq polimerase, 3 p1 H 20 miliq e 3 p1 DNA(10 ng/ p1). A ampli-
ficao foi feita utilizando termociclador Eppendorf, com uma dissociao
inicial a 94C por 7 mm, seguindo-se 30 ciclos de 9400 por 1 mm, 50C
por 1 min e 72 C por 2 mm, e uma extenso de 72 C por 7 mm. As
amostras amplificadas foram submetidas a eletroforese em gel de
poliacrilamida (10%) a 150V por 90 mm. A colorao dos gis foi feita
com brometo de etidio e as bandas visualizadas em transiluminador com
luz ultra-violeta.
A semelhana de estudos anteriores conduzidos na Embrapa Soja, os

primers de microsatlites utilizados permitiram verificar a presena de
bandas especficas para cada um dos pais (Figura 1). Os microsatlites
Satt 460, Satt 316 e Satt 456 permitiram separar a cv. suscetivel CD 206
da cv. resistente Pintado.
Essa caracterstica foi confirmada ao se comparar plantas oriundas dos
cruzamentos entre a cv. Pintado e a cv. CD 206. Os resultados demons-
tram que todos os cruzamentos foram efetivos, todas as plantas so
heterozigotas e todas contm um alelo de cada progenitor (Figura. 2).
A prxima etapa ser identificar marcadores associados ao gene de re-
sistncia ao virus da necrose da haste da soja, teis na seleo
assistida.No futuro, o desenvolvimento de mapas genticos mais saturados
e o desenvolvimento de mais marcadores devero contribuir com o pro-
grama de melhoramento da Embrapa Soja na obteno de cultivares com
uma constituio gentica mais ampla para resistncia a doenas.
Sati 341 Satt 222 San 460 Satt 316 San 591
P1 1 P1 P1
San 519 San 546 Satt 274 San 456 Satt 360
l
ii
iir'
Figural. Perfis eletroforticos de amplificaes de DNA de cultivares de soja

utilizando primers microsatlites. Identificao das amostras: M=
marcador molecular 100 pb; 1= cv. CD 206; 2= cv. BRS 133; 3= cv.
Pintado.
Amostras de cruzamentos testadas

4
-- -- --- -'
r
1 Li
UuLLL4st4LLLLLLL1 :'
L.
-
Figura 2. Perfis eletroforticos de amplificaes de DNA de plantas de soja

oriundas do cruzamento da cv. Pintado e cv. CD 206. M= marcador
molecular 100 pb; 1= cv. Pintado; 2= cv. CD 206.
Consideraes Finais
Microsatlites so regies do genoma de animais e plantas que se

caraterizam por possuir uma srie de repeties de seqncias curtas de
nucleotdeos (1 a 6 pb) que se repentem seguidamente na molcula de
DNA ("tandem"). Essas regies, no codantes, cuja sua origem e funo,
no esto bem claras. Os microsatlites apresentam, contudo, uma parti-
cularidade interessante. Entre dois indivduos o nmero de vezes que
aparece a seqncia bsica muito varivel e pode diferir entre individu-
os. Portanto, ao se analisar essas regies, possvel identificar diferen-
as entre eles. Essa caracterstica dos microsatlites foi utilizada para
diferenciar duas cultivares de soja que fizeram parte de um estudo de
herana de resistncia ao vrus da necrose da haste, uma doena que
tem provocado significativas perdas em lavouras de soja. Do cruzamento
Jorna da acadmica da Embrapa Soja 27
entre uma cultivar resistente (Pintado) com outra suscetivel (CD 206), foi
observada, na gerao E 2 , uma proporo de trs plantas resistentes para
uma planta suscetvel, na maioria das linhagens derivadas de diferentes
plantas F 1 . Entretanto, algumas dessas linhagens no apresentavam esse
padro de segregao. Ao se procurar determinar a causa dessa varia-
o, especulou-se se na gerao F 2 poderiam existir plantas oriundas de
autofecundao. Microsatlites que apresentavam amplificaes especi-
ficas para cada um dos pais foram identificados e utilizados, no se cons-
tatando a existncia de plantas originrias de semente proveniente de
autofecundao. A razo para a alterao observada continua sendo
investigada. Este trabalho permitiu tambm identificar diferentes
microsatlites, especficos para as duas cultivares citadas e que sero
utilizados na obteno de marcadores moleculares para deteco de gene
de resistncia ao VNHS.
Referncias
AKKAYA, M.S.; BHAGWAT A.A.; CREAGAN, P.B. Length polymorphisms

of simple sequence repeat DNA in soybean. Genetics, v.1 32, p11 31-1139,
1992.
CREGAN, R, JARVIK, T., BUSH, A.L., SHOEMAKER, R.C., LARK, K.G.,
HHALER, A.L., VANTQI, T.T., LOHNES, D.G., CHUNG, J., SPECTH, J.E.
An integrated genetic Iinkage map of the soybean. Crop Science v39, p.
1464-1490. 1999.
KEIM, W., OLSON, RT.C.; SHOEMAKER, R.C. A rapid protocol for
isolating soybean DNA. Soybean Genetics Newsletter, v.15, p.150-152,
1988.
WEBER, J.L., AND P.E. MAY. 1989. Abundant class of human DNA
polymorphisms which can be typed using the polymera chain reaction.
Am. J. Hum. Geriet. 44:388-396.
LITT, M., AND J. A. LUTY. 1989. A hypervariable microsatellite revealed by
in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle
actin gene. Am. J. Hum. Genet. 44:397-401.
TAUTZ I D. 1989. Hypervariability of simple sequences as a general source

for polymorphic ONA markers. Nuci. Acids Res.v 17 p.6463-6471.
JEFFREYS,A. J., V. Wilson, S.L. Thein. "Hypervariable minisatellite regions
in human DNA," Nature, 314(6006):67-73, 1985.
Seqenciamento do plasmdeo simbitico da

estirpe CFN 299 de Rhizobium tropici
Daisy Rickli Binde 1 ; Ligia Maria de Oliveira Chueire2 ; Ismaci 1-lernandez Lucas3
;
Mansa Fabiana Nicols 4 ; Ana Tereza Ribeiro Vasconcelos4 ; Luiz de Paula

Gonzaga4 ; Esperanza Martinez-Romer0 3 ; Fernando Gomes Barcellos 5 ; Minam
Francisca da Silva 6 ; Jos Eduardo Garcia 7 ; Maniangela Hungria 2 Bolsista de
. 1
Especializao da Embrapa Soja; 2 Embrapa Soja; 3Centro de Fijacin de Nitrgeno,

Cuernavaca, Mxico; 4 Laboratrio Nacional de Computao Cientfica; 5 Bolsista
de ps-doutorado do CNPq; 6 Bolsista deAT do CNPq; 7UEL.
Introduo
A fixao biolgica do nitrognio atmosfrico (N 2 FBN) o processo

) (
de reduo do N 2 a amnia (NH 3), catalisado pelo complexo enzimtico

da nitrogenase. Esse complexo encontrado somente em procariotos
denominados fixadores de N 2 , ou diazotrficos, incluindo bactrias e
arquebactrias. Nenhum organismo eucarioto, animal ou planta, ca-
paz de utilizar o N 2 diretamente em seus processos biossintticos, ape-
sar da larga disponilidade desse gs na atmosfera (cerca de 80%). A
FBN constitui a principal via de incorporao do N 2 biosfera, perfa-
zendo cerca de 65% do total, ou 96% da fixao por processos natu-
rais e considerada, aps a fotossintese, como o processo biolgico
mais importante, sendo fundamental para a vida na Terra (Hungria et
aI., 2005)
Hoje o Brasil o segundo maior produtor de feijo do mundo (Phaseo/us
vulgaris L.), que a fonte mais importante de protena para a populao.
Acultura ocupou 4,8 milhes de hectares em 200112002, mas o pais tam-
bm apresenta uma das mais baixas produtividades mundiais, de apenas
834 kg/ha. O baixo nivel de tecnologia empregado na cultura e o cultivo
em solos de baixa fertilidade, especialmente pobres em N contribuem,
fortemente, para esse cenrio. Conseqentemente, o suprimento ade-
quado de N, pela simbiose com bactrias capazes de fixar o N 2 de modo
eficaz, representa uma alternativa para aumentar o rendimento do feijoeiro

nacional com baixo custo, alm de evitar a contaminao dos recursos
hdricos, pelo nitrato, e de diminuir a emisso de gases com efeito estufa
(Hungria et ai., 2003).
Rhizobium tropici uma bactria Gram-negativa, com a habilidade de
nodular leguminosas como o feijoeiro (Phaseolus vulgaris) e a ieucena
(Leucaena Ieucocephala). Pode-se citar, dentre as principais caractersti-
cas dessa espcie, a resistncia a metais pesados, acidez do solo e a
temperaturas elevadas (Martinez-Romero et ai., 1991). As caractersticas
de adaptabilidade de R. tropici resultaram em que, para a cultura do
feijoeiro, esta seja a nica espcie de Rhizobium recomendada para o
uso de inoculantes no Brasil (Hungria et ai., 2003).
O genoma de /?, tropici inclui vrios plasmideos e, em um deles, conheci-
do como plasmdeo simbitico (psym), esto todos os genes necessrios
nodulao e FBN. Uma caracterstica interessante do psym que seu
"replicon" confere a capacidade de nodular e fixar N 2 a diferentes bactri-
as, que normalmente no possuem essa habilidade, como Agrobacterium
tumefacien.s, Ochcrobactrum antropii, Bruce/la melitensis e Ensifer
adherens. Em um esforo para caracterizar geneticamente o psym, o grupo
de pesquisa de Cuernavaca tentou curar esse replicon. Contudo, s fo-
ram conseguidas delees, sugerindo que o plasmdeo contm, alm dos
genes relacionados nodulao e FBN, outros genes necessrios para a
sua viabilidade.
Este projeto prope-se a realizar o seqenciamento do pSym, da estir-

pe CFN 299 de R. tropici. Com isso, poder ser possvel: 1) Identificar
novos genes envolvidos na interao planta-rizbio; 2) Verificar se o
psym possui genes essenciais sobrevivncia da bactria; 3) Verifi-
car se o plasmideo contm ilhas patognicas ou simbiticas, bem como
genes de metabolismo. Alm disso, a anlise dos genes do pSym per-
mitir entender os mecanismos que conduzem grande adaptao de
R. tropici em solos tropicais, cidos e submetidos, com freqncia, a
temperaturas elevadas, definindo estratgias para a inoculao do
feijoeiro que permitam a maximizao do processo de FBN para esta
cultura no Brasil.
Jornada acadmica da Fmbi'apa Soja 31
Objetivo
Realizar o seqenciamento do plasmideo simbitico da estirpe CEN 299

de Rh/zobium tropici, procurando genes relacionados competitividade e
eficincia do processo de fixao biolgica do nitrognio.
Material e Mtodos
Construo de bibliotecas genmicas do pSym da estirpe CFN 299

de R. tropici
- Extrao de ONA genmico
O DNA do pSym foi obtido no Centro de Fijacin de Nitrgeno, Cuernavaca,
Mxico e enviado para a Embrapa Soja. At o presente momento, foram
realizadas duas bibliotecas do pSym. O ONA foi extrado utilizando, para
o rompimento da parede celular, degradao de protenas, polissacardeos,
restos de parede e RNA, os reagentes SDS, proteinase-K, fenol, clorofr-
mio e RNAse. Aps a purificao, o DNA foi quantificado em
espectrofotmetro.
- Construo de bibliotecas
O preparo da biblioteca "sbotgun" envolveu a purificao do DNA e a frag-
mentao deste DNA ao acaso, por meio mecnico (nebulizao). O DNA
misturado com glicerol 50% e NaOAc 3M foi nebulizado por 30 segundos
a uma presso de 2 Kgf/cm 2 , a fim de obter fragmentos de 500 pares de
bases (pb) a 2 kb. A fragmentao foi confirmada em gel de agarose 1%.
Aps a fragmentao, as extremidades foram reparadas e fosforiladas
pelo uso do fragmento enzimtico Klenow da DNA polimerase de
Escherichia coli. Os fragmentos de 500 pb a 2 kb foram separados em gel
de agarose "low melting", grau analtico. Aps recuperao dos fragmen-
tos a partir do gel de agarose, os mesmos foram colocados para se liga-
rem ao vetor pUC18, digerido com a enzima de restrio SmaI-BAP e
defosforilados com a enzima T4 DNA ligase. Aps a ligao, o material foi
utilizado para transformao de clulas de E. co//estirpe DH1OB, atravs
da tcnica de eletroporao. As clulas foram plaqueadas em meio Luria-
Bertani contendo ampicilina (100 ug/ml, previamente esterilizada com fil-

tro 0,2 m), IPTG e X-gal e as bactrias foram crescidas durante a noite,
a 37C.
- Seqenciamento
No processo de seqenciamento, colnias brancas individuais (clones

recombinantes) so inoculadas em placas de crescimento de cultura
com 96 poos contendo meio Terrific Grow" (12 gIL de bactotriptona,
24 gLde extrato de levedura e 4 mLIL de glicerol) e ampicilina (100 RL/
mL). As bactrias so crescidas com agitao de 150 rpm, a 37C,
"overnight". As placas de crescimento de cultura so utilizadas para
estoque em glicerol (80%), sendo ento reinoculadas em blocos de
crescimento, seguindo o mesmo procedimento anteriormente descri-
to. Aps o crescimento, so obtidos "pellets", por centrifugao a 4000
rpm, por 8 minutos, O DNA , ento, extraido pelo mtodo de rompi-
mento alcalino. Aps o rompimento da parede celular das bactrias, os
restos de parede celular, polissacarideos e proteinas remanescentes
so seletivamente precipitados com KOAc 3M (acetato de potssio
estocado a 4C, pH 4,7-4,9). O sobrenadante filtrado por filtros ml-
tiplos (MultiScreen, Millipore) e o DNA, obtido atravs da filtragem,
purificado e resuspendido em gua, verificando-se a concentrao em
gel de agarose a 1%.
O DNA precipitado seqenciado, utilizando-se o "kit" "DYEnamicTM ET

dye terminator cycle sequencing (MegaBACETM)" (Amersham Pharmacia
Biotech). As reaes de PCR so realizadas com os "primers" "Universal"
e "Reverso", para se conseguir a amplificao dos genes. Os produtos da
reao so analisados em um seqenciador automtico (MegaBacel 000,
Amersham), pelo mtodo dos terminadores fluorescentes.
- Montagem do genoma
As leituras obtidas so submetidas anlise de bioinformtica, realizada

no LNCC, com o programa SABI, que integra vrios programas de do-
mnio pblico: "phred", "phrap", "Consed", "phrapview" e permite a identi-
ficao de ORFs ("open reading frames") como os programas "Glimmer",
BLAST, KEGG, COG, INTERPRO e PSORT.
Jornada acadmica da Embrapa Soja tal
Resultados
Duas bibliotecas j foram obtidas e validadas. Foi construda uma

"homepage" para o projeto (www.bnf.lncc.br ) e os resultados obtidos, at
o presente momento, constam dos Quadros 1 e 2.
Quadro 1. Leituras do psym deR. tropici CFN 299.
Nmero total de leituras 1.325

Nmero total de leituras sem vetores (c= 10% vector) 1.037
Nmero de leituras com 10-80% de bases de vetores 208
Nmero de leituras com mais de 80% de bases de vetores 80
Quadro 2. Bases obtidas do pSym de R. tropici CFN 299.
Nmero de bases depositadas (pb) (excluindo os 1.220.032(100%) (61%

vetores, incluindo bases de baixa qualidade) do genoma, estimado em
2 milhes de pb)
Nmero de bases com qualidade elevada >= 20 (pb) 718.579 (51,50%)
Nmero de bases com qualidade >=30 (pb) 585.373 (41,95%)
Nmero de bases com vetores (pb) 175.288(12,56%)
Comprimento mdio (pb) 920,78
Mdia de comprimento (qualidade >=20) (pb) 542,32
Cobertura do genoma sem considerar sobreposio 257.338 (12,9%)
Consideraes Finais
A estratgia de construo e validao das bibliotecas foi confirmada e

dever permitir o sequenciamento do plasmdeo simbitico da estirpe CFN
299 de R. tropici.
Agradecimentos
Ao CNPq, pelo financiamento parcial do Projeto (50.549912004-5, 50.59461

2004-1 e 30124112004-0).
Referncias Bibliogrficas
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, I.C. Benefits of inoculation ofthe

common bean (Phaseolus vulgari.$) crop with efficient and competitive
Rhizobium tropici strains. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v.39, p.
88-93, 2003.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, l.C.; GRAHAM, P.H. Contribution

of biological nitrogen fixation to the N nutrition of grain crops in the tropics:
the success of soybean (Glycine max L, Merr.) in South America. In: SINGH,
R.R; SHANKAR, N.; JAIWAL, RK., eds. Nitrogen nutrition and
sustainable plant productivity. Houston, Texas: Studium Press, LLC,
2005. (no prelo).
MARTNEZ-ROMERO, E.: SEGOVIA, E.; MERCANTE, EM.; FRANCO,

A.A.; GRAHAM, P.H.; PARDO, M.A. Rhizobium tropici, a novel species
nodulating Phaseolus vulgari.s L. beans and Leucaena sp. trees.
International Journal ci Systematic Bacteriology, Washington, v.41,
p.417-426, 1991.
Efeito da palha, da umidade e

da esterilizao do solo na produo de
esclercios de Sclerotium ro!fs Sacc.
DanieleCortezi 1 ; T. Mituti 1 ; Ivani O. Negro Lopes 2 ; Alexandre Jos Cattelan 2 ;
Paulo Roberto Galerani 2 ; Eleno Torre5 2 lvaro Manoel Rodrigues Almeida 2

; .
1 Estudante de Biologia da UNIFIL; 2 Embrapa Soja.
Introduo
Sclerotium rolfsii infecta mais de 500 espcies vegetais (Aycock, 1966).

Foi identificado, pela primeira vez, em 1926, infectando plantas de fumo,
na frica do Sul (Moore). Este fungo no produz esporos e perpetua-se
atravs da produo de esclercios, normalmente o inculo primrio en-
contrado em restos de plantas infectadas e tambm, no solo (Punja &
Grogan, 1983). Segundo esses autores, a fase perfeita denominada Athelia
rolfs/i, tem sido obtida em laboratrio, mas no foi identificada natural-
mente na natureza.
Este patgeno comum em regies mais quentes e midas. Raramente
ocorre em locais onde a temperatura de inverno cai abaixo de 0 C. O
fungo ataca primeiramente hastes e ramos de plantas, mas pode infectar
qualquer parte se as condies de ambiente forem favorveis. A tempera-
tura ideal para desenvolvimento micelial varia de 25 a 35 C. Esclercios
germinam bem quando a umidade do solo est entre 25-35%.
Considerando que no h cultivares de soja resistentes a esse patgeno,
avaliou-se efeito de microrganismos antagnicos na sobrevivncia de
esclercios, o efeito da palha e do teor de umidade do solo na germina-
o e produo de esclercios. Este trabalho constituiu parte das obser-
vaes realizadas nos experimentos de rotao-sucesso de culturas da
Embrapa Soja.
Material e Mtodos
1. Isolamento e obteno de esclercios

Utilizou-se isolado de S. ro/fsii obtido de soja (isolado 83) e multiplicado
em meio de BDA. Os esclercios formados na superficie do meio foram
transferidos para frascos de vidro e mantidos a 10C at serem utilizados
nos experimentos.
2. Coleta de amostras de solo e esterilizao
Amostras de solo LATOSOLO ROXO foram retiradas profundidade de
0-20 cm de profundidade, em diferentes campos, utilizando-se trado com
8 cm de dimetro. As amostras foram peneiradas e secas temperatura
ambiente. Parte da amostra (200 g) foi utilizada para determinao da
capacidade de campo. O restante foi dividido em partes iguais, sendo
uma parte esterilizada a 1200 C, em autoclave por 45 min e a outra, mantida
sem esterilizao.
3. Coleta de palha e esterilizao
Palha de soja, milho e trigo, coletadas em campo, foram lavadas e secas.
Posteriormente, foram acondicionadas em sacos de celofane e esteriliza-
das a 120 C, em autoclave por 25 mm.
4. Experimentos e delineamentos conduzidos
Efeito da esterilizao do solo e da palha de cobertura na produo de
esclercios. Foram utilizadas duas amostras de solo (esterilizado e sem
esterilizar) e trs tipos de palha (soja, trigo e milho). O delineamento
estatistico foi inteiramente casualizado, com seis tratamentos e nove
repeties, por tratamento. Cada gerbox constituiu um tratamento. O
solo esterilizado e sem esterilizar foi acondicionado em gerbox (3,2 cm
x 11 cm x 11 cm), colocando-se cinco esclercios sobre a superfcie do
solo e a seguir, cobriu-se com palha. O solo e a palha foram levemente
umedecidos com 15 mL de gua estril. Cada gerbox foi pesado de
modo a manter a umidade. Pesagens foram feitas diariamente, por cer-
ca de 3 semanas quando a palha foi retirada e o esclercios coletados
da palha e da superfcie do solo. A seguir os esclercios de cada gerbox
foram contados.
Jornada acadmica da Embrapa Soja ti'
Efeito da umidade do solo na produo de esclercios. Utilizou-se parte

do solo coletado para o experimento 1. O solo foi esterilizado a 120 C,
em autoclave por 45 mm . A seguir determinou-se a capacidade de cam-
po. Aps distribudo em gerboxes, metade das amostras foi mantida na
capacidade de campo e a outra metade, com 75% desse valor. Cinco
esclercios foram colocados na superfcie do solo de cada gerbox e
cobertos com palha de soja. O delineamento estatstico utilizado foi in-
teiramente casualizado com dois tratamentos e cinco repeties por tra-
tamento. Cada gerbox constituiu uma repetio.
Os tratamentos constam das Tabelas 1 e 2.
Tabela 1. Tatamentos utilizados na avaliao do efeito da esterilizao do

solo e da palha de cobertura na produo de esclercios.
Tratamento Solo Palha

1 Esterilizado Milho
2 Esterilizado Soja
3 Esterilizado Trigo
4 No esterilizado Milho
5 No esterilizado Soja
6 No esterilizado Trigo
Tabela 2. Tratamentos utilizados na avaliao do efeito da umidade do solo

na produo de esclercios.
Solo Palha Umidade

Esterilizado Soja Capacidade de campo
Esterilizado Soja 75% da capacidade de campo
Resultados
A Tabela 3 mostra o nmero mdio de esclercios produzidos nas dife-

rentes palhas utilizadas, sobre solo com e sem esterilizao. Os resulta-
dos demonstram que, em solo estril, a palha de trigo favoreceu mais a
Tabela 3. Nmero de esclercios de Sc/erotum rolfsii formados em solo

esterilizado e no esterilizado, com cobertura de palha de trigo,
soja e milho.
Falha
Solo
Milho
Estril 193,8 aA* 55,5 aA 100,8 aA
No estril 4,6 aB 11,4 aB 16,9 aB
C.V. 17,14%
* Mdias seguidas pela mesma letra minscula nas linhas e maisculas nas colunas no
diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de significncia.
produo dessas estruturas do que o milho e a soja (Fig.1). Tambm se

constatou que a esterilizao do solo contribuiu para o desenvolvimento
de esclercios, mostrando a ao benfica de outros microrganismos na
competio saprofitica por restos de cultura e parasitismo dos esclercios,
especialmente por Trichoderma sp. (Fig. 2). A esterilizao do solo elimi-
nou os microrganismos antagnicos.
Sclerotium rolfsii no apresentou maior desenvolvimento e produo de
esclercios quando a umidade do solo foi mantida na capacidade de cam-
po, em comparao com o solo levemente mais seco, o qual foi mais
favorvel ao desenvolvimento do patgeno (Tabela 4).
Figural. Desenvolvimento de
esclercios de
Sclerotium roffsii em
palha de trigo.
Jornada acadmica da Embrapa Soja 3-9
:7: : ':;

'a':
. ' i -?
1
&!V
ftC*
'
Figura 2 Parasit:smo observado em escle
rcios por Trfchoderma sp.
Tabela 4. Efeito da umidade do solo (capacidade de campo e 75% desse

valor), na formao de esclercios de Sclerotium rolfsiL
Umidade do solo Mdia

Capacidade de campo 22,4 b
75% do valor da capacidade de campo 65,8 a
18,1
Mdias seguidas pela mesma letra minscula na coluna no diferem entre si pelo teste de
Tukey a 5% de significncia. Anlise efetuada com dados transformados em .
AYCOCK, R. Stem rot and other diseases caused by Sclerotium ro/fsii or

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40 Emb,apa Soja. Documentos, 268
Desenvolvimento tecnolgicos do
"requeijo" cremoso de soja
Elielma C.X. ColIa 1 ; Solange AO. Neves 2 ; Vera de Toledo Benassi 3 Acadmi-
. 1
cada UniFil e bolsista Embrapa Soja; 2 Docente UniFil; 3 Embrapa Soja.
Resumo
Nos ltimos anos a cincia da nutrio tem aberto novas fronteiras ligan-
do tecnologia de alimentos e medicina com o surgimento do conceito de
alimentos funcionais, porm a descoberta de novos produtos alimentcios
contendo componentes ativos capazes de reduzir o risco de doenas,
adaptados ao consumo da populao pode facilitar novos hbitos alimen
tares, saudveis, quebrando obstculos e preconceitos relacionados a
alguns alimentos, entre eles o soja.
O estado nutricional de populaes vivendo em pases industrialmente
desenvolvidos pode claramente ser mostrado pelas tendncias desfa-
vorveis como o excessivo consumo de gorduras, principalmente
saturadas, acar e sal e, ainda, diminuio considervel do consumo
de amido e fibras dietticas (STAMLER, J.,1993). Estudos
epidemiolgicos tm confirmado essa tendncia que indica dficit do
consumo de cidos graxos polHnsaturados, protenas de alto valor bio-
lgico, vitaminas e minerais, assim como em pases subdesenvolvido.
Este estado nutricional carente tem originado elevadas incidncias de
doenas crnico degenerativas, dentre elas doenas cardiovasculares,
cncer, hipertenso, diabetes, obesidade, entre outras. A situao to
grave que dados da OMS mostram que essas doenas so respons-
veis por 70-80% da mortalidade nos pases desenvolvidos e cerca de
40% naqueles em desenvolvimento.
Estima-se que 113 dos casos de cncer esto relacionados dieta. Alm
da relao com as doenas crnicas, h fortes evidncias do papel da
dieta em melhorar a performance mental e fsica, retardar o processo de
envelhecimento, auxiliar na perda de peso, na resistncia s doenas,

entre outros (DE ANGELIS, 2001).
Hoje, para a maioria dos pesquisadores a nica sada para alterar esses
dados preocupantes o aumento do consumo de gros, frutas e vegetais,
fazendo com que a populao mude seus hbitos alimentares e siga o
que Hipcrates pregava, "Faa do alimento o seu medicamento".
No Brasil, a soja o alimento que mais oferece possibilidades para o
desenvolvimento de produtos funcionais, j que o pais o segundo maior
produtor mundial (LAURIL, C., 2004). E mesmo com dados to importan-
tes, a populao ocidental ainda no esta adaptada ao consumo destas
leguminosa.
A soja e seus derivados tem recebido considervel ateno dos pesqui-
sadores ao longo dos anos, principalmente devido a qualidade e quanti-
dade de sua protena, sendo considerada dentre os vegetais, um exce-
lente substituto dos alimentos de origem animal. Alm disso, dados
epidemiolgicos j mostravam que o seu elevado consumo por popula-
es orientais (principalmente China e Japo), poderia ser o fator
determinante na baixa incidncia de doenas como certos tipos de cn-
cer (mama, prstata e clon), doenas cardiovasculares, osteoporose e
sintomas da menopausa quando consumida periodicamente (WEI H., et
alI, 1995).
Este "gro de ouro" ainda no um produto de fcil acesso nos mercados
brasileiros. No pela quantidade, preo ou produo, mas sim pelo sabor,
que considerado ranoso ou pelo chamado beany- fiavor (um gosto
forte de mato). O beany- flavor est diretamente ligado presena de
aldeidos e hidrocarbonetos, que so formados durante o processamento
inadequado dos gros. Muitos pesquisadores esto desenvolvendo vari-
edades sem as enzimas lipoxigenases responsveis pela formao deste
sabor desagradvel, alm de aumentar o teor de proteina e isoflavonas
do gro (MOREIRA, 2004).
O presente trabalho teve como objetivo formular um "requeijo" de soja
cremoso com finalidade em ser mais uma nova alternativa de se consu-
mir um produto com propriedades funcionais e sensoriais agradveis ao
paladar. Para desenvolver esse produto partiu-se de duas formulaes. A

primeira em que se utilizou extrato hidrossolvel de soja acrescentado de
vrios hidrocolides individualmente. Os hidrocolides que propiciaram a
melhor consistncia cremosa foram o amido de mandioca (5%) e a
carboximetilcelulose (20%) quando comparados com amido de milho, fa-
rinha de arroz, fcula de batata, araruta e farinha de aveia em todas con-
centraes testadas 5%, 10% e 20%. Devido solubilidade ou disperso
em meio aquoso temperatura ambiente a carboximetilcelulose apresen-
tou melhor aspecto para o processamento tcnico adotado. A segunda
formulao partiu-se da protena coagulada de soja, utilizando extrato
hidrossolvel de soja por processamento caseiro, aquecido a 65C e co-
agulado com sulfato de magnsio. Em seguida foi acrescentado 20% de
leo vegetal e 5% de gua, posteriormente foi liquidificada e obtida uma
pasta homognea de cor caracterstica ao extrato hidrossolvel de soja.
Essa segunda formulao foi a que mais se aproximou do requeijo cre-
moso de leite de vaca em termos de consistncia e cremosidade. Para as
duas formulaes foi possvel acrescentar aromatizantes em diversos
sabores de queijo ou ervas finas com o objetivo de mascarar o possvel
sabor residual. A determinao da vida de prateleira e a anlise sensorial
sero realizadas na prxima etapa.
Como parmetro para avaliar a estabilidade do produto, sero determina-

dos pH e acidez total, seguindo a metodologia do Instituto Adolf Lutz, e
contagem total de microrganismos (bactrias e fungos) de acordo com a
metodologia exposta no Manual Merck, assim como, a composio
centesimal onde umidade, cinza, lipidios totais, protenas totais, sero
determinadas conforme bibliografia referenciada. Para verificar a aceita-
o e/ou preferncia do "requeijo" cremoso de soja, ser utilizada a es-
cala hednica de nove pontos. O modelo estatstico a ser utilizado ser
anlise de varincia (ANOVA) e as diferenas entre as mdias sero com-
paradas pelo teste de Tukey a 5% de significncia.
Apesar de diversos estudos estarem demostrando os grandes benefcios

para a sade humana, esta rica oleoginosa e muitos de seus derivados
ainda no fazem parte da dieta dos brasileiros, que se dizem no habitua-
dos ao seu sabor. A divulgao do elevado valor nutricional da soja, assim
como sugestes de preparaes diferenciadas, ou a utilizao de condi-

mentos que reduzam ou mascarem o sabor que desagrada muitos consu-
midores deve ser mencionado, trabalhado e estudado por profissionais
da rea.
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rEI Em/.wapa Soja. Documentos, 268
Efeito antagonista de clulas e exsudatos de

Chromohacterium via Jaceum contra fungos
patognicos de sem entes de soja e contra a
lagarta da soja Anticarsia gemmata!is Hubner
(Lepidoptera:Noctuidae)
Eriana Serpa Barreto 1 ; Rodrigo Masel Capeletti Cioat0 2 ; Marliton Rocha

Barret0 3 ; Mariangela Hungria 4 Bolsista de DTI do CNPq; 2Bolsista de ITI do
. 1
CNPq; 3 Doutorando na Embrapa Soja; 4 Embrapa Soja.
Introduo
A Chromobacterium violaceum uma bactria saprfita, Gram-negativa e

aerbica facultativa, encontrada em amostras de solo e gua de regies
tropicais e subtropicais de diversos continentes. No Brasil, ocorre com
abundncia na gua e nos bancos de areia do Rio Negro, na Regio
Amaznica. A cor do pigmento produzido por C. vio/aceum, a violaceina,
representa uma de suas caractersticas mais atrativas. A violaceina apre-
senta atividade antimicrobiana contra Mycobacterium tuberculosis,
Trypanosoma cruz! e Leishmania sp. e, tambm, atividade antifngica,
antiviral e antitumoral (Durn et ai., 2001). Essas caractersticas levaram
escolha da estirpe-tipo ATCC 12472, isolada de guas fluviais frescas
em Mentekab, Malsia, como modelo para ser o primeiro microrganismo
a ter seu genoma completamente seqenciado por um consrcio de labo-
ratrios de mbito nacional (Projeto Genoma Brasileiro MCT/CNPq). O
seqenciamento revelou um cromossomo circular com 4.751.080 pares
de bases e 4.429 "open reading frames" (ORFs), tendo sido identificadas
2.715 protenas conhecidas, 958 hipotticas conservadas e 756 prote-
nas hipotticas (Vasconcelos et aI., 2003).
A cultura da soja (Gfycine max (L.) Merrill) apresenta grande importncia
econmica para o Brasil, mas pode ser limitada por diversos patgenos
de sementes que, inclusive, praticamente inviabilizam a semeadura sem
ouso de defensivos agrcolas em diversos tocais do pas (Arajo, 1995).

