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MTODOS DE
TRABALHO EM

BIOQUMICA
VEGETAL

E TECNOLOGIA DE
ENZIMAS

Coordenador:

Prof. Dr. Fernando Broetto

IBB/UNESP Campus de Botucatu


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MTODOS DE TRABALHO EM BIOQUMICA


VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS
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2014 Editora UNESP

Cultura Acadmica

Praa da S, 108

01001-900 - So Paulo - SP

Tel.: (0xx11) 3242-7171

Fax: (0xx11) 3242-7172

www.editoraunesp.com.br

feu@editora.unesp.br

FICHA CATALOGRFICA ELABORADA PELA SEO TC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM.

DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECRIA RESPONSVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE

Mtodos de trabalho em bioqumica vegetal e tecnologia de enzimas


[recurso eletrnico] / coordenador: Fernando Broetto.- Botucatu: IBB, Cultura
Acadmica, 2014.
Recurso digital

Formato: PDF

Requisitos do sistema: Adobe Acrobat Reader

Modo de acesso: World Wide Web

ISBN 978-85-7983-550-6

1. Clulas e tecidos vegetais. 2. Enzimas. 3. Plantas - Metabolismo. 4. Protenas


- Metabolismo. 5. Bioqumica. 6. Qumica vegetal. 7. Instituto de Biocincias de
Botucatu. 8. Cultura Acadmica. I. Ttulo. II. Broetto, Fernando.

CDD 581.4
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SUMRIO
Captulo 1: Preparo de Tampes e Mtodos para Coleta,
Procedimentos e Extrao de Enzimas em Tecidos Vegetais. ................................... 07
Djanira Rodrigues Negro, Sthefany Rodrigues Fernandes Viana e Fernando Broetto
Introduo / Preparo de Tampes / Mtodos para Coleta / Coleta de folhas ou outros rgos vegetais/
Procedimentos e Extrao de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para extrao / Obteno do
extrato bruto / Uso de antioxidantes / Centrifugao / Preparo de Solues / Referncias Bibliogrficas.

Captulo 2: Aminocidos e Protenas: estrutura qumica,


funo e propriedades. ............................................................................................ 12
Thalita Cristina Marques Cervezan, Aline Cristina Rabonato, Enrique Alonso Zuiga, Fernando
Broetto, Juan Plutarco Mungua-Lpez
Aminocidos / Propriedades Qumicas e Eltricas / Curva de Titulao de um Aminocido / Prtica: Titulao
de um aminocido / Procedimento prtico / Protenas / Prtica: Determinao de protenas solveis totais em
tecido vegetal / Referncias Bibliogrficas

Captulo 3: Atividade de lipoxigenases. ...................................................................... 19


rica Amanda de Barros, Amanda Cristina Esteves Amaro, Fernando Broetto
Introduo / Material Utilizado / Preparo de Solues / Procedimento / Resultado e Discusso / Referncias
Bibliogrficas.

Captulo 4: Enzimas antioxidativas em ps-colheita de vegetais. .............................. 24


Thalita Cristina Marques Cervezan, Mariana da Silva Caldeira, Fernando Broetto
Introduo / Procedimentos e Extrao de Enzimas em Tecidos Vegetais / Preparo da amostra para
extrao / Extrao enzimtica / Anlises / Preparo de Reagentes / Resultado / Referncias Bibliogrficas.

Captulo 5: Enzimas antioxidativas em tecidos vegetais. ........................................... 29


Marcos de Oliveira Bettini, Renata Bruna dos Santos Coscolin, Dayanne Fabrcio Bressan,
Edilson Ramos Gomes, Fernando Broetto
Introduo / Material e Mtodo / Processamento do material vegetal para obteno do extrato
bruto / Atividade da enzima Superxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) / Atividade da enzima Catalase
(CAT; EC 1.11.1.6) / Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7) / Atividade da enzima
Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11) / Peroxidao de Lipdeos / Referncias Bibliogrficas.

Captulo 6: Atividade da enzima Nitrato Redutase. .................................................... 35


Amanda Cristina Esteves Amaro, rica Amanda de Barros, Marco Antonio Castillo
Campohermoso, Fernando Broetto
Introduo / Material e Mtodo / Preparo das solues / Teste enzimtico / Curva padro de nitrito (NO2) /
Referncias Bibliogrficas.

Captulo 7: Anlise de protenas por Eletroforese Nativa. ......................................... 41


Mariana da Silva Caldeira, Marcos de Oliveira Bettini, Dayanne Fabrcio Bressan, Fernando
Broetto
Introduo / Procedimentos / Extrao de protenas / Eletroforese / Preparo do sistema / Preparo do gel /
Preparo da amostra / Corrida do gel / Atividade das enzimas / Superxido Dismutase SOD / Catalase
-CAT / Reagentes / Utilizados no preparo dos gis / Utilizados para extrao e atividade protica / Solues
/ Gel de separao / Gel de empilhamento / Tampo de reservatrio / Tampo de extrao / Tampo
fosfato / Tampo de colorao para SOD / Tampo de colorao para CAT / Referncias Bibliogrficas

Captulo 8: Atividade da Invertase de Levedura: valores da constante de Michaelis-


Menten (Km) e velocidade mxima (Vm). ............................................................... 51
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana, Djanira Rodrigues Negro, Fernando Broetto
Introduo / Invertase de Levedura / Reao a ser estudada / Determinao de Km e Vm da Invertase de
Levedura / Referncias Bibliogrficas.

Captulo 9: Solues Tampo: Conceito e Preparao. ..........................................


Jos Pedro Serra Valente, Fernando Broetto 56
Introduo / Clculo do pH de uma Soluo Tampo / Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora
(Cf) / Prtica: Preparao da Soluo Tampo / Parte Experimental / Limitaes da Equao de
Henderson- Hasselbalch com Base nas Concentraes Nominais (Analticas) / Referncias Bibliogrficas

Captulo 10: Espectrofotometria Quantitativa na Regio do UV-Vis (180 - 800 nm). 70


Jos Pedro Serra Valente, Fernando Broetto
Introduo / Banda de Absoro da Molcula e Absorbncia Mxima (max.). / Processo de Absoro
de Radiao UV-Vis da Molcula (m) / Princpios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - VIS / Lei
de Lambert / Lei de Beer / Juno das duas leis / Aspectos Prticos / Requesitos para Quantificao do
Analito / Validade da Curva de Referncia / Determinao da Concentrao do Analito na Amostra /
Procedimento Bsico para Operao do Espectrofotmetro / Procedimento para Tratamento dos Dados
Experimentais / Construo da curva de referncia e determinao da concentrao desconhecida de um
analito / Espectrofotmetro / Esquema do espectrofotmetro / Limitaes da Lei de Beer (distores da
linearidade/erros) / Regra Prticas para Diminuir os Desvios da Lei de Beer / Referncias Bibliogrficas

Captulo 11: Protelise enzimtica da carne. ......................................................... 87


Luis Artur Loyola Chardulo, Jessica Moraes Malheiros, Victor Augusto Domingos Dias, Ana
Paula Costa Rodrigues Ferraz, Fernando Broetto
Introduo / Procedimentos e Extrao Proteica / Preparo da amostra / Extrao das protenas / Anlises /
Clculo / Preparo de Reagentes / Resultado / Referncias Bibliogrficas.
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MTODOS DE TRABALHO EM BIOQUMICA


VEGETAL E TECNOLOGIA DE ENZIMAS

Os trabalhos de laboratrio, muitas vezes solitrio ou em equipe, requerem


planejamento e disciplina visando anlises precisas e confiveis. Para
anlises bioqumicas em tecidos vegetais, por exemplo, faz-se necessrio
uma gama de procedimentos que vo desde a coleta e processamento,
at a melhor maneira de armazenar os extratos e por fim a anlise
da atividade enzimtica ou teor de compostos e macromolculas de
interesse biolgico. Este livro foi proposto como desafio para os alunos
da disciplina Tecnologia de Enzimas (FCA/UNESP- Campus de Botucatu),
como parte de suas atividades acadmicas. Desafio aceito, o texto foi
organizado em captulos, os quais descrevem diferentes temas e suas
metodologias utilizadas em aulas prticas. Esperamos que o texto possa
servir de apoio queles que necessitem iniciar ou dar continuidade a
trabalhos que envolvam anlises bioqumicas em tecidos vegetais.
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Captulo 1
Preparo de Tampes e Mtodos para Coleta,
Procedimentos e Extrao de Enzimas em
Tecidos Vegetais
Djanira Rodrigues Negro
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana
Fernando Broetto

Introduo

O estudo de enzimas fundamental em bioqumica e fisiologia vegetal, visto que praticamente,


todas as respostas da planta envolvem processos metablicos, os quais so regulados por diversos
complexos enzimticos. Dada a sua importncia, a natureza da estrutura das enzimas e a forma do
stio ativo podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de provocar mudanas conformacionais
na estrutura protica. Isso torna a atividade enzimtica dependente do meio ambiente, notadamente
do pH e da temperatura.

A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para a qual sua atividade mxima,
e a velocidade da reao diminui medida que o valor do pH se afasta desse valor timo, que
caracterstico para cada enzima, mas com frequncia, est prximo do pH neutro. A influncia do
pH sobre a catlise enzimtica s pode ser compreendida partir da anlise dos grupos dissociveis
presentes nos grupos radicais dos aminocidos.
Assim, para realizar anlises enzimticas de qualquer natureza, i.e. tecidos vegetais, animais
ou de microrganismos, normalmente utiliza-se vrios reagentes e, dentre esses, o uso de uma soluo
tampo um recurso altamente necessrio. Um tampo uma mistura de substncias qumicas que
torna possvel o extrato enzimtico resistir a variaes de pH, porm, cada tampo tolera uma variao
de pH dentro de uma faixa particular.