Em relao aos fungos patognicos, as estimativas atuais so de que,
desde a safra 200112002, o tratamentos de sementes de soja com
fungicidas vem sendo utilizado em mais de 93% da rea semeada no
Brasil (Henning, 2004). J em relao a insetos, a lagarta-da-soja,
Anticar.sia gemmatalis Hubner (Lepidoptera:Noctuidae), uma das princi-
pais pragas desfolhadoras de plantas de soja, sendo alvo da maior parte
das aplicaes de inseticidas na cultura (Secchi, 2002).
Objetivos
Verificar a atividade biocida das clulas e dos exsudatos da estirpe pa-

dro e de dois isolados de Chromobacterium vio/aceum da Amaznia
contra fungos patognicos de sementes de soja e contra a lagarta-da-
soja.
Material e Mtodos
A atividade biocida da estirpe padro e de dois isolados selecionados,

07 e 27, bem como de seus respectivos exsudatos foi testada contra
sete fungos patognicos de sementes de soja (Aspergi/lus sp.,
Cercospora kikuchi, Colietotrichum sp., Fusarium sp., Phomopsis sp.,
Corynespora sp. e Botroyodip/odia sp.). Esses fungos esto relaciona-
dos a doenas importantes na cultura da soja, como a queima-da-haste
(Phomopsis sp.), a antracnose (Co/Ietotrichum sp.) e a sndrome da morte
sbita (Fusarium sp.). Duas metodologias foram utilizadas para avalia-
o da atividade antifngica, segundo Arajo (1995), com modificaes.
Na primeira, os fungos foram inoculados, por meio de discos com miclio,
em quatro pontos eqidistantes em placas de Petri contendo meio BDA
(200g de batata, 12g de glicose em 1 .000mL de gua destilada, 1,5% de
gar), 24h antes da inoculao das bactrias e do exsudato filtrado. As
bactrias foram cultivadas em meio CV contendo 0,6% de cloreto de
sdio, 0,3% de extrato de levedura, 0,5% de peptona e 0,25% de glicose
dissolvidos em gua destilada, durante 24h, a uma temperatura de 28 a
30C, com agitao de 100 rpm. A seguir, as clulas foram lavadas trs
vezes em tampo fosfato pH 6,5 e ressuspensas no mesmo tampo, at
atingir a concentrao de 108 clulas mL-1. Para o tratamento com os
exsudatos, as bactrias foram cultivadas nas mesmas condies j cita-
das e centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 mm, procedendo-se
filtragem do sobrenadante em filtro do tipo Millipore (0,2 pm). No orifcio
central da placa foram colocados 80 pL de cada cultura de clula, ou do
respectivo sobrenadante filtrado. Os ensaios foram conduzidos com trs
repeties e as placas incubadas temperatura de 28C durante sete
dias. Aps esse perodo, foram avaliados os halos de inibio da bact-
ria e do exsudato em relao aos fungos. Na segunda metodologia, a
bactria foi inoculada em um circulo externo e os discos contendo os
miclios foram colocados na parte central da placa de Petri. No caso de
ausncia de atividade biocida, os fungos continuam a crescer, mesmo
na presena da bactria, ou do exsudato.
A habilidade inseticida da estirpe padro, dos isolados 07 e 27, e de seus
respectivos exsudatos tambm foi testada contra a lagarta-da-soja. As
bactrias foram cultivadas em meio CV. Os tratamentos utilizados conti-
nham culturas com 24h, 48h e 72h de crescimento, conforme sugerido
em Martin etal. (2004), em diluies de 1091012 clulas mL 1 , em tampo
fosfato pH 6,5, e os respectivos exsudatos foram esterilizados por filtra-
o em membrana com 0,45 mm de poro. Os controles foram feitos com
gua destilada e meio de cultura CV.
As lagartas foram alimentadas com dieta artificial de Hoffmann-Campo et
ai. (1985). O experimento foi realizado segundo Barreto et aI. (1999). No
bionsaio foram testadas 20 larvas de 2 2 instar da lagarta da soja para
cada tratamento. Cada pedao de dieta (2 cm x 0,8 cm x 0,5 cm) foi em-
bebido nas suspenses contendo as bactrias e nos respectivos exsudatos
e foi oferecido s larvas, as quais foram mantidas em copos plsticos de
50 mL com tampa, a uma temperatura e umidade relativa aproximadas de
25C e 50%, respectivamente. A cada 24 ou 48h foi acrescentada nova
dieta e o tempo de exposio s bactrias e aos exsudatos foi de 24h
para todos os tratamentos. A mortalidade foi acompanhada diariamente,
durante todo o perodo larval.
Jornada acadm,ba da Ernbrapa Soja 47
Resultados
Os ensaios iniciais mostraram atividade antagonista promissora, princi-

palmente contra os fungos C. kikuchi, Co//etotrichum sp. e Co,ynespora
sp. A atividade biocida foi confirmada utilizando a segunda metodologia,
com o fungo crescendo na parte central da placa. Essa segunda
metodologia tambm se mostrou mais eficaz na avaliao da atividade
antifngica. interessante observar que o potencial antifngico dos dois
isolados da Amaznia foi superior ao da estirpe padro, e que os trata-
mentos com as culturas de clulas foram mais eficientes quando compa-
rados aos tratamentos com os exsudatos. Shirata et aI. (2000) demons-
traram uma atividade inibitria da violaceina produzida por
Janthinobacterium lividum, que foi particularmente forte contra
Co/letotrichum dematium e Pose/linfa necatrix, os quais causam antracnose
e o apodrecimento branco das raizes de amoreira, respectivamente. Esse
resultado ratifica a existncia de atividade fungicida da violaceina, tam-
bm produzida pelas clulas de C. vio/aceum.
No foi verificada atividade inseticida de C. violaceum contra a lagarta da
soja em nenhum dos tratamentos. Tambm no foi verificado qualquer
tipo de inibio no desenvolvimento da lagarta. As bactrias prpuras tais
como C. violaceum no so, freqentemente, isoladas de insetos e, tam-
bm, no so consideradas seus patgenos, mas foi verificado, por Martin
et ai. (2004), que a estirpe PRAA4-1 de Chromobacterium sp., isolada em
Maryland, nos Estados Unidos, txica s larvas do besouro da batata do
Cobrado (Coleoptera: Chrysomelidae), o que demonstra a capacidade
inseticida desse tipo de bactria e refora a necessidade de busca de
novos mtodos para sua utilizao no controle biolgico de pragas agr-
colas.
Consideraes Finais
Houve indicao de atividade biocida em Chromobacterium violaceum

contra fungos fitopatgenos de sementes de soja, mas no foi observada
atividade inseticida contra a lagarta da soja.
Agradecimentos
Financiado parcialmente pelo CNPq (680.220100-5). Os autores agrade-

cem a Fbio F. Arajo, Ana Tereza Ribeiro Vasconcelos (LNCC) pelo
apoio na conduo do projeto e a Daniel Sosa-Gmez pela utilizao do
Laboratrio de Patologia de Insetos (Embrapa Soja). As estirpes da Ama-
znia foram isoladas pelo grupo do Prof. Spartaco Astolfi-Filho (Universi-
dade Federal do Amazonas). As lagartas foram fornecidas pelo Laborat-
rio de Criao Massal de Anticarsia gemmata/is (Embrapa Soja).
Refe r n cias
ARAJO, F.F. Efeito de Bacillus spp. e seus metablitos na

competitividade e na nodulao da soja (G!ycine max [L] Merril) por
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Panorama genmico de Rhizobium tropici

estirpe PRF 81 (Semia 4080)
Fabiana Gisele da Silva Pinto 1 ; Ligia Maria de Oliveira Chueire 2 ; Ana Tereza
Ribeiro Vasconcelos 3 ; Mansa Fabiana Nicolas 3 ; Luiz Gonzaga 3 ; Emilene
Andr4 ; Mariangela Hungria 2 Bolsista de Doutorado UEL/Embrapa Soja;
. 1
2 Embrapa Soja; 3Laboratrio Nacional de Computao Cientifica; 4 Bolsista de Ini-
ciao Cientifica do CNPq.
Introduo
O Brasil o segundo maior produtor e o maior consumidor mundial de

feijo (Phaseo/us vulgaris L.). A cultura do feijoeiro ocupou, nas trs sa-
fras anuais conduzidas em 2004, cerca de 4.000.000 ha, com uma produ-
o de mais de 3.000.000 toneladas, mas com rendimento mdio nacio-
nal bastante baixo, de apenas 826 kg ha 1 (CONAB, 2004). O baixo nvel
de tecnologia empregado na cultura e o cultivo em solos de baixa fertilida-
de, especialmente pobres em N contribuem, fortemente, para esse cen-
rio. Conseqentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose com
bactrias diazotrficas, de modo eficaz, representa uma alternativa para
aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, alm de evitar a
contaminao dos recursos hdricos pelo nitrato e de diminuir a emisso
de gases com efeito estufa. A eficincia do processo de fixao biolgica
do N 2 (FBN) com a cultura do feijoeiro, porm, tem sido considerada bai-
xa, por problemas relacionados nodulao, dificuldade de introduo
de melhores estirpes e baixa tolerncia a estresses ambientais, como
temperaturas elevadas e deficincia hidrica.
Contudo, a seleo, por nosso grupo de pesquisa, de estirpes mais efici-
entes e competitivas, dentro da variabilidade natural da populao do solo,
conseguiu identificar a estirpe PRF 81 (= SEMIA 4080) de R. tropici. A
obteno de rendimentos elevados de at 4.000 kg ha -1 ,obtidos com a
inoculao da estirpe PRF 81 conduziram sua recomendao para o
uso em inoculantes comerciais desde 1998 (Hungria et ai., 2000, 2003).
Jornada acadmica da Em/napa So/a 51
Como o Brasil , atualmente, o pais que mais utiliza a tecnologia de

inoculao (Hungria et ai., 2003), torna-se importante desenvolver estu-
dos de genmica com estirpes brasileiras, particularmente com o
microssimbionte do feijoeiro, cultura que necessita um impulso tecnolgico
para incrementar os rendimentos a um baixo custo.
Por meio de uma estratgia denominada determinao do panorama
genmico, baseada no seqenciamento parcial, de cerca de 10% a 15%
do genoma (Viprey et ai., 2000), da estirpe PRF 81 deR. tropici poss-
vel identificar, por homologia com os demais genomas, genes relaciona-
dos com o processo de FEN, bem como com a capacidade saprofitica.
Pela anlise desses genes possvel, ainda, identificar diferenas na
estrutura do genoma dessa estirpe eficiente e competitiva e que permi-
tam delinear novas estratgias que contribuam para minimizar as limita-
es FBN, freqentemente relatadas na simbiose com a cultura do
feijoeiro.
Objetivo
Obter o panorama genmico, com a cobertura de 10 a 15% do genoma da

estirpe de Rhizobium tropici PRF 81 (= SEMIA 4080), utilizada em
inoculantes comerciais para a cultura do feijo.
Material e Mtodos
- Extrao do DNA genmico

A partir dos "pellets" obtidos de clulas da estirpe PRF 81 de R. tropici,
aps o crescimento em meio de cultura LB (Sambrook et ai., 1989),
centrifugao a 10.000 g por 20 minutos e estocagem a 70C, o DNA
genmico das bactrias foi extrado pelo mtodo descrito por Sambrook
et aI. (1989). Aps o rompimento da parede celular das bactrias, os res-
tos de parede celular, polissacardeos e proteinas remanescentes foram
seletivamente precipitados com o reagente CTAB
('hexadecy/trimethy/ammonium bromide") e o DNA de alto peso molecular
foi recuperado do sobrenadante por precipitao com etanol. Este DNA

de alto peso molecular e de boa qualidade foi utilizado para a construo
das bibliotecas de "shotgun".
- Construo de bibliotecas "shotgun"
Aps a purificao do DNA genmico, a fragmentao do DNA foi rea-
lizada ao acaso, por meio mecnico (nebulizao). Aps a fragmenta-
o, as extremidades foram reparadas e fosforiladas pelo uso do frag-
mento Klenow da DNA polimerase de Escherichia cali e/ou a DNA
polimerase T7-fago. Fragmentos com tamanho entre 1,5-4,0 kb foram
separados em gel de agarose "low melting". Aps a recuperao destes
fragmentos a partir do gel de agarose, os mesmos foram colocados para
se ligarem ao vetor pUC1 8, digerido com a enzima de restrio Smal. e
desfosforilados com a enzima T4 DNA ligase. Aps a ligao o material
foi utilizado para transformao de clulas de E. ccli estirpe DH1013,
atravs da tcnica de eletroporao. As clulas foram plaqueadas em
meio LB contendo ampicilina (100 mg. mL 1 ) e crescidas durante a noite
a 37C. Os clones recombinantes produzidos foram, ento, transferidos
para placas do tipo ELISA de 96 poos, contendo meio liquido Terrif
Broth" suplementado com ampicilina (100 mg. ml.) e glicerol a 8% e
armazenados a -70C.
- Seqenciamento dos clones
As colnias individuais das bibliotecas obtidas foram inoculadas em meio

Terrific Grow" acrescido de ampicilina (100 mg. mL 1 ) e foram crescidas
com agitao de 300 rpm, por 16 horas, a 37C. O DNAfoi extraido pelo
mtodo usual de rompimento alcalino (Sambrook et aI., 1989), com uma
modificao no final do procedimento, que o da passagem do
sobreriadante por filtros mltipos (MultiScreen, Millipore) antes da precipi-
tao do DNA. O ONA purificado foi ressuspenso em gua e verificado
em gel de agarose a 0,8%, conforme descrito por Sambrook ei ai. (1989).
O DNA foi precipitado, procedendo-se ao seqenciamento utilizando o
"kit" "DYE nam i c TM ET dye terminator cycle sequencing (MegaBACETM)"
(Amersham Pharmacia Biotech). As reaes de PCR foram realizadas
com os "primers" "Universal" e "Reverso" (Invitrogen), para se conseguir a
amplificao dos genes. Os produtos da reao foram analisados em um

seqenciador automtico (MegaBacel000, Amersham), pelo mtodo dos
terminadores fluorescentes. As seqncias obtidas foram enviadas para
a "homepage" "http://www.nbf.lncc.br " e submetidas a um programa de
alinhamento de seqncias e construo de possveis "contigs" (Phred,
Phrap e Consed), e as seqncias "consensus" resultantes desses ali-
nhamentos foram posteriormente analisadas para verificar alinhamentos
significativos (BLAST nucleotide-nucleotide) com seqncias de DNA de
outras bactrias depositadas em banco de dados disponvel no GenBank
database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov ).
Resultados o Discusso
Foram feitas oito bibliotecas e foram realizadas 4.789 leituras, 94% delas
com tima qualidade, possuindo menos de 10% de vetores, confirmando
a validade das bibliotecas. Ao todo, j foram lidas 52 placas, provenientes
de oito bibliotecas, que resultaram em 5.074.975 pares de bases (pb),
2.221.754 pb das quais com qualidade igual ou superior a 20 (Quadro 1).
Estimando-se o genoma em 7.000.000 de pb, essas bases de boa quali-
dade seriam suficientes para cobrir cerca de 32% do genoma. Contudo,
pela natureza da biblioteca "shotgun", em que vrios fragmentos
correspondem a seqncias idnticas, a cobertura obtida, at o presente
momento, de 13,69% (Quadro 2).
Quadro 1.Total de bases obtidas no seqenciamento do genoma da estirp

PIRF 81 de R. tropici
Nmero de bases depositadas (pb) (excluindo 5.074.975(100%)

vetores, incluindo bases de baixa qualidade)
Nmero de bases com qualidade >= 20 (pb) 2.221.754 (42.22%)
Nmero de bases com qualidade >=30 (pb) 1.795.154 (34.12%)
Nmero de vetores (pb) 186.815 (3.55%)
Comprimento mdio (bp) 1059,71
Comprimento mdio (qualidade >=20) (pb) 463,93
54 Embrapa So/a. Documentos, 268
Quadro 2. Parmetros no seqenciamento da estirpe PRF 81 de R. tropci
Parmetro Situao em 05/2005

Nmero de "singlets" isolados de phrap 2.053(42,87% do no.
total de leituras)
Nmero de "phraps" no vetores isolados nos 1.175 (5723% dos
"singlets" "singlets")
Nmero de "singletons" isolados 1.239
Nmero de "contigs" phrap 868
Tamanho mdio dos "contigs" 1104,27
Nmero mdb de leituras em um "contig" 2,34
Nmero total de 'contigs" 2.043
Cobertura por "contigs" phrap (pb) 890.686
Cobertura por "singletons" (pb) 67.822
Qualidade media das bases nos "contigs" phrap 22,30
Cobertura do genoma (estimado em 7.000.000 pb), 958.508
considerando-se a soma dos "contigs" (pb)
Cobertura do genoma 13,69%
Os genes putativos esto sendo identificados com o uso de ferramen-

tas da bioinformtica, de predio de genes. Pelo uso do BLASTX, j
foi possivel identificar mais de 1.500 genes putativos, podendo-se ci-
tar, como exemplo, aqueles que codificam a protena SMb20348, de S.
me/iloti, adesinas, protena 1b1r4512 de B.japonicum, m112848 e mlr8056
de M. loti, Y4q1 de Rhizobium sp. NGR234, NifA, NodA, NodQ, NodU,
NodS, protena regulatria P-ll, protena "heat shock" ClpX, entre ou-
tros.
Consideraes Finais
O panorama genmico foi uma estratgia excelente para a cobertura par-

cial do genoma da estirpe de Rhizobium tropici PRF 81 (SEMIA 4080),
utilizada em inoculantes comerciais para a cultura do feijoeiro.
Agradecimentos
Ao CNPq, pelo financiamento parcial do Projeto (50549912004-5, 50.59461

2004-1 e 30124112004-0).
Referncias
CONAB (Companhia Nacional de Abastecimento). Anlise conjuntural

de 2002. Disponvel em: <http://www.conab.gov.br >. Acesso em: 18 fev.
2004.
HUNGRIA, M.; ANDRADE, D.S.; CHUEIRE, L.M.O.; FROBANZA, A.;
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HUNGRIA, M.; CAMPO, R. .J.; MENDES, 1. C. Benefits of inoculation of
the common bean (Pliaseo/us vulgaris) crop with efficient and competitive
Rhizobium trop/c/strains. Biology and Fertility a SolIs, Berlin, v.39, p88-
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SAMBROOCK, J.; FRITSCH, E.F; MANIATIS, T. Molecular cloning: a
laboratory manual. 2 n1 ed. New York: CoId Spring Habor Laboratory, 1989.
VIPREY, V.; ROSENTHAL, A.; BROUGHTON, W.K.; PERRET, X. Genetic
snapshots of the Rhizobium species NGR234 genome. Genome Biology,
vi, p.l-l7, 2000.
Diversidade de rizbios que nodulam o

feijoeiro (Phaseo!us vulgaris L.)
em solos dos cerrados
Fabio Plotegher'; lda Carvalho Mendes 2 ; Mariangela Hungria 3 Bolsista de

. '
IC do CNPq; 2 Embrapa Cerrados; 3Embrapa Soja.
Introduo
O feijo a base da alimentao de cerca de 300 milhes de pessoas,

especialmente na Amrica Latina e no sul e leste da frica, sendo con-
siderado, por alguns nutricionistas, um alimento perfeito, pois fonte de
protenas, fibras e carboidratos complexos. Estima-se que, para mais
de 100 milhes de consumidores pobres, cuja dieta baseada em ami-
do, essa leguminosa representa a nica fonte protica. O Brasil , hoje,
o segundo maior produtor mundial de Phaseolu.s e o primeiro produtor e
consumidor de feijo, contudo, os rendimentos mdios obtidos so bas-
tante baixos, de apenas 826 kg/ha (CONAB, 2004). O baixo nvel de
tecnologia empregado na cultura e o cultivo em solos de baixa fertilida-
de, especialmente pobres em N contribuem, fortemente, para esse ce-
nrio. Conseqentemente, o suprimento adequado de N pela simbiose
com bactrias diazotrficas, de modo eficaz, representa uma alternativa
para aumentar os rendimentos nacionais a um baixo custo, alm de evi-
tar a contaminao dos recursos hdricos pelo nitrato e de diminuir a
emisso de gases com efeito estufa. Para o estabelecimento de uma
simbiose efetiva necessrio, porm, um maior conhecimento da diver-
sidade dos rizbios nativos capazes de nodular a leguminosa. Em estu-
dos anteriores, foi constatada diversidade gentica elevada de rizbios
nos Cerrados (Mostasso et ai., 2002) e, dentro dessa diversidade, foi
possvel selecionar estirpes mais eficientes e competitivas (Hungria et
ai., 2003). Contudo, estudos mais abrangentes precisam ser conduzi-
dos para um conhecimento mais preciso da diversidade de rizbios nos
Cerrados.
Objetivos
Caracterizar geneticamente rizbios microssimbiontes de feijoeiro em re-

as nativas dos Cerrados
Material e Mtodos
Foram coletados ndulos de diversos locais nos Cerrados, nunca cultiva-

dos anteriormente. O DNA das bactrias foi extrado a partir de culturas
puras de rizbios em meio YMA, segundo procedimento otimizado
(Kaschuk, 2003). O DNA foi amplificado pela tcnica de PCR com o primer"
BOX-Al R (5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (Versalovic et ai.,
1994) e os seus produtos foram submetidos eletroforese em gel de
agarose a 1,5% por 6horas. Em seguida, o gel foi corado com brometo de
etdio (0,00005%), observado em transluminador UV e fotografado. Essa
tcnica verificou a variabilidade gentica em nvel de estirpes. O
polimorfismo foi analisado usando o programa Bionumerics (Applied
Mathematics, Blgica) com o algoritmo UPGMA e o coeficiente de Jaccard
O DNA tambm foi amplificado com 'primers" que codificam a regio do
gene ribossomal 16SrRNA:Y1(5'-TGGCTCAGMCGMCGCGTGGCGGC-
3') e Y3 (3'-CTGACCCCAACTTCAGCATTGTTCCAT-5). Os produtos
dessas amplificaes foram submetidas metodologia de RFLP-PCR
(Laguerre et aI.,1994), com as seguintes enzimas de restrio: HaeIll;
Mspl e Rsal. Os fragmentos obtidos foram aplicados em gel de agarose a
3% e corridos em sistema de eletroforese a 120 V durante 4 horas. O
polimorfismo tambm foi analisado usando o programa Bionumerics.
O nivel de diversidade gentica encontrado na anlise de BOX Al R-PCR

foi muito elevado, pois praticamente cada estirpe apresentou um perfil
nico (Fig. 1). Essa anlise indica variabilidade entre estirpes, contudo, o
grande nmero de perfis obtidos representa um forte indicativo de diversi-
dade gentica elevada, provavelmente com vrias espcies novas, ainda
no descritas.
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Figura 1. Anlise de agrupamento dos produtos de DNJA obtidos por BOX Al R-

PCR de rizbios microssimbiontes do feijoeiro isolados de solos de
Cerrados.
Na anlise por RFLP-PCR da regio do gene ribossomal 16S, houve indi-

cao de predomnio de uma espcie (Fig. 2). Contudo, outras espcies
foram observadas, diversas delas bastante distintas das estirpes-tipo usa-
das como referncia, representando outro indicativo de novas espcies
de rizbios nos Cerrados.
II 1 1 II 1
II
III
1
' II II '1
II
II
II II
11 II
II 1 II II
Figura 2. Anlise de agrupamento dos produtos de DNA obtidos por RFLP-PCR

de rizbios microssirribiontes do feijoeiro isolados de selos de Cerrados
r*i Embrapo Soja. Documentos, 268
Consideraes Finais
A diversidade gentica elevada observada em rizbios microssimbiontes

do feijoeiro um forte indicativo de que muitas espcies de rizbios dos
solos tropicais ainda no foram descritas e que o patrimnio gentico dos
microrganismos em solos brasileiros precisa ser conhecido com mais de-
talhes, podendo representar uma fonte importante de genes de importn-
cia agrcola.
Agradecimentos
Projeto parcialmente financiado pelo CNPq (30124112004-0).
Referncias
CONAR (Companhia Nacional de Abastecimento). Anlise conjuntural

de 2002. Disponvel em: <httQ://www.conab.ciov.br >. Acesso em: 28 jan.
2003.
HUNGRIA, M.; CAMPO, R.J.; MENDES, I.C. Benefits of inoculation ofthe

common bean (Phaseolus vulgaris) crop with efficient and competitive
Rhizobfurn tropici strains. Biology and Fertility of Soils, Berlim, v.39, p.
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KASCHUK, G. Diversidade de rizbios que nodulam o feijoeiro

(Phaseo!us vulgaris L.) sob diferentes sistemas de manejo de solo.
2003. 79 f. Tese (Mestrado em Microbiologia) - Universidade Estadual de
Londrina.
LAGUERRE, G.; ALLARD, M.-R.; REVOY, E; AMARGER, N. Rapid

identification of rhizobia by restriction fragment lenth polymorphism analysis
of PCR-amplified 16S rRNA genes. Applied and Environmental
Microbiology, Washington, v.60, p.56-63, 1994.
MOSTASSO, L.; MOSTASSO, F.L.; DIAS, B.G.; VARGAS, M.A.T.;

HUNGRIA, M. Selection of bean (Phaseo/us vulgaris L.) rhizobial strains
forthe Brazilian Cerrados. Field Crops Research, v.73, p.121-132, 2002.
VERSALOVIC, J.; SCHNEIDER, M.; DE BRULJIN, F.; LUPSKI, J.R.

Geriomic fingerprinting of bactria using repetitive sequence-based
polymerase chain reaction. Methods of Molecular Ceil Biology, Oxford,
v.5, p.25-40, 1994.
Avaliao da eficincia na fixao biolgica do

nitrognio com a cultura da soja e
caracterizao genotpica e da diversidade de
estirpes de Bradyrhizobium japonicum
Fernando Gomes Barcellos 1 ; Pmela Menna 2 ; Jesiane Stefnia da Silva Ba-

tista 3 ; Mariangela Hungria 4 13oisista de ps-doutorado do CNPq; 2 Boisista de
. 1
mestrado da CAPES; 38olsista de mestrado da Embrapa; 4 Embrapa Soja.
introduo
A fixao biolgica do nitrognio (FBN), atravs da inoculao da soja

com estirpes selecionadas de bactrias do gnero Bradyrhizobiurn, tem
sido essencial na viabilidade econmica da cultura no Brasil, dispensan-
do o uso de adubao nitrogenada (Hungria et ai., 2005). Ouso das estir-
pes selecionadas de Bradyrhizobium (B.japon/cum SEMIA 5079 e SEMIA
5080 e B. elkanii SEMIA 587 e SEMIA 5019) resulta em uma economia
estimada em mais de 3 bilhes de dlares por safra (Hungria et ai., 2005).
Entretanto, devido ao constante aprimoramento das prticas agrcolas,
ao lanamento de cultivares mais produtivas e adaptadas s diferentes
condies ambientais, bem como ao estabelecimento de populaes de
estirpes em solos previamente inoculados, faz-se necessrio uma cons-
tante busca por gentipos de Braclyrhizobiurn mais competitivos e eficien-
tes no processo de FBN. Para esta busca necessrio um prvio conhe-
cimento da diversidade genotipica existente em relao s estirpes de
Bradyrhizobiurn atualmente utilizadas nos inoculantes, assim como que-
las populaes existentes nos solos das regies cultivadas, as quais pas-
saram por um processo de seleo natural e adaptao.
O estudo comparativo entre genomas que diferem quanto eficincia e
competitividade na FBN constitui-se em uma estratgia importante para a
elucidao das bases genticas relacionadas a essas diferenas possibi-
litando, assim, uma busca mais eficiente por gentipos de desempenho
produtivo superior. O uso dos marcadores moleculares e os resultados

obtidos a partir do seqenciamento de genomas tm representado ferra-
mentas importantes utilizadas nos estudos de diversidade e caracteriza-
o genotipica de inmeros organismos. No gnero Bradyrhizobium exis-
tem muitos estudos de diversidade e caracterizao genotpica com o uso
de marcadores moleculares, constatando-se, em geral, variabilidade ge-
ntica elevada (Lilly et ai., 2001). Isso tambm foi constatado com estir-
pes de Bradyrhizobium isoladas no Brasil (Silva, 2003). A diversidade ob-
tida atravs desses marcadores pode ser utilizada na busca de seqnci-
as gnicas relacionadas s diferenas existentes quanto competitividade
e eficincia na FBN, sendo essas seqncias posteriormente caracteriza-
das. O Laboratrio de Biotecnologia dos Solos da Embrapa Soja possui
uma coleo com cerca de 1.500 isolados naturalizados, microssimbiontes
de soja, bem como 150 estirpes de Bradyrhizobium provenientes de di-
versas leguminosas hospedeiras. Visto que poucos laboratrios no mun-
do esto estudando bactrias deste gnero, bem como pela importncia
das mesmas na FBN, tanto para a cultura da soja, como para diversas
leguminosas nativas, torna-se estratgica a identificao de regies
gnicas relacionadas FBN, visando a busca de gentipos superiores
quanto eficiencia na FBN. Do mesmo modo, tambm importante iden-
tificar regies gnicas associadas competitividade e capacidade
saproftica das estirpes.
Objetivos
Identificar e caracterizar genes relacionados capacidade competitiva de

estirpes e a eficincia na FBN com a cultura da soja, tomando como mo-
delo estirpes de Bradyrhizobium japonicum.
Material e Mtodos
Foram utilizadas 17 estirpes de B.japonicum provenientes da coleo do

Laboratrio de Biotecnologia dos Solos da Embrapa Soja. Duas dessas
estirpes so consideradas parentais, SEMIA 586 e SEMIA 566 e as de-
mais so variantes naturais dessas estirpes, obtidas aps adaptao ao

solo, isto , vrios anos aps a inoculao do solo e cultivo da soja.
Foram desenvolvidas as seguintes atividades: Anlise da eficincia de
FBN das estirpes de B.japonicum escolhidas e inoculadas na soja; Ampli-
ficao por rep-PCR ("repetitive regions - polymerase chain reaction", com
os "primers" BOX-Al R e REP) dos DNAs das 17 estirpes de B. japon/cum;
PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphism", polimorfismo no
comprimento de fragmentos de restrio), dos genes ribossomais 16S
das 17 estirpes de B. japonicum; Agrupamento das estirpes B. japonicum
segundo niveis de similaridade obtidos com a aplicao das tcnicas de
rep-POR e PCR-RFLP dos genes ribossomais 16S.
Resultados
- Anlise da eficincia da FBN das estirpes de B. japonicum escolhidas e

inoculadas na soja
As plantas inoculadas com as 17 estirpes de B. japonicum foram avalia-
das quanto massa da parte area seca (MPAS), nmero de ndulos
formados na raiz (NN), massa dos ndulos secos (MNS), relao massa/
nmero de ndulos (MSN/NN), nitrognio total acumulado na parte area
(NTPA) e eficincia dos ndulos (NTPA/MNS). Os experimentos foram
realizados com trs repeties e as mdias agrupadas pelo teste de Tukey
(SAS, 1989). As estirpes de B. japonicum pertencentes ao mesmo
sorogrupo (sorogrupo SEMIA 566 ou sorogrupo SEMIA 586) no pude-
ram ser agrupadas com relao aos parmetros avaliados, pois dentro de
cada sorogrupo foram encontradas estirpes mais e menos eficientes, com
variaes significativas em todos os parmetros analisados (Tabela 1).
- Agrupamento das estirpes de B. japonicum segundo niveis de similari-
dade com base nos marcadores rep-PCR (com os "primers" BOX-A1R
e REP) e POR - RFLP dos genes ribossomais 165:
Os DNA5 das 17 estirpes de B.japonicum foram amplificados por POR
("polymerase chain reaction, reao em cadeia de polimerase") com o
uso do 'primer" BOX-A1R e REP. 0 gene ribossomal 165 foi amplificado
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por POR e o produto de amplificao submetido a chvagens com as

enzimas de restrio Hhal, Hpall e Ddel. De acordo com os perfis de
bandas apresentados, as estirpes foram agrupadas segundo nveis de
similaridade. Com base nos ndices de similaridade obtidos, com exce-
o das estirpes S 127 e CPAC 402, as estirpes pertencentes ao mesmo
sorogrupo (sorogrupo SEMIA 566 ou sorogrupo SEMIA 586) foram seme-
lhantes entre si, sendo possvel distinguir os dois grupos. J as estirpes S
127 e CPAC 402 apresentaram perfis de bandas distintos dos dois
sorogrupos, apresentando ndices de similaridade com as demais estir-
pes de 62,2% e 57,3%, respectivamente. Pelo seqnciarnento do gene
165, constatou-se que a estirpeS 127 pertence, na verdade, espcie B.
elkanii, enquanto a CPAC 402 uma estirpe de Sfnorhizobium sp. Desse
modo, o estudo sugere que ocorre transferncia lateral de genes de FBN
para rizbios nativos do solo, o que est sendo confirmado pelo uso de
outras tcnicas moleculares.
L1 1 34567091011121314151617
n
r
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Figural. Amplificao por BOX-A1R PCR dos DNAs das 17 estirpes de B.

japonicum. M - marcador de peso molecular (Ladder lKb plus); - 1 a 9:
estirpes do sorogrupo SEMIA 566: SEMIA 566 e suas variantes CPAC
15 e 3 127, 340, 370, 372, 478, 490, 516 respectivamente; 10 a 17:
estirpes do sorogrupo SEMIA 586: SEMIA 586 e suas variantes CPAC
7,390, 392, 394, 402, 403 e 404.
Consideraes Finais
As metodologias de amplificao do DNA por rep-PCR , com os "primers"

BOX-A1R e REP, bem como de PCR-RFLP dos genes ribossomais 165
com trs enzimas de restrio mostraram-se eficientes em estudos de
diversidade gentica, identificao de estirpes e monitoramento de estir -
pes de Bradyrhizobiurn no solo.
Agradecimentos
Projeto financiado parcialmente pelo CNPq 30124112004-0,40071012004-

8) e pelo PRONEX. Os autores agradecem a Ligia Maria O. Chueire pelo
apoio na conduo das anlises.
Referncias
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de Londrina, Londrina.
Seleo de substrato artificial para

ao de percevejos-pragas da soja
Flvia Augusta Cloclet da Silva 1 ; Antonio Ricardo Panizzi 2 Bolsista de mestrado

. 1
da CNPQ na Embrapa; 2 Embrapa Soja.
Introduo
Percevejos da familia Pentatomidae so considerados as principais pra-

gas da soja, Glycine max (L.) Merrili (Fabaceae), no Brasil. Estudos sobre
o comportamento reprodutivo desses insetos podem auxiliar no desen-
volvimento de mtodos de controle, alm de dar suporte ao aprimora-
mento de tcnicas de criao massal em laboratrio.
Vrias tentativas tm sido feitas para se criar percevejos em laboratrio,

utilizando-se dietas naturais (Sailer, 1952; Kobayashi, 1978: Kadosawa &
Santos, 1980; Harris & Todd, 1981) ou dietas artificiais (Schell etal. 1957;
Jensen & Gibbens, 1973; Kamano, 1980). Entretanto, na criao artificial
de insetos, alm da questo relacionada dieta, h necessidade de se
testar substratos artificiais para postura que, associados dieta, podem
permitir maiores avanos na tcnica de criao de percevejos.
Em estudos com o percevejo verde, Nezara viridula, foi demonstrado que

possvel utilizar modelos artificiais como substrato para oviposio, alm
desta metodologia apresentar facilidades no manuseio (Panizzi et aL,
2000).
Outra alternativa o uso de extratos de plantas, obtidos a partir de folhas

ou vagens de soja, que aplicados em substratos artificiais, mostram-se
eficientes no condicionamento da oviposio de percevejos (Panizzi et
al., 2004). Entretanto, preciso esclarecer melhor o efeito dos extratos de
plantas de soja no comportamento da oviposio dos percevejos em
substratos artificiais.
Os modelos artificiais visam substituir o ambiente natural, representando

um suporte valioso, principalmente para programas de pesquisa em con-

trole biolgico (Parra, 1992). Assim, o desenvolvimento de um substrato
artificial, capaz de receber grandes quantidades de ovos de percevejos,
facilitar a produo massal de parasitides de ovos, contribuindo para o
controle biolgico de percevejos da soja.
Visando aprimorar as tcnicas de criao massal de percevejos-pragas

da soja, este trabalho objetiva estudar o comportamento de oviposio
dos percevejos Euschistus heros (F.), Nezara viridula (L.) e Piezodorus
guildin(West.), em substratos artificiais, e avaliar a ao de extratos qu-
micos de plantas de soja aplicados nestes substratos, condicionando a
oviposio dos percevejos.
A pesquisa est sendo conduzida no Laboratrio de Bioecologia de Per-

cevejos da Embrapa Soja, localizada no municipio de Londrina, PR, e
ser desenvolvida entre maro de 2005 e janeiro de 2009. Para os testes
com substratos artificiais sero comparadas diferentes caractersticas f-
sicas como: textura, tamanho, forma e cor. Nos testes com caractersticas
qumicas, sero comparadas diferentes concentraes de extratos de
vagem de soja.
HARRIS, V.E.; TOOD, J.W. 1981. Rearing the southern green stink bug,
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Diversidade de rizbios que nodulam o

feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.)
sob diferentes sistemas de manejo de solo
em Campo Belo do Sul, SC
Glaciela Kaschuk 1 ; Julio C.P. Santo5 3 ; Joo F. Berton-Junior 4 ; Mariangela

'2
Hungria 1 Embrapa Soja; 2 ooutoranda sanduche da Wageningen University,

. 1
Holanda; 2 Prof. UDESC, Lages, SC; 3 Mestrando em Cincia do Solo, UDESC.
Introduo
Pouco se conhece sobre a dinmica de populaes microbianas da

rizosfera, especialmente nos trpicos, embora j existam diversas e mo-
dernas tcnicas laboratoriais disponveis para a conduo desses estu-
dos. A diversidade de grupos de microrganismos na rizosfera, por exem-
plo, rizbios, poderia representar um bom indicador de qualidade do
solo, porque estes respondem rpida e sensivelmente s mudanas
ambientais do solo e esto presentes em grande densidade de popula-
o. Alm disso, o maior conhecimento do efeito dos sistemas de mane-
jo do solo sobre as variaes populacionais dos rizbios pode contribuir
para o delineamento de estratgias para incrementar a fixao biolgica
de nitrognio (FBN), processo biolgico fundamental produo vege-
tal sustentvel. Torna-se essencial verificar, particicularmente em condi-
es tropicais, o efeito do manejo do solo na diversidade microbiana,
bem como se alteraes na diversidade resultam em maior susten-
tabilidade agricola.
Objetivos
Caracterizar genet[icamente rizbios microssimbiontes de feijoeiro em re-

as de plantio direto (PD), plantio convencional (PC) e campo nativo (CN)
de Santa Catarina.
72 Embrapa Soja, Documentos, 268
Material e Mtodos
As amostras de solo foram coletadas em reas sob PD, PC e CN em uma

propriedade rural de Campo Belo do Sul, SC. A rea de PD foi cultivada
com feijoeiro (Phaseo/us vu/garis) e soja (G/ycine max), inoculados peno-
dicamente, por 20 anos, sendo os ltimos 10 anos sob PD. O teor de
nutrientes foi corrigido e o pH foi ajustado para 5,5, segundo anlise de
solo. A rea de PC foi explorada com agricultura por trs anos. O pH tam-
bm foi corrigido para 5,5, entretanto, o solo ainda apresentava algumas
limitaes de nutrientes, pois as produtividades foram inferiores quelas
obtidas no PD. Ambas as lavouras foram originalmente implantadas so-
bre o CN e receberam todos os tratamentos fitossanitrios necessrios. A
rea de CN vinha sendo utilizada com pecuria extensiva, sem fertilizan-
tes ou implantao de leguminosas, apenas manejada com uso de fogo
no inverno. O solo de cada rea foi diludo sucessivamente at a diluio
de 10. Uma alquota de 1 mL dessa diluio foi, ento, inoculada sobre
sementes de feijoeiro (cv. Prola), previamente desinfestadas, para o plan-
tio em areia esterilizada. As plantas foram cultivadas em casa de vegeta-
o por 30 dias e coletadas para retirada dos ndulos. Ndulos foram
escolhidos aleatoniamente e os rizbios foram isolados (Vincent, 1970).
O DNA das bactrias foi extrado a partir de culturas puras de rizbios
em meio YMA, segundo procedimento otimizado (Kaschuk, 2003). O
DNA foi amplificado pela tcnica de PCR com o "primer" BOX-Al R (5'-
CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3') (Versalovic et ai., 1994) e os
seus produtos foram submetidos eletroforese em gel de agarose a
1,5% por 6 horas. Em seguida, o gel foi corado com brometo de etdio
(0,00005%), observado em transluminador UV e fotografado. Essa tc-
nica verificou a variabilidade gentica em nvel de estirpes. O
pohmorfismo foi analisado usando o programa Bionumerics (Applied
Mathematics, Blgica) com o algoritmo UPGMA, o coeficiente de
Jaccard e tolerncia de 2%.
O DNA tambm foi amplificado com 'primers" que codificam a regio do

gene ribossomai 16S rRNA: Y1 (5'-TGGCTCAGAACGAACGCGTGGCGGC-
3') e '(3 (3'-CTGACCCCAACTTCAGCAUGTTCCAT-5'). Os produtos
dessas amplificaes foram submetidas metodologia de RFLP-PCR
Jornada acadmica da Em/rapa Soja 73
(Laguerre et al.,1994), com as seguintes enzimas de restrio: Cfol; HintI,

Mspl, Rsal e Mbo!. Os fragmentos obtidos foram aplicados em gel de
agarose a 3% e corridos em sistema de eletroforese a 120 V durante 4
horas. O polimorfismo foi analisado visualmente e uma letra diferente foi
dada a cada perfil distinto, agrupando-se os perfis semelhantes em um
mesmo grupo de espcie.
A comparao da diversidade de estirpes foi realizada pela distino de
perfis BOXA1 R a 70% de similaridade e pelo clculo dos ndices de diver-
sidade, H' (Shannon & Weaver, 1949), de riqueza gentica, RI (Margalef,
1958) e de equidade, E (Pielou, 1977). Tambm foi construda uma curva
acumulativa dos perfis para anlise comparativa da variabilidade.
As estirpes utilizadas como referncia foram CIAT 899 (Rhizobium tropici
Tipo llB), CEN 299 (R. tropiciTipo lIA), CFN 42 (R. eU'), PRF 81 (R. tropici),
H 152 (R. giardinhi bv. gallicum) e R 602 (/R. gal/icum bv. gailicum).
As tcnicas moleculares demonstraram grande diversidade gentica de

rizbios microssimbiontes do feijoeiro nos solos estudados. Pela amplifica-
o do DNA por BOX Al R - POR foram obtidos 35 perfis das estirpes iso-
ladas do PD, 36 do PC e 20 do CN. Essas amplificaes resultaram em um
grau elevado de polimorfismo entre as bandas das trs reas de origem.
Os dendrogramas demonstraram que as bactrias apresentavam baixa si-
milaridade entre si. As estirpes dos dendrogramas do PD, PC e ON foram
agrupadas em nveis de similaridade de apenas 17, 23 e 36% respectiva-
mente (dados no mostrados). Poucas bactrias assemelharam-se s es-
tirpes utilizadas como referncia e a maioria apresentou perfil nico.
Os perfis com 70% de similaridade na anlise de BOX Al R - POR foram
agrupados e uma estirpe representante de cada grupo foi escolhida para
a anlise de RFLP-PCR da regio i6S rONA. Foram analisadas 24 estir-
pes de cada sistema de plantio e 12 do CN. Uma grande variedade de
perfis foi observada, forte indicativo de diversidade gentica elevada, bem
como de vrias espcies novas, ainda no estudadas.
74 Embrapa Soja, Documentos, 268
A diversidade gentica elevada observada um fade indicativo de que

muitas espcies de rizbios dos solos tropicais ainda no foram descri-
tas. Esta situao j havia sido diagnosticada anteriormente (Grange &
Hungria, 2004). A escolha da simbiose com feijoeiro provou ser um exce-
lente modelo para estudos de diversidade rizobiana nos solos tropicais. A
alta diversidade , provavelmente, relacionada natureza promscua do
hospedeiro, que se associa a uma grande diversidade de rizbios (Michiels
et aI., 1998).
Os ndices de diversidade obtidos com os perfis de BOX Al R - PCR fo-
ram semelhantes nos sistemas PD (H=2,96, R1=6,47 e E=0,93) e PC
(H'=3,02, R1=6,42 e E=0,95), contudo, foram inferiores no CN (H'=2,35,
R1=3,67 e E=0,94). Os ndices calculados com os perfis de RFLP - PCR
da regio do 16S rRNA evidenciaram diferenas de diversidade entre o
PD (H'=3,12 e R1=6,92) e as demais reas (PC: H=2.86 e R1=5.59; CN:
H'2.09 e R1=3.21). O nmero acumulado de perfis indicou maior variabi-
lidade gentica no grupo de estirpes provenientes do PD e menor no gru-
po do ON, em ambas as comparaes (estirpes com BOX Al R - POR e
espcies com RFLP - POR) (Fig. i).
25 - . Plantio direto 25 - - - Plaittio direto

Plantio convencional Plantio convencional
20 Qtnpo nativo - siro nativo -
20
--- ,
IS
E Nu,,'cro,Iecstn1ws
T N ,,,e ro de es ti, o
Figura 1. Diversidade acumulada em funo do nmero de rizbios de feijoeiro

avaliados e dos perfis obtidos com as tcnicas de BOXAIR - PCR eu
RFLP - PCR da regio lOS rDNA em reas de lavoura de Campo Belo
do Sul, SC sob os sistemas de plantio direto (PD), plantio convencional
(PC) e campo nativo (CN).
Jornada acadmica da Embrapa Soja
Consideraes Finais
Neste estudo, a diversidade gentica de rizbios microssimbiontes do

feijoeiro foi superior no sistema PD, quando comparada ao sistema PC a
ao CN. Os benefcios do PD em relao ao PC, em vrios parmetros
microbiolgicos, tem sido evidenciado (Hungria & Vargas, 2000) e os
menores valores observados no CN resultam do manejo inadequado com
fogo no inverno. A maior diversidade microbiana importante por garantir
que as funes dos microrganismos do solo sejam preservadas no ambi-
ente, representando um "efeito tampo". Os resultados indicam, ainda, a
viabilidade de utilizar a diversidade gentica de rizbios com um indica-
dor da qualidade do solo.
Agradecimentos
Projeto parcialmente financiado pela Fundao Araucria (convnio 0461

2003) e pelo CNPq (30124112004-0).
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.
Jornada acadmica da Emb,apa Soja 77
Estudos da distribuio de percevejos,

na planta de soja
Heuen Cristina Romagnolo Pereira'; Beatriz S. Corra-Ferreira 2 1Estagiria

.
da Embrapa Soja; 2 Embrapa Soja.
Introduo
A soja desponta, cada vez mais, como um produto rentvel, apesar dos
altos custos para cultiv-la e dos srios problemas enfrentados em fun-
o da presena de elevadas populaes de percevejos-pragas, presen-
tes nas lavouras.
Os percevejosfitfagos (Ordem Hemiptera), podem diminuir drasticamente
a produo gros, por se alimentarem dos mesmos, na fase de desenvol-
vimento e maturao, e inviabilizar a produo de sementes das lavouras
atacadas (Vilias Boas etal., 1985).
As espcies mais abundantes so: Euschi.stus heros (Fabricius),
Piezodorus gui!dinhi (Westwood) e Nezara viridu!a (Linnaeus), embora
vrias outras tambm possam ser encontradas, em populaes menores.
Durante seu desenvolvimento, os percevejos passam pelas fases de ovo,
ninfa, composta de cinco instares, e fase adulta.
Na planta de soja, os percevejos se deslocam para extratos mais ou me-
nos expostos ao sol, em funo dos diferentes horrios do dia, observan-
do-se diferenciao no comportamento das ninfas e dos adultos. O co-
nhecimento dessa distribuio fundamental para que as medidas de
controle adotadas sejam mais eficientes.
Os danos soja so causados, principalmente, por ninfas do 3 0 ao 5 0
instar e por adultos, sendo provocados pela introduo do aparelho bucal
nas sementes.
A cultura da soja colonizada pelos percevejos, a partir da pr-florao,
alcanando o nivel mximo durante o periodo de enchimento de gros.
78 Ernbrapa Soja. Documentos, 268
Aps a maturao da soja, eles se deslocam para espcies de plantas

hospedeiras (Panizzi & Slansky, 1985) que lhes fornecem alimento ou
apenas refgio (Panizzi, 1985).
Objetivos
Com o objetivo de se conhecer a distribuio dos diferentes instares de

desenvolvimento dos percevejos, na planta de soja, foi desenvolvido este
trabalho, a nvel de campo.
Materiais e Mtodos
O trabalho foi realizado na Fazenda Experimental da Embrapa Soja, na

safra 2004105, durante o ms de maro, em lavoura de soja com plantas
na fase de enchimento de gros maturao.
Em cada data de amostragem, foi selecionado, ao acaso, um metro de
fileira de soja. Essa unidade amostral foi dividida, com o auxlio de bar-
bante e estacas de ferro, em trs extratos: superior, mediano e inferior.
As unidades amostrais foram escolhidas, tanto na bordadura como no
centro da lavoura, e realizadas em dez repeties. As leituras foram rea-
lizadas pela manh, num perodo mais fresco (8h15' - 9h15') e a tarde
(13h15' - 14h15') anotando-se a posio das massas de ovos, das
ninfas e dos adultos das diferentes espcies de percevejos.
As espcies presentes na rea amostral foram: E. heros (79,8%), P gui/dinii

(12,1%), N. viridula (5%), Edessa meditabunda (1,9%), Thyanta perdidor
(0,9%) e Dichelops me/acanthus (0,3%).
Pelos resultados obtidos, constatou-se que a distribuio dos ovos e das
diferentes fases de ninfas foram diferentes nas trs partes da planta.
Nas unidades amostrais, constatou-se uma predominncia de massas de
ovos de E. heros, onde 54,9% estavam presentes nas vagens e 45,1%

nos foliolos, tanto na face superior como inferior.
Observou-se que as ninfas de primeiro e segundo instar predominaram

na parte mediana da planta, tanto no perodo matutino como no vesperti-
no. Na parte inferior das plantas foram observadas poucas ninfas, o que
pode ser explicado pelas poucas folhas e vagens na regio inferior da
planta (Tabela 1), nessa fase de desenvolvimento da cultura da soja.
Tabela 1. Ocorrncia mdia (%) de adultos e ninfas de diferentes espcies

de percevejos, encontrados em plantas de soja, no municpio do
Londrina, PR, 2004/05.
Perodo Extrato Adultos Ninfas1-2 Ninfas3-5
Superior 20 16,7 36,9

Manh Mediana 73,3 65,7 50
Inferior 6,7 17,6 13,1
Superior 49,1 9,6 25,7

Tarde Mediana 49,1 63,5 65,7
Inferior 1,8 26,9 8,6
Comportamento semelhante foi observado com as ninfas de terceiro ao

quinto nstar, que tambm distriburam-se em maior quantidade na parte
mediana, em relao s outras partes da planta. Observou-se, tambm,
uma freqncia maior de adultos na parte mediana da planta, encontran-
do-se 73,3% no perodo da manh e 49,1% no perodo da tarde. Um n-
mero expressivo da populao tambm foi observado na regio superior
da planta (20% e 49,1%, respectivamente) (Tabela 1).
Mais estudos da distribuio dos percevejos na planta de soja esto em

andamento e novas observaes sero realizadas na safra 2005106.
PANIZZJ, A.R. Seba.stiana acu/cata: nova planta hospedeira de

Piezodorus guildinli no Paran. Pesq. Agropec. Bras. 20(1 0):1 237-1 238,
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Diversidade de estirpes de
Bradyrhizobium japonicum e
Bradyrhizobium elkan!i estabelecidas por
inoculao em solos dos cerrados
Jesiane Stefnia da Silva Batista 12 ; Fernando Gomes Barcellos 3 ; Pmela

Menna' 2 leda Carvalho Mendes 4 ; Mariangela Hungria". 'Ernbrapa Soja; 2 UEL;
;
3 Bolsista CNPq; 4 Embrapa Cerrados.
Introduo
A fixao biolgica de nitrognio (FBN), considerada a principal via de in-

corporao do N 2 biosfera, um processo realizado por certos organis-
mos procariontes, dentre os quais bactrias da ordem Rhizobiales, que
estabelecem uma relao simbitica atravs da formao de estruturas al-
tamente especializadas, denominadas ndulos, nas razes de algumas plan-
tas, principalmente da famlia Leguminosae. Nos ndulos, ocorre a conver-
so do N 2 atmosfrico amnia, pelas bactrias, que incorporada em
diversas formas de N orgnico para a utilizao pela planta hospedeira.
Bradyrhizobiumjaponicum e B. elkanhi so bactrias do solo simbiontes
de plantas leguminosas, dentre as quais a soja (Glycine Max (L.) Merr.),
cultura de extrema importncia para a balana comercial brasileira e, tam-
bm, por desempenhar um papel relevante na nutrio da populao.
Os solos brasileiros so, originalmente, livres de microssimbiontes da soja,
,tornando necessria a inoculao de sementes no estabelecimento des-
sa cultura no pais, utilizando estirpes selecionadas. A independncia de
fertilizantes nitrogenados uma das principais vantagens da cultura de
soja no Brasil, pois, ao contrrio do que freqentemente ocorre em alguns
outros pases desenvolvidos, como nos E.U.A., as bactrias introduzidas
via inoculao conseguem se estabelecer nos solos e suprir as necessi-
dades de N da planta de modo mais barato, efetivo e ambientalmente
seguro.
82 Em/rapa Soja. Documentos, 268
Quatro estirpes so recomendadas para utilizao em inoculantes comer-

ciais para a cultura da soja no Brasil: CPAC 15 (= SEMIA 5079, 566A) e
CPAC 7 (SEMIA 5080) da espcie B. japonicum e SEMIA 587 e SEMIA
5019(29W)da espcie B. elkanll ( Chueire etaL, 2003). O Brasil possui
legislao especifica para o controle de qualidade de inoculantes, que de-
vem apenas possuir estirpes recomendadas por um comit de microbio-.
logistas. Essa recomendao leva em considerao a efetividade no pro-
cesso da FBN, bem como a habilidade competitiva e a persistncia das
estirpes no solo, que so fatores primordiais para o sucesso da inoculao.
Objetivos
Caracterizar a diversidade gentica de estirpes de 8. japonicum e B. e/kanii

reisoladas da regio dos Cerrados, aps introduo em solo originalmen-
te isento de bactrias capazes de estabelecer simbiose efetiva com a
soja.
Material e Mtodos
- Isolamento e crescimento das estirpes
Mendes ei ai. (2004) conduziram experimento de campo na Embrapa

Cerrados, em Planaltina, DE, com a finalidade de estudar a dinmica de
ocupao dos ndulos e a eficincia de FBN das estirpes recomendadas
para a cultura da soja no Brasil. A Tabela 1 apresenta os tratamentos do
ensaio, que foi conduzido com quatro repeties.
No sexto ano do experimento, foi realizado o reisolamento das estirpes a
partir dos ndulos da soja (cultivar Doko) em meio de cultura slido YM
(manitol, 5,0g; K2 HPO4 0,59; NaCI, 0,19; MgSO 7 H 2 0, 0,2g; extrato de
levedura, 1,0g; agar, 12g/L) acrescido de vermelho Congo 1% e azul de
bromotimol 0,5% e caracterizao sorolgica das mesmas.
- Extrao do DNA
Aps o crescimento em meio liquido YM, as suspenses bacterianas fo-
ram centrifugadas, sendo o sobrenadante descartado e as clulas
Tabela 1. Tratamentos de inoculao conduzido em regio isenta de

estirpes capazes do estabelecer simbiose efetiva com a soja, em
solos dos Cerrados.
Tratamentos
1 Ano 20 Ano 30 Ano 4 Ano 50 Ano 6 Ano
SI CPAC 7 SI SC SI
CPAC 7 CPAC 7 CPAC 7 SI SC SI
CPAC15 CPAC7 SI SC SI
SI CPAC 7 SI SC SI
CPAC15 CPAC7 CPAC7 SI SC SI
SI CPAC7 SI SC SI
SI CPAC7 CPAC7 SI SC SI
SI: sem inoculao; sc: sem cultivo. No primeiro ano, as parcelas que no receberam inolante
foram cultivadas com arroz, cultivar Rio Paranaiba.
bacterianas lavadas com soluo salina (NaCI 0,85%), resuspensas em