1. Preparo de Tampes

Uma soluo tampo a mistura de um cido fraco e seu sal correspondente, como por exemplo,
o cido actico e o acetato de sdio. Por definio, os cidos so compostos capazes de dissociar-

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05


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se, liberando H+; j cidos fracos so compostos em que a dissociao no completa, restando
em soluo tambm uma porcentagem do cido no dissociado, existindo, portanto, um equilbrio
qumico, que pode ser descrito:

HA A + H+

Por exemplo, um tampo de cido actico-acetato de sdio efetivo entre a faixa de pH 3,5 a
5,5 mas tem pouca capacidade tamponante em pH 7,0. Portanto, esse tampo seria inadequado para
a maioria dos microrganismos. Um tampo comumente utilizado pelos pesquisadores a mistura de
um cido fraco, o fosfato monopotssico (KH2PO4), e seu sal, o fosfato dipotssico (K2HPO4). Esta
mistura tem uma forte capacidade tamponante entre pH 6 a 8.
Na prtica, quando misturamos as quantidades calculadas do cido e da base conjugados
para preparar um tampo, o pH resultante no exatamente o esperado. A principal razo dessa
discrepncia que o pH governado pelas atividades do cido e da base conjugados, e no por suas
concentraes. Por esse motivo, aps preparar o tampo com as quantidades calculadas, em geral faz-
se necessrio um pequeno ajuste no pH (pela adio de uma soluo bsica ou cida diludas) para
obter o pH desejado.
importante saber que diferentes solues contm diferentes quantidades ou concentraes de
compostos dissolvidos. Em bioqumica, geralmente utiliza-se o peso molecular de um composto para
expressar a concentrao, nesse caso, da soluo tampo, lembrando que o peso molecular a soma
dos pesos atmicos de todos os tomos na molcula de um composto.

2. Mtodos para Coleta


2.1 Coleta de folhas e outros rgos vegetais

O material vegetal como, por exemplo, as folhas, devero ser coletadas no tero mdio da
planta com uso de estilete. Para a pesquisa com protenas recomendvel padronizar o local de coleta
nas plantas, alm de atentar-se ao melhor perodo do dia para a mesma. Em seguida, o material deve
ser acondicionado em tubos tipo Falcon (25 ou 50 mL), microtubos tipo eppendorf ou em envelope de
papel alumnio, devidamente identificados (tipo de material vegetal, data da coleta, responsvel, etc.).
Aps a coleta, o material deve ser rapidamente congelado, a fim de preservar a integridade
das molculas proticas, em nitrognio lquido (-196 C). Caso o congelamento ocorra nos tubos
do tipo Falcon, retirar o excesso de nitrognio lquido antes de fechar o recipiente. Outra forma de
preservar o material vegetal pode ser feita na forma de discos foliares, com auxlio de um cortador
de dimetro definido. Esses discos podem ser acondicionados em tubos eppendorf (com um pequeno
furo na tampa que evita que a mesma estoure devido presso do nitrognio) e depois colocados no
nitrognio lquido para congelamento rpido. O armazenamento das amostras dever ser feito em
ultrafreezer (-80 C), para preservar maximamente a integridade molecular.
importante ter muito cuidado no transporte e manuseio do nitrognio lquido. Para tanto, seu

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.


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transporte feito em tambor criognico para evitar acidentes. aconselhvel utilizar luvas e culos
de proteo; para o manuseio do material congelado usam-se pinas e nunca descartar o nitrognio
lquido na tubulao.

3. Procedimentos e Extrao de Enzimas em Tecidos Vegetais


3.1 Preparo da amostra para extrao

Primeiramente, antes de realizar as extraes, recomendvel que as solues tampo


necessrias para todos os processos de extrao sejam previamente preparadas.
A grande maioria das solues tampo devem ser armazenadas em geladeira, identificados
com o nome do tampo, molaridade, pH e a data de preparao. Para maior segurana das anlises,
recomenda-se utilizar solues recm-preparadas, alm de usar reagentes dentro da data de validade.
Para evitar eventuais alteraes bioqumicas no material vegetal a ser analisado, recomenda-se
que os utenslios usados (graal, pistilo, pinas) durante as extraes enzimticas fiquem mantidos em
gelo (4 C ) durante todo o processo.
O material congelado deve ser macerado em graal na presena de nitrognio lquido, at a
obteno de um p fino, o qual deve ser armazenado em freezer (-80C), devidamente identificado,
para a preservao da atividade bioqumica do tecido modo at o momento das anlises. Para anlises
isotpicas, que exigem maior pulverizao do material, geralmente as amostras so preparadas em
moinho criognico.

3.2 Obteno do extrato bruto

Em geral, a quantidade de material vegetal fresco necessrio para realizar uma extrao de
300 mg, pesados em balana digital. As amostras do tecido modo e congelado devem ser maceradas
na presena de uma soluo tampo, onde a concentrao molar e pH variam coforme o objetivo
da extrao. Como mencionado, a funo da soluo tampo de estabilizar o pH do meio, para
expresso da atividade enzimtica.
Ao macerar o tecido vegetal recomendvel colocar, pelo menos, a metade da quantidade da
soluo tampo necessria para a extrao; aps a macerao transferir o extrato para o tubo Falcon
(devidamente pesado) e a quantidade restante de tampo poder ser utilizado para lavar o graal,
permitindo assim que praticamente todo o material pesado seja analisado.
Eventualmente, dependendo da natureza do tecido vegetal, como os mais fibrosos (razes,
cascas), uma pequena poro de areia lavada (ponta de uma esptula) pode ser utilizada para facilitar
a macerao, na presena da soluo tampo.
Aps a obteno do extrato bruto, o prximo passo obter o extrato enzimtico. Para tanto,
amostras do extrato bruto so acondicionadas em tubos Falcon, juntamente com a soluo de extrao
e/ou outros reagentes necessrios para tal e ento levados centrfuga.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.


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3.3 Uso de antioxidantes

Algumas espcies vegetais geram compostos fenlicos, no ato das maceraes, o que poder
interferir substancialmente na atividade enzimtica ou outra determinao bioqumica, principalmente
aquelas baseadas em mtodos ticos. Deste modo, importante que a oxidao seja controlada pelo
uso de antioxidantes, suplementares s solues tampo. Como exemplos, citam-se o uso do polmero
no reativo, o PVPP (Polyvinylpolypyrrolidone) e tambm o cido ascrbico, dentre outros.

3.4 Centrifugao

A fora centrfuga um recurso bsico na pesquisa em bioqumica vegetal, para separar


componentes de densidades diferentes. O processo de centrifugao deve separar as partculas slidas
(pellets) dos compostos solveis, os quais devem conter o composto ou a protena de interesse.
Antes de ligar a centrfuga, necessrio fazer o balanceamento dos tubos com as amostras, de
modo que fiquem em pares ao encaix-los nos orifcios do rotor. A centrifugao deve ter velocidade
(expressa em g ou rpm) e temperatura controladas, alm do tempo de rotao, conforme o protocolo
adotado. Geralmente, as extraes so conduzidas a 4 C, com velocidade entre 10 e 12.000 x g.
Existem ainda ultracentrifugaes (acima de 50.000 x g) utilizadas para separaes diferenciais ou
em gradiente.
Aps a centrifugao, o sobrenadante (fase lquida) deve ser recolhido com pipeta automtica
ou de Pasteur, acondicionado em tubo eppendorf e armazenado em ultrafreezer, at o momento das
anlises em espectrofotmetro.

4. Preparo de Solues

Exemplos de preparo de solues tampo comumente utilizadas em processos de extrao


enzimtica.

A) Soluo tampo Fosfato de Potssio 50 mM, com pH 7,8 (1 L):


Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4, PM = 136,09 g L).
1M 136,09 g L X = 6,8045 g L-1
50 .10-3 M X
Fosfato de potssio bibsico (K2HPO4, PM = 174,18).
1M 174,18 g L X = 8,7090 g L-1
50 .10-3 M X
Dissolver os reagentes em 500 mL de gua destilada, aferir o pH desejado e somente depois
completar para o volume final de um litro com gua destilada.

B) Soluo tampo de NaOH (PM = 40) a 0,05 M (600 mL).

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.


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Podemos obter atravs de duas formas:


Obter o nmero de moles:
Litros x M 0,6 x 0,05 = 0,03 moles de NaOH.
Nmero de moles x PM 0,03 x 40 = 1,2 g.
Utilizar os clculos pela regra de trs:
40 (PM) 1 M x = 0,05 x 40/1 = 2 g L-1
x 0,05 M ou 1,2 g em 0,6 L

C) Expressar a concentrao da soluo de NaOH (0,05 M, 600 mL) em porcentagem peso volume
(% p/v):
% p/v = peso em gramas de um soluto por 100 mL de soluo, ou seja:
2,0 g.L-1 = 0,2 g.100 mL-1 = 0,2% (p/v).
D) Soluo extratora para polifenoloxidades a 0,2 M, com pH 6,7 (1 litro):
KH2PO4 monobsico (soluo cida), PM = 136,09 g (pH 5)
1 molar 139,09 g x = 27,218 g
0,2 m x
Para preparar 100 mL:

27,218 g 1000 mL x = 2,72 g


x 100 mL

5. Referncias Bibliogrficas

PASSOS, L.P. Mtodos analticos e laboratoriais em fisiologia vegetal. Coronel Pacheco:


EMBRAPA-CNPGL, 1996, 223p.
SKOOG, D.A. et al. Fundamentos de qumica analtica. 8 ed. So Paulo: Cengage Learning, 2010,
999p.
TORRES, B.B. Elementos de enzimologia. In: BORZANI, W. et. al. (Coords.) Biotecnologia
industrial. v. 1. Edgar Blcher, 2001, 151-176 p.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 01, p.01-05.


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Captulo 2
Aminocidos e Protenas: estrutura qumica,
funo e propriedades
Thalita Cristina Marques Cervezan
Aline Cristina Rabonato
Enrique Alonso Zuiga
Juan Plutarco Mungua-Lpez
Fernando Broetto

1. Aminocidos

O aminocido uma molcula orgnica composta por tomos de carbono, hidrognio,


oxignio, nitrognio e, em alguns casos, o enxofre. Os aminocidos so formados pela juno do
grupo amina (NH2), grupo carboxlico (COOH), hidrognio, carbono e um radical caracterstico de
cada aminocido (Figura 1).

Figura 1. Estrutura molecular de um aminocido simples

Atravs de ligaes peptdicas sequenciadas de vinte aminocidos, as protenas so formadas.


Esses vinte aminocidos principais possuem caractersticas estruturais em comum, pois h a presena
de um carbono central , quase sempre assimtrico, ligados a um grupo carboxila, um grupamento
amina e um tomo de hidrognio.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.


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O radical representado esquematicamente por R o responsvel pela diferenciao entre os


aminocidos e por suas caractersticas polaridade e grau de ionizao em soluo aquosa. Quanto
polaridade do radical R pode-se classificar em apolar, polar no carregado e polar carregado
dividido em duas subclasses: carregado positivamente e carregado negativamente.
Os aminocidos com ramificao apolar possuem o radical R geralmente formado
exclusivamente por carbono e hidrognio grupamento alquila. So oito e caracterizados como
hidrofbicos: Alanina (CH3CH(NH2)COOH); Valina (CH3CH (CH3)CH(NH2)COOH); Leucina
(CH3(CH2)3CH2CH(NH2)COOH); Isoleucina (CH3CH2CH(CH3)CH(NH2)COOH); Prolina
(CH2CH2CH2 - ligando o grupo amino ao carbono ); Fenilalanina (C6H5CH2CH(NH2)COOH);
Triptofano (R aromtico - CH(NH2)COOH); Metionina (CH3SCH2CH2CH(NH2)COOH).
Os aminocidos com ramificao polar no carregado apresentam o radical R contendo
hidroxilas, sulfidrilas e grupamentos amida. So sete e caracterizados como hidroflicos: Glicina
(HCH(NH2)COOH); Serina (OHCH2CH(NH2)COOH); Treonina (OHCH(CH3)CH(NH2)
COOH); Cistena (SHCH2CH(NH2)COOH); Tirosina (OHC6H4CH2CH(NH2)COOH);
Asparagina (NH2COCH2CH(NH2)COOH); Glutamina (NH2COCH2CH2CH(NH2)COOH).
Os aminocidos com radical R polar carregado so divididos em duas subclasses: R
carregado positivamente e R carregado negativamente. O radical R carregado positivamente
so aminocidos diamino e monocarboxlicos, sendo trs: Lisina (NH3CH2CH2CH2CH2
CH(NH3)COOH); Arginina (HN=C(NH2)NHCH2CH2CH2CH(NH2)COOH); Histidina (H
(C3H2N2)CH2CH(NH2)COOH). Os aminocidos com ramificao R carregado negativamente
so aminocidos monoamino e dicarboxilicos, sendo dois: cido Asprtico (HCOOCH2CH(NH2)
COOH); cido Glutmico (HCOOCH2CH2CH(NH2)COOH).

2. Propriedades Qumicas e Eltricas

Todos os aminocidos so anfteros, isto , contm em sua estrutura pelo menos um grupo
cido (carboxilico) e um grupo bsico (-amino) funcionais que, em soluo aquosa, comportam-se
como cido e como base.

Os aminocidos podem tambm conter outros grupos facilmente ionizveis em sua molcula, tais
como: grupamentos amino-carboxilco, p-hidroxifenil, sulfidrilas, guanidino e imidazol. A estrutura
bsica da cadeia polipetidca implica na unio do grupo carboxlico de um aminocido com o grupo
-amino de um aminocido adjacente. O carter inico dos polipeptdeos se deve principalmente a
estes grupos ionizveis adicionais aos grupos terminais -amino e carboxlicos.
Outra propriedade fsica dos aminocidos o alto ponto de fuso, principalmente em sua frao
carboxlica. Esta uma caracterstica de compostos cuja rede de molculas no estado cristalino
estabilizada por foras eletrolticas de atrao entre grupos de cargas opostas. Estes fatos, bem como
outros pontos de evidncia levam a concluso de que os aminocidos ocorrem em solues como ons
dipolares e no como molculas dissociadas.
Quando um aminocido dissolvido em gua, pode se comportar como cido (doador de

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.


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prtons) ou como base (receptor de prtons).


Como cido: H2N+ - CH2COO- H+ + H2NCH2COO-
Como base: H2N+ - CH2COO- + H+ H3N CH2COO-
O grupamento carboxila ioniza-se em soluo aquosa liberando prton, e adquirindo carga
negativa. Por sua vez, o grupamento amina ioniza-se em soluo aquosa aceitando prton e adquirindo
carga positiva. Este comportamento depende do pH do meio aquoso em que o aminocido se encontra.
Em meio cido, os aminocidos tendem a aceitar prtons, comportando-se como base e
adquirindo carga positiva, pois, ionizam em seu radical amina. Em meio bsico, os aminocidos
tendem a doar prtons, comportando-se como cidos e adquirindo carga negativa, ionizam-se em seu
radical carboxila.
Em solues aquosas de pH neutro, os aminocidos podem existir em duas formas:
eletricamente neutra e ionizada. Ao dizer que o aminocido est eletricamente neutro, significa que
o grupo amina est desprotonado (-NH2) e o grupo carboxila protonado (-COOH). Em sua forma
ionizada, o grupo amina se encontra protonado (-NH3+) e o cido carboxlico desprotonado (-COO-),
denominando-se esta forma de zwitteron - molcula globalmente neutra em termos de carga eltrica,
mas possui cargas locais devido presena de grupos ionizados.
O valor de pH onde as cargas eltricas do aminocido de igualam e se anulam chama-se ponto
issoeltrico, ou pH isoeltrico (pI). O ponto isoeltrico quando o pH em que a carga lquida da
molcula igual a zero. Em um pH abaixo do valor de pI, os aminocidos e protenas apresentam
carga lquida positiva. Em um valor de pH acima do pI, os aminocidos e protenas encontram-se com
carga lquida negativa.

3. Curva de Titulao de um Aminocido

Ao titular um aminocido possvel determinar o efeito do pH sobre a sua estrutura devido


aos processos de desprotonao. Alm disso, pode-se determinar a reatividade das cadeias laterais
dos aminocidos e a concentrao de uma soluo atravs de uma soluo padro de concentrao
conhecida. Ao titularmos um aminocido monoamino e monocarboxilico, temos o seguinte
comportamento.

Ponto 1: Aminocido totalmente protonado


Ponto 2: [+NH3CHRCOO-]
Ponto 3: Ponto isoeltrico = on dipolar ou zwitterion (molcula neutra)
Ponto 4: [NH2CHRCOO-]
Ponto 5: Aminocido totalmente desprotonado

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.


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3.1 Prtica: Titulao de um aminocido

3.1.1 Procedimento prtico

O procedimento prtico estudado nesse captulo ir verificar o comportamento de um aminocido


essencial em contato com um cido ou uma base. No aminocido em questo ser determinado os
valores de pK e do pI, aplicando-se a equao de Handerson-Haselbach.

Clculos envolvidos:
pH = pK + log [doador prtons] / [receptor de prtons]
O pI de um aminocido pode ser calculado pela seguinte equao:
pI = (pKa1 + pKa2) / 2

Materiais e Reagentes
- Potencimetro; Bureta de 25 mL; Agitador magntico; Pipetas; Bquer; Solues: NaOH 0,1 mol
L-1; glicina 0,1 mol L-1; fenolftalena 5% m/v.

Procedimento:
Efetua-se a titulao do aminocido: Volume de 10 mL da soluo de glicina 0,1M transferido
para um Becker de 100 mL; Adiciona-se 10 mL de HCl 0,1 mol L-1 e 3 gotas de fenolftalena 5%
m/v. Aps homogeneizao e com o auxlio de uma bureta, titular a soluo com NaOH 0,1 mol L-1,
anotando-se o valor de pH aferido no potencimetro, a cada acrscimo de 1 mL da soluo alcalina.
Acrescentar NaOH at que ocorra a viragem completa do corante e o valor de pH no sofra mais
alterao significativa. Distribuir os valores conforme o grfico (Figura 2) a seguir: (x=mL de NaOH
adicionados; Y=pH)

pKa2

pI

pKa1

Figura 2. Grfico obtido pela titulao de glicina 0,1M com NaOH 0,1M

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16

Resultados e Discusso:
pK1 = (1,95+4,15) pK1 = 3,05
2
pK2 = (8,45+11,63) pK2 = 10,04
2
pI = (3,05+10,04) pI = 6,55
2
O primeiro pH aferido aps a adio do NaOH foi de 1,95 (ons protonados), permanecendo
com certa constncia at 4,15. medida que se tem NaOH adicionado, o pH aumenta at o momento
em que o grupo carboxila (COOH-) perde seu prton.
Na alterao do pH 4,15 para 8,45 h a formao de um ponto de inflexo, no qual ocorre a
remoo completa do prton do grupo amina e inicia-se a remoo do prton do grupo amino (NH3+).
Ao final da titulao, com pH de 11,63, tem-se calculado o segundo ponto pK. O ponto isoeltrico
(pI) calculado pela mdia aritmtica dos valores de pKa obtidos foi de 6,55.
Ao serem comparados com os dados da Tabela 1, com os valores obtidos pela titulao, percebe
que o perfil encontrado do aminocido analisado se assemelha com os dados de glicina j tabelados.

4. Protenas

As protenas so as molculas mais abundantes e funcionais, presentes em praticamente todos


os processos vitais. Apresentam uma incrvel diversidade de funes, embora todas compartilhem a
caracterstica estrutural comum de serem constitudos por aminocidos.
Quando as protenas so aquecidas em um meio aquoso, cido ou bsico, as ligaes amida
sofrem hidrlise liberando os aminocidos constituintes, cuja identificao implica no conhecimento
de suas propriedades fsico-qumicas. A hidrlise tambm pode ser realizada atravs de leveduras que
utilizam enzimas para a quebra de molcula. A invertase comumente usada para quebrar a molcula
de sacarose do substrato para absorver a molcula de glicose e frutose que so menores e transform-
las em etanol.
Invertase encontrada em um grande nmero de tecido de plantas e so frequentes os relatos
que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como razes e tubrculos de
batata, chicria, cenoura e beterraba, a atividade da invertase baixa em tecidos normais. Entretanto,
quando esses tecidos so cortados em discos e lavados em gua estril ou tampo, h um grande
aumento na sua atividade.
A anlise da atividade da invertase contribui significativamente para a formulao de hipteses
relativas cintica da interao entre a enzima e seu substrato. Dos dados obtidos da cintica da
invertase Michaelis e Mentem propuseram que uma molcula enzimtica reage com seu substrato
para formar o complexo enzima-substrato.