TE 50120, tratadas com SDS 10%, proteinase K, lisozima e RNA5e e incu-
badas a 37C por cerca de uma hora. Aps a incubao, foram acresci-
dos NaCI 5M e AcONa 51M, seguido de um perodo de repouso a 4C,
antes da centrifugao por 15 minutos a 12.000 rpm; o sobrenadante foi
recolhido e acrescido de etanol absoluto. Por fim, as amostras foram ar-
mazenadas por uma noite a -20C, sendo o etanol posteriormente des-
cartado e o precipitado resuspenso em TE 10/1. As amostras foram sub-
metidas eletroforese em gel de agarose 1%, para a determinao da
concentrao e da pureza do DNA.
- Perfil de PCR-RFLP do gene 163 rRNA
O DNA de cada amostra foi submetido reao de PCR ("polimerase
chain reaction") com a finalidade de amplificar a regio especfica do gene
16S rRNA que possui, aproximadamente, 1.500 pares de bases. Uma
soluo mix" foi preparada para a reao de amplificao, consistindo de
dNTPs (0,3mM de cada base), tampo 1OX, MgC, Taq DNA polimerase
e os "primers" fDl (5' cgaattcgtcgacaacAGAGTTTGATCCTGGCTCAG
84 Emb,'apa Soja. Documentos, 268
- 3') e rol (3' cCcgggatccaagcttAAGGAGGTGATCCAGCC - 5'). O re-

sultado da amplificao foi verificado atravs de eletroforese em gel de
agarose 1%.
Para a verificao de polimorfismo do gene 163 rRNA, os produtos de
PCR foram digeridos com as seguintes enzimas de restrio: /-thal (5' -
GCGIC 3'; 3' CIGCG 5'), HpaII (5' C/CGG 3'; 3' GGCIC 5') e
Ddel ( 5' - C/TNAG 3'; 3' C/GCG 5'). Para cada reao, o volume de
reagentes utilizado foi de 0,5m1_ de enzima (1OU/mL), lmL de tampo
especifico, 6mL do produto de PCR e 2,5mL de gua mili-O estril, segui-
do de incubao a 37C em termociclador pelo tempo recomendado pelo
fabricante. Os fragmentos foram separados por eletroforese em gel de
agarose a 3%; os gis foram fotografados aps a colorao com brometo
de etidio, para anlise dos perfis obtidos utilizando o programa
BioNumerics, (Applied Mathematics, Blgica), juntamente com os padres
de outras estirpes significativas.
Foram reisoladas, no sexto ano do experimento, 263 estirpes, a partir dos

ndulos da soja das parcelas que receberam inoculantes com estirpes de
B. japonicum. Atravs de comparao dos padres de restrio do gene
163 rRNA das estirpes reisoladas com as estirpes padres, foi possvel
constatar que 62,73% das estirpes eram pertencentes ao sorogrupo da
CPAC 15, confirmando a elevada habilidade competitiva e saprofitica dessa
estirpe, que tambm caracterizada por seus elevados ndices de N 2
fixado, enquanto 11,02% das estirpes foram classificadas como perten-
centes ao sorogrupo da CPAC 7. Alm disso, 23,19% das bactrias isola-
das foram classificadas como B. e/kanit Tal ocorrncia pode ser atribuida
a provveis contaminaes durante o experimento.
Os padres de restrio obtidos pela digesto com as trs enzimas utili-
zadas foram suficientes para permitir a identificao das espcies das
estirpes reisoladas, bem como a distino entre estirpes pertencentes a
diferentes sorogrupos de B. japonicum , O mesmo no possvel para dis-
tinguir sorogrupos de B. e/kanll, pois, devido conservao das seqn-
cias de 16S rRNA, esse mtodo pode ter limitaes na identificao

intraespecifica.
Notavelmente, sete das estirpes reisoladas (o que corresponde a 2,66%
do total) apresentaram padres de restrio discrepantes em relao aos
padres de B. japonicum e B. elkant, visto que o solo era isento de bact-
rias capazes de estabelecer simbiose com a soja, anlises mais refinadas
dessas estirpes devem ser conduzidas para sua caracterizao.
Algumas bactrias apresentaram padro de PCR-RFLP do gene 16S rRNA
no condizente com a caracterizao sorolgica, que uma metodologia
rotineira de identificao, em muitos casos indicando diferentes espcies
nas anlises realizadas. Perfis genotpicos contrastantes com os perfis
sorolgicos de rizbios j haviam sido relatados por Santos et ai. (1999).
Hipteses como a ocorrncia de rearranjos genmicos e a transferncia
lateral de genes simbiticos e de fixao de estirpes inoculadas para bac-
trias nativas podem explicar a diversidade desse organismos.
Consideraes Finais
Uma porcentagem significativa das estirpes de Bradyrhizobium simbiontes

da cultura da soja sofre alteraes morfolgicas, fisiolgicas e genticas
poucos anos aps a introduo, via inoculao, nos solos. Essas altera-
es devem ser monitoradas e compreendidas, para verificar os efeitos
dessa nova populao na contribuio da fixao biolgica do nitrognio.
Agradecimentos
Projeto financiado parcialmente pelo CNPq (30124112004-0 e 4007101

2004-8).
Referncias
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rfl Embrapa Soja. Documentos, 268
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Anlise sensorial descritiva de

extratos de soja em p
Josemeyre Bonifcio da Silva 1 ; Ilana Felberg 2 ; Sandra Helena P. Perreira 3

;
Mercedes Concrdia Carro-Panizzi 4 ; Soo Young Lee 5 Mestranda em

. 1
Tecnologia de Alimentos, UEL; 2 Ernbrapa Agroindstria de Alimentos; 3UEL;

4 Embrapa Soja; 5University of Illinois, USA.
Introduo
Um dos fatores que limitam a introduo e adoo direta da soja na dieta

ocidental devido aos sabores indesejveis presentes nesta leguminosa.
Os sabores de "feijo" cru ou rano provavelmente, resultam da ao das
enzimas lipoxigenases que catalisam a hidroperoxidao de cidos graxos
livres pokinsaturados principalmente, os cidos linoiico e linolnico, for-
mando os hidroperxidos; estes se decompem em aldeidos, cetonas,
cidos e outros produtos secundrios ou no, responsveis pelos sabo-
res caracteristicos da soja e de seus produtos (AXEROLD et ai., 1981). J
o gosto amargo e a adstringncia so causados pelas saponinas
(SHIRAIWA et ai., 1991) e pelas isofiavonas (CARRO-PAN1ZZI et ai.,
1999). Tambm, tem sido observado que a soja apresenta um sabor ine-
rente e diferenciado para cada gentipo (PAN1ZZI, 1985), como ocaso
da soja tipo hortalia que possui sabor mais suave do que a comercial.
Vrios processos tecnolgicos tm sido propostos para inativar as enzimas
lipoxigenases diminuindo assim, os sabores indesejveis da soja. Porm,
a eliminao gentica destas enzimas pode contribuir para o desapareci-
mento destes sabores (TORRES-PENARANDA et aI., 1998). Para dimi-
nuir o desenvolvimento de compostos no volteis causados pela pre-
sena de isofiavonas, alguns autores propem o tratamento em gua fer-
vente contendo bicarbonato de sdio, para inativar as 2-glicosidases, per-
mitindo a obteno de extrato solvel de soja com gosto mais agradvel.
Na anlise sensorial descritiva os provadores utilizam um vocabulrio
comum na caracterizao dos produtos, porm, h uma grande dificuida-
de em descraver os atributos para produtos de soja conduzindo assim, a

uma variedade de termos descritores como cru, capim, tinta, adstringente,
entre outros. N'KOUKA et aI. (2004) desenvolveram um vocabulrio de
termos descritores para extratos de soja, com o intuito de facilitar a descri-
o das caractersticas sensoriais do produto. Assim, o objetivo deste tra-
balho foi descrever sensorialmente extratos de soja comerciais e produzi-
dos em laboratrio a partir de cultivares desprovida de lipoxigenases e
convencional e de uma linhagem tipo hortalia, conforme o dicionrio de
termos descritores desenvolvido por N'KOUKA et aI. (2004).
Material e Mtodos
Preparo dos extratos

Para o preparo dos extratos de soja em p utilizaram-se gros da cultivar
convencional BRS 133, cultivar BRS 213, desprovida das isoenzimas
lipoxigenases 1, 2 e 3 e da linhagem BRM94 52273, obtida do cruzamen-
to entre um cultivar comercial e uma cultivar tipo hortalia, fornecidos pela
Embrapa Soja, Londrina/Paran. Os extratos foram produzidos conforme
metodologia proposta por FELBERG et al.(2004), na Embrapa
Agroindstria de Alimentos, no Rio de Janeiro. Tambm, foram utilizados
dois extratos de soja em p comerciais adquiridos em um supermercado
de Londrina/Paran.
- Anlise Sensorial Descritiva
Nove provadores da Universidade de Illinois em Urbana-Champaign, EUA,
foram selecionados aps, executarem um teste de reconhecimento de
gostos bsicos e um para o reconhecimento da soluo de n-propil-tiouracil
e de sua intensidade. O levantamento dos atributos sensoriais foi realiza-
do com o auxlio do dicionrio de termos descritores para extratos de soja
em p desenvolvido por N'KOUKA et ai. (2004). Aps, vrias sesses em
grupo e consenso entre a equipe sensorial, chegou-se a lista final dos
atributos descritores: gosto amargo, adstringente e doce; aroma nasal e
textura de amido; recobrimento da boca e densidade; aroma nasal de
gro cozido, de soja tostada, de algodo doce, de peixe, de rano e de
sementes de gergelim; aroma retronasal de soja tostada, de gro cozido,

de sementes de gergelim e de malte. Para o treinamento, os provadores
realizaram duas sesses com a lista de atributos por eles gerada e com
as amostras de referncia e, ento, seguiu-se para avaliao das amos-
tras em cabines individuais.
- Anlise Estatistica
O delineamento experimental foi o de blocos completos casualizados, com
5 amostras de extratos de soja, 9 provadores e 2 repeties. Os resulta-
dos do estudo foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) e ao
teste E ajustado considerando como fonte de variao as amostras para
os atributos que apresentaram valores obtidos entre amostras x provadores
significativos (STONE & SIDEL, 1993). Tambm, foi conduzido o teste
(LSD) de comparao de mdias para os atributos cujos valores calcula-
dos de F amostras e Famostras ajustado eram significativos. Uma Anlise de Com-
ponentes Principais (ACP) foi realizada considerando-se os atributos que
apresentaram valores obtidos de Famostras e Famostras ajustado significativos.
Resultados
Os resultados da anlise de varincia (ANOVA) indicaram diferenas en-

tre a interao amostras x provadores para os atributos: aroma nasal de
amido, de soja tostada, de rano, de algodo doce, de sementes de
gergelim e de peixe; aroma retronasal de soja tostada, de sementes de
gergelim e de malte; gosto adstringente e doce. Foi ento, conduzido o
teste F ajustado para estes atributos que mostrou, diferenas estatsticas
entre as amostras para aroma nasal de soja tostada, de rano, de semen-
tes de gergelim e de peixe; aroma retronasal de soja tostada, de semen-
tes de gergelim e de malte e gosto amargo. Aps o teste tambm, foi
verificado que os atributos aroma nasal de amido e adstringncia perma-
neciam idnticos entre as amostras. O teste t (LSD) foi conduzido para
verificar as diferenas entre as amostras. No foi encontrada diferena
entre os extratos produzidos em laboratrio para os atributos aroma nasal
de gro cozido, de soja tostada, de rano, de algodo doce, de sementes
de gergelim e de peixe; aroma retronasal de gro cozido, de soja tostada,
de sementes de gergelim e de malte. Estes extratos apresentaram maior

intensidade para o aroma nasal de gro cozido e de algodo doce; aroma
retronasal de gro cozido e de malte. Os extratos comerciais 1 e 2 diferi-
ram dos extratos obtidos das cultivares e da linhagem por apresentarem
maior intensidade dos atributos aroma nasal de soja tostada, de rano, de
sementes de gergelim e de peixe. O extrato comercial 2 mostrou-se dife-
rente de todos os demais extratos em estudo e manifestou maior intensi-
dade para os atributos aroma retronasal de soja tostada e sementes de
gergelim. Os extratos comerciais 1 e 2 foram caracterizados pela maior
intensidade de gosto amargo e menor intensidade para gosto doce que
os extratos produzidos em laboratrio. No foi observada diferena entre
o extrato comercial 2 e os extratos da cultivares para o atributo relativo
densidade. Quanto textura de amido, o comercial 2 no diferiu do extra-
toda linhagem tipo hortalia. A anlise de componentes principais foi rea-
lizada para os atributos sensoriais que apresentaram Famostras e Famostras ajus-
tado significativos. Na Figura 1 A est apresentada a projeo dos atribu-
tos sensoriais sobre o plano fatorial (CPI x CPll) e na Figura 1 B, a proje-
o das amostras de extratos de soja. O primeiro componente principal
(CPI) explicou 80,58% da variao total existente entre as amostras, e o
segundo componente principal (CPII) explicou 10,99%, totalizando 91,57%
de explicao. A porcentagem de 80,58% da variabilidade entre as amos-
tras, explicadas no primeiro componente principal (CPI), so devido ao
fato das amostras variarem em relao aos atributos aroma nasal de gro
cozido, de soja tostada, de rano, de sementes de gergelim, de algodo
doce e de peixe; aroma retronasal de gro cozido, de soja tostada, de
sementes de gergelim e de malte, gosto doce e amargo e textura de ami-
do. A variabilidade explicada no segundo componente principal (CPII),
devido variao entre as amostras com relao ao atributo densidade.
Na Figura 1 B, cada amostra de extrato de soja foi representada por um
losngulo (Al, A2, A3, A4 e A5). Quando as repeties da avaliao de
cada amostra esto prximas, significa que houve boa repetibilidade da
avaliao. Somente a avaliao da amostra do extrato de soja da cultivar
BRS 133 (A21 e A22), no apresentou boa repetibilidade. As amostras
localizadas mais esquerda na Figura 1 B (extratos de soja obtidos em
laboratrio), apresentaram maior intensidade dos atributos aroma nasal
Jornada acadmica da Embrapa 50/a 9,
(A) Legenda
1,0
Arcin a nasal: 1 qrao cozid-o: 2 soja

tonilada: 3 = ranno: 4 serrieniles de
0,5
gergelim,; 5 = peixe: O algodo de.
Aroma retrornasal: 7 = gro cozido; O =
soja tostada: 9 = sementes de gergelim;
0.0
10 = malte
Goalcnconii prendedon de nariz. 11
e)
amargo.
Gosto: 12 = amilargo: 13 = doce.
o
'o Textura: 14 = densidade; 15 = amido.
'a
5,0
0,0 0,5 5,0
CP 1: 80,58%
03
A41 (8) Legenda

02
042
Ali e Al2 - cultivar 00.5213, repetiao 1
0I e2
.032
A21 e A22 - cultivar 00.5 133. repetio 1
cc e2
052
o
'V
A31 e A32 - linhagem 5RM94 - 52273,
xl nepetro 1 e 2
051 A41 e A42 - comercial 1, repetio 1 e 2
021
'02 MI e A52 - comercial 2. repetio 1 e 2
CP 1: 80,58T.
Figura 1. Projees dos atributos sensoriais (A) e das amostras de extratos de

soja (B) sobre o plano fatorial (CPI x CPU)
de gro cozido e de algodo doce, aroma retronasal de gro cozido e de

malte e gosto doce. J as amostras dos extratos comerciais 1 e 2 localiza-
dos mais direita (Figura 1 8) demonstraram maior intensidade dos atri-
butos de aroma nasal de soja tostada, de rano, de sementes de gergelim
e de peixe; aroma retronasal de soja tostada e de sementes de gergelim;
92 Ernbrapa Soja. Documentos. 268
gosto amargo e textura de amido. No segundo CP, o principal atributo, foi

de densidade (Figura 1 A), indicando que a amostra localizada mais aci-
ma (extrato comercial 2) apresentou maior intensidade deste atributo.
Consideraes Finais
Os extratos obtidos das cultivares BRS 213 e BRS 133 e da linhagem

BRM94 -52273 foram caracterizados sensorialmente, pelos atributos aro-
ma nasal de gro cozido e de algodo doce; aroma retronasal de gro
cozido e de malte e gosto doce, indicando sabor mais suave. No diferi-
ram entre si quanto ao aroma nasal de gro cozido, de soja tostada, de
rano, de algodo doce, de sementes de gergelim e de peixe; aroma
retronasal de gro cozido, de soja tostada, de sementes de gergelim e de
malte; gosto amargo e doce e densidade. No processamento dos extratos
ocorreu a inativao das enzimas lipoxigenases devido ao tratamento tr-
mico, tornando-os assim, iguais quanto ausncia de lipoxigenases. Os
extratos comerciais foram qualificados pelos atributos aroma nasal e
retronasal de soja tostada e de sementes de gergelim, aroma nasal de
rano, gosto amargo e textura de amido, sugerindo sabor mais desagra-
dvel que os extratos produzidos em laboratrio. Diferenas significativas
foram evidentes entre os extratos obtidos em laboratrio e os comerciais,
o que pode ser devido aos processamentos diferenciados podendo ou
no incluir a inativao de lipoxigenases.
AXEROLD, B.; CHEESBROUGHT, T.M.; LAAKSO, S. Lipoxygenase from

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Teste de Elisa para a determinao da

ocupao nodular
Giovana Bortoti 1 ; Kelien Banhos do Carmo 1 ; Alexandre Jos Cattelan 2 AIu-

. 1
na da UNIFIL; 2 Embrapa Soja.
Introduo
ELISA (Enzyme Linked IrnrnunoscrbentAssay) um teste sorolgico que

visa identificar e quantificar o antigeno reconhecido pelo antissoro
(imunoglobulina) que lhe deu origem, formando o complexo anticorpo-
antgeno, associado s propriedades colorimtricas.
A colorao do meio ocorre devido ao de certa enzima sobre um

substrato cromognico. A enzima previamente conjugada imuno-
globulina. Atualmente, existem vrias formas de se aplicar o ELISA (Clark
e Bar-Joseph,1984). Vrias enzimas so citadas para a obteno de con-
jugados. A sensibilidade do mtodo de ELISA pode ser aumentada pelo
uso de substratos fluorognicos, como o fosfato 4-metil-umbeliferil.
Substratos radioativos tambm podem ser utilizados, no entanto exigem
equipamentos mais sofisticados e maior ateno.
No laboratrio de microbiologia do solo da Embrapa Soja o teste de Elisa

utilizado para identificar espcies Bradyrhizobiurn spp.
Objetivo
Verificar atravs do teste de Elisa quais estirpes de Bradyrliizobiurn spp,

bactrias fixadoras de nitrognio, esto presentes em ndulos de plantas
de soja submetidas a diferentes tratamentos.
Material e mtodos
Produo de antissoro
Jornada acadm/ca da Embrapa Soja 95
O antigeno foi produzido a partir das estirpes de Bradyrhizobium SEMIA

587, 5019, 5079 e 5080. Crescidos em meio slido; suspensos em imi de
soluo salina e centrifugados (1000 rpm, 10 mm). Descartou-se sobrena-
dante, adicionou 1 ml de sol. salina, repetiu-se novamente e na 3a vez
adicionou-se 0,5 ml de sol. salina e agitou. Aqueceu-se em banho-maria a
100C por 15 mm. Completou para 1 ml com soluo tampo de cobertu-
ra. Manteve em geladeira (4C, usar em questo de dias). Com o antgeno
pronto, fez-se a imunizao do animal a fim de produzir o antissoro. O ani-
mal escolhido foi o coelho, pois, eles permitem retirar quantidades sufici-
entes de sangue, alm de serem de fcil manuseio. O esquema de imuni-
zao usado de injees intramusculares. Aps a injeo do antigeno,
ocorrem diferentes reaes no sistema imunolgico do animal, incluindo a
produo de anticorpos. A imunizao segue o cronograma descrito abaixo.
O animal chega no biotrio e fica trs dias em observao para se verifi-
car sua sade. O inicio da imunizao deve ocorrer numa sexta-feira,
onde se aplica o antigeno + adjuvante completo. Nos dias em que no h
aplicao deve-se sempre verificar a situao do coelho. A prxima apli-
cao ser na quarta-feira seguinte onde se aplica antigeno + adjuvante
incompleto. Aps quatro dias, uma nova aplicao de antgeno + adjuvante
incompleto. Trs dias aps, aplica-se antigeno + adjuvante incompleto,
espera-se mais quatro dias e aplica-se pela ltima vez antgeno + adjuvante
incompleto. Cinco dias depois, no perodo da tarde, retira-se a rao para
que no dia seguinte pela manh se faa a sangria. Existem dois mtodos
de sangria: a puno Cardaca e pela orelha. Na puno Cardaca feita
somente uma coleta de sangue, retirada diretamente do corao por uma
seringa esterilizada. Em seguida, aplica-se loa 15 ml de ter no mesmo
local, causando a morte instantnea. A sangria pela orelha ocorre na veia
marginal da orelha. Usa-se xilol para dilatar a veia, fazendo-se o corte
com lmina de barbear. O mtodo mais indicado ode puno cardaca,
pois alm de causar menos sofrimento para o animal, a quantidade de
soro obtido maior.
Quando o perodo de imunizao e coleta chegam ao fim necessria a
limpeza do biotrio. A amostra de sangue coletada ter como fim, a reali-
zao dos testes de ttulo e reao cruzada.
O teste do ttulo dos antissoros tm como o objetivo determinar se a con-

centrao de anticorpos do soro est alta ou baixa. Tem-se como incio a
diluio deste antissoro comeando em 11100 at 1151200. O diluente
usado PBS-Tween. Primeiro pipetar 10 ul de antissoro em um tubo com
990 ul de PBS-Tween (11100), retiram-se 500 ul deste tubo e distribuem-
se nos outros tubos at obter a ltima diluio (para isso repete-se 10
vezes). O titulo determinado atravs da preparao de uma placa de
Elisa, tendo as bactrias presentes juntamente com as diluies dos
antissoros, seguindo-se a metodologia descrita por Fuhrmann & Wollum
(1985). Repousar por uma noite e no dia seguinte fazer a leitura do ttulo
no espectrofotmetro. Aps a determinao do ttulo, escolher as dilui-
es para utilizar no teste de reao cruzada. Este teste tem o objetivo de
verificar se h possibilidade de uma bactria reagir com o antissoro de
outra. A placa montada com as diluies escolhidas. Depois da monta-
gem da placa, incubar em geladeira 4C por uma noite. No dia seguinte,
lavar uma vez, adicionar 100 ul de tampo substrato com o reagente
Phosphatase Substrate, deixar repousar temperatura ambiente de 30 a
50 mm. e observar a reao colorimtrica do antissoro com o seu espec-
fico antigeno. Fazer leitura em leitor para placas de Elisa.
Se os teste de titulo e de reao cruzada tiverem resultado positivo, ter
ento o inicio dos testes nodulares. O antigeno nodular preparado da
seguinte forma: - esmagar os ndulos em tubos plsticos com 0,5 ml de
salina (flambar as pinas entre os ndulos); -Aquecer em banho-maria a
1001C por 15 mm.; - completar para 1 ml com tampo de cobertura. Aps
a preparao dos antigenos comea uma seqncia de procedimentos
para realizao do Elisa: 1a Etapa - Incubao de cobertura (perodo da
tarde), pipetar 100 ul de antigeno por compartimento da placa (pipetar
para um nmero de compartimento igual ao nmero de antissoros sendo
testados), incubar temperatura ambiente por 1 hora, esvaziar a placa e
secar, lavar com PBS-Tween por 4 vezes, secando bem entre as lavadas.
21 Etapa - pipetar 100 ul de antissoro com o titulo corrigido por comparti-
mento, a diluio do antissoro se dar com PBS-Tween, cobrir as placas
e incub-las a 28C por 1 hora e, em seguida, lavar como anteriormente.
31 Etapa - adicionar 100 ul do conjugado diludo 5000x em PBS-Tween,
incubar em geladeira 4C durante a noite, lavar como em 1. 4a Etapa -
Jornada acadmica da Em/rapa Soja 97
adicionar 100 ul de soluo fresca de substrato contendo 1 mg de substrato

por ml de tampo para substrato, incubar a temperatura ambiente por 30
a 50 mm. ou at a cor amarela das reaes positivas aparecer, fazer a
leitura em leitor para placas de Elisa, absorbncia de 405 nm, caso a
leitura no possa ser feita imediatamente, adicionar 3 gotas de NaOH 3M
por compartimento.
Resultados
Tm-se atravs do teste de Elisa a determinao da ocupao nodular

das estirpes de Bradyrhizobium spp. presentes em plantas de soja, o qual
sua funo proporcionar urna maior fixao biolgica de nitrognio no
solo. Aps identificao nodular, outros trabalhos sero elaborados afim
de garantir a total eficincia das estirpes para a plantao de soja.
CLARK, ME; BAR-JOSEPH, M. Methods in virology. NewYork:Academic

Pess, 1984. P51-85
FUHRMANN, J.J.; WOLLUM II, A.G. Simplified enzyme-linked
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Embrapa So/a. Documentos, 268
Panorama genmico da estirpe de

Bradyrhizobiumjaponicum CPAC 15,
recomendada para o uso em
inoculantes comerciais para a cultura da soja
Leandro Pereira Godoy 1 ; Ligia Maria de Oliveira Chueire2; Fernando Gomes

Barcellos 3 ; Ana Tereza Ribeiro Vasconcelos 4 ; Luiz de Paula Gonzaga 4 ; Mansa
Fabiana Nicols 4 ; Mariangela Hungria 2 Bolsista de Mestrado da Embrapa Soja;
. 1
1 Embrapa Soja; 3 13olsista de ps-doutorado do CNPq; 4 Laboratrio Nacional de
Computao Cientfica.
Introduo
A cultura da soja se beneficia do processo de fixao biolgica do nitrog-

nio (FBN), dispensando o uso de N de fertilizantes nitrogenados. Atual-
mente, quatro estirpes de Bradyrhizobium so recomendadas para uso
nos inoculantes comerciais, duas pertencentes espcie B. elkan, a
SEMIA 587 (recomendada no perodo de 1968 a 1975 e, novamente, des-
de 1979)e a SEMIA 5019 (=29w), recomendada desde 1979 e duas estir-
pes de B.japonicum, selecionadas pela Embrapa Cerrados, a CPAC 15 e
a CPAC 7, que vm sendo utilizadas desde 1992. Essas quatro estirpes
so capazes de fornecer N para as cultivares de soja mais produtivas
recomendadas atualmente, permitindo a obteno de rendimentos supe-
riores a 4.000 kg/ha (Hungria et aL, 2005).
A estirpe CPAC 15 (= SEMIA 5079, =566a, =DF 24) pertence ao mesmo
sorogrupo da SEMIA 566. Em relao ao histrico da SEMIA 566, muitos
inoculantes americanos empregados na dcada de 1960 no se mostra-
ram eficientes e, ento, foi realizado o isolamento da estirpe adaptada
SEMIA566 (= BR 40) (SEMIA, Seo de Microbiologia Agrcola), que pode
ser consderada como uma das primeiras estirpes brasileiras. A SEMIA
566 foi isolada em 1966, de um ndulo da cultivar Hardee, em vaso de
Leonard que havia recebido inoculante americano distribuido pela firma
Dixie Inoc, provavelmente um inoculante da Nitragin (Milwaukee, E.U.A.),
quando se buscava superar problemas de nodulao a campo com essa

cultivar. A CPAC 15 uma variante natural da CPAC 15, obtida a partir do
reisolamento em solos do DF, de estirpes vrios anos aps a sua ltima
inoculao, quando se buscava isolados adaptados com elevada capaci-
dade de FBN e com alta competitividade (Hungria et ai., 2005).
A estirpe SEMIA 566, bem como sua variante CPAC 15 so, sem dvida,
as mais competitivas estabelecidas em solos brasileiros. Essa estirpe
pertencente ao mesmo sorogrupo da USDA 123 (3111b123, =TAL 376,
=ACCC15036), que foi isolada em 1960 de um ndulo de soja em Iowa,
nos E.U.A., sendo considerada indgena naquele pas. As estirpes relaci-
onadas sorologicamente ao sorogrupo USDA 123 sorogrupo tm sido
consideradas como as mais competitivas da regio do meio-oeste dos
E.U.A., ocupando, caracteristicamente, de 60% a 80% dos ndulos for-
mados, sendo muito dificil introduzir novas estirpes em solos com estir-
pes desse sorogrupo (Hungria et ai., 2005).
No Brasil, h relatos de que, nos primeiros dois anos, a SEMIA 566 e a
CPAC 15 apresentam baixa competncia saprofitica, contudo, logo de-
pois se estabelecem fortemente. Relatos semelhantes foram feitos para a
USDA 123 nos E.U.A., sugerindo que a estirpe deva residir no solo por
um determinado perodo antes de dominar os ndulos. Um exemplo des-
sa capacidade foi, recentemente, mostrado por Mendes et ai. (2004), em
um ensaio conduzido por sete anos na Regio dos Cerrados. No quarto e
sexto anos desse experimento, como conseqncia da disperso, estir-
pes do sorogrupo SEMIA 566 foram encontradas em todas as parcelas,
mesmo naquelas que haviam sido inoculadas com outras estirpes, onde
chegou a ocupar mais de 50% dos ndulos.
A importncia de determinao dos genes dessa estirpe com alta
competitividade e capacidade elevada de FBN reside em que, com o lan-
amento de cultivares de soja mais produtivas, o uso de novas prticas
agricolas e o cultivo em solos que j receberam inoculantes anteriormen-
te, existe a necessidade de selecionar estirpes mais eficientes e competi-
Uvas, bem como de conhecer melhor o genoma das estirpes estabelecidas
nos solos brasileiros, visando prever o seu comportamento e as respos-
tas inoculao.
Objetivo
Realizar a cobertura de 10% a 15% do genoma da estirpe CPAC 15 de