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4.1 Prtica: Determinao de protenas solveis totais em tecido vegetal

O mtodo a ser utilizado emprega um corante, Coomassie Brilliant Blue G-250, o qual sendo
carregado negativamente liga-se com cargas positivas da cadeia polipeptdica. O corante apresenta em
dois picos de absoro: vermelho (Amax.= 465nm) e azul (Amax.= 595 nm). Apesar da predominncia
da forma vermelha de absoro, a mesma converte-se para a forma azul, quando o corante reage com
a protena. A reao altamente reproduzvel e rpida, completando-se em cerca de dois minutos com
estabilidade de cor por at uma hora. No entanto, as leituras devem ser efetuadas aps 15 minutos de
incubao.

A) ENSAIO
Obteno do extrato*
Macerar 500 mg de tecido em 2 mL de tampo fosfato 0, 1 M, pH 6.7
Centrifugar por 10 min (4 C) a 5000 rpm e coletar o sobrenadante (extrato bruto);
Pipetar trs alquotas de 100 L (triplicata) de extrato* + 5 mL do reativo de Bradford (agitar);
Ler a absorbncia em 595 nm aps 15 minutos.
Comparar a leitura obtida em espectrofotmetro com o padro (BSA), atravs da equao da
reta.
Determinar poucas amostras de cada vez para que as leituras no demorem.
Utilizar preferencialmente cubetas de vidro ou plstico (metacrilato) e no de quartzo para
evitar a adeso do complexo corante-protena nas mesmas.

B) PREPARO DAS SOLUES


Comassie Brilliant Blue G-250
Dissolver 100 mg do corante em 50 mL de etanol 95%;
Adicionar 100 mL de cido fosfrico 85% e misturar bem em becker;
Diluir at 1 litro em balo volumtrico;
Filtrar 2 vezes aps completa dissoluo e armazenar em frasco escuro em geladeira.
Albumina de Soro Bovino - BSA (1 mg ml-1)
Dissolver 0,88 g de NaCl (PM = 58,45) em 100 mL de H2O para sol. salina 0,15 M;
Dissolver 100 mg de protena em 100 mL de soluo salina 0,15 M
Armazenar em freezer.

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C) CURVA PADRO
Preparar uma soluo estoque de BSA (Albumina de Soro Bovino) em concentrao final de 1
mg mL-1. Ver procedimento no item B.

Identificao Componentes do ensaio


Tubo No Concentrao g BSA L H2O L Comassie brilliant blue (mL)
1 0 0 100 5.0
2 10 10 90 5.0
3 20 20 80 5.0
4 30 30 70 5.0
5 40 40 60 5.0
6 50 50 50 5.0
7 60 60 40 5.0
8 70 70 30 5.0
9 80 80 20 5.0
10 90 90 10 5.0
11 100 100 0 5.0

A figura abaixo representa uma curva padro tpica, obtida a partir de BSA:

Figura 3. Curva padro BSA.

5. Referncias Bibliogrficas

Hayashi, F. Y.; Csar, M. C. - Relatrio 1: Titulao de Aminocidos. Bioqumica Fundamental-


ZAB0361. UNIVERSIDADE DE SO PAULO, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Ali-
mentos, Departamento de Cincias Bsicas, Pirassununga SP, Maio/2011.
Recife, J. S. - Bioqumica Vegetal. Engenharia Agrcola e Ambiental EAA1, Egdio Bezerra Neto,
Universidade Federal Rural de Pernambuco, Abril/2010.
Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254, 1976.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 02, p.06-12.


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Captulo 3
Atividade de lipoxigenases
rica Amanda de Barros
Amanda Cristina Esteves Amaro
Fernando Broetto

Introduo

As lipoxigenases (LOX) so isoenzimas que esto amplamente distribudas em plantas e animais


superiores. Elas catalisam a adio do oxignio molecular ao sistema pentadieno dos cidos graxos
poliinsaturados, formando hidroperxidos dos cidos graxos correspondentes que se decompem em
cidos, aldedos e cetonas de cadeia curta, (AXELROD et al., 1981; LEONI et al., 1985; MACK et
al., 1987; VICK; ZIMMERMAN, 1987; BUNKER et al., 1995).
Durante um processo de estresse, ocorrem danos fsicos s clulas vegetais, em razo disso, as
lipoxigenases (linoleato: oxignio oxido-redutase - EC 1.13.11.12) utilizam cido linolnico (C18:3)
ou cido linolico (C18:2) como substrato, tranformando-o em hidroperxidos do cido graxo, que
so rapidamente metabolizados para formar vrios produtos.
Dentre esses, esto a traumatina, envolvida na resposta a ferimentos e na induo da diviso
celular e formao de calos (SIEDOW, 1991), o cido jasmnico, associado ativao de genes que
codificam para a sntese de protenas de reserva e inibidores de proteases (MELAN et al., 1993), os
aldedos volteis e oxicidos, que causam efeito inibitrio sobre o crescimento de fungos patognicos
(VAUGHN; GARDNER, 1993), insetos e protozorios (CROFT et al., 1993). Esses aldedos
possivelmente agem tambm como um sinal qumico na atrao do inimigo natural do herbvoro para
a planta danificada (PAR; TUMLINSON, 1997).
Foram isoladas quatro isoenzimas, as lipoxigenases L-1, L-2, L-3a e L-3b. Estas isoenzimas
diferem entre si em vrios aspectos da ao cataltica, tais como pH timo de ao, especificidade
para substrato, regio-especificidade, produtos primrios e secundrios formados e valor de Km. As
isoenzimas L-3a e L-3b so muito similares em suas propriedades e, para fins analticos, podem ser
consideradas idnticas e caracterizadas como L-3 (AXELROD et al., 1981).
As lipoxigenases so protenas globulares, solveis em soluo salina e consistem em uma
cadeia polipeptdica simples, de peso molecular (Tabela 1) em torno de 100 Kda (HILDEBRAND;
HYMOWITZ, 1981; AXELROD et al., 1981). So dioxigenases, contendo um mol de ferro
em um grupamento no-heme, por mol de protena, portanto so denominadas metaloprotenas

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 03, p.13-17.


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(VLIEGENTHRT et al., 1979). O ferro II oxida-se em ferro III, ento retirado um tomo de
hidrognio da cadeia carbnica do cido graxo e este tomo de hidrognio se oxida a prton. O radical
pentadieno ligado a enzima convertido em um dieno conjugado que capta o oxignio. Ocorre ento
a liberao de hidroperxido, iniciando assim uma reao em cadeia (MORETTO; FETT, 1998).
As LOX esto presentes em grande variedade de tecidos animais, como aves, peixes e mamferos
(GERMAN; KINSELLA, 1985; GROSSSMAN et al., 1988; HSIEH et al., 1988), e esto envolvidas
no passo inicial da biossntese do cido araquidnico e de compostos ativos fisiologicamente, como
leucotrienos e lipoxinas (NAVARATNAM et al., 1988; KULKARNI; COOK, 1988). Tambm em
tecidos vegetais, tais como folhas (alfafa), sementes (cevada, abbora, oliveira, girassol, milho,
soja), frutos (ma, tomate), tubrculos (batata). NIELSEN et al. (2003), detectaram e analisaram
compostos de aroma, decorrentes da ao da LOX em alho cortado no branqueado. PREZ et al.
(1999) verificaram LOX em morangos. Dentre as plantas, a semente de soja a fonte mais rica das
enzimas representando cerca de 2% do total de protenas contidas no gro (AXELROD, 1981).
Os cidos graxos dos gros de soja so: os saturados (~15%) palmtico e esterico; o
monoinsaturado olico (~24%), e os poliinsaturados, linolico (~54%) e linolnico (~7%). Portanto,
a soja constitui-se num dos produtos mais susceptveis a ocorrncia da oxidao dos cidos graxos
(WILSON, 1987).
Os sabores descritos como amargo, adstringente e ranoso, resultantes principalmente da ao
da enzima lipoxigenase limitam o consumo dessa leguminosa. Nos gros de soja ntegros (secos), o
substrato no est exposto ao dessa enzima. A reao s ocorre quando os gros se quebram e
absorvem gua (MORAIS; SILVA, 1996).
A atividade da LOX tem sido associada diminuio da qualidade de vrios produtos, e desperta
o interesse de muitos cientistas, devido ao seu papel na gnese de compostos volteis e na formao
de radicais livres responsveis por atacar molculas de vitaminas, compostos fenlicos e protenas
(DONNELLY; ROBINSON, et al., 1995).

1. Material utilizado

Pistilo e graal; Tubos Falcon; Pipeta automtica; Eppendorf; Cubeta de quartzo;


Espectrofotmetro; Balana analtica; Gros de soja cultivares: BRS-213, BRS-258 e Embrapa
48.

2. Preparo de Solues

Tampo Tris-HCl 50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0; Soluo-estoque de linoleato de sdio 10


mM; Tampo fosfato 50,0 mM, pH 6,5.

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21

3. Procedimento

Para extrair a enzima dos gros macerou-se 20 mg da amostra com 2 mL de tampo Tris-HCl
50 mM, CaCl2 20 mM, pH 8,0, a soluo macerada foi transferida para tubos falcon e centrifugada a
5.500 rpm por 10 minutos, 4 C. O sobrenadante (extrato enzimtico) obtido da centrifugao foi
pipetado para eppendorf.
A atividade de lipoxigenases (LOX) sobre o cido linolico foi determinada segundo o mtodo
descrito por Axelrod et al. (1981), o qual se baseia no aumento da absorbncia a 234 nm, resultante
da formao de um sistema de duplas ligaes conjugadas no hidroperxido formado.
A soluo-estoque de linoleato de sdio 10 mM foi preparada adicionando a um erlenmeyer
envolvido por papel alumnio, contendo aproximadamente 10 mL de gua deionizada, previamente
fervida, 78 L de cido linolico (~99%) e 90 L de Tween 20 (SIGMA). Em seguida, homogeneizou-
se a soluo, succionando com auxlio de uma pipeta automtica e tomando-se o cuidado para no
formar bolhas. Para o clareamento da soluo, foram adicionadas gotas de soluo de hidrxido de
sdio 0,5 N. Aps o clareamento, a soluo foi transferida para um balo volumtrico de 25 mL
coberto por papel-alumnio, aps a aferio do volume. A soluo-estoque de linoleato de sdio foi
armazenada em tubos eppendorf, envolvidos em papel alumnio e armazenados em freezer a 20C.
Para as anlises das atividades de LOX, adicionou-se 10 L de extrato enzimtico e 40 L da
soluo-estoque de linoleato de sdio (substrato) em 500 L de tampo fosfato 50,0 mM, pH 6,5.
A velocidade da reao foi determinada de 20 em 20 segundos, a 234 nm, por um perodo de 60
segundos. Sob as mesmas condies, procedeu-se com o branco, que consistiu apenas da mesma
quantidade de substrato e tampo.
Os resultados foram expressos em mol/min/mg de protena a partir da expresso:
Velocidade da reao: E x VE x FD x VC

E = variao da absorbncia a 234 nm;


VE= volume do extrato enzimtico;
FD= fator de diluio;
VC= volume utilizado na cubeta;
= 25000 M-1 cm-1 (coef. de extino molar dos hidroperxidos do cido linolico a 234 nm).
Atividade especfica o nmero de unidades de enzima por miligrama de protena (LEHNINGER,
1995). Assim, os valores de atividade especfica foram obtidos dividindo-se os valores de atividade
pela concentrao de protenas em que a velocidade da reao/ mg de protena presente na amostra.
A quantificao do teor de protena no extrato enzimtico foi realizada pelo mtodo de
BRADFORD (1976), onde a concentrao de protena solvel presente nos extratos foi determinada
em triplicata, com albumina de soro bovino (BSA) como protena padro. A curva padro foi obtida
atravs de uma soluo de BSA em concentrao final de 1mg mL-1.

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4. Resultado e Discusso

Os resultados mdios obtidos para os trs cultivares de gros irradiados diferiram


significativamente dos resultados encontrados para os gros in natura (Controle) em relao
atividade de LOX, provando que as dosagens de irradiao utilizadas nos gros induziram queda da
atividade da lipoxigenase.
Era esperado que os resultados da atividade de LOX do cultivar BRS-213 fossem menores
quando comparados aos resultados encontrados para as cultivares BRS-258 e Embrapa 48, pois a
BRS-213 um cultivar modificado, livre da LOX, demonstrando valores mdios distantes entre eles.
Porm, o cultivar BRS-213 no livre totalmente de lipoxigenases, apresentando ainda uma atividade
residual.

Tabela 1. Atividade especfica de lipoxigenases-LOX (nmol. min.-1mg de protena-1) em trs cultivares de


soja (Controle) e em gros irradiados.

Atividade de LOX
Dosagem (*kGy) Cultivares
BRS-213 BRS-258 EMB-48
Controle 0,0125a 1,6883c 1,5068c

2,5 0,0261b 0,9911b 0,8565b

5 0,0170a 0,9613b 0,4696a

10 0,0234b 0,3327a 0,2826a


Mdias seguidas de letras diferentes na coluna indicam diferena significativa pelo teste de Tukey ao nvel de
5% de probabilidade. *kGy= unidade de dose de irradiao ionizante.

Em relao ao controle, os resultados mdios encontrados para os cultivares BRS-258 e Embrapa


48 foram prximos. Os valores obtidos para o cultivar BRS-258 irradiado a 10 kGy demonstrou
diferena significativa dos valores expressos para as outras dosagens e o controle. J o cultivar 48 no
apresentou diferena entre as dosagens de 5,0 e 10,0 kGy, e ambas diferiram da dosagem 2,5 kGy e
do controle. Portanto, pode-se afirmar para os cultivares BRS-258 e EMBRAPA 48 que quanto maior
a dosagem de irradiao maior ser a inativao das enzimas lipoxigenases.

5. Referncias Bibliogrficas
AXELROD, B.; CHEESBROUGH, T.M.; LAAKSO, S. Lipoxygenase from soybeans. Methods in
enzymology, New York. v.71, p.441-451, 1981.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the microgram quantities of protein utilizing the
principle of protein-dye-binding. Analytical Biochemistry, 72: 248-254, 1976.
BUNKER, T.W.; KOETJE, D.S.; STEPHENSON, L.C.; CREELMAN, R.A.; MULLET, J.E.;
GRIMES, H.D. Sink limitation induces the expression of multiple soybean lipoxygenase mRNAs

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 03, p.13-17.


23

while the endogenous jasmonic acid level remains low. Plant Cell, 7:1319-1331, 1995.
CROFT, K.P.C.; JNTTER, F.; SLUSARENKO, A.J. Volatiles products of the lipoxygenase
pathway envolved from Phaseolus vulgaris (L) leaves inoculated with Pseudomonas syringae pv
phaseolicola. Plant Physiol, 101:13-24, 1993.
DONNELLY, J. K; ROBINSON, D. S. Free radical in foods. Free radical research, Yverdon, v. 22, n.
2, p. 147-176, 1995.
GERMAN, J.B.; KINSELLA, J.E. Lipid oxidation in fish tissue. Enzymatic initiation via lipoxygenase.
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GROSSMAN, S.; BERGMAN, M.; SKLAN, D. Lipoxygenase in chiken muscle. J. Agric. Food
Chem. Easton, 36:1268-70, 1988.
HILDEBRAND, D.F.; HYMOWITZ, T. Two genotypes lacking lipoxygenase-1. J. Am. Oil Chem.
New York, 49: 583-86, 1981.
HSIEH, R.J.; GERMAN, J.B.; KINSELA, J.E. Lipoxygenase in fish tissue: some properties of the
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xenobiotic metabolism in the presence of linoleic acid. Research Commun. Chem. Pathol.
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LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princpios de bioqumica. So Paulo, Editora
Sarvier, 1995. 839p.
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MACK, A.J.; PETERMAN, T.K.; SIEDOW, J.N.Lipoxygenase isoenzymes in higher plants:
biochemical properties and physiological role.Current Topics Biolog Medi Resear, 13:127- 54,
1987.
MELAN, M.A.; DONG, X.; ENDARA, M.E.; DAVIS, K.R.; AUSUBEL, F.M.; PETTERMAN, T.K.
An Arabidopsis thaliana lipoxygenase gene can be induced by pathogens, abscisic acid, and
methyl jasmonate. Plant Physiol, 101:441-450, 1993.
MORAIS, A. A. C.; SILVA, A. L. Soja: suas aplicaes. Rio de Janeiro: MEDSI, 1996. 259 p.
MORETTO, E.; FETT, R. Tecnologia de leos e gorduras vegetais na indstria de alimentos, So
Paulo: Varela,1998-150p.
NAVARATNAM, S.; FEITERS, M.C.; AL-HAKIM, M.; ALLEN, J.C.; VELDINK, G.A.;
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Acta. Amsterdam, 956:70-76, 1988.
NIELSEN, G.S.; LARSEN, L.M.; POLL, A. Formation of aroma compounds and lipoxygenase (EC
1.13.11.12) activity in unblanched leek (Allium ampeloprasum var. bulga) slices during long-
term frozen storage. J. Agric. Food Chem. Easton, 51:1970- 76, 2003.
PAR, P.W.; TUMLINSON, J.H. De novo biosyntesis of volatiles inducible by insect herbivory in
cotton plants. Plant Physiol, 114:1161-1167, 1997.
PREZ, A.G.; SANZ, C.; OLIS, R.; OLIS J.M. Lipoxygenase and hidroperoxide lyase activities
in rypening strawberry fruits. J. Agric. Food Chem. Easton, 47:253, 1999.
SIEDOW, J.N. Plant lipoxygenase: struture and function. Ann. Rev. Plant Physiol Plant Mol Biol,
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VAUGHN, S.F.; GARDNER, H.W. Lipoxygenase-derived aldehides inhibit fungi pathogenic on
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VICK, B.; ZIMMERMAN, D.C. Oxidative systems for modification of fatty acids: the lipoxygenase
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Press, 9:53-97, 1987.
WILSON, R.F. Seed Metabolism. In: WILCOX, J.R. SOYBEANS: Improvement, production and
uses. 2.ed. Madison: Academic Press, 1987. cap.16, p.643-683.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 03, p.13-17.


24

Captulo 4
Enzimas antioxidativas em ps-colheita de
vegetais
Thalita Cristina Marques Cervezan
Mariana da Silva Caldeira
Fernando Broetto

Introduo

Aps a colheita de frutas e hortalias inicia-se uma srie de processos bioqumicos degradativos
que aceleram a senescncia, causando perdas de grande parte da produo. Muitas dessas perdas
podem ser atribudas ao de enzimas durante a ps-colheita (ZANATTA et al., 2006). Existem
numerosas enzimas oxidativas que promovem alteraes nos alimentos. A maioria das reaes
metablicas em frutos e hortalias catalisada por enzimas (CHITARRA e CHITARRA, 1990).
Entre elas a polifenoloxidase (PPO), encontrada praticamente em todos os tecidos vegetais,
resultando na formao de pigmentos escuros, proporcionando mudanas indesejveis nas
caractersticas sensoriais dos produtos. A polifenoloxidase aparentemente se torna envolvida no
metabolismo quando h ruptura da clula e vacolos com mistura dos seus contedos. Isso ocorre
durante a senescncia quando a integridade da clula rompida, ativando a PPO latente (PIMENTA,
2001).
O escurecimento desses alimentos durante o processamento e armazenamento provoca uma
diminuio na qualidade do produto devido mudana de cor, aroma e sabor, alm das propriedades
nutricionais. Essas mudanas so causadas por compostos fenlicos, que so muito encontrados nos
vegetais, sendo os maiores responsveis pela atividade antioxidante.
O grau de escurecimento nos vegetais est relacionada divergncia na concentrao destes
compostos fenlicos, alm da quantidade de oxignio, substncias redutoras, ons metlicos, pH,
temperatura e atividade de diferentes enzimas oxidativas, especialmente a polifenoloxidase e a
peroxidase. O escurecimento enzimtico causado pela produo de polifenlicos complexos, uma
reao catalisada primariamente pela PPO, produzindo as quinonas reativas.
As polifenoloxidades (PPO ou POF) so enzimas que promovem a oxidao enzimtica de
compostos fenlicos, produzindo, inicialmente, quinona que rapidamente condensa, formando
pigmentos insolveis e escuros, denominados melanina. Essas enzimas podem reagir no-

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 04, p.18-22.