BradyrhizobIumjaporiicum, procurando genes relacionados capacidade
saprofitica, competitividade e eficincia do processo de fixao biolgica
do nitrognio.
Material e Mtodos
Construo de biblioteca genmica de Bradyr/iizobium japonicum CPAC1 5

- Extrao de ONA genmico
At o presente momento, foi feita uma biblioteca da CPAC 15. Os "pellets"
foram obtidos de clulas da CPAC 15, crescidas em meio de cultura con-
tendo extrato-de-levedura e manitol a 28 C, por sete dias e, ento,
centrifugadas a 5.000 rpm por 10 min. O DNA genmico das bactrias foi
extrado utilizando, para o rompimento da parede celular, degradao de
protenas, polissacardeos, restos de parede e RNA, os reagentes SDS,
proteinase-K, fenol, clorofrmio e RNAse. Aps a purificao, o DNA foi
quantificado em espectrofotmetro.
Construo de bibliotecas
O preparo da biblioteca "shotgun" envolveu a purificao do DNA e a frag-
mentao deste DNAa0 acaso, por meio mecnico (nebulizao). O DNA
misturado com glicerol 50% e NaOAc 3M foi nebulizado por 30 segundos
a uma presso de 2 kgf/cm 2 , a fim de obter fragmentos de 500 pares de
bases (pb) a 3 kb. A fragmentao foi confirmada em gel de agarose 1%.
Aps a fragmentao, as extremidades foram reparadas e fosforiladas
pelo uso do fragmento enzimtico Klenow da DNA polimerase de
Escherichia coiL Os fragmentos de 3 a 5 kb foram separados em gel de
agarose low melting", grau analtico. Aps recuperao dos fragmentos a
partir do gel de agarose, os mesmos foram colocados para se ligarem ao
vetor pUC18 digerido com a enzima de restrio SmaI-BAP e defosforilados
com a enzima T4 DNA ligase. Aps a ligao, o material foi utilizado para
transformao de clulas de E. coli estirpe D111013, atravs da tcnica de
eletroporao. As clulas foram plaqueadas em meio Luria-Bertani con-

tendo ampicilina (100 ug/mL, previamente esterilizada com filtro 0,2 m),
IPTG e X-gal e as bactrias foram crescidas durante a noite a 37C.
- Seqenciamento
No processo de seqenciamento, colnias brancas individuais (clones
recombinantes) foram inoculadas em placas de crescimento de cultura
com 96 poos contendo meio "Terrific Grow" (12 gIL de bactotriptona, 24
gIL de extrato de levedura e 4 mLIL de glicerol) e ampicilina (1 00 jiL/mL).
As bactrias foram crescidas com agitao de 150 rpm, a 37 00 1 "overnight".
As placas de crescimento de cultura foram utilizadas para estoque em
glicerol (80%), sendo ento reinoculadas em blocos de crescimento, se-
guindo o mesmo procedimento anteriormente descrito. Aps o crescimento,
foram obtidos "pellets" por centrifugao a 4.000 rpm por 8 minutos. O
DNAfoi, ento, extrado pelo mtodo de rompimento alcalino. Aps o rom-
pimento da parede celular das bactrias, os restos de parede celular,
polissacardeos e proteinas remanescentes foram seletivamente precipi-
tados com KOAc 3M (acetato de potssio estocado a 4C, pH 4,7-4,9). O
sobrenadante foi filtrado por filtros mltiplos (MultiScreen, Millipore) e o
DNA obtido atravs da filtragem purificado e ressuspendido em gua,
verificando a concentrao em gel de agarose 1%.
O DNA precipitado foi seqenciado utilizando o "kit" "DYEnamic'M ET dye

terminator cycle sequencing (MegaBACETM)" (Amersham Pharmacia
Biotech). As reaes de POR foram realizadas com os "primers" Univer-
sal" e 'Reverso", para se conseguir a amplificao dos genes. Os produ-
tos da reao foram analisados em um seqenciador automtico
(MegaBace1000, Amersham), pelo mtodo dos terminadores fluorescen-
te 5.
- Montagem do genoma
As leituras obtidas so submetidas anlise de bioinformtica, realizada

no LNCC, com o programa SABI, que integra vrios programs de dom-
nio pblico: "phred", "phrap", Consed", "phrapview" e permite a identifica-
o de ORF5 ("open reading frames") como os programas "Glimmer",
BLAST, KEGG, COO, INTERPRO e PSORT.
Resultados
O projeto iniciou em janeiro de 2005 e uma primeira biblioteca foi obtida e

validada. Foi construda uma "homepage" para o proleto (www.bnf.lncc.br)
e os resultados obtidos at o presente momento constam dos Tabelas 1 e
2.
Tabela 1. Leituras do genoma de B. japonicum CPAC 15.
Nmero total de leituras 625

Nmero total de leituras sem vetores (c= 10% vector) 563
Nmero de leituras com 10-80% de bases de vetores 46
Nmero de leituras com mais de 80% de bases de vetores 16
Tabela 2. Bases obtidas no genoma de B. japonicum CPAC 15.
Nmero de bases depositadas (pb) (excluindo os 627.090 (100%)

vetores, incluindo bases de baixa qualidade) (?0,07% do genoma,
estimado em
9 milhes de pb)
Nmero de bases com qualidade elevada >= 20 (pb) 309.709 (46,70%)
Nmero de bases com qualidade >=30 (pb) 243.682 (36,75%)
Nmero de bases com vetores (pb) 36.057 (5,44%)
Comprimento mdio (pb) 1003,34
Mdia de comprimento (qualidade >=20) (pb) 495,53
Cobertura do qenoma 151.083 (? 167%)
Consideraes Finais
A estratgia de construo e validao das bibliotecas foi confirmada e

dever permitir a cobertura parcial do genoma da estirpe CPAC 15 de B.
japonicum.
Agradecimentos
Ao CNPq, pelo financiamento parcial do Projeto (50.549912004-5, 50.59461

2004-1 e 301241/2004-0).
Referncias
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MENDES, l.C.; HUNGRIA, M.; VARGAS, M.A.T. Establishment of
Bradyrhizobiurn japonicum and B. elkanhi strains in a Brazilian Cerrado
oxisol. Biology and Fertility of Soils, Berlin, v.40, p.28-35, 2004.
104 Embrapa Soja. Documentas, 268
Dinmica da matria orgnica em

vrios sistemas de manejo e
rotao de culturas em Londrina
Letcia C. Babujia 1 ; Thais P. Correa 1 ; Rosinei A. Souza 2 ; Jlio Cezar Franchini 3 .
1 Estudante de graduao da UEL; livestranda em Qumica Ambientai da UEL;
3 Embrapa Soja.
Introduo
O sistema de plantio direto (P0) tem sido amplamente adotado no Brasil,

onde atualmente j ocupa 22 Mha (FEBRAPDP, 2005). Em comparao
com o plantio convencional (PC), o P0 aumenta a reteno de umidade
do solo, diminui a oscilao de temperatura do solo e a eroso pela gua
e pelo vento, melhora a estrutura e, com o tempo, aumenta a matria
orgnica do solo (MOS), muitas vezes resultando em maiores produtivi-
dades (Castro Filho et ai., 2002; Derpsch et ai., 1991; Bayer et ai., 2002;
Amado et ai., 2001; S et ai., 2001). Alm disso, o P0 pode representar
um papel importante na reduo do aquecimento global por permitir uma
maior reteno de CO 2 e economizar at 40% do trabalho humano e do
uso de combustveis fosseis em comparao com o PC (Derpsch et ai.,
1 991; Kladivko, 2001: Bayer et ai. 2002).
Alguns estudos tm demonstrado que a rotao de culturas essencial
para que todos os benefcios do PD possam ser alcanados, especial-
mente em relao ao acmulo de carbono. Neste contexto, o uso de
leguminosas em sistemas de rotao de culturas se destaca como prtica
essencial, embora na realidade ainda seja pouco utilizada (Amado et ai.,
2001; Bayer et ai., 2002).
Deste modo, o objetivo deste trabalho foi avaliar o comportamento do

carbono e nitrognio do solo em resposta ao cultivo e a rotao de cultu-
ras com quantidades variveis de gramneas e leguminosas.
Jornada acadmica da Ernbrapa Soja
Desenvolvimento
O ensaio de campo foi estabelecido em 1997 na estao experimental da

Embrapa soja, em Londrina. O experimento foi desenhado para comparar
os efeitos dos sistemas de plantio direto e convencional e rotao de cul-
turas incluindo culturas de gros (soja, milho e trigo) e culturas de cober-
tura (tremoo e aveia preta). Os sistemas de rotao so apresentados
na tabela 1. O ensaio tinha um delineamento em blocos ao acaso, com
quarto repeties.
Tabela 1. Sistemas de rotao do culturas utilizados nos sistemas de

manejo do solo.
Inverno vero Inverno Vero Inverno Vero Inverno vero Inverno Vero
Rotaes 97 01 01102
97/98 98 98/99 99 99100 2000 00101
1 Aveia MiLho Aveia Soia Trigo soja Tremoo Milho Aveia Soja
2 Aveia soja Tremoo Milho Aveia soja Trigo soja Tremoo Milho
3 Aveia Soja Trigo Soia Tremoo Milho Aveia Milho Trigo Milho
As determinaes dos estoques de O e N foram feitas no quinto ano do

experimento. Foram coletadas em trincheiras amostras deformadas e
indeformadas nas camadas de 0-10, 10-20 e 20-40cm de profundidade.
As amostras indeformadas foram coletadas com cilindros de ao de 100
cm 3 . Trs amostras foram coletadas por camada e secas a 105C para
determinao da densidade do solo (Blake, 1965). O carbono orgnico
foi determinado indiretamente aps oxidao com dicromato na presen-
a de cido sulfrico a 170C por 30 minutos e determinao espec-
trofotomtrica do Cr 3 formado. Na curva padro foi utilizado C-sucrose.
O N-total foi determinado aps digesto das amostras com cido sulf-
rico na presena de sulfato de cobre e potssio e determinao
espectrofotomtrica do NH 4 -N usando o mtodo do azul de indofenol
(Feije & Anger, 1972). A densidade do solo foi considerada para os cl-
culos dos estoques de O e N que foram expressos em kg m 2 para cada
camada de solo.
Resultados
O manejo do solo afetou os estoques de O orgnico, os quais variaram

com a profundidade do solo. As camadas de 0-10 e 20-40 cm mostraram
as maiores diferenas entre os sistemas de manejo, com a primeira acu-
mulando maiores quantidades no P0 e a segunda no PC. O C orgnico
no PD apresentou as seguintes mudanas lquidas em relao ao PC:
+0,476, 0,019 e 0,207kg m, nas camadas de 0-10, 10-20 e 20-40 cm,
respectivamente. Entretanto, embora o P0 acumulou mais C na superf-
cie e menos em profundidade, considerando o perfil todo analisado (0-
40), um balano de +0,250 kg C m -2 foi obtido no PD, correspondendo a
2.500 kg C ha-1 acumulado nos perodo de cinco anos, ou 500 kg ha 1 ano1 .
Os estoques de carbono tambm variaram com o sistema de rotao de

culturas e as mudanas lquidas na camada de 0-40 cm foram: +0,363,
+0,584 e 0,197kg C m 2 nas rotaes 1,2 e 3, o que equivaleu a 726,
1.167 e-394 kg ha -1 ano 1 , respectivamente.
Resultados semelhantes foram observados para os estoques de N. Em
media, a comparao entre PD e PC resultou nas seguintes mudanas
lquidas de N: +0,034, +0,010 e 0,003kg m nas camadas de 0-10, 10-
20 e 20-40 cm, respectivamente. Deste modo, as principais diferenas
entre os sistemas de manejo foram observadas na camada superficial.
Considerando o perfil todo (0-40 cm), um aumento de 0,041 kg N m 2 foi
obtido no P0, representando 410kg de N ha 1 , ou 82kg de N ha 1 ano 1 .As
rotaes de culturas tambm afetaram a acumulao de N no PD e para
a camada de 0-40 cm, mudanas de +0,036, +0,069 e +0,018 kg N m 2
foram observadas nas rotaes 1,2 e 3, equivalendo a 71, 137 e 37kg de
N ha 1 ano 1 , respectivamente.
Os dados obtidos nesse estudo mostram que a predominncia de
leguminosas na rotao 2 favoreceu o acmulo de C no P0, enquanto o
uso de culturas comerciais e de cobertura no leguminosas, favoreceu
o acmulo no PC. Os resultados indicam tambm, que a acumulao de
C no PD em relao ao PC com a incluso de leguminosas resultaria da
maior taxa de mineralizao da MOS no PC do que propriamente de
maior acmulo no P0.
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Profundidade (cm)
Figura 1. Mudanas liquidas de C (A) e N (B) do solo entre os sistemas PD e PC

em diferentes sistemas de rotao de culturas em funo da
profundidade do solo. 1, 2 e 3 se referem a aveia, tremoo e trigo,
respectivamente, conforme seqncia de culturas dos sistemas de
rotao descritos na Tabela 1.
Refe r n ci as
AMADO, T.J.C.; BAYER, C.; ELTZ, FL.F; BRUM, A.C.R.. 2001. Potencial
de culturas de cobertura em acumular carbono e nitrognio no solo
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BAYER, O.; MIELNICZUK, J.; MARTIN-NETO, L.; ERNANI, RR.. 2002.
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Jornada acadmica da Embrapa Soja IOQ
Relaes pblicas como ferramenta

estratgica no relacionamento entre a
Embrapa Soja e os seus diversos pblicos
Flvia Monti Arone 1 ; Ludmila Maia Mendes 1 ; Gilceana Soares Moreira

Galerani 2 Estudantes de graduao da UEL; 2 Embrapa Soja.
. '
Apresentao
O gerenciamento da comunicao entre as organizaes e seus pblicos

considerado uma das principais funes de Relaes Pblicas. Entre-
tanto, um estudo profundo da rea demonstra que seu campo de atuao
amplo e est de acordo com o tipo, os objetivos, a finalidade e a poltica
da empresa na qual est inserido.
A Embrapa Soja est ligada a vrios grupos interessados direta ou indire-
tamente s aes de pesquisa de soja. Esses grupos possuem expectati-
vas e desejos diferentes. Por isso, torna-se necessrio um constante tra-
balho de seu mapeamento e sua classificao como pblicos, para assim
realizarem-se trabalhos que tentem corresponder s necessidades des-
ses segmentos.
Nesse contexto, a rea de Comunicao Empresarial da Embrapa Soja
(ACE) atua estrategicamente como colaboradora em proporcionar um am-
biente empresarial satisfatrio junto aos seus diversos pblicos, fato que
se concretiza, principalmente atravs de um planejamento de comunica-
o adequado. O foco deste trabalho baseia-se no desenvolvimento das
atividades produzidas no estgio de Relaes Pblicas realizado pelas
estudantes do terceiro e quarto anos desse curso na Universidade Esta-
dual de Londrina.
110 Em/rapa Soja. Documentos, 268
Objetivo
Divulgar o papel estratgico da atividade de Relaes Pblicas no desen-

volvimento institucional da Embrapa Soja.
Desenvolvimento
Para ser titulada como ferramenta estratgica, as Relaes Pbicas devem

estar inseridas em um cenrio de projees, e prognsticos, ou seja,
elementos decorrentes do planejamento. Kunsch (2003) afirma que "o exer-
ccio da funo estratgica de relaes pblicas s possvel por meio do
planejamento, pois o gestor de comunicao ou profissional de relaes
pblicas nas organizaes contemporneas precisa ir alm das tcnicas".
Para testar a veracidade dessa afirmao, prope-se um roteiro para o
planejamento que ser utilizado, expondo melhor as aes realizadas na
Embrapa Soja, em especifico durante este estgio de Relaes Pblicas,
no que tange rea de comunicao e ao trabalho com seus diversos
pblicos. Seguem as etapas propostas.
- Pesquisa: etapa que abrange desde a identificao da situao e o le-
vantamento de dados do que se deseja realizar at a construo do
diagnstico referente ao ambiente estudado. Para o planejamento de
comunicao anual da Embrapa Soja, foi efetuada uma pesquisa de
opinio interna que coletou conceitos, sugestes e criticas dos empre-
gados da empresa, para assim serem concretizadas aes que aten-
dam s expectativas do pblico interno. Para eventos em geral, feito
um levantamento do pblico alvo e das condies externas.
- Planejamento: com os dados coletados, definem-se os objetivos e as
metas a alcanar com determinadas aes e a definio dessas estra-
tgias. Ser nessa fase que ocorrer a seleo dos meios de comunica-
o, a verificao dos recursos necessrios e disponveis e, principal-
mente, a obteno do apoio da direo, no caso da Embrapa Soja, o
apoio da chefia. Cita-se como exemplo prtico, a elaborao de um
concurso fotogrfico direcionado ao pblico interno da instituio, o qual
foi produzido desde a escolha do nome do concurso at a formulao
do regulamento com datas, prmios e informaes pertinentes, assim

como os veculos de divulgao.
- Implantao: considera-se fundamental, nesta etapa, a divulgao ao
pblico alvo do que foi planejado. Para isso, faz-se necessrio elaborar
aes que causem impacto e interesse nos grupos envolvidos no plano
de ao. Alm disso, essa a fase de monitorar as atividades desenvol-
vidas, para possiveis ou necessrias correes.
- Avaliao: a ltima etapa do planejamento estratgico proposta por
Kunsch (2003) a mensurao dos resultados obtidos com as ativida-
des planejadas e implementadas. Entretanto, importante ressaltar que
ela no est sempre ao final de todo o processo e sim deve ser realiza-
da durante todas as fases, para medir a efetividade das aes. Na
Embrapa Soja, esse mecanismo utilizado por meio de instrumentos
de pesquisa de avaliao que indicam a satisfao do pblico ao qual o
programa foi dirigido. Para isso, cria-se o instrumento adequado, apli-
ca-se, tabulam-se e analisam-se os dados obtidos para serem repassa-
dos chefia e aos demais interessados. Eventos como seminrios,
workshops, estandes, Dia de Campo, entre outros, foram avaliados nos
aspectos de organizao, divulgao, materiais de apoio, atendimento
ao pblico do evento e contedos apresentados.
Atravs desse processo, que no necessariamente segue uma ordem cro-
nolgica, busca-se o planejamento estratgico da comunicao empresari-
al e a aceitao dos grupos envolvidos com a organizao, neste caso a
Embrapa Soja e os seus diversos pblicos. Alm das atividades citadas,
desenvolvidas em cada uma das fases, o estgio de Relaes Pblicas
proporciona o trabalho com veculos de comunicao dirigida, como a
elaborao e a manuteno do mural temtico da empresa e o atendi-
mento aos pblicos interno e externo, possibilitando aprimoramento das
funes a serem desempenhadas pelo profissional de Relaes Pblicas.
Consideraes Finais
A partir do exposto, compreende-se que, por meio do planejamento estra-

112 Emb,'apa Soja. Documentos, 268
tgico as Relaes Pblicas podem alcanar, de modo mais efetivo, suas

metas e seus objetivos. Esse aspecto que se confirma com a aplicao
dos preceitos tericos de autores como Kunsch (2003), aos planos e pro-
jetos desenvolvidos pela rea de Comunicao Empresarial da Embrapa
Soja.
Sendo assim, a possibilidade f os estagirios de Relaes Pblicas au-
xiliarem no desempenho de atividades estratgicas de relacionamento
com diferentes pblicos da empresa de fundamental importncia. Isso
permite a aplicao das tcnicas estudadas, alm da construo da viso
critica do processo de comunicao e do papel da atividade de Relaes
Pblicas no desenvolvimento institucional das organizaes.
Referncias
CHIAVENATO, 1. Introduo teoria geral da administrao. So Pau-

lo: Campus, 2004. 494p.
FORTES, W.G. Relaes Pblicas: processo, funes, tecnologia e es-
tratgias. Londrina: UEL, 1998. 327p.
KUNSCH, M.M.K. Planejamento de relaes pblicas na comunica-
o integrada. 4ed. Ver., atual. E ampl. So Paulo: Sumus, 2003. 417p.
Identificao de QTL associados

fixao biolgica do nitrognio em soja
Maria Aparecida dos Santos"; Mansa Fabiana Ni c olsZ4 ; Taila Carolina Santini
Vedovati 3 4 ; Mariangela Hungria 4 . 1 13olsista de mestrado da CAPES; 2 Bolsista de
DTI do CNPq; SBolsista de iC do CNPq; 4 Ernbrapa Soja.
Introduo
Dentre os principais fatores biticos que contribuem para a elevada pro-

duo de soja no Brasil, destaca-se a fixao biolgica do nitrognio (FBN).
Estudos indicam que a FBN pode suprir todo o N que a soja necessita. A
no utilizao de fertilizantes nitrogenados na cultura da soja resulta em
uma economia estimada em US$3 bilhes, por safra, para o Brasil (Hungria
et ai., 2005). Todavia, os caracteres da FBN no tm sido contemplados
diretamente nos programas de melhoramento gentico da soja. Estes tm
priorizado caractersticas relacionadas com a produo e a resistncia
doenas. Diferenas, quanto eficincia no processo de FBN, entre os
gentipos comerciais de soja que so utilizados atualmente nos progra-
mas de melhoramento foram relatadas por Bohrer & Hungria (1998) e
Hungria & Bohrer (2000).
Marcadores moleculares, identificados no mapa genmico da soja (Cregan
et ai., 1999; Song et aI., 2004), vm sendo utilizados para a identificao
de QTL (locos de carter quantitativo). Utilizando marcadores do tipo
microssathtes seqncias simples repetidas (SSR), Meksem et ai. (2001)
identificaram regies genmicas relacionadas com a produo de
isoflavonides. Marcadores de pohmorfismo no comprimento de fragmen-
tos de restrio (RFLP) e SSR tambm foram utilizados para mapear QTL
envolvidos com o incremento no teor de protenas nos gros (Sebolt et ai.,
2000). Diversos QTL para caractersticas relacionadas com o rendimento
de gros tambm foram descritos (Chung et ai., 2003).
Com relao FBN, Nodari et ai. (1993) detectaram quatro QTL afetando
o nmero de ndulos em feijoeiro (Phaseolus vulgans L.). Na soja, Nicois
etal. (2005) identificaram, em uma populao de 160 famlias F 23 do cru-

zamento BRS 133 (baixa capacidade de FBN) x Embrapa 20 (mdia ca-
pacidade de FBN), 16 associaes significativas entre marcadores SSR e
QTL para parmetros de crescimento e nodulao das plantas.
Objetivo
Identificar QTL relacionados capacidade de fixao biolgica do nitro-

gnio em soja.
Material e Mtodos
Cento e cinqenta e sete linhagens F 27 endogmicas recombinantes de

soja, derivadas do cruzamento entre as cultivares Bossier (alta capaci-
dade de FBN) e Embrapa 20 (mdia capacidade de FBN) foram avalia-
das, em casa de vegetao, quanto caractersticas relacionadas com
o crescimento da planta (massa da parte area seca, MPAS) e
nodulao (massa de ndulos secos, MNS; nmero de ndulos, NN; e
massa mdia de ndulos secos, MNS/NN). O delineamento experimen-
tal foi o inteiramente casualizado, com oito repeties de cada linha-
gem. Cada planta no estdio V2, recebeu 1 mL de inoculo misto (v:v 1:1)
de B. japonicum SEMIA 5079 e B. elkanh SEMIA 587. Trinta dias aps a
inoculao, as plantas foram coletadas individualmente e determinaram-
se os parmetros: MPAS, NN, MNS e a relao MNS/NN. Os dados
coletados foram submetidos anlise de varincia (Tabela 1). A
herdabilidade para cada caracterstica foi calculada pela frmula: hl
2 g/[ p 2 g+( 2 e/r)].
O DNA genmico das 157 linhagens F 2 .7 e dos parentais tambm foram
amplificados com 24 pares de "primers" microssatlites, escolhidos a par-
tir do mapa do genoma da soja (Cregan et ai., 1999; Song et aI., 2004).
A existncia de ligao entre um loco marcador e um carter quantitativo
foi determinada por anlise de regresso simples. A ligao foi admitida
quando constatada diferena significativa (P~0,05) entre o valor fenotipico
mdio das linhagens F 2 .7 e o marcador (Tabela 2). A proporo da varia-
Tabela 1. Resumo da anlise de varincia para massa da parte area seca

(MPAS), nmero de ndulos (NN), massa de ndulos secos
(MNS) e relao MNS/NN, nas linhagens F2 : 7 do cruzamento
Bossier x Embrapa 20.
Varivel OM GL F P A2 CV (%) 1.12
MPAS 17,1176 156 1,98 0,0001 0,2280 25,60 49

NN 16.831,6510 156 1,44 0,0008 0,1768 50,12 30
MNS 210.989,8000 156 1,49 0,0002 0,1822 49,85 33
MNS/NN 4,1040 156 1,37 0,0034 0,1695 45,60 27
Tabela 2. Marcadores SSR significativamente associados com as diferen-

as fenotpicas, (massa da parte area seca (MPAS), nmero de
ndulos (NN), massa de ndulos secos (MNS) e relao
MNS/NN).
Grupo Nvel de
Caracterstica A
A1A? A2 2 2
Marcador de significncia R2 (%)
quantitativa (Bossier) (Embrapa 20)
hgao 1 do teste F
MPAS Satt332 LO 31 0,0100 3,70 11,1910 11,76a

(mg.pr1) Satt434 LO H 0,0300 3,10 11,18b 11,72a
Satt232 LO L 0,0050 5,00 11 ,84a 11 ,20b
Satt197 LO 31 0,0500 2,50 207,47a 222, 27b

NN Satt509 LO Bi 0,0040 5,25 203,19b 224,93a
(Nduto.p[ 1 ) Satt307 LO C2 0,0025 6,20 228,58a 2o5,28b
Satt325 LO F 0,0160 3,80 229,88a 209 ,67b
MNS Satt202 LO C2 0,0220 3,30 783,00a 71 8,30b

(m9.planta) Satt307 LO C2 0,0005 8,00 802,51a 706,90b
Satt296 LO Dlb 0,0300 3,00 3,71b 3,98a
MNS/NN Satt192 LO H 0,0300 3,80 3,93a 3,68b
Satt509 LO BI 0,0500 3,69a
1
Grupo de ligao como descrito em Cregan et ai. (1999).
2
Mdias allicas do marcador associadas aos parentais Bossier (A,A 1 ) e Embrapa 20 (A2A2 ).
Nas linhas, os valores seguidos pela mesma letra no diferem significativamente, de acordo
com o teste de Tukey P?0,05.
o fenotipica explicada pelo marcador foi estimada, utilizando-se o coe-

ficiente de determinao (R 2 ) ( Edwards et aI., 1987).
lia Embrapa Soja. Documentos, 268
Resultados e Consideraes Finais
Foram identificados sete marcadores (Satt192, Satt197, Satt202, Satt296,

Satt307, Satt332 e Satt509) relacionados nodulao e trs (Satt232,
Satt332 e Satt434) associados produo de biomassa da planta. Des-
ses marcadores, os Satt192, Satt197, Satt232, Satt296, Satt307, Satt332
e Satt509 j haviam sido identificados em uma populao E 2 originada
. 3
do cruzamento Embrapa 20 (mdia capacidade de FBN) x BRS 133 (bai-

xa capacidade de FBN) (Nicols et ai., 2005). Estes marcadores tm
potencial para utilizao em programas de melhoramento de soja visando
o desenvolvimento de gentipos com maior FBN.
Agradecimentos
Projeto financiado parciaimente pelo CNPq 40071012004-8 e 301241/2004-

0) e pelo PRONEX. A Rinaldo Benedito Conceio, Ligia Maria O. Chueire
e Manuel P. da Silva, funcionrios da Embrapa soja, pelo apoio tcnico.
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Biologia da lagarta-da-soja em dieta

enriquecida com diferentes concentraes
de rutina e genistina --
Mariana C. Salvador 1 ; Sandra H. Miyakubo 1 ; Srgio Henrique da Silva 1 ; Maria