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enzimaticamente com aminocidos, protenas ou outros compostos.


As polifenoloxidases (PFOs), assim como peroxidases (POX), SOD e outras oxidases, so
enzimas que oxidam substratos orgnicos. Porm, PFOs se diferenciam das demais por catalisarem
uma reao de oxidao dependente de oxignio de monofenis. A polifenoloxidase geralmente
elevada em tecidos infectados e tem grande importncia para as plantas, com envolvimento nos
mecanismos de defesa ou na senescncia. Em extratos de plantas, a atividade da peroxidase tem
sido encontrada na forma solvel e tambm ionicamente ligada parede celular. Alm disso, h um
aumento em sua solubilidade durante o perodo de maturao e, consequentemente, um aumento na
atividade dessa enzima no ps-climatrio.

Figura 1. Mecanismo geral de reao da polifenoloxidase.


Fonte: BELITZ e GROSCH (1997).

1. Procedimentos e Extrao de Enzimas em Tecidos Vegetais

1.1 Preparo da amostra para extrao

A coleta do material vegetal fresco deve seguir recomendaes de coleta citadas no Captulo 1
deste livro. Aps a coleta, a amostra macerada em nitrognio lquido deve ser quantificada, cerca de
500 mg, e ter seu peso devidamente anotado.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 04, p.18-22.


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1.2 Extrao enzimtica

Aps quantificao, a amostra ser colocada em tubo para centrfuga contendo 5 mL da soluo
tampo fosfato de potssio pH 6,7 e, posteriormente, acondicionada em centrfuga refrigerada. A
centrifugao dever ser feita a 10.000 rpm por 5 min na temperatura de 0 - 4C.
Ao trmino da centrifugao, deve-se retirar o sobrenadante e armazena-los em vidros pequenos
sobre refrigerao.

2. Anlises

As anlises sero realizadas em espectrofotmetro a 395 nm. Para tanto, prepara-se trs tubos
de ensaio. O primeiro tubo ser o branco da soluo, o que ir conter apenas 0,3 mL de soluo
tampo e 1,85 mL de catecol 0,1M. O segundo tubo ser o branco da amostra, que conter 0,3 mL
da amostra e 1,85 mL de gua deionizada. Para finalizar, o terceiro tubo receber 0,3 mL da amostra
e 1,85 mL de catecol 0,1 M.

As leituras obtidas pelo equipamento sero anotadas para a determinao da enzima de


polifenoloxidades.

Clculo

Para a determinao da enzima de polifenoloxidades, ser necessrio usar a seguinte frmula:


POF = (Leitura/30) x 1000
Peso da amostra

Onde:
- 30 tempo reao
- Leitura: a leitura indicada na frmula a subtrao da leitura amostra com a leitura do branco da
amostra. O resultado x obtido dever ser subtrado da leitura do branco da soluo, determinando
assim o y. Veja o exemplo abaixo:

Leitura amostra Leitura do branco da amostra = x


X leitura do branco da soluo = y

- Peso da amostra: dever ser determinado conforme o esquema abaixo:


500 mg 5 mL
X 1 mL da amostra
X= 0,1
Unidade: mol catecol transformado . min-1 g-1 massa fresca

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 04, p.18-22.


27

3. Preparo de Reagentes

A) Soluo extratora: Tampo Fosfato de Potssio 0,2 M, com pH 6,7:


Cada enzima tem um pH em que a sua atividade tima, no caso das POF esse valor 6,7. Para
o preparo do tampo necessrio fazer as solues:

Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4, PM = 136,09).


1,0 M 136,09 g (pH 5)
0,2 M x
x = 27,218 g para 1 L de gua deionizada ou 2,21 g para 100 mL de gua

Fosfato de potssio bibsico (K2HPO4, PM = 174,18).


1,0 M 174,18 g (pH 9)
0,2 M x
x = 34,83 g para 1,0 L de gua deionizada ou 3,483 g para 100 mL de gua

Para ajustar a soluo a um pH mais cido, coloca-se a soluo cida sobre a soluo bsica,
ajustando assim, o pH para cido. Para ajustar a soluo a um pH mais bsico, coloca-se a soluo
bsica sobre a soluo cida, ajustando assim, o pH para bsico. Para ajustar o pH a 6,7, coloca-se a
soluo bsica em bquer e acerta o pH com a soluo cida at chegar ao valor 6,7.

B) Preparar soluo de Catecol a 0,1M


Deve-se misturar Catecol com Soluo tampo de fosfato de potssio pH 6,7
Catecol:
1,0 M 110 g
0,1M x
X = 11g para 1,0 L de soluo tampo
Para preparar 50 mL:
11 g 1000 mL
x 50 mL
x = 0,55 g para 50 mL de soluo tampo

C) Soluo de cido perclrico (HClO4) 2N


Calcular:
C1 x V1 = C2 x V2
2N x 100 mL = 12,1N x X
X= 165,29 mL

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 04, p.18-22.


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165,29 mL 1000 mL
Y 100 mL
Y= 16,53 mL para 100 mL de gua deionizada

4. Resultado

Para compreender melhor a aplicabilidade do processo da enzima polifenoloxidases em ps-


colheita, descreve-se roteiro para sua determinao em goiaba e brcolis.
Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 500 mg de cada amostra e
extradas com tampo de extrao.
Aps realizar as leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotmetro, foi efetuado o clculo
para determinar o teor da enzima.

Tabela 1. Experimento prtico sobre a determinao de enzimas antioxidantes em ps- colheita de vegetais

Leituras em Absorbncia
Amostras Branco Branco da amostra Amostra POF
Goiaba 0 0,014 0,050 12,00
Brcolis 0 0,099 0,206 35,67

Essa prtica um exemplo simples para demonstrar atravs do calculo a atividade da enzima polifenoloxidase.
perceptvel a diferena entre as amostra analisadas demonstrando haver maior atividade nos Brcolis em
relao Goiaba.

5. Referncias Bibliogrficas

CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. B. Ps-colheita de frutas e hortalias: fisiologia e manuseio.


Lavras: ESAL/ FAEPE, 1990. 320 p.
Lopes, A.S. & Clemente, E. - Minerais e enzimas oxidativas em brcolos (Brassica oleracea L. Cv.
Italica) minimamente processado. Universidade Estadual de Maring, Maring, Paran, Brasil.
Publicado em Acta Scientiarum Maring, v. 24, n. 6, p. 1615-1618, 2002.
PIMENTA, C. J. poca de colheita e tempo de permanncia dos frutos espera da secagem, na
qualidade do caf (Coffea arbica L.). 2001. 145 p.Tese (Doutorado) Universidade Federal de
Lavras, Lavras, 2001
Ribeiro, J.M.; Oliveira, E.A.G.; Fernandes, K.V.S.; Pinto, M.S.T. - Extrao e Quantificao Simultnea
de Polifenoloxidases de Extratos Proteicos Solveis e Insolveis de Folhas. Publicado em ISSN
1808-9984.Dezembro, 2011 Petrolina, PE
ZANATTA, C. L.; ZOTARELLI, M. F.; CLEMENTE, E. Peroxidase (POD) e polifenoloxidase (PPO)
em polpa de goiaba (Psidium guajava R.). Cincia e Tecnologia dos Alimentos, v. 26, p. 705-708,
2006.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 04, p.18-22.


29

Captulo 5
Enzimas antioxidativas em tecidos
vegetais
Marcos de Oliveira Bettini
Renata Bruna dos Santos Coscolin
Dayanne Fabrcio Bressan
Edilson Ramos Gomes
Fernando Broetto

Introduo

O estresse oxidativo em vegetais pode ser definido como o desequilbrio entre a formao e
a remoo de agentes oxidantes, decorrente da gerao excessiva de espcies reativas de oxignio
(ERO). Segundo Mittler (2002), os agentes oxidantes das ERO so resultantes de uma reduo parcial
do oxignio molecular, podendo estes estar forma de oxignio singleto 1O2, radical hidroxila OH-,
nion superxido O2 - e perxido de hidrognio H2O2 (Figura 1) (SCANDALIOS, 2005; RESENDE
et al., 2003; MITTLER, 2002).
Fatores como a deficincia hdrica, variaes de luminosidade e temperatura, salinidade,
injrias provocadas por patgenos, uso de herbicidas, entre outros, podem intensificar a formao
dessas espcies aumentando sua concentrao no meio celular. O principal ponto de produo das
ERO durante as situaes de estresse so as organelas com alta atividade de oxidao metablica isto
devido ao intenso fluxo de eltrons, exemplo: cloroplastos e mitocndrias, sendo que nos cloroplastos
a formao das ERO esta relacionada aos eventos fotossintticos.
Os radicais superxidos so os primeiros a serem formados, os quais no conseguem atravessar
as membranas biolgicas ficando confinados no compartimento onde foram gerados. Em seguida,
haver a formao da espcie perxido de hidrognio que tem a capacidade de atravessar as
biomembranas e se distribuir a partir do local de sua produo (BREUSEGEM et al., 2001). A ltima
e mais reativa espcie a ser formada o radical hidroxila (OH.). Esse radical formado pela reduo
do H2O2 por ons metlicos (Fe2+ e Cu2+) e tem grande afinidade por molculas biolgicas em seu
stio de produo, tambm apresenta uma meia-vida curta, pois reage rapidamente com molculas
biolgicas sequestrando um tomo de hidrognio (BREUSEGEM et al. , 2001; NORDBERG e
ARNER, 2001). Portanto todas essas espcies destacam-se pela grande reatividade com biomolculas
que, por consequncia, provocam a lipoperoxidao das membranas celulares (BREUSEGEM et al.,

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


30

2001), bem como a oxidao de protenas e quebra na cadeia do DNA (ARGUIRRE et al. , 2005 ;
HAMID et al. , 2002).
Um dos mecanismos que a clula dispe para dismutar radicais livres produzidos em condio de
DH a ativao de enzimas antioxidativas, dentre elas a superxido dismutase (SOD, E.C. 1.15.1.1),
a ascorbato peroxidase (APX, E.C. 1.11.1.11), a catalase (CAT, E.C. 1.11.1.6), peroxidase (POX E.C
1.11.1.7) (MITTLER, 2002).
A enzima superxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1) so metaloprotenas que catalisam a
dismutao de radicais superxido a perxido de hidrognio e oxignio. Podem ser detctadas trs
classes de SOD diferenciadas de acordo com o metal presente em seu stio ativo como cofator:
cobre/zinco (Cu/Zn SOD), ferro (Fe-SOD) e mangans (Mn-SOD) e localizadas em diferentes
compartimentos celulares (SCANDALIOS, 2005).
Outra enzima importante no sistema de resposta antioxidativa em plantas a catalase (CAT;
EC 1.11.1.6), a qual decompe o perxido de hidrognio (H2O2) gerado nos peroxissomos durante a
fotorrespirao (GERBLING et al., 1984), bem como o produto de reao da SOD.
Entre as enzimas degradantes de H2O2, a nica que no consome equivalentes redutores da
clula e que possui um mecanismo muito eficiente para a remoo do perxido formado em condio
de estresse (SCANDALIOS, 2005).
Essa enzima tem sido descrita como susceptvel a fotoinibio e degradao, aps sua inativao
por luz, a atividade da catalase fortemente dependente de uma nova sntese da enzima, como relatado
por Hertwig et al. (1992).

nion superxido Radical hidroxila


Perxido de hidrognio

Figura 1. Produo de radicais livres em clulas.

1. Material e Mtodo
1.1 Processamento do material vegetal para obteno do extrato bruto.

Processar as amostras para obteno do extrato (Figura 1), que ser obtido atravs da
ressuspenso do material vegetal (300 mg) em 2,0 mL de tampo fosfato de potssio 0.1 M, pH 6.8,
suplementado com 200 mg de PVPP. Aps centrifugao por 10 min. a 10.000 x g, o sobrenadante
ser coletado e armazenado em freezer a - 80 C.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


31

Figura 1. Procedimento de seleo e macerao do material vegetal

1.2 Atividade da enzima Superxido Dismutase (SOD; EC 1.15.1.1)

A determinao da atividade da SOD considera a capacidade da enzima em inibir a fotorreduo


do NBT (Azul de nitrotetrazlio cloreto). A atividade ser determinada pela adio de 50 mL de
extrato bruto a uma soluo contendo 13 mM de metionina, 75 mM de NBT, 100 nM de EDTA e 2
mM de riboflavina em tampo fosfato de potssio 50 mM, pH 7,8.

A reao ser iniciada pela iluminao dos tubos, em cmara composta por tubos fluorescentes
(15 W), a 25 C. Aps 5 minutos de incubao, o final da catlise ser determinado pela interrupo
da luz (GIANNOPOLITIS e RIES, 1977). O composto azul formado (formazana) pela fotoreduo
do NBT ser determinado pela leitura em espectrofotmetro a 560 nm.
Os tubos considerados branco para a anlise recebem os mesmos reagentes, porm so mantidos
cobertos com papel alumnio, portanto, abrigados da luz. Uma unidade de SOD definida como a
atividade da enzima necessria para a inibio de 50 % da fotorreduo do NBT. Para o clculo da
atividade especfica da enzima, considera-se a porcentagem de inibio obtida, o volume da amostra
e a concentrao de protena na amostra (mg mL-1).

Preparo da soluo tampo (Fosfato de potssio 50 mM pH 7,8)


Para 1 L de tampo preparar os reagentes e proceder a mistura, controlando-se o pH em
potencimetro:

KH2PO4 (monobsico, PM = 136,09) = 6,8045 g L

K2HPO4 (bibsico, PM = 174,18) = 8,7090 g L

Aps a obteno do tampo no pH 7,8, o volume deve ser ajustado para 1 L com gua destilada.

Preparo da soluo para determinao da SOD (Soluo de trabalho)


Para 120 mL de tampo fosfato 50 mM pH7,8 adicionar:

13 mM de Metionina (PM = 149,2) 232,8 mg

75 mM de NBT (PM = 817,6) 7,2 mg

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


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100 nM EDTA (PM=380,2): Dissolver 10 mg de EDTA em 0,5 L de gua dest. Para a soluo,
pipetar 228 mL

2 mM de Riboflavina (diluir por ltimo e manter no escuro PM = 376,4)

Dissolver 10 mg em 500 mL de gua destilada 4,48 mL

Obs.: A soluo ser preparada em Erleinmayer coberto com papel alumnio, para evitar
fotoreduo.

Anlise:
Pipetar 50 mL de extrato bruto (amostra)

Pipetar 2,950 mL da sol. de trabalho

1 Tubo em branco - receber a sol. de trabalho + amostra; dever estar coberto com papel
alumnio; ser utilizado para zerar o espectrofotmetro.

2 Tubo 100% de fotoreduo (Controle) - receber somente a soluo de trabalho; dever


receber luz e ser utilizado para determinar a fotoreduo total do NBT.

3 Tubo da amostra receber a soluo de trabalho mais a amostra. Dependendo da atividade


da SOD, na amostra, se determinar a taxa de inibio da fotoreduo do NBT.

Aps incubao sob luz por 5 min., as absorbncias sero determinadas a 560 nm.

Ex. para o clculo: Os tubos sem amostra (controle) apresentam uma taxa de absorbncia
mdia de 0,280 e o tubo com a amostra, uma absorbncia em torno de 0,120. utilizando-se a
frmula , tem-se:

CONTROLE AMOSTRA
X 100 = % INIBIO
CONTROLE

Neste ex., tem-se= [(0,280 0,120) / 0,280] x 100 = 57,14% de inibio da fotoreduo.

Considerando-se que 50 % de inibio de fotoreduo representa 1 unidade de SOD,


neste exemplo teramos (por regra de trs) 1,14 U de SOD.

1 Unidade (U) de SOD definida como a quantidade de enzima requerida para inibir 50 %
da fotoreduo do NBT.

Atividade Especfica da SOD = U = % de inibio x volume da amostra mL


mg de protena 50 % x concentrao de protena mg mL

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


33

1.3 Atividade da enzima Catalase (CAT; EC 1.11.1.6)

A catalase uma hemoprotena (possui o grupo heme) altamente especfica, transforma o


perxido de hidrognio em gua:

Possui o mais alto nmero de turnover (Kcat) conhecido em enzimas: uma molcula pode
catalisar a decomposio de at 40.000.000 molculas de perxido de hidrognio por segundo.
A atividade da enzima catalase ser determinada em espectrofotmetro (240 nm) pelo
monitoramento da variao da absoro do perxido de hidrognio, conforme Peixoto et al. (1999).
Para o teste, 50 mL de extrato bruto sero adicionados a 950 mL de um tampo fosfato de potssio
50 mM, pH7,0 suplementado com perxido de hidrognio a uma concentrao final de 12.5 mM.
A variao da absoro (DE) ser calculada em um intervalo de 80 s, sendo a atividade da enzima
calculada utilizando-se um coeficiente de extino molar e = 39,4 mM-1 cm-1. A atividade especfica
(Kat g Prot-1) da catalase, levou em considerao a concentrao de protena solvel no teste.

Teste enzimtico:

50 mL de extrato bruto
950 mL of tampo fosfato 50 mM, pH 7.0 (suplementado com 12.5 mM de H2O2 (53.75 mL de
H2O2 (30%) en 100 mL de tampo).

1.4 Atividade da enzima Peroxidase (POD; EC 1.11.1.7)

A peroxidase uma enzima que possui uma variedade de isoformas e que utiliza diferentes
redutores, se caracteriza tambm por localizar-se em diferentes compartimentos celulares e por sua
importante funo relacionada biossntese da parede celular. Utilizam H2O2 ao invs de O2 como
agente oxidante:
+ +
NADH + H + H2O2 NAD + 2H2O
NADH peroxidase

A atividade da enzima ser determinada atravs da diluio (1:25) de 100 mL de extrato bruto
e adicionados a 4,9 mL de soluo tampo fosfato de potssio 25 mM, pH 6,8 contendo 20 mM de
Pyrogallol e 20 mM H2O2. Aps incubao por 1 min a reao deve ser paralisada com 0,5 mL de
H2SO4 e a leitura da absorbncia feita a 420 nM; A atividade especfica (Kat g Prot-1) da enzima
calculada usando-se coeficiente de extino molar de 2,47 mM-1 cm-1 (PEIXOTO et al., 1999).

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


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1.5 Atividade da enzima Ascorbato Peroxidase (APX; EC 1.11.1.11)

Para a anlise da atividade da enzima APX, inicialmente prepara-se uma soluo de trabalho
contendo uma alquota de 100 mL de extrato bruto com 2,9 mL de tampo fosfato de potssio 50 mM,
pH 6,0 (volume final de 3,0 mL). A esta soluo acrescenta-se ascorbato e perxido de hidrognio,
em concentrao final de 0.8 e 1,0 mM, respectivamente. A determinao da variao da extino (-),
efetuada a 290 nm, sendo que a atividade especfica da enzima (Kat g Prot-1) deve ser calculada
a partir de um coeficiente de extino molar de 2,8 mM-1 cm-1 (KOSHIBA, 1993).