Cristina Neves de Oliveira 1 ; Clara Beatriz Hoffmann-Campo 2 Estagrios da
. 1
Embrapa Soja; 2 Embrapa Soja,
Introduo
Anticarsia gemrnatalis Hbner (Lepidoptera: Noctuidae) tambm conheci-

da como lagarta-da-soja uma das principais pragas desfolhadoras da
soja, e no Brasil encontra-se distribuda em praticamente todas as reas
de cultivo. O uso indiscriminado de inseticidas para o controle desta pra-
ga aumenta as agresses ambientais, causando desequilibrio no incio
do desenvolvimento da cultura. Assim, outras tcnicas de controle esto
sendo pesquisadas e a resistncia de plantas uma das alternativas.
Os mecanismos de defesa da planta abrangem uma srie de caractersti-
cas morfolgicas e, tambm, um complexo de substncias quimicas, que
podem torn-la repelente, txica ou, de algum modo, inadequada para os
insetos-praga (PIUBELLI 2004). Na soja, as substncias de defesa mais
provveis so os flavonides (HOFFMANN-CAMPO 1995) e, dentre eles,
a rutina (quercitina 3-0-rutinosidio) reconhecida por desempenhar pa-
pel importante na defesa da planta a iepidpteros (HOFFMANN-CAMPO
et ai, 2001). Esta substncia foi identificada em extratos de folhas de P1
227687, P1 274454 e outros poucos gentipos resistentes a insetos
(PIUBELLI et aI, 2005). Adicionalmente, o isoflavonide genistina
(genisteina 7-0-a-D-glicosidio) foi observado em menor concentrao na
maioria dos gentipos estudados por PIUBELLI, et ai (2005).
Este trabalho teve como objetivo avaliar a atividade biolgica da interao
das substncias qumicas rutina (quercitina 3-0-rutinosidio) e genistina
em populaes de A. gemmatalis.
Jornada acadmica da Embi-apa Soja 119
Material e Mtodos
Os experimentos foram realizados no Laboratrio de Resistncia de Plan-

tas e Fitoqumica da Embrapa Soja, em Londrina,PR. Rutina (Sigma) e a
genistina, obtida por um processo de cristalizao e recristalizao (M. A.
Berhow, com. pessoal), a partir de um concentrado de isoflavonas da marca
Novasoy, cedido pela ADM (Archer Daniels Midland Co), foram utilizadas
nos bioensaios.
Cristalizao: Para a cristalizao, 20g de concentrado de isoflavonas
(Novasoy) foi solubilizado em 1000m1 de MEOH e aquecido sob agita-
o at 50C, quando adicionou-se lOOmI de H 20 destilada. Aps esfri-
ar completamente, a soluo foi colocada na capela em repouso at a
precipitao dos cristais de genistina e filtrado. O lquido resultante foi
deixado em Becker semiaberto por aproximadamente 12h e, novamen-
te, filtrado.
Recristalizao: A pureza dos precipitados foi monitorada atravs da an-
lise em HPLC (High-Performance Liquid Cromatograpy) e o precipitado
com maior teor de genistina, foi solubilizado em MEOH, at a obteno de
uma soluo clara e transparente. Esta soluo foi aquecida sob agitao
at atingir 50C, quando adicionou-se 10% de H 2 O destilada. O processo
de cristalizao (evaporao e precipitao), foi repetido, at que se obte-
ve acima de 95 % de genistina.
As substncias rutina 0,25g (R 1 ) e 0,50 g (R2), genistina 0,017g (G 1 ) e
0,034g (G 2 ), a mistura das duas substncias 0,25g de rutina + 0,017g de
genistina (R+G), foram adicionadas quando a dieta artificial atingiu 40C.
Dieta normal, sem adio de nenhuma substncia foi considerada tes-
temunha. A concentrao de genistina foi corrigida para 100% de pure-
za.
As lagartas provenientes do laboratrio de criao massal da Embrapa
Soja, foram criadas desde a emergncia em suas respectivas dietas e, na
pr muda para o 3 0 instar, foram pesadas e individualizadas em copos de
acrlico com tampas de papelo esterilizadas. A dieta contida em cada
copo foi pesada antes e aps o consumo. Os copos foram colocados em
bandejas com tampa para evitar perda de umidade da dieta, e mantidas
em B.O.D. com fotofase de 12h, temperatura de 25 2 C e umidade de

70 10%. As lagartas foram observadas diariamente, avaliando a morta-
lidade e o tempo de alimentao de cada estdio.
Para a obteno do fator de correo peso fresco/seco, cinco individu-
os foram pesados, mortos e secos em estufa por (721h, 60C) e nova-
mente pesados. O valor obtido foi multiplicado pelo peso fresco de cada
lagarta do bioensaio. O mesmo procedimento foi adotado para o clculo
do peso seco da dieta oferecida aos insetos. A dieta remanescente nos
copos foi separada das fezes, sendo ambas secas em estufa (72h, 60C).
A quantidade de dieta consumida pelas lagartas foi obtida, subtraindo-
se do peso seco inicial da dieta corrigido, a quantidade de dieta restante
nos copos.
As pr-pupas foram individualizadas em copos com vermiculita e mantidas
sob condies controladas de temperatura, luz e umidade. Aps 48h da
transformao, as pupas foram pesadas (peso fresco) e transferidas para
estufa (72h, 60C) e, novamente, pesadas (peso seco).
A anlise de covarincia (ANCOVA) proposta por RAUBENNHEIMER &
SIMPSON (1992) seguida de diagramas bicoordenados de utilizao
(RAUBENHEIMER & SIMPSON, 1994) foram utilizados para estimar o
crescimento (peso de pupa ajustado pelo tempo de alimentao), consu-
mo alimentar (dieta consumida ajustada pelo tempo de alimentao), efi-
cincia na assimilao (peso de fezes ajustado pelo consumo) e conver-
so dos alimentos ingeridos em biomassa (peso de pupa ajustado pelo
consumo). Todas as anlises de covarincia foram realizadas utilizando-
se os pesos secos das variveis.
A mortalidade observada em A. gemmata/is segundo o teste c2 ocor-

reu em funo dos diferentes tratamentos, e morreram respectivamente,
34,28% e 25,70% dos insetos alimentados de dietas R 2 e R+G.
O tempo de alimentao total foi afetado pelos diferentes tratamentos.
Na testemunha, G 1 e G 2 , o desenvolvimento das lagartas foi mais rpido.
Nos demais tratamentos observou-se um prolongamento no ciclo larval

do inseto. As populaes alimentadas em dieta R 1 . R2 e R+G apresenta-
ram periodo de alimentao mais longo, comparado aos demais trata-
mentos. Para equilibrar o baixo aproveitamento nutricional e custos meta-
blicos a que so submetidos, os insetos alongam seu ciclo para atingir o
peso ideal necessrio para a fase de pupa e posterior reproduo
(PIUBELLI 2004). Porm, desta forma ficam suscetveis aos fatores natu-
rais de mortalidade, por um perodo maior.
Os maiores pesos secos iniciais de lagartas (0,68; 0,59 e 0,67) e de pupa

(61,56; 58,15 e 57,08) foram observados quando os insetos se alimenta-
ram das dietas G 2 , G 1 e testemunha, respectivamente, sugerindo que os
tratamentos G 1 e G 2 no apresentam nenhum efeito antinutricional ou re-
pelente aos insetos. No entanto, na menor concentrao, misturada com
rutina, observou-se o menor peso de pupa, comparvel quele, obtido
pelas lagartas alimentadas com a dieta R 2 .
Lagartas alimentadas de dietas contendo a maior concentrao de

genistina G 2 consumiram a maior quantidade de dieta (302,28mg). Prova-
velmente, devido a A. gemmatalis estar acostumada com esta substncia,
que alm das folhas, est tambm presente nos gros de soja; a protena
de soja faz parte da composio da dieta artificial utilizada para a criao
das lagartas. Os insetos alimentados com dieta R tambm consumiram
grande quantidade de dieta (290,51g) mas, apresentaram o menor cres-
cimento (peso de pupa ajustado pelo tempo de alimentao), provavel-
mente por terem sido menos eficientes na converso do alimento ingerido
em biomassa (peso de pupa ajustado pelo consumo) e na assimilao
dos alimentos (peso de fezes ajustado pelo consumo). Assim, observou-
se que mesmo aumentando o consumo (dieta consumida ajustada) pelo
tempo de alimentao, as lagartas no apresentaram proporcional au-
mento no peso. Esses fatos evidenciam que os insetos falharam em de-
tectar rutina na dieta, pois o consumo no foi afetado pela adio do
flavonide. As lagartas alimentadas de dieta R + G consumiram menos
que R2 , mas foram mais eficientes na converso do alimento ingerido.
Porm, o peso seco de pupa, o peso de fezes e o tempo de alimentao
no diferiram significantemente do tratamento
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Uso de marcadores moleculares em soja

visando identificar caracteres da
fixao biolgica do nitrognio
Michele Asai 1 "; Maria Aparecida dos Santo& 4 ; Mansa Fabiana Nicols 34 ;
Mariangela Hungria4 Bolsista de Iniciao Cientfica do CNPq; 2 13olsista de

. 1
mestrado da CAPES; 3 13olsista de OTI do CNPq; 4 Embrapa Soja.
Introduo
O nitrognio (N) um nutriente essencial para o crescimento e reprodu-

o das plantas, sendo um fator limitante as culturas, conseqentemente,
a agricultura moderna utiliza fertilizantes nitrogenados, o que eleva os
custos de produo, alm de ser fonte de contaminao ambiental. No
entanto, algumas plantas so capazes de utilizar o nitrognio molecular
(N 2 ), que constitui cerca de 78% dos gases da atmosfera, atravs da
simbiose com bactrias fixadoras de nitrognio. A interao entre bactri-
as dos gneros R/jizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium
e Azorhizobium e plantas leguminosas tem sido extensivamente estuda-
da. Durante essa interao, as bactrias induzem ndulos nas razes das
leguminosas, convertendo o N 2 a NH 3 , atravs do complexo enzimtico
da nitrogenase. A planta fornece s bactrias os compostos de carbono
(0) e outros nutrientes para sustentar o crescimento bacteriano, enquanto
a bactria fornece N planta hospedeira.
A associao entre a soja e as bactrias Bradyrhizobium japonicum e B.
elkanhi contribui, significativamente, para o sucesso da cultura no Brasil,
uma vez que a demanda de nitrognio (N) das cultivares brasileiras pode
ser suprida totalmente pelo processo biolgico. Estudos de quantificao
da FBN no pas indicam que o processo biolgico pode suprir a soja em
at 300 kg de N ha 1 , resultando em uma economia estimada em US$ 3
bilhes por safra (Hungria et ai., 2005).
O conhecimento sobre genes nos rizbios envolvidos na nodulao (nod,
noi e noe) e no processo de FBN (nif e fix) so elevados (Stougaard,
2000), entretanto, pouco se sabe sobre os genes das leguminosas hos-

pedeiras que esto relacionados simbiose. O estudo dos fatores gen-
ticos das plantas relacionados com a FBN dificultado pelo tamanho e
complexidade do genoma (Thoquet, et ai., 2002).
O desenvolvimento das tcnicas de biologia molecular tem possibilitado a
construo de mapas genticos saturados para vrias culturas de interes-
se econmico. Esses mapas constituem ferramentas importantes para
estudos de gentica e genmica dessas espcies, revelando novas pos-
sibilidades para o estudo da herana quantitativa e aplicao no melhora-
mento gentico destas culturas, como o mapeamento de QTLs,
monitoramento da resposta seleo e identificao de germoplasma
com alelos superiores. Com isso, possvel determinar os QTL relaciona-
dos com a produo de sementes, o peso de plantas, o tempo de
florescimento, a maturidade, a qualidade e a resistncia a estresses biticos
e abiticos. O emprego dessa tecnologia no mapeamento e clonagem
baseada em mapeamento de genes de plantas leguminosas relaciona-
dos com a FBN tem sido relatado (Colebatch et ai., 2001; Thoquet et ai.,
2002). Cregan et ai. (1999) e Song, et aI. (2004) desenvolveram um mapa
gentico de ligao do genoma da soja com marcadores microssatlites
(SSR - Simpie Sequence Repeat) integrado com outros marcadores
moieculares e marcadores clssicos. Alguns desses marcadores
moleculares disponveis no mapa do genoma da soja j esto sendo em-
pregados em programas de melhoramento.
Na soja, Nicols et ai. (2005) identificaram, pela utilizao de marcadores
do tipo microssatlites (SSR), em uma populao de 160 famlias F 23 .do
cruzamento BRS 133 (baixa capacidade de FBN) X Embrapa 20 (mdia
capacidade de FBN), 16 associaes significativas entre marcadores SSR
e QTL para parmetros de crescimento e nodulao das plantas. Sete
marcadores foram confirmados em outra populao composta por 157
linhagens F 27 do cruzamento das cultivares Bossier (alta) e Embrapa 20
(mdia) (Santos et ai., 2005).
Atualmente, busca-se identificar novos marcadores SSR que sejam
polimrficos para essas duas populaes, visando uma maior saturao
das regies onde foram detectados os QTL para crescimento e nodulao.
Objetivos
Verificar a existncia de polimorfismo dos marcadores SSR entre os

parentais Bossier e Embrapa 20 e avaliar a segregao dos marcadores
polimrficos na populao.
Material e Mtodos e Resultados
As anlises esto sendo conduzidas em uma populao de mapeamento

composta por 157 linhagens endogmicas recombinantes derivadas do
cruzamento de duas cultivares previamente identificadas como tendo dis-
tintas capacidades de FBN, Bossier (alta) X Embrapa 20 (mdia) (Nicols
et ai.! 2002).
As amostras de DNA foram extradas a partir de duas a trs folhas (pri-
meiras folhas trifoliadas) de cada uma das 157 linhagens F 2 e dos
.7
parentais Bossier e Embrapa 20 pelo mtodo descrito por Keim et ai.

(1988). A seguir, cada amostra de DNA genmico total amplificada
com " primers " microssatlites escolhidos a partir do mapa do genoma
da soja (Cregan et ai., 1999). Os fragmentos so separados por
eletroforese em gel de poliacriiamida (29:1, acrilamida:bis-acrilamida)
10%, corados em uma soluo de brometo de etidio (0,5 ig mF 1 ) e foto-
grafados sob luz UV. A partir do perfil das bandas nos gis, construda
uma matriz de dados numricos para cada marcador, considerando-se
1 (presena de banda da parental Bossier) e 2 (presena da banda da
parental Embrapa 20).
Os clculos da freqncia de recombinao, da distncia gentica entre
os diferentes marcadores genticos e da determinao do posicionamento
dos marcadores esto sendo feitos como auxlio do programa
MAPMAKER/EXP. O agrupamento dos marcadores est sendo feito ado-
tando um valor limite de deteco (LOD) de 3,0 e a converso da freqn-
cia de recombinao para centimorgans (cM) com a distncia de
mapeamento de Haldane (r= 050).
Na Figura 1, pode-se verificar os resultados obtidos com a amplificao
de um dos "primers" do tipo microssat[te.
Consideraes Finais
Quarenta e dois marcadores apresentaram-se polimrficos para os

parentais Bossier e Embrapa 20 e esto sendo amplificados na popula-
o. At o presente momento, sete marcadores foram amplificados na
populao.
Agradecimentos
Projeto financiado parcialmente pelo CNPq 400710/2004-8 e 301241/2004-

0) e pelo PRONEX.
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ni Embrapa Soja. Documentos, 268
Anlise filogentica de rizbios, utilizados em

inoculantes comerciais brasileiros, com base
no seqenciamento do gene ribossomal IGS
Pmela Menna'; Fernando Gomes Barcellos 2 ; Jesiane Stefnia da Silva Ba-

tista 3 ; Eliane Bange1 4 ; Rubens Jos Campo 5 ; Mariangela Hungria 5 Bolsista
. 1
de mestrado da CAPES; 2 Bolsista de ps-doutorado do CNPq; 3 Bolsista de

mestrado da Embrapa; 4 FEPAGR0; 5Embrapa Soja.
Introduo
Rizbios so bactrias capazes de fixar o nitrognio atmosfrico (N 2) e

convert-lo a uma forma assimilvel pelas plantas, quando em simbiose
com determinadas plantas da familia Leguminosae (Hungria, 1994). Esse
processo, conhecido como fixao biolgica do nitrognio (FBN), permite
suplementar ecossistemas naturais com novas quantidades de nitrognio
(N), aproveitando a reserva inesgotvel de N 2 presente na atmosfera
(Drozdowicz, 1997). Contudo, apesar da importncia ecolgica e econ-
mica, os rizbios tm sido relativamente pouco estudados. Com base nos
dados de seqenciamento do gene ribossomal 16S, existem atualmente
cinco gneros de rizbios descritos, Azorhizobium, Bradyrhizobium,
Mesorhizobium, Rhizobium e Sinorhizobium, e mais de 40 espcies com-
preendidas na subclasse alfa das proteobactrias (Garrity & Holt, 2001).
Recentemente, o estudo da diversidade de rizbios resultou na identifica-
o de novas espcies simbiticas, como no caso de bactrias do gnero
Burkholdera ( Moulin et ai., 2001), pertencente subclasse beta das
proteobactrias, e Methy!obactehum ( Sy et ai., 2001), tambm na subclasse
alfa. Como em muitas outras bactrias, as anlises de diversidade, filogenia
e taxonomia dos rizbios tm sido derivadas, principalmente, de seqncias
nucleotidicas do gene 1 6S rRNA. Ouso desse gene se deve constatao
de que ele suficientemente conservado, o que permite o estabelecimento
de relaes evolucionrias universais, entretanto, com variabilidade suficiente
para permitir a classificao bacteriana (Wang & Martinez-Romero, 2000).
No Brasil, diferentes instituies de pesquisa so depositrias de cole-

es de culturas de rizbios, provenientes de distintas leguminosas, sen-
do que a "Coleo de Culturas SEMIA" do Centro de Pesquisa de Fixao
Biolgica do Nitrognio, da Fundao Estadual de Pesquisa Agropecuria
do Rio Grande do Sul (FEPAGRO), a responsvel pela manuteno e
distribuio de estirpes recomendadas para o uso em inoculantes comer-
ciais. Algumas dessas leguminosas so de grande importncia econmi-
ca nacional ou regional, como a soja, o feijoeiro, a ervilha, o feuo - de-
corda, o amendoim, a alfafa, os trevos e diversas leguminosas arbreas
utilizadas em programas de recuperao de reas degradadas e para
reflorestamento. Embora a coleo de cultura 'SEMIA" seja um reservat-
rio de estirpes de rizbios, resultantes de programas de seleo durante
dcadas, muito pouco se conhece sobre a diversidade e relaes genti-
cas existentes entre as mesmas e suas respectivas plantas hospedeiras,
em regies tropicais.
Objetivos
Determinar as relaes filogenticas e, assim, inferir as posies

taxonmicas, com base no seqenciamento do gene ribossomal 165, de
68 estirpes SEMIA recomendadas como inoculantes para 64 leguminosas
de importncia econmica e/ou ambiental para o Brasil.
Material e Mtodos
- Estirpes utilizadas
Foram analisadas 68 estirpes provenientes da FEPAGRO, denominadas
SEMIA (Seco de Microbiologia Agricola), isoladas de 46 distintas
leguminosas e recomendadas, como inoculantes, para 64 leguminosas.
Extrao do DNA e amplificao por PCR da regio do DNA que codifica
para o gene 16S RNAr e purificao dos produtos obtidos
A extrao do DNA foi realizada conforme descrito por Fernandes et ai.
(2003). 0 DNA obtido foi diludo a 20 ng de DNA pL 1 e, a seguir, mantido
a -20 0 C. O DNA de cada estirpe foi amplificado com "primers" para a re-
gio do gene ribossomal 16S, conforme descrito por Weisburg etal. (1991).
Os produtos de PCR obtidos foram, posteriormente, precipitados utihzan-
do o protocolo de precipitao por acetato de amnio (7,5M) e etanol.
Aps a precipitao, a concentrao do DNA de cada amostra foi verificada
em gel de agarose a 1.5%, ajustada para 40 ng DNA pL e mantida a -
20C.
- Seqenciamento e anlise do gene 16S rRNA
Os produtos de PCR obtidos de cada estirpe (80 ng por reao) recebe-
ram uma mistura de 3 iL de dye (DYEnamic ET terminator reagente para
o MegaBACE, Amersham Biosciences), e 3 pmol de cada "primer". Para
que a seqncia completa do gene 16S rRNA fosse obtida, foram realiza-
das cinco reaes com os seguintes primers fDl, Y2, (Fernandes et aI.,
2003) e 362f, 786f e 1203f (Prof. Leonardo M. Cruz, Dept. de Bioquimica,
UFPR, Curitiba, PR, Brasil). Aps amplificao, cada 20 pL de reao
foram precipitados utilizando o protocolo de precipitao com acetato de
amnio (7,5M) e etanol e, ento, procedeu-se ao seqenciamento
(MegaBACE 1000 DNA). As seqncias obtidas foram reunidas em
"contigs" usando os programas phred, phrap e consed e depositadas no
Banco de dados (GeneBank), onde receberam um nmero de acesso de
AY904726 a AY904789. Posteriormente, uma rvore filogentica foi
construda, utilizando uma anlise de "bootstrap" de 2.000 repeties e o
coeficiente de Neighbour Joining (NJ).
Resultados
O dendrograma resultante, aps a anlise das seqncias do 16S RNAr,

revelou heterogeneidade e dividiu as estirpes em nove grupos principais,
reunidos em um nvel de similaridade de 77,8%. Sete destes grupos fo-
ram relatados aos gneros/espcies de Bradyrhizobium japonicum, S.
e/kanii, Rhizobium tropicilA grobacterium (reciassificado como Rhizobium),
IR. Ieguminosarum, Sinorhizobium me!iloti/S. fredif, Mesorhfzobium ciceri/
M. !oti, e Azorbizobium caulinodans ( Fig. 1).
Foi possvel observar alguns agrupamentos distintos, com estirpes apre-
163 rRNA,1450
NJ, .10, boct2000
99
76
A2olhizobiurn sp.
I.leorhizobiuru
6.rneli!oti
Rhizobiurn sp.
Age ob a cl erlu m
Rhizobiurn + 4grobacteiurn
99 R Iis384
64 R.Iegurnincsarum
- .. Cuikholderia
0.02
Figural. rvore filogentica, baseada no seqenciamento de gene 16S rRNA,

de 65 estirpes simbiontes de 46 leguminosas e oficialmente
recomendadas para o uso em inoculantes comerciais brasileiros, bem
como de estirpes-tipo e estirpes utilizadas como referncia das espcies
de rizbios. Anlise considerando o algoritmo Neighbour Joining e os
nmeros indicam os resultados obtidos na anlise por "bootstrap" com
2000 repeties.
sentando discrepncia em mais de 15 nucleotdeos das estirpes-tipo, su-

gerindo que essas podem estar relacionadas a novas espcies e, desse
modo, foram classificadas como "sp.".
Os resultados demonstraram uma elevada promiscuidade quanto plan-
ta hospedeira, com estirpes estabelecendo simbiose com leguminosas
pertencentes a distintas tribos e at mesmo distintas subtamilias. Desse
modo, os resultados demonstraram no haver correlao evolucionria
entre as estirpes analisadas e suas respectivas plantas hospedeiras, em
regies tropicais.
Consideraes Finais
A comparao de seqncias do gene ribossomal 16S demonstrou ser

uma ferramenta poderosa para deduzir relaes filogenticas e

evolucionrias, alm de definir posies taxonmicas entre bactrias ca-
pazes de fixar N em simbiose com leguminosas. O grau elevado de di-
versidade gentica observado entre as estirpes demonstra que as regi-
es tropicais so importantes reservatrios de genes de fixao de nitro-
gnio 1 os quais ainda necessitam ser explorados.
Agradecimentos
Projeto financiado parcialmente pelo CNPq (47177312004-2, 301241/2004-

0) e pelo PRONEX. Os autores agradecem a Ligia Maria O. Chueire pelo
apoio na conduo das anlises.
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134 Embrapa Se/a. Documentos, 268
Parmetros microbiolgicos como

indicadores de qualidade do solo em
sistemas de manejo e rotao de culturas
Rosinei Aparecida de Souza 1 ; Letcia Carlos Babujia 2 ; Thais Portantiolo

Correa2 ; Eleno Torres 3 ; Julio Cezar Franchini3 ; Mariangela Hungria 3 Mestranda
. 1
em Qumica Ambiental da UEL; 2 Estudante de graduao do Curso de Qumica da

UEL; 3Embrapa Soja.
Introduo
Alguns experimentos tm indicado que o plantio direto (P0), associado

rotao de culturas, pode incrementar a biomassa microbiana (BM) quali-
tativa e quantitativamente. Alm disso, outras populaes de microrganis-
mos relevantes para a agricultura, como os rizbios fixadores de N 2 e
fungos micorrizicos, podem ser beneficiadas. Um dos principais efeitos
resultantes do incremento na BM o do aumento temporrio nas imobili-
zaes de N e outros nutrientes que sero, posteriormente, liberados len-
tamente, de acordo com as necessidades das culturas (Balota etal. 1 1998,
2003; Hungria, 2000).
Tem sido sugerido que mudanas quantitativas e qualitativas na popula-
o de microrganismos do solo podem refletir em mudanas na qualida-
de do solo sendo, portanto, potencialmente adequadas como indicadores
do efeito do manejo do solo e das culturas. Entretanto, existe deficincia
de informaes consistentes, especialmente para os trpicos, a respeito
dos efeitos, a longo prazo, da adio de diferentes resduos culturais e do
uso de sistemas de manejo do solo, sobre a atividade microbiolgica.
Informaes sobre o efeito do manejo do solo e da cultura na microbiota
do solo precisam ser obtidas, pois representam a base da sustentabilidade
agrcola.
Jornada acadm/ca da Emb,apa Soja 135
Objetivos
Avaliar o potencial de uso de parmetros microbiolgicos para monitorar

mudanas do solo em resposta aos sistemas de manejo do solo e de
rotao de culturas.
Material e Mtodos
O ensaio de campo foi estabelecido em 1997, na estao experimental da

Embrapa Soja, em Londrina. O experimento foi desenhado para compa-
rar os efeitos dos sistemas de plantio direto (P0) e convencional (PC) e
rotao de culturas, incluindo culturas de gros (soja, milho e trigo) e cul-
turas de cobertura (tremoo e aveia preta). Os sistemas de rotao so
apresentados na Tabela 1. O ensaio foi delineado em blocos ao acaso,
com quatro repeties.
Tabela 1. Sistemas de manejo adotados para o ensaio.
Rotaes Inverno 97 Vero 97/98 Inverno 98 Vero 98/99 Inverno 99

1 Aveia Milho Aveia Soja Trigo
2 Aveia Soja Tremoo Milho Aveia
3 Aveia Soja Trigo Soja Tremoo
continua...
continuao Tabela 1
Rotaces Vero 99/00 Inverno 00 Vero 00/01 Inverno 01 Vero 01/02
1 Soja Tremoo Milho Aveia Soja
2 Soja Trigo Soja Tremoo Milho
3 Milho Aveia Milho Triqo Milho
As taxas de emisso de CO 2 do solo foram determinadas em treze perodos,

seis antes e sete depois da arao do solo, durante o perodo de agosto a
novembro. O CO2 foi avaliado nos tratamentos que estavam sob as cultu-
ras de aveia e trigo com o uso de cmaras estticas (tubos de PVC, 10 x
20cm, dimetro x comprimento), pelo mtodo da armadilha alcalina, modi-
ficado deAnderson (1982) e os valores foram expressos em g de CO 2-C m 2

dia 1 . O carbono e o nitrognio da biomassa microbiana (CBM e NBM)
foram determinados antes e aps o preparo do solo no PC. Cinco
subamostras foram coletadas na camada de 0-10 cm, homogeneizadas e
combinadas como uma amostra por parcela. A biomassa microbiana do
solo foi avaliada pelo mtodo da fumigao-extrao, com valores de 0,33
e 0,54 para o quociente de extrao de C e N, respectivamente (Brookes
et ai., 1985; Vance et ai., 1987). Os teores de C e N nos extratos foram
determinados por espectrofotometria, segundo Bartiett & Ross (1988) e
(Feije & Anger, 1972), respectivamente. Os valores obtidos para a BM
foram corrigidos para a densidade do solo e expressos em g m -2 .
O quociente metablico (q002) foi estimado atravs da razo entre a

emisso de CO 2 e CBM obtidos antes e aps a arao, sendo expresso
como mg of CO 2-C g 1 de CBM dia -1 . As analises estatisticas foram reali-
zadas para cada tempo de amostragem e combinando as amostras antes
e aps a arao do solo no PC.
Resultados
As taxas de emisso de 002 foram afetadas pelas varias no perodo

de amostragem, bem como pelo cultivo e sistemas de rotao de cultu-
ras. Antes da arao do solo no PC, as emisses de 002 foram similares
nos sistemas de manejo, entretanto, aps a sexta amostragem, a arao
aumentou as perdas de 002 no PC em 57%, quando comparado com o
PD. Considerando todas as amostragens, as emisses foram 21% maio-
res no PC (dados no mostrados).
Em relao rotao de culturas, a emisso mdia total de CO 2 foi 13%
maior na rea previamente cultivada com tremoo do que naquela com
trigo. Diferenas entre as culturas foram associadas com a decomposi-
o dos resduos de tremoo entre a terceira e a sexta amostragens aps
o corte, com valores similares entre os resduos aps essa coleta, indi-
cando uma rpida taxa de decomposio dos resduos da leguminosa.
Deste modo, aps a sexta coleta as taxas de emisso de CO 2 foram 31%
menores do que as observadas previamente (dados no mostrados).
A BM foi influenciada pelo momento de amostragem e pelo sistema de

manejo, mas no pelos sistemas de rotao de culturas (Tabela 2). Aps
cinco anos, o CMB e o NMB foram 80% e 104% maiores no PD do que no
PC, respectivamente. As diferenas entre amostragens foram observa-
das apenas no CMB no PD e foram associadas com a cultura do tremoo.
A menor BM no PC foi associada com maior emisso de CO 2 implicando
em pouca converso do C dos resduos em BM. tambm notvel que as
diferenas entre o PD e PC, em relao BM, tenham ocorrido num pero-
do de tempo relativamente curto, de cinco anos (Tabela 2).
Tabela 2. Carbono e nitrognio microbiano nos perodos de pr-arao e

ps-arao, em sistemas de manejo do solo e rotao de
culturas.
C-microbiano (g m 2 ) N-microbiano (g m 2 )
Mdia Pr-arao Ps-arao Mdia Pr-arao Ps-arao

............................................ Tratamentos ..................................................
Cl 34,74b 35,02b 34,46b 4,761b 5,21b 4,321b
C2 32,06b 29,731b 34,391b 4,16b 4,71b 3,61b
C3 28,601b 25,961b 31 ,25b 4,901b 5,33b 4,48b
Dl 55,11a 51,89a 58,33a 10,09a 10,98a 9,19a
D2 62,08a 56,96a 67,20a V 9,53a 9,47a 9,58a
D3 54,59a 50,96a 58,21a 8,65a 9,29a 8,01a
....................................... Sistemas de Manejo ...........................................
C 31,80 30,24 33,37 4,61 5,08 4,14
O 57,26 53,27 61,25 942 9,92 8,93
c: Pc; D: PD; 1, 2 e 3 se referem a aveia, tremoo e trigo, respectivamente, conforme
seqncia do culturas dos sistemas de rotao descritos na Tabela 1. Letras indicam
diferenas entre sistemas de manejo com a mesma cultura. indica diferena entre mdias de
sistemas de manejo. V indica diferena entre pocas de amostragem
A eficincia da comunidade microbiana foi maior no solo sob PD; em mdia,

o quociente metablico (qCO2 foi 55% menor do que no PC. O qCO2 foi
)
maior antes da arao do solo no CT e, aps essa etapa, pareceu estar

relacionado com a decomposio dos resduos, embora nenhuma rela-
o tenha sido observada com as culturas (dados no mostrados).
Consideraes Finais
Os maiores valores encontrados de CBM e NBM e as menores taxas de

emisso de 002 e menores quocientes metablicos (qCO2 ) encontrados
no P0, em comparao ao PC, enfatizam a importncia do PD para a
conservao da matria orgnica do solo. Os parmetros microbiolgicos
avaliados neste estudo responderam com rapidez e sensibilidade aos efei-
tos do manejo do solo, demonstrando serem adequados como indicado-
res da qualidade do solo.
Agradecimentos
Projeto parcialmente financiado pela Fundao Araucria (convnio 0461

2003) e pelo CNPq (30124112004-0 e PRONEX).
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; . '
da UNIFIL; 2 ESALQ; 3 I13I1-CE/UNESP; 4 Embrapa Soja.
Introduo
Arachis repetis Handro, planta da famlia Fabaceae (http:11scisun.nybg.org:88901

searchdb/owa/wwwcatalog.detail_list?this_id=4062504At) tem sido utiliza-
da em jardinagem como cobertura de solo. A planta cultivada como
forrao maneira de gramado, apresentando folhagem sempre verde
que lhe confere notvel efeito decorativo.
Algumas plantas de jardins localizados na rea urbana de Londrina, PR e

em reas rurais, protegendo curvas de nvel, apresentavam folhas reduzi-
das e com sintomas de mosaico (Fig. lA). Esses sintomas sugeriam a
presena de vrus.
Figura 1. (A) Sintomas de mosaico observados em plantas de Arachis repons

Handro naturalmente infectadas. (B) Fotomicrografia de particula do vrus
identificado em plantas de Arachis repetis Handro, com sintomas de
mosaico.
Como essas plantas tambm aparecem prximas a campos de soja, pro-

curou-se identificara possvel ocorrncia de vrus em Arachi.s repens atra-
vs de ensaios de estudos de gama de hospedeiras, transmisso mec-
nica, microscopia eletrnica, purificao e sorologia.
Material e Mtodos
Coleta de plantas e multiplicao. Hastes de plantas com sintomas de

mosaico foram retiradas das plantas e transplantadas para solo estril.
Aps cerca de 30-45 dias, folhas com sintomas foram utilizadas como
fonte de inculo para estudos de hospedeiras diferenciais.
Microscopia eletrnica. Amostras de folhas com sintomas de mosaico
foram analisadas em microscopia eletrnica de transmisso ('leaf dip")
segundo Kitajima & Nome (1999)
Gama de hospedeiras. Plantas da espcie Phaseolus vulgaris (varieda-
des Jalo, Manteiga, IAPAR 144, Carnaval, Rosinha e Tibagi) e Glycine
max cv. CD 206 foram inoculadas com suspenso viral obtida a partir da
macerao de tecido foliar sintomtico, na presena de tampo fosfato de
potssio 0,0I1V1, pH7, utilizando carvo vegetal finamente modo como
abrasivo. Aps a inoculao, as plantas foram lavadas e mantidas em
casa-de-vegetao. As avaliaes foram feitas aos 14 e 21 dias aps a
inoculao.
Purificao. Folhas de plantas infectadas foram coletadas e modas em
tampo fosfato de potssio 0.5 M, pH 7.0, contendo 0,005M EDTAe sulfito
de sdio 0,1%, na proporo 1:2 (glv) segundo Gaspar & Costa (1993). O
macerado foi filtrado em gaze e, em seguida, clarificado com % volume
da mistura de clorofrmio e tetracloreto de carbono (1:1), sob agitao
por 30 mm. Aps a clarificao, o material foi submetido centrifugao
de 10.950 g por 15 mm. O sobrenadante foi coletado, adicionando Triton
X-1 000.5% e PEG 80006% e mantendo sob agitao constante por duas
horas a 4C. Aps esse perodo, o material foi centrifugado por 15 min a
10.950 g e o precipitado ressuspendido em 10% do volume inicial (tam-
po fosfato de potssio 0,51V1, 0,02M EDTA, Triton X-100 0,1% e DTT 1M
142 Em/napa Soja. Documentos, 268
01%) e ficando sob agitao por aproximadamente 12horas. O material

foi novamente submetido centrifugao por 15 minutos (10.950 g). O
sobrenadante foi coletado e ultracentrifugado a 110.000 g por 90 mm. A
preparao semipurificada do vrus foi submetida a gradiente de sulfato
de csio (50%-10%), o qual foi ultracentrifugado a 110.000 g por duas
horas. A banda resultante foi recolhida e submetida a uma nova
ultracentrifugao nas mesmas condies anteriores.
Eletroforese de protena capsidial. A massa molecular da protena
capsidial foi determinada atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida
a 10% com SDS, descrito por Laemmli, 1970. A anlise foi realizada
temperatura ambiente, com utilizao do tampo Tris-Glicina pH8.3, a 120v,
durante uma hora. Aps a eletroforese, o gel foi retirado da placa e corado
com Comassie Blue R 250. O clculo da massa molecular da protena
capsidial foi determinado pela regresso linear obtida com a distncia
migrada pelos padres de protenas utilizadas e as respectivas massas
moleculares.
ELISA indireto. O teste de ELISA indireto (Koenig, 1981) foi feito utilizan-
do anti-soro obtido pela imunizao de coelhos com preparaes
purificadas do Cowpea mild mott/e virus (CMMV), um membro do gnero
carlavirus. A imunoglobulina G (lgG) foi obtida aps purificao do anti-
soro. Utilizaram-se duas diluies da lgG (1:500 e 1:1000). O extrato ve-
getal foi utilizado nas diluies de 1:300, 1:500 e 1:1200. Duas outras
espcies vegetais, infectadas pelo CMMV foram utilizadas alm de A.
repens. A amostra de folhas de feijo 'Jalo' sadio foi utilizada como con-
trole negativo.
A anlise de microscopia eletrnica demonstrou a presena de partculas

alongadas, com cerca de 650 nm, tpicas de vrus do grupo carlavirus
(Fig. IB). Os sintomas induzidos em diferentes plantas hospedeiras e a
reao de plantas infectadas demonstraram que o vrus possui estreita
gama de hospedeiras.
Sintomas de clorose nas plantas de feijo inoculadas apareceram cerca

de 16 dias aps a inoculao, e todas as variedades inoculadas apresen-
taram resposta positiva infeco do vrus, comprovando a ocorrncia de
um agente infeccioso.
Eletroforese feita a partir de suspenso purificada do vrus mostrou banda
com massa molecular de 33 kDa, similar quela observada com o CMMV
(Fig. 2).
97 kDa
66 kDa
45 kDa
30 kDa
20,1 kDa
Figura 2. Eletroforese de proteina capsidial do

14,4 kDa virus isolado de Arachs repens
Handro.
Os resultados obtidos por ELISA indireto demonstram que o anti-soro re-

agiu com todas as amostras infectadas, incluindo a amostra de A. repens,
o que demonstra ser o vrus estudado, o CMMV. Todas as diluies utili-
zadas de lgG e de antigeno (extrato foliar infectado) apresentaram resul-
tados positivos (Fig. 3).
O vrus isolado de A. repens infectou apenas plantas da famlia Fabaceae.
Arachis repetis normalmente multiplicado por estaquia, o que deve co-
laborar para sua disseminao. Embora no tenha sido testado, acredita-
se que sua disseminao seja atravs de mosca branca, similar trans-
misso do CMMV.
0,9
0,8
E 0,7
0,6 O Soja (VNHS)
'
300
1ljhJTulL)hiJhll
lgG 1:500 IgG 1:1000
Diluies
Figura 3. Absorbncia observada entre amostras infectadas e sadias por ELISA
indireto, utilizando lgG purificada contra o Cowpca miM mottlo vrus.
Amostras diludas em 1:300, 1:500 e 1:1200.
Referncias
GASPAR, J.O.; COSTA, A.S. Vrus do mosaico angular do feijoeiro:

purificao e ultraestrutura dos tecidos infectados, 1993. 534-540 p.
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tal. In Docampo, D.M. & Lenardn, S.L. eds. Mtodos para detectar
patgenos sistmicos. Crdoba, IFFIVE/INTA-JICA, 1999. 59-87 p.
KOENIG, R. lndirect ELISA methods for the broad specificity detection
of plant viruses, 1981. 53-62 p. (Journal of Geneneral Virology, 55).
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly
of the head of bacteriophage T4, 1970. 680-685 p. (Nature 227).
Jornada acadmica da Em/rapa So/a 145
Distribuio de carbono e estabilidade de

agregados em amostras indeformadas de
diferentes sistemas de manejo de solo
Thais P. Correa'; Letcia C. Babujia 1 ; Rosinei A. Souza 2 ; Eleno Torres 3; Jlio

Cezar Franchini3 Estudante de graduao da UEL; 2Mestranda da UEL; 3Embrapa
. 1
Soja.
Introduo
A matria orgnica do solo (MOS) a principal responsvel pela forma-

o e estabilidade de agregados, que por sua vez, determinam maior re-
sistncia do solo eroso e uma estrutura mais adequada para o estabe-
lecimento e desenvolvimento das culturas. O manejo inadequado, com
excessivo revolvimento, pode causar uma rpida deteriorao da estrutu-
ra devido a desorganizao do ambiente do solo e o conseqente aumen-
to na oxidao da MOS. A agregao do solo e a dinmica de formao
de agregados so importantes em vrios aspectos, proteo da fsica da
MOS, fornecimento adequado de gua e oxignio para as razes, forneci-
mento de microhabitats para a macro e microfauna do solo e formao de
poros de maior dimetro que favorecem a infiltrao de gua reduzindo o
escorrimento superficial e a eroso. A adoo de sistemas de manejo
com menor revolvimento do solo tem sido indicada para a recuperao
dos teores de MOS e da estabilidade estrutural de solos degradados pelo
uso do plantio convencional (Castro Filho et ai., 2002; Madari et ai., 2005).
Neste contexto este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito de siste-
mas de manejo com diferentes taxas de revolvimento do solo sobre a
dinmica de agregao e distribuio de carbono em agregados.
Material e Mtodos
A dinmica de agregao foi avaliada em experimento de longa durao

estabelecido na fazenda experimental da Embrapa Soja, em Londrina,
PR. Foram amostrados os tratamentos sob plantio direto continuo (PD),

plantio direto com escarificao com arado cruzador a cada trs anos
(PDc), plantio convencional contnuo (PC) e a converso do plantio con-
vencional para o plantio direto (PDn). Os trs primeiros sistemas foram
estabelecidos em 1989, enquanto o ltimo em 2001, apresentando por-
tanto 16 e 3 anos, respectivamente, no momento da avaliao. Os siste-
mas foram sempre cultivados com a sucesso soja/trigo. Em outubro de
2004, foram coletadas amostras indeformadas de solo na camada de 0-
10 cm. As amostras foram coletadas em recipientes plsticos com dimen-
ses dell cmxli cmx 10cm (largura, comprimento e altura, respectiva-
mente). Os blocos foram saturados durante 20 minutos e transferidos para
a peneira superior de um conjunto constitudo por peneiras com abertura
de malha decrescente, 8,00; 4,00; 2,00; 1,00 e 0,50 mm. As peneiras es-
tavam contidas em um recipiente com gua e foram submetidas oscila-
o vertical de 5 cm numa taxa de 30 ciclos por minutos, durante 30 minu-
tos. A seguir, o solo retido em cada peneira foi separado. A frao <0,50
mm foi passada por peneira de malha de 0,053 mm e a suspenso resul-
tante foi floculada com CaCl Todas as fraes foram pesadas, secadas,
modas e analisadas quanto ao seu teor de carbono (C) por oxidao com
dicromato em meio cido. A massa dos agregados foi utilizada para o
clculo do dimetro mdio geomtrico (DM0) segundo Schaller &
Stockinger (1953).
A estabilidade de agregados foi alterada pelos sistemas de manejo do

solo (Figura 1). De modo geral, nas classes >2,00 os sistemas de plantio
direto apresentaram maior proporo de agregados, enquanto nas classes
<2,00 a maior proporo de agregados ocorreu no plantio convencional.
Deste modo, o revolvimento do solo proporcionou uma reduo do DM0
dos agregados, que foi de 1,33; 1,30; 1,18 e 1,06 mm, para os sistemas
P0, PDc, PDn e PC, respectivamente. As classes mais afetadas pelos
sistemas de manejo foram as de agregados >8,00 mm e de 0,5-0,053 mm.
0 teor de C nas classes de agregados foi maior nos sistemas de PD e
PDc em relao aos sistemas PDn e PC (Figura 2). De modo geral, o teor
de C foi proporcional ao tamanho das classes, at a classe de 1-0,5 mm,
onde foram observados os menores teores. Nas classes seguintes (0,5-
0,053 e <0,053) os teores de C tenderam a aumentar em todos os siste-
mas, e no PC a classe de partculas primrias foi a que apresentou o
30
25
20
e15
lo
5
o
>8 8-4 4-2 2-1 1-0,5 0,5-0,053 <0,053
Classes (mm)
Figural. Distribuio das classes de agregados em sistemas de manejo do solo.

PC: plantio convencional; PDn: plantio direto 3 anos; PDc: plantio direto/
cruzador 3 anos; PD: plantio direto continuo.
25
20
ct 15
o
O, 10
0 5
:ii
>8 8-4 4-2 2-1 1-0,5 0,5-0,053 <0,053
Classes (mm)
Figura 2. Teor de carbono das classes de agregados em sistemas de manejo do

solo. PC: plantio convencional; PDn: plantio direto 3 anos; PDc: plantio
direto/cruzador 3 anos; PD: plantio direto continuo.
maior teor de C. Esse comportamento demonstra que os agregados > 0,5

mm proporcionam melhor proteo ao C, razo pela qual seu acmulo
aumentado nestas classes. No caso do PC, a menor agregao nas clas-
ses maiores diminuiu a proteo do C, o que torna seu teor maior na
classe representada pelas partculas primrias (<0,053 mm).
A distribuio do C entre as classes de agregados seguiu a mesma ten-
dncia observada para a estabilidade das classes, sendo portanto, maior
a quantidade de C nos sistemas de plantio direto nas classes >2,00 mm,
enquanto nas classes c 1,00 mm a quantidade foi maior no PC (Figura 3).
00
o
04
>8 8-4 4-2 2-1 1-0,5 0,5-0,053 <0,053

Classes (mm)
Figura 3. Distribuio de carbono nas classes de agregados em sistemas de
manejo do solo. PC: plantio convencional; PDn: plantio direto 3 anos;
PDc: plantio direto/cruzador 3 anos; PD: plantio direto continuo.
O comportamento do sistema PDn demonstra que o plantio direto contri-

buiu para a recuperao da estabilidade de agregados antes mesmo que
ocorressem alteraes significativas nos teores de C nos agregados. Esse
comportamento pode estar associado com as alteraes no ambiente f-
sico e biolgico que contribuem para a estabilizao dos agregados por
mecanismos no afetados diretamente pelo carbono, como a estabiliza-
o por hifas de fungos e razes.
A coleta de blocos indeformados de solo para determinao da estabilida-
de de agregados permitiu a identificao de duas classes potencialmente
afetadas pelo manejo: > 800 e 05-0,053 mm. A vantagem deste mtodo
que ele no altera a disposio natural dos agregados no solo como
outros mtodos que fazem pr seleo de agregados no campo e aca-
bam selecionando agregados de maior dimetro (Madari et ai., 2005).
Outra vantagem do mtodo, foi a possibilidade de observar de forma clara
a participao do C na estabilizao de agregados> 1,00, que por outros
mtodos tem sido atribuida apenas a agregados > 4,00.
Concluso
A estabilidade de agregados diretamente afetada pela intensidade de

revolvimento do solo e tem relao direta com a conservao do C no
solo.
Referncias
CASTRO FILHO, C.; LOURENO, A.; GUIMARAES, ME; FONSECA,

I.C.B.. Aggregate stability under different soll management systems in a
red latosol in the State of Parana, Brazil. Soil TilI. Res., 2002. 65, 45-51.
MADARI, 3.; MACHADO, P.L.O.A.; TORRES, E.; ANDRADE, A.G.; VA-
LENCIA, L.I.O.. No tillage and crop rotation effects on soil aggregation
and organic carbon in a Rhodic Ferralsol from southern Brazil. SoU TiO.
Res., 2005. 80:185-200.
SCHALLER, EW.; STOCKINGER, K.R..Acomparison of tive methods for
expressing aggregation data. SoU Sci. Soc. Am. Proc., 1953. 17:310-
313.
Grupos de desenvolvimento humano:

uma proposta para a promoo da auto-anlise
e autogesto na Embrapa Soja
Danieli de Cssia Barreto 1 Vivian Maria Stabile Fumo 1 Talita Soares Lope&;
; ;
Camila Lombardi Padovezi 1 Rosety Jung Pisicch10 2 Lucila Gazzola. 1 Estagi-

; ;
rias da Embrapa Sola; 2Embrapa Soja.
Introduo
Conhecer a histria do trabalho, identificar as caractersticas particulares

da organizao, as relaes de poder nela institudas e tambm as for-
mas de expresso que a organizao permite aos seus trabalhadores,
constituem aspectos indispensveis para que se possa entender a
intrincada relao individuo-trabalho-organizao.
O conhecimento de tal relao permite que se tenha condies de propor
aes que venham favorecer tanto o trabalhador - em seu desenvolvimento
pessoal e interpessoal - quanto o'ganizao da qual ele participa.
Conforme as pessoas executam e praticam suas aes, vo se construin-
do como sujeitos. Nessa construo, o trabalho adquire um dos papis
sociais de maior destaque, pois contribui na produo de sua subjetivida-
de. Segundo Guattari e Rolnik (1993), a subjetividade funciona tecendo
modos de ser, que determinam diferentes maneiras de agir, sentir e pen-
sar. Em outras palavras, a subjetividade a produo de distintos modos
de vida, atravs dos quais os indivduos vem, sentem e se relacionam
com o mundo.
Uma das formas de se resgatar a subjetividade das pessoas que traba-
lham nas organizaes atravs da utilizao do referencial terico da
Anlise Institucional. Essa tem como proposta criar situaes que propor-
cionem espaos de fala, reflexo e ao (Baremblitt, 2002).
A finalidade da Anlise Institucional a implantao de dois processos
simultneos e articulados: a auto-anlise e a autogesto. A auto-anlise
implica na produo de um saber, ou seja, do conhecimento do grupo

acerca dos seus problemas, necessidades e recursos. Para chegar a esse
ponto, preciso criar dispositivos, ou seja, organizar-se. Quando o grupo
alcana esse nvel de organizao e capaz de colocar mudanas em
prtica, pode-se dizer que esse grupo alcanou a autogesto.
atravs do trabalho com grupos que se podero concretizar tais proces-
sos. Segundo Osrio (2003, p. 57), grupo definido como "o conjunto de
pessoas capazes de se reconhecerem em sua singularidade e que esto
exercendo uma ao interativa com objetivos compartilhados".
Na Embrapa Soja, atravs dos grupos de Desenvolvimento Humano
(DH) que se busca desenvolver a auto-anlise e a autogesto, e assim,
resgatar a subjetividade das pessoas que nela atuam.
Objetivos
- Conhecer como as relaes de poder/saber acontecem dentro da orga-

nizao, favorecendo o espao de fala, com vistas a transformaes
desejveis pelos trabalhadores e pela empresa.
- Oportunizar os processos de auto-anlise e autogesto dos grupos.
- Favorecer o desenvolvimento das relaes interpessoais dentro da empresa.
- Estimular o trabalho em equipe e a circulao de lideranas.
- Transpor para o cotidiano organizacional as experincias construdas
nos grupos.
Desenvolvimento
Para a formao e a estruturao dos grupos de Desenvolvimento Huma-

no, existem regras necessrias, quais sejam: freqncia, horrio, dura-
o, sigilo e local das reunies. Todas essas regras, exceto sigilo, so
discutidas e elaboradas pelo grupo. O grupo passa a decidir sobre seu
funcionamento, ou seja, decidem sobre a participao ou no de um novo
integrante, os temas a serem trabalhados, etc.
A partir dos temas propostos pelo grupo, os quais devem estar relaciona-
dos ao cotidiano organizacional, as coordenadoras atuam como
facilitadoras dos processos de auto-anlise e autogesto do mesmo. Isso
quer dizer, estimulam os integrantes para que se articulem e analisem a
situao em que se encontram e, posteriormente, busquem aes con-
cretas e benficas para o grupo e a empresa como um todo.
Para referenciar o trabalho das estagirias e, por conseguinte, o trabalho
com grupos, so realizadas supervises semanais de campo e acadmi-
ca, supervises conjuntas, levantamento e estudos bibliogrficos para
orientar aes relacionadas aos grupos, e tambm, elaborao de relatos
das reunies para posterior confeco do relatrio acadmico.
Os grupos de Desenvolvimento Humano da Embrapa Soja tiveram seu
inicio em maro de 2004. A psicloga da unidade e as estagirias fizeram
visitas aos setores para explicao da proposta de interveno e a forma-
o dos grupos aconteceu de forma voluntria.
Inicialmente, foram formados seis grupos (Tabela 1). O grupo A interrom-
peu suas atividades em janeiro de 2005. O grupo D, devido sobrecarga
de trabalho, interrompeu temporariamente as reunies em novembro de
2004, com o compromisso de avaliar sua retomada no ano seguinte. Atu-
almente, h, na Embrapa Soja, quatro grupos de Desenvolvimento Hu-
mano em andamento (B, C, E, F). No ms de junho de 2005, o grupo D se
reencontrar e aguarda-se a confirmao de um novo grupo (G).
Tabela 1. Nmero de reunies de Desenvolvimento Humano e mdia de

participantes, no perodo de maro de 2004 a maio de 2005
Grupo N2 de reunies de DH Mdia de participantes
A 19
B 26
C 25
D 14
E 13 9
F 23 10
Jornada acadm/ca da Ernbrapa Soja 153
Resultados
O trabalho com os grupos possui resultados eminentemente qualitativos

e de difcil mensurao. Tais resultados podem ser observados atravs
da anlise e da evoluo das aes do grupo e, tambm, atravs dos
relatos de seus participantes, os quais podem ser exemplificados com as
seguintes falas:
"O trabalho em grupo tem uma viso de longo prazo".
"Aqui o espao pra gente conversar, discutir e se conhecer".
"Queria falar o que eu acho das reunies ( ... ) Antes eu era muito teimoso e
bruto com as pessoas, mas agora estou melhorando, estou me ajustando".
"Venho sim e estou gostando, porque estou aprendendo a me comunicar
com os outros. Antes, Unha poucos amigos; agora meu crculo de amigos
aumentou, j estou fazendo mais brincadeiras".
'Falar o que a gente sente, desabafar, bom. No funciona fazer de conta
que tudo est bom".
Entender, aprender com os colegas de trabalho. Eu penso de um jeito,
eles de outro. Ento acho que aqui a gente pode conhecer e melhorar as
relaes".
"O relacionamento com os outros j melhorou muito e pode melhorar ain-
da mais".
Os principais resultados alcanados nos grupos de Desenvolvimento Hu-
mano so: melhoria nas relaes interpessoais, auto-conhecimento, am-
pliao da viso da empresa, diviso de responsabilidades, troca de in-
formaes, compartilhamento de experincias, circulao de liderana,
exposio de sentimentos e opinies, e melhoria nos processos de trabalho.
Entende-se que este trabalho alcana seus objetivos e estimula o desen-
volvimento humano, uma vez que possibilita o resgate da subjetividade
dos trabalhadores, ao valorizar o conhecimento/saber e suas aes.
A continuidade deste trabalho ao longo dos anos conditio sitie qua
non para o alcance dos objetivos, pois esta uma das melhores for-
mas de valorizar o maior bem da organizao: as pessoas que nela

trabalham.
Bibliografia
BAREMBLITT, G. Compndio de Anlise Institucional e outras correntes:

teoria e prtica. 5. ed. Belo Horizonte: Instituto Felix Guattari, 2002.
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gia social. Londrina: UEL, 2001.
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DAVEL, E.; VASCONCELOS, J. (org) 'Recursos" humanos e subietivida-
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GUATTARI, E; ROLNIK, S. Micropoltica: Cartografias do Desejo. 3. ed.
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tividade. In: HELOANI, J. R. Organizao do trabalho e Administrao:
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vel. In: CODO, et ai (org) Trabalho, organizaes e cultura. So Paulo:
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KANAANE, R. Comportamento Humano nas organizaes: O Homem
Rumo ao sculo XXI. So Paulo: Atlas, 1999.
OSRIO, L. C. Psicologia grupal: uma nova disciplina para o advento de
uma era.9orto Alegre: Artmed, 2003.
Determinao de enzimas de lipoxigenase em

soja_crua e tratada de cultivares brasileiros
Andreia C. Santana 1 ; Wladimir S. Crancianinov 1 ; Adriana M. Freitas 1 ; Mercedes

Concrdia Carro-Panizzi 2 UEL; 2 Embrapa Soja.
. '
Introduo
No Brasil, a soja utilizada como principal fonte de leo comestivel e

como rao animal. Seu gro e sua farinha, no entanto, so muito pouco
usados para consumo humano direto, devido ao seu sabor desagradvel,
classificado como "feijo cru" ou ranoso, considerando-se o potencial
nutritivo da soja e a grande produo do gro no pas, isto um contra-
senso. Estudos comprovaram que o sabor desagradvel da soja est li-
gado a uma reao que forma compostos partir de cidos graxos
poliinsaturados, a qual catalisada pelas enzimas lipoxigenases. As
enzimas normalmente so ativadas durante o preparo dos alimentos, quan-
do os gros de soja so colocados em gua fria, e vrios compostos so
formados os quais apresentam sabores caractersticos. Na soja existem
trs lipoxigenases, as isoenzimas: lipoxigenase-1 (L-1), lipoxigenase-2
(L-2) e lipoxigenase-3 (L-3). Por meio de mutao gentica, induzida por
raios gama, pesquisadores japoneses obtiveram gentipos de soja mutante
com a ausncia das trs isoenzimas (CARRO-PANIZZI etal. 2000). Na
Embrapa Soja, no programa de melhoramento gentico para obteno de
cultivares de soja com caractersticas mais adequadas ao consumo hu-
mano, foram conduzidos cruzamentos para introduo dos genes para
ausncia de lipoxigenases em cultivares brasileiras. Como resultado, foi
obtida a cultivar BRS 213, que no apresenta lipoxigenases e que dever
ser comercializada em 2005. Outras tcnicas para melhorar o sabor da
soja utilizam metodologias que inativam as enzimas durante o
processamento dos alimentos. Por meio do tratamento trmico dos gros,
as enzimas perdem suas funes e o sabor pode ser suavizado. Reco-
menda-se tratar os gros em gua fervente por cinco minutos, colocando-
os logo aps em gua fria. Com isso, as lipoxigenageses se inativam,

pois so desnaturadas com o choque trmico, e perdem suas estruturas.
Objetivo
Determinar a atividade da enzima lipoxigenase em gros de soja tratados

com aquecimento e avaliar a eficcia deste processo para diminuir a ativi-
dade das lipoxigenases.
Materiais e Mtodos
Uma metodologia simples e rpida para determinar a ausncia ou pre-

sena dessas enzimas, o mtodo colorimtrico desenvolvido por
KIKUCHI (2001), que utiliza reagentes corantes e pequena quantidade de
amostra. Essa metodologia viabiliza a realizao de um grande nmero
de anlises, facilitando o trabalho de pesquisa e de melhoramento gen-
tico. Neste estudo, foram analisadas as cultivares produzidas pelo pro-
grama de melhoramento gentico da Embrapa Soja, BRS 213, BRS 133
e a BRS 216, quanto a sua reao ao tratamento trmico. Amostras de
farinha obtidas de gros crus( no tratados) e de farinhas obtidas de gros
tratados termicamente, foram analisadas pelo mtodo citado acima, onde
observa-se que a cor verde indica a ausncia das trs isoenzimas; azul
indica a ausncia das lipoxigenases L-1 e L-2; amarelo indica a ausncia
de L-3; e incolor indica a presena de todas enzimas.
Os resultados dos testes realizados neste experimento mostraram que

entre as amostras no tratadas termicamente, somente a cultivar BRS21 3
no apresentou as enzimas lipoxigenases, enquanto que as cultivares
convencionais BRS 133 e BRS 216 apresentaram a presena de todas as
lipoxigenases. Quando as amostras foram tratadas termicamente, no foi
constatada atividade das enzimas em todas as cultivares, o que mostrou
a eficcia do processamento trmico. Como a BRS 213 resultado de
cruzamentos que visaram retirada das lipoxigenases nos gros para

obteno de produtos com sabor superior, era esperado que, no teste, ela
apresentasse colorao verde (indicativo de ausncia de L-1, L-2. e L-3).
Esta cultivar, portanto, dispensa tratamento trmico, implicando em ob-
teno de produtos alimentares de soja com melhor qualidade.
Referncias
KIKUCHI,A. Simple and Rapid Method for the Detection of Lipoxigenase