1.6 Peroxidao de Lipdeos

Homogeneizar 200 mg de folhas em 4 mL de tampo TCA (1% w/v); Filtrar o homogenato


em cheesecloth (4X) ou 2X papel de filtro; centrifugar por 15 min a 12.000 x g; Pipetar 1 mL do
sobrenadante + 3 mL de cido tiobarbitrico 0,5 % (w/v) em TCA 20% (w/v); Incubar a 95 C por 60
min em dubnoff; Transferir os tubos para banho de gelo (para parar a reao); Centrifugar novamente
os tubos a 9.000 x g por 10 min; Ler os valores de absorbncia a 532 nm e 660 nm (para subtrair,
isolando-se interferentes).
A atividade ser calculada, utilizando-se um e = 155 mM-1 cm-1

2. Referncias Bibliogrficas

BROETTO, F.; LTTGE, U.; RATAJCZAK, R. Influence of light intensity and salt-treatment on
mode of photosynthesis and enzymes of the antioxidativo response system of Mesembryanthemum
crystallinum. Functional Plant Biology, v.29, p.13-23, 2002.
GIANNOPOLITIS, C.N., RIES, S.K.; Superxido dismutases. I. occurrence in higher plants. Plant
Phys., 59:309-314, 1977.
JENKS, M. A., HASEGAWA, P. A.; Plant Abiotic Stress. Oxford: Blackwell, 270 p., 2005.
KOSHIBA, T. Cytosolic ascorbate peroxidase in seedlings and leaves of maize (Zea mays). Plant
and Cell Phys., 34:713-721,1993.
MELO, G. M. O eu-estresse na micropropagao da cana de aucar: variveis bioqumicas e
moleculares. Seminrio e projeto de dissertao de mestrado no curso de melhoramento gentico
de plantas. UFRPE. Recife, 2010
PEIXOTO,.H.P.P..; CAMBRAIA, J.; SANTANA, R.; MOSQUIM, P.R.; MOREIRA, A.M.;
Aluminium effects on lipid peroxidation and the activities of enzymes of oxidative metabolism
in sorghum. Rev. Bras. Fis. Vegetal, 11 (3):137-43, 1999.
SOARES, A. M. S., MACHADO, O. L. T. Defesa de plantas: Sinalizao qumica e espcies reativas
de oxignio. Revista Tropica Ciencias Agrarias e Biologicas. V.1, n. 1, p. 9, 2007.
STEVANATO, R. Propriet antiossidanti e struttura chimica di molecole naturali - Spring School
Brasil-Itlia, CaFoscari e UNESP - Botucatu, 2011
TONIN, F. B. Atividade de enzimas antioxidantes e absoro de silcio em plantas de pimento
submetidas a estresse salino. Dissertao de mestrado da Faculdade de Cincias Agronmicas
da UNESP, Botucatu, 93p, 2005.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 05, p.23-28.


35

Captulo 6
Atividade da Nitrato Redutase
Amanda Cristina Esteves Amaro
rica Amanda de Barros
Marco Antonio Castillo Campohermoso
Fernando Broetto

Introduo

O nitrognio est entre os principais elementos minerais, pois vem logo depois do C, O e H
como componente de biomassa. A energia e a estrutura molecular necessria para a incorporao do
nitrognio provm do metabolismo dos carboidratos, o qual depende da fotossntese, e essa, por sua
vez, depende dos compostos contendo nitrognio, como, por exemplo, a clorofila, criando, assim, um
ciclo de interdependncia (LARCHER, 2006).
A assimilao de nitrognio o segundo maior processo metablico nas plantas superiores,
sendo superado apenas pela fixao fotossinttica do CO2. As plantas absorvem o nitrognio do solo
nas formas de nitrato e amnio, sendo que o nitrato a principal forma de nitrognio inorgnico
disponvel para as plantas, e sua absoro depende do pH na rizosfera, sendo que, sob pH baixo, a
absoro de nitrato mais prejudicada que a de amnio (BUCHANAN et al., 2000).
No citoplasma das clulas, depois de o nitrato (NO3) ser absorvido pelas razes das plantas, o
primeiro passo a sua reduo para nitrito (NO2), reao essa catalisada pela enzima nitrato redutase
(NR) (LARCHER, 2006).
A forma mais comum da enzima nitrato redutase usa, durante a reduo de nitrato para nitrito,
o NADH como doador de eltrons. No entanto, em tecidos no clorofilados pode utilizar tanto o
NADH, quanto o NADPH (YANG e MIDMORE, 2005).

NO3 + NADH + H+ NO2 + NAD+ + H2O


(Nitrato) (Nitrato Redutase) (Nitrito)

A enzima nitrato redutase (NR) formada por duas subunidades idnticas com trs grupos
prostticos cada (flavina adenina dinucleotdeo FAD, heme e complexo formado por molibdnio,
mais uma molcula orgnica chamada pterina) presente no citoplasma (TAIZ e ZEIGER, 2009).

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 06, p.29-34.


36

Depois da reduo do nitrato para nitrito, ele transportado rapidamente do citosol para o
interior dos cloroplastos (em tecidos clorofilados) e plastdeos (em tecidos aclorofilados), onde ser
reduzido amnia pela enzima nitrito redutase (NiR), usando ferredoxina reduzida como doadora de
eltrons; esse transporte deve ser rpido, pois o nitrito um on altamente reativo e potencialmente
txico para a clula. A ferredoxina reduzida proveniente do transporte de eltrons da fotossntese nos
cloroplastos e do NADPH formado na rota da oxidao das pentose-fosfato nos tecidos aclorofilados
(YANG e MIDMORE, 2005; TAIZ e ZEIGER, 2009).
Em seguida, esse amnio incorporado em molculas orgnicas, como aminocidos e
nucleotdeos, por meio da ao conjunta das enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase
(GOGAT) (LARCHER, 2006).
A nitrato redutase rapidamente produzida, de acordo com as necessidades da planta, sendo
que o nitrato, a luz e os carboidratos interferem na traduo e transcrio (TAIZ e ZEIGER, 2009).
A atividade da nitrato redutase muda de acordo com a fase da vida da planta; assim, possui
sua maior atividade em rgos de crescimento, durante a fase jovem, pois estes requerem grande
quantidade de nitrato. A citocinina tambm estimula a produo de nitrato redutase, alm de ser
regulada pelas alternncias entre luz e escuro (LARCHER, 2006).
As alteraes dirias na fotossntese interferem na expresso e atividade da nitrato redutase,
variando de acordo com o dia e com a noite, sendo que, geralmente, possui um pico de produo
no final da noite e nas primeiras horas do dia. Para um grande nmero de espcies, mesmo se elas
forem colocadas em condies de luz constante, as oscilaes circadianas da atividade da nitrato
redutase permanecero por aproximadamente 24 horas, indicando que esse ritmo endgeno (YANG
e MIDMORE, 2005).

1. Material e Mtodo
Fosfato de potssio dibsico (K2HPO4) PM 174,18;
Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) PM 136,09;
N-propanol, tambm conhecido como lcool iso-proplico ou iso-propanol ou 2-propanol PM
60,10;
N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride PM 259,17;
cido Clordrico (HCl);
Sulfanilamida PM 172,21;
Nitrito de sdio NaNO2.

1.1 Preparo das solues

Tampo fosfato de potssio 0,1 M pH 7,0

Fosfato de potssio dibsico (K2HPO4) PM = 174,18g

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 06, p.29-34.


37

1 mol L-1 ----------------- 174,18g


0,1 mol L-1 -------------- X
X = 17,418g em 1 L de H2O destilada

Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4) PM = 136,09g


1 mol L-1 ----------------- 136,09g
0,1 mol L-1 -------------- X
X = 13,609 g em 1 L de H2O destilada

KH2PO4
Acrescentar a soluo de KH2PO4 soluo de K2HPO4
at atingir pH final de 7,0. Completar o vol. para 1 L
K2HPO4

N-propanol (1%)
Para preparar 50 mL de soluo:

Pipetar 500 L de N-propanol em um balo e completar para 50 mL com gua destilada.


Tampo de extrao
2,527 g de KNO3
2,5 mL da soluo de N-propanol
Dissolver no tampo fosfato de potssio at atingir 250 mL em balo volumtrico.

Soluo N-Naftil 0,02%

Dissolver 10 mg de N-(1-napthy) ethelenediamine dihydrochloride em gua destilada completando o


volume final para 50 mL.
Soluo de sulfanilamida 1% (Massa/Volume) em HCl 1,5N

HCl 1,5N
Como: densidade=1,19 g mL-1 (T=37%) PM: 36,48
Ento: em 1 mL de soluo de HCl: 1,19 X 0,37 = 0,4403 g de HCl em mL do reagente.
NHCl = 0,4403/36,48 = 0,01207
M = 0,01207/ 1,0 X 10-3 L = 12,07 Molar

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38

Portanto para preparar 1,0L de uma soluo a 1,5N


N1 x V1 = N2 x V2
12,07 x V1 = 1,5 x 1,0
V1 = 0,1242 L de HCl
Colocar 0,1242 L de HCl em balo volumtrico e completar para 1L com gua destilada

Para preparar 100 mL de soluo de sulfanilamida:


Acrescente 12,4 mL de HCl em 87,6 mL de gua destilada
Dissolva 2 g de sulfanilamida

Cuidado:

Solues concentradas de cido clordrico (HCl) so corrosivas e podem causar queimaduras


graves. O vapor extremamente irritante para a pele, olhos e sistema respiratrio. O preparo dessa
soluo deve ser feita dentro de uma capela ventilada; Ao diluir cidos, sempre adicione o cido
gua, e no o contrrio.

1.2 Teste enzimtico

Cortar 200 mg de segmentos foliares, com auxlio de um estilete ou tesoura (Obs.: as plantas
devero estar iluminadas pelo menos por 2 horas, para a correta ativao da NR);
Colocar os segmentos em tubos de ensaio, acrescentar 10 mL do tampo de extrao e tampar
com a rolha especial para infiltrao vcuo (Figura 1);
Incubar vcuo: 3 ciclos de durao de 2 minutos, com intervalo de 1 minuto entre eles. Para
verificar se esta ocorrendo a correta infiltrao verifique se h formao de bolhas na beirada
das folhas. Alm disso, no deixe que as folhas se depositem no fundo, d pequenas batidas