Isozymes in Soybean Seeds. Anual Report 2001 n.8, p.47-48, 2001
CARRO-PANIZZI, M.C. Melhoramento Gentico da Soja para Obteno
de Cultivares Mais Adequados Para o Consumo Humano Revista Brasi-
leira de Nutrio Clnica v.15, n.2, p.330-340, 2000
Avaliao do teor de inibidor de tripsina de

kunitz e de isoflavonas em gros de soja
germinados da cultivar BRS 213
Wladimir S. Crancianinov 1 ; Adriana M. Ereitas 1 ; Andrela C. Santana'; Jos

Marcos Gontijo Mandarno 2 ; Mercedes Concrdia Carro-Panizzi 2 UEL; . 1
2 Embrapa Soja.
Introduo
A produo de soja no Brasil est voltada para a exportao de gros,

farelo protico e leo comestvel, bem como para a alimentao animal e
o para consumo humano. Para a produo de raes para sunos e aves
utilizado o farelo de soja, rico em protenas, nutriente necessrio para o
desenvolvimento destes animais (MORAIS & SILVA, 2000). Entretanto,
os gros de soja possuem em sua composio fatores anti-nutricionais
que podem prejudicar o desenvolvimento de humanos e animais. So
fatores anti-nutricionais: os inibidores de protease (inibidor de tripsina de
Kunitz - KSTI) e as lectinas (MORAIS & SILVA, 2000). No organismo hu-
mano e animal, o inibidor de tripsina liga-se enzima tripsina, respons-
vel pela digesto de protenas, impedindo assim que as protenas prove-
nientes da dieta sejam absorvidas e aproveitadas, com conseqente re-
duo no crescimento e desenvolvimento de humanos e animais (RACKIS,
1981). Os inibidores de protease so termolbeis sendo, portanto, parci-
almente destruidos pelo processamento trmico como a torra ou cozimento
dos gros (NELSON et ai. 1979). Entretanto, pesquisas recentes tm de-
monstrado que estes compostos possuem uma potente ao antioxidante,
complexando radicais livres que podem causar danos ao material genti-
co. Os inibidores de protease podem atuar na reduo dos riscos de al-
guns tipos de cncer, bem como no aumento da imunocompetncia do
organismo (MESSINA etal. 1994).
As isoflavonas so outros substncias presentes na soja, responsveis
pelo sabor adstringente, so compostos fenlicos que possuem estrutura
Jornada acadmica da Embrapa 50/a 159
qumica semelhante do hormnio estrgeno sendo, portanto, eficazes

no alivio dos sintomas do climatrio (menopausa) e na reduo dos riscos
de cncer hormnio dependentes, como os cnceres de mama, colo de
tero e prstata. Reduzem os nveis de colesterol sangineo total e do
[DL colesterol prevenindo, assim, doenas cardiovasculares (MESSINA
eL aL 1994). Este estudo teve como objetivos avaliar os teores de inibidor
de tripsina de Kunitz e isofiavonas nas sementes em diferentes estdios
de germinao da cultivar BRS 213 produzida nos campos experimentais
da Embrapa Soja, em Londrina, PR.
Materiais e Mtodos
Aproximadamente 50 sementes de soja da cultivar BRS 213 foram germi-

nadas em laboratrio por dois e quatro dias, na ausncia de luz. Para
tanto, foram utilizados beckers de vidro contendo papel de germinao
embebido em gua destilada deionizada esterilizada. As sementes ger-
minadas foram trituradas em micro moinho, desengorduradas a frio com
n-hexano e submetidas s anlises para determinao dos teores de
inibidor de tripsina de Kunitz (KSTI) e de isoflavonas. Na determinao do
teor de KSTI foi utilizado o mtodo de Kakade et al.(1973) modificado por
Hamerstrand et al.(1 981). A separao e a quantificao das isoflavonas
foram realizadas em coluna de fase reversa do tipo ODS C18 (YMC Pack
ODS-AM Columm) utilizando-se um cromatgrafo liquido da marca Waters,
modelo 2690, com injetor automtico de amostras. Para a separao das
isoflavonas foi utilizado o sistema de gradiente linear binrio tendo-se como
fases mveis metanol contendo 0,025% de cido TFA (cido
trifluoroactico) (solvente A) e de H 2 0 destilada deionizada ultrapura con-
tendo 0,025% cido TFA (solvente B). A condio inicial do gradiente foi
de 20% para o solvente A, atingindo-se 100% em 40 min e retornando
20% novamente a 41 mm. o tempo total de corrida foi de 60 mm. O fluxo
da fase mvel foi de 1 mL/min e a temperatura durante a corrida foi de 25
C. Para a deteco das isoflavonas foi utilizado o detector de arranjo de
foto diodo da marca Waters, modelo 996, ajustado para o comprimento
de onda de 260 nm. Para a identificao das isoflavonas foi utilizada uma
mistura dos padres de daidzina, daidzena, genistina e genisteina da
marca Sigma. Esta soluo foi preparada em metanol contendo um mix

dos glicosdeos nas seguintes concentraes: 0,00625 mg/mL; 0,0125
mg/mL: 0,0250 mg/mL; 0,0500 mg/mL e 0,1000 mg/mL. A quantificao
das isoflavonas por padronizao externa (rea dos picos) foi realizada
utilizando os padres como referncia de acordo com a metodologia pre-
conizada por Berhow, M., 2002.
O teor de KSTI nas amostras germinadas foi menor quando comparado

com o da soja no germinada. Nas sementes com dois dias de germina-
o houve uma reduo no teor de inibidor e, aos quatro dias, o teor atin-
giu valores semelhantes queles das sementes no germinadas. Isto in-
dica que, o processo de germinao poderia ser utilizado como uma alter-
nativa para a produo de alimentos base de soja e de raes para
animais, empregando-se menos energia, para inativaro KSTI, reduzindo-
se assim os custos de produo. O teor total das isoflavonas sofreu uma
reduo durante o processo de germinao. Com relao aos grupos de
isoflavonas, foi verificada uma reduo mais acentuada dos glicosdeos e
das formas malonil, enquanto as agliconas (dadzefna e genistena) apre-
sentaram aumento no seu teor, quando comparado com a soja no germi-
nada.Aforma malonil-glicitina foi identificada na amostra aps quatro dias
de germinao. A gliciteina no mais foi identificada na amostra inicial, mas
estava presente nas amostras com dois e quatro dias de germinao.
BERHOW, M. A. Modern analytical techniques for flavonoid determination.

In: BUSLIG, B. S.; MANTHEY, J. A. (ed.). Flavonoids in the living cell.
New York: Klusher Academic, 2002. p.61-76. (Adv. Exp. Md. Biol. v.
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soy products: modification of the standard analytical procedure. Cereal
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KAKADE, ML.; RACKIS, J.J.; McGHEE, J.E.; PUSKI, G. Determination of

trypsin inhibitor anatysis of an improved procedure. Cereal Chemistry,
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Composio qumica de gros de soja em

estdio R-7 danificados por percevejo da soja
Wladimir S. Crancianinov 1 ; Adriana M. Freitas 1 ; Andreia C. Santana'; Jos

Marcos Gontijo Mandarino 2 ; Mercedes Concrdia Carro-Panizzi 2 UEL; . '
2 Embrapa Soja.
A soja o principal produto agrcola de exportao do Brasil, sendo res-

ponsvel pela alta tecnologia e crescimento do agronegcio brasileiro. A
cultura da soja est sujeita a vrios fatores climticos, ambientais e biol-
gicos tais como o ataque de doenas e pragas(CARRO-PANIZZI et ali
1999). O percevejo da soja uma praga importante, implicando em per-
das econmicas considerveis.
Cultivares tardias so mais susceptiveis ao ataque dos percevejos, j que,
com a colheita das cultivares precoces, ocorre um aumento da presso
de pragas nestas cultivares tardias. Ao sugar o gro, o percevejo injeta
toxinas no gro, bem como favorece o desenvolvimento de um fungo,
causando uma srie de reaes que podem alterar a composio qumi-
ca do gro.
O objetivo desse estudo foi comparar a composio de protena, lipdios,
inibidor de tripsina Kunitz e isoflavonas, em gros de soja em estdio R7,
danificados e no danificados por percevejos.
Material e Mtodos
Gros da linhagem BRM94-52273, colhidos em Ri em maro de 2005,

foram analisados para determinao de suaa composio qumica. As
anlises foram conduzidas em base mida e base seca; as protenas fo-
ram analisadas pelo mtodo de micro Kjeldahl, os lipdios por extrao no
destilador de Soxhlet, a umidade pelo mtodo gravimtrico (AOCS, 1988).
Na determinao do teor de inibidor de tripsina Kunitz foi utilizado o mto-
do de Kakade et al.(1 973), modificado por Hamerstrand et al.,(1981). A
separao e a quantificao das isoflavonas foram realizadas em coluna

de fase reversa do tipo ODS 018 (YMC Pack ODS-AM Columm), utilizan-
do-se um cromatgrafo liquido da marca Waters, modelo 2690, com injetor
automtico de amostras. Para a separao das isoflavonas, foi utilizado o
sistema de gradiente linear binrio, tendo-se como fases mveis: metanol
contendo 0,025% de cido TFA (cido trifluoroactico) (solvente A) e de
H 20 destilada deionizada ultrapura contendo 0,025% cido TFA (solvente
3). A condio inicial do gradiente foi de 20% para o solvente A, atingindo-
se 100% em 40 min e retornando 20% novamente a 41 min. O tempo
total de corrida foi de 60 mm. A vazo da fase mvel foi de 1 mL/min e a
temperatura durante a corrida foi de 25 C. Para a deteco das
isoflavonas, foi utilizado o detector de arranjo de foto diodo da marca
Waters, modelo 996, ajustado para o comprimento de onda de 260 nm.
Para a identificao das isoflavonas foi utilizada uma mistura dos padres
de daidzina, daidzena, genistina e genistena da marca Sigma. Esta solu-
o foi preparada em metanol contendo um mix dos glicosdeos nas se-
guintes concentraes: 0,00625 mg/mL; 0,0125 mg/mL; 0,0250 mg/mL;
0,0500 mg/mL e 0,1000 mg/mL. A quantificao das isoflavonas por pa-
dronizao externa (rea dos picos) foi realizada utilizando os padres
como referncia, de acordo com a metodologia preconizada por Berhow,
M., (2002).
Resultados
Os resultados mostraram um aumento no teor de umidade da soja

danificada, como conseqncia do dano e desenvolvimento do fungo no
gro. A protena no teve nenhuma alterao considervel, assim como
os lipdios. O teor de inibidor de tripsina na soja danificada aumentou em
relao soja sadia. O teor das isoflavonas totais na soja danificada foi
reduzido, enquanto que as formas agliconas aumentaram em relao
soja sadia. A gliciteina s foi detectada na soja danificada. Em gros ma-
duros de soja, a concentrao de agliconas insignificante, sendo que o
aumento na concentrao destes compostos nos gros danificados pode
ser devido ativao da enzima b-glicosidase, responsvel pela forma-
o das formas agliconas na soja(CARRO-PANIZZI ei. ai., 2000).
AOCS. Official Methods and Recommended Practices oftheAmerican

Oil Chemists' Society. 3. ed. Champaign, 1988. v.1-2.
BERHOW, M. A. Modern analytical techniques for fiavonoid determination.
ln: BUSLIG, B. S.; MANTHEY, J. A. (ed.). Flavonoids in the living cell.
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soybean from different regions of Brazfl. Pesquisa Agropecuria Brasi-
leira, Braslia, v. 34, n. 10, p. 1787-1795, 1999.
CARRO-PANIZZ1, MC.; BORDIGNON, J.R. Activity of beta-glucosidase
and leveis of isofiavone glucosides in soybean cultivars affected by the
environment. Pesquisa Agropecuria Brasileira, Brasilia, v. 35, n.5, p.
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HAMERSIRAND, G.E.; BLACK, L.T.; GLOVER, J.D. Trypsin inhibitors in

trypsin inhibitor analysis of an improved procedure. Cereal Chemistry,
Saint Paul, v. 51, n.3 p. 376-382, 1974.
Composio qumica de soja verde para

consumo como hortalia
Wladimir S. Crancianinov'; Adriana M. Freitas 1 ; Clverson R. Urrutia 2 ; An-

dreia C. Santana 1 ; Jos Marcos Gontijo Mandarin0 2 ; Mercedes Concrdia
Carro-Panizzi 2 UEL; 2 Embrapa Soja.
. 1
introduo
A soja apresenta diferentes estdios de desenvolvimento classificados

como Ri (emergncia) at R8 (colheita). O consumo de soja verde em
estdio P6 uma forma de utilizao saudvel e saborosa, porque a soja
se constitui numa hortalia de alto valor nutritivo. Neste estdio o teor de
umidade alto, o que confere bom sabor e textura ao gro. Os outros
componentes como protena, lipidios, carboidratos, inibidor de tripsina
Kunitz, e isoflavonas apresentam teores diferenciados nos diferentes es-
tdios de crescimento.
A soja verde (estdios P6 e P7) tem grande aceitao na alimentao
humana pelas culturas orientais, sendo popular o "edamame", prato tradi-
cional da culinria japonesa, no qual as vagens so fervidas com gua e
sal e consumidos os gros.
O presente estudo foi conduzido com o objetivo de determinar a composi-
o quimica da linhagem BRM94-52273 em estdio P6, proveniente do
projeto de melhoramento de soja para consumo humano da Embrapa Soja.
Esta linhagem ser recomendada para uso comercial e se ajusta ao con-
sumo como soja verde ou hortalia.
As isoflavonas so substncias naturalmente presentes nos gros de soja,
que apresentam variao na concentrao, dependendo da gentica da
planta e de fatores ambientais (temperaturas altas reduzem a concentra-
o destes compostos) (CARRO-PANIZZI et aL 1999). Isoflavonas so
molculas que podem ter 12 estruturas diferentes, algumas delas presen-
tes somente no hipoctilo da semente, onde o teor de isoflavonas 5 6
166 Em/rapa Soja. Documentos. 268
vezes maior do que no resto do gro, e esto ausentes no tegumento

(KUDOU et al., 1991). Isoflavonas tambm so chamadas de fitoestr-
genos, porque apresentam estrutura semelhante ao hormnio estrgeno.
Esta caracterstica faz com as isoflavonas atuem na reduo dos sinto-
mas da menopausa, alm de diminuir os riscos do cncer de mama
(MESSINA et ai., 1994).
Material e Mtodos
Gros da linhagem BRM94-52273, colhidos em R6 e R7 em maro de

2005, foram analisados para sua composio qumica. As anlises realiza-
das foram protenas, analisadas pelo mtodo de micro Kjeldahl, os lipdios
por extrao no destilador de Soxhlet, a umidade pelo mtodo gravimtrico
(AOCS, 1988). Na determinao do teor de inibidor de tripsina Kunitz foi
utilizado o mtodo de Kakade etal., 1973, modificado por Hamerstrand et
al.,1981.A separao e a quantificao das isoflavonas foram realizadas
em coluna de fase reversa do tipo ODS Cl 8 (YMC Pack ODS-AM Columm)
utilizando-se um cromatgrafo liquido da marca Waters, modelo 2690,
com injetor automtico de amostras. Para a separao das isoflavonas foi
utilizado o sistema de gradiente linear binrio tendo-se como fases m-
veis metanol contendo 0,025% de cido TFA (cido trifluoroactico)
(solvente A) e de H 20 destilada deionizada ultrapura contendo 0,025%
cido TFA (solvente B). A condio inicial do gradiente foi de 20% para o
solvente A, atingindo-se 100% em 40 min e retornando 20% novamente
a 41 mm. O tempo total de corrida foi de 60 mm. O fluxo da fase mvel foi de
1 mL/min e a temperatura durante a corrida foi de 25 C. Para a deteco
das isoflavonas foi utilizado o detector de arranjo de foto diodo da marca
Para a identificao das isoflavonas foi utilizada uma mistura dos padres
de daidzina, daidzeina, genistina e genistena da marca Sigma. Esta soluo
foi preparada em metanol contendo um mix dos glicosdeos nas seguin-
tes concentraes: 0,00625 mg/mL; 0,0125 mg/mL; 0,0250 mg/mL; 0,0500
mg/mL e 0,1000 mg/mL. A quantificao das isoflavonas por padroniza-
o externa (rea dos picos) foi realizada utilizando os padres como
referncia de acordo com a metodologia preconizada por Berhow, M., 2002.
Jornada acadm/ca da Embrapa Soja 167
Resultados
No estdio R6 o teor de umidade foi 67%, diminuindo para 12% no est-

dio RO, conforme prossegue a maturao da semente. O teor de protena
nos estdios analisados variou de 36% a 40% (base seca), respectiva-
mente em R6 e R8, mostrando que, a partir de R6, o teor de protena se
manteve relativamente estvel. O teor de protena em base mida variou
de 12% a 35% (R6 a R8, respectivamente), como conseqncia do teor
de umidade. Considerando a recomendao (FDA, 1991) de consumo de
pelo menos 25g de protena de soja, numa dieta saudvel para um adulto,
o que corresponde cerca de 62,5g do gro de soja seco(ou de farinha
de soja) no caso da soja hortalia seriam necessrios 210g de gros de
soja verde. Devido ao sabor e textura muito agradveis da soja verde,
fcil consumir esta quantidade numa dieta.
A concentrao de lipdeos continuou aumentando at o estdio R8, en-
quanto o inibidor de tripsina Kunftz aumentou do R6 at o final do R7,
depois do qual houve uma diminuio no seu teor at o amadurecimento.
As isoflavonas tiveram uma maior concentrao nos estdios R6 a R7, com
alta concentrao das formas malonil (42,19 mg de isoflavonas por gra-
ma de amostra desengordurada), enquanto as formas glicosdicas apre-
sentaram uma pequena variao de 7,32 para 5,25 mg de isoflavonas por
grama de amostra desengordurada, e as formas agliconas diminuiram
at o final de R-8, de 10,00 para 15,19 mg de isoflavonas por grama de amos-
tra desengordurada. As formas glicitina, encontradas em maior quantida-
de no hipoctilo, sofreram reduo na concentrao durante o amadure-
cimento do gro. As formas agliconas que so dependentes de condies
de processamento, para seu desenvolvimento, encontram-se em quanti-
dades muito reduzidas nos gros verdes e secos. Asoja verde ou hortalia
tem boas caractersticas nutricionais para ser usada no consumo humano.
AOCS. Oficial Methods and Recommended Practices oftheAmerican

011 Chemists' Society. 3. ed. Champaign, 1988. v.1-2.
168 Embrapa Se/a. Documentos, 268

In: BUSLIG, B. 9.; MANTHEV, J. A. (ed.). Flavonoids in the living cefi.
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Jornada acadmica da Embrapa So/a 169
Comparao entre dois mtodos para a

extrao de isoflavonas em cultivares de soja
Wladimir S. Crancianinov 1 ; Adriana M. Freitas 1 ; Andreia C. Santana 1 ; Jos

Marcos Gontijo Mandarino2 ; Mercedes Concrdia Carro-Panizzi 2 UEL; . 1
2 Embrapa Soja.
Introduo
As isoflavonas so compostos de baixo peso molecular, metablitos se-

cundrios de plantas, pertencentes ao grupo do flavonides e que pos-
suem trs anis benzeno ligados (RHODES, 1996). Os diferentes radi-
cais ligados a estes anis do origem a doze formas de isoflavonas,
divididas em quatros grupos: as formas malonil, as formas acetil, os
glicosdeos e as agliconas. As diferentes conformaes desses radicais
em cada grupo, originam as diversas formas das isoflavonas daidzina,
genistina, glicitina e ainda as agliconas daidzena, genistena e gliciteina
(PARK et ai., 2001).
As formas malonil so as mais abundantes na soja in natura, quando os
gros so submetidos a processamentos com alta temperatura e pres-
so, estas formas so convertidas nas formas acetil, e estas, nas formas
glicosdicas (PARK et aL, 2001). Os processos fermentativos podem con-
verter os glicosideos as formas agliconas, devido ao aumento na ativida-
de da enzima b-glicosidades (CARRO-PANIZZI, MC.; BORDIGNON,
J.R., 2000). As caractersticas genticas da semente bem como as condi-
es climticas (temperatura), influenciam no teor de isoflavonas nos gros.
Sua sntese ocorre por volta de 35 dias aps o florescimento e, aos 50
dias, ocorre um aumento na sntese de genistina e malonil-genistina. En-
tretanto, as formas daidzina e malonii-daidzina esto presentes em altas
concentraes durante todo o perodo de maturao das sementes
(CARRO-PAN1ZZ1, et ai. 1999). As isofiavonas concentram-se no
hipoctilo da semente e no so encontradas no tegumento. As isoflavonas
tm estrutura qumica semelhante do hormnio estrgeno sendo, por-
170 Embrapa So/a. Documentos. 268
tanto, eficazes no alvio dos sintomas do climatrio (menopausa) e na

reduo dos riscos de cncer hormnio dependentes, como os cnceres
de mama, colo de tero e prstata (MESSINA et aL, 1994) O objetivo
deste trabalho foi comparar dois mtodos para a extrao das isoflavonas
presentes nas sementes de soja e sua subseqente quantificao por
cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE).
Materiais e Mtodos
Para tanto foi utilizada a cultivar BRS 213 produzida nos campos expe-
rimentais da Embrapa Soja em Londrina, PR. Foram comparados os
mtodos de extrao com Metanol:DMSO (8:2) e Etanol com 0,1% de
cido actico. No procedimento de extrao das isoflavonas foram rea-
lizadas as seguintes variaes: tempo de extrao (uma hora e 17 ho-
ras), natureza da amostra (integral e desengordurada).A separao e
quantificao das isoflavonas foram realizadas em coluna de fase reversa
do tipo ODS 018 (YMC Pack ODS-AM Columm) utilizando-se um
cromatgrafo liquido da marca Waters, modelo 2690, com injetor auto-
mtico de amostras. Para a separao das isoflavonas foi utilizado o
sistema de gradiente linear binrio tendo-se como fases mveis metanol
contendo 0,025% de cido TFA (cido trifluoroactico) (solvente A) e de
H 2 0 destilada deionizada ultrapura contendo 0,025% cido TFA (solvente
3). A condio inicial do gradiente foi de 20% para o solvente A, atingin-
do-se 100% em 40 min e retornando 20% novamente a 41 mm. o
tempo total de corrida foi de 60 mm. O fluxo da fase mvel foi de 1 mL/
min e a temperatura durante a corrida foi de 25 C. Para a deteco das
isoflavonas foi utilizado o detector de arranjo de foto diodo da marca
Para a identificao das isoflavonas foi utilizada uma mistura dos pa-
dres de daidzina, daidzejna, genistina e genistena da marca Sigma.
Esta soluo foi preparada em metanol contendo um mix dos glicosdeos
nas seguintes concentraes: 0,00625 mg/mL; 0,0125 mg/mL; 0,0250
mg/mL; 0,0500 mglmL e 0,1000 mg/mL. A quantificao das isoflavonas
por padronizao externa (rea dos picos) foi realizada utilizando os
padres como referncia.
Na comparao entre os mtodos, a modificao no tempo de extrao

de uma hora para 17 horas com o extrator de etanol 0,1% de cido actico
no mostrou diferena na extrao das isoflavonas. Portanto, no se faz
necessrio aumentar o tempo de extrao, quando este mtodo utiliza-
do. Tambm no houve diferenas significativas quando foram utilizadas
amostras desengordurada ou integral.
Entretanto, durante a anlise cromatogrfica, o ruido de fundo foi menor
quando se utilizou amostra desengordurada, causando portanto menos
danos coluna. Portando o mtodo mais eficiente para extrao das
isoflavonas foi de Ges-Favoni et ai., 2001 com 1 hora de extrao e
amostra desengordurada.Entretanto, para que a anlises seja realizada
de maneira mais rpida e sem prejuzo na extrao das isofiavonas pode
ser utilizada amostra integral, com a ressalva de que este procedimento
pode diminuir a vida til da coluna.

In: BUSLIG, B. S.; MANTHEY, J. A. (ed.). Flavonoids in the living ceil.
NewYork: KlusherAcademic, 2002. p.61-76. (Adv. Exp. Md. Biol. v. 505).
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Determinao do inibidor de
tripsina de kunitz em soja crua e
tratada de cultivares brasileiras
Wladimir S. Crancianinov 1 ; Andreia C. Santana 1 ; Adriana M. Freitas 1 ; Jos

Marcos Gontijo Mandarino 2 ; Vera de Totedo Benassi 2 UEL; 2 Embrapa Soja.
. 1
Introduo
A tripsina uma enzima secretada pelo pncreas, que tem como funo
digerir as protenas ingeridas. Os inibidores de tripsina, que podem ser
encontrados em batatas, ovos e algumas leguminosas, como a soja, tm
a capacidade de se ligar enzima tripsina, impedindo sua ao sobre as
protenas. Os inibidores de tripsina so enzimas, as quais se desnaturam
com o aumento de temperatura, ou seja, modificam sua estrutura espaci-
al e deixam de atuar. Existem dois grupos principais de inibidores: o de
Bowman-Birk e o de Kunitz, sendo que este ltimo mais facilmente
inativado por tratamento trmico.
O inibidor de tripsina costumava ser considerado como um fator anti-
nutricional e, portanto, indesejvel nos alimentos. No entanto, alguns
estudos tm investigado sua ao anti-cancerigena, tendo se verifica-
do, em teste de laboratrio, uma ao efetiva na inibio de genes do
cncer de mama, pele, bexiga, clon, pulmo, pncreas, boca e
esfago, alm de proteger as clulas do efeito da radiao e dos radi-
cais livres.
Como no comum o consumo humano de soja crua, as quantidades de
inibidor de tripsina ingeridas pelo homem so muito pequenas para que
se possa consider-lo como um fator anti-nutricinal relevante, embora
possa ainda ser eficaz na reduo de riscos de cncer. A maioria dos
produtos de soja processada comercialmente apresenta alguma ativida-
de residual (5-20%do valor inicial) do inibidor de tripsina, uma vez que,
para elimin-lo totalmente, o tratamento trmico necessrio poderia pro-
174 Embrapa Soja. Oocumentos, 268
vocar diminuio do valor nutricional das protenas, bem como perda de

suas propriedades funcionais (tecnolgicas).
O efeito do tratamento trmico aplicado no processamento depende de
vrios fatores como: tempo de aquecimento, umidade do material e do meio,
tamanho das partculas e temperatura utilizada. O calor mido mais
eficiente do que o calor seco na inativao do inibidor de tripsina. Afervura
dos gros inteiros, em gua, por 20 minutos, inativa a maior parte dos
inibidores de tripsina e, se os gros forem macerados em gua por 8horas,
5 minutos de fervura so suficientes. Mtodos usando calor seco, como
tostagem e extruso tambm so efetivos. Num processo de extruso a seco,
a 135-145C, velocidade de rosca de 550 rpm, bastam 30 segundos.
Objetivo
Determinar a atividade do inibidor de tripsina de Kunitz (KSTI) em gros de

soja tratados termicamente, em comparao com a atividade do inibidor
em gros crus, de cultivares geneticamente diferentes quanto ao teor de KSTI.
Materiais e Mtodos
O inibidor de tripsina de Kunitz (KSTI) foi quantificado em trs cultivares

de soja (BRS 155, BRS 213 e BRS 216) desenvolvidos pelo programa de
melhoramento gentico da Embrapa Soja, utilizando-se o mtodo de
Kakade et al.(1973), modificado por Hamerstrand et ai. (1981). Foram
analisadas amostras de farinha obtidas a partir da moagem de gros crus
e de gros previamente submetidos a um tratamento trmico em estufa.
Todas as farinhas foram desengorduradas a frio com hexano, por quinze
horas, sob agitao constante, e a atividade do inibidor foi calculado na
mdia de trs repeties.
As amostras que passaram pelo tratamento trmico apresentaram um

teor de inibidor de tripsina (KSTI) inferior ao das farinhas cruas obtidas
dos mesmos cultivares. A BRS 155 apresentou uma variao de 10,65

para 6,13 mg de KSTI por g de amostra desengordurada, a BRS 213
oscilou de 27,23 paral 2,63 mg de KSTI por g de amostra desengordurada
e a BRS 216 de 18,70 para 11,93 mg de KSTI por g de amostra
desengordurada.
Embora a reduo observada no teor do inibidor de tripsina tenha sido
considervel, foi bastante inferior aos dados da literatura citados na intro-
duo. Isso possivelmente foi devido ao tratamento utilizado, que constou
de calor seco a uma temperatura no muito elevada.

Chemistry 51: 42-45, 1981,
trypsin inhibitor analysis of an improved procedure. Cereal Chemistry 51:
376-382, 1974.
MESSINA, M.; MESSINA, V; SETCHELL, K. Anticarcinogen: a big word
that can save your life. In:. The simple soybean and your health.
New York: Avery Publishing Group, 1994. p. 63-70.
RACKIS, J.J. Significance of soya trypsin inhibitors in nutrition. Journal of
TheAmerican 011 Chemists Society 58: 495-501,1981.
TROLL, W.; KENNEDY, A. Meeting report. Workshop report from the
Division of Cancer Etiology, National Cancer Institute, National Institutes
of Health. Cancer Research 49: 499-502, 1989.
Em "Z.pa
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Centro Nacional de Pesquisa de Soja
Ministrio da Agricultura, Pecu ria e Abastecimento
Caixa Postal, 231 - CEP: 86001-970 - Londrina - Paran
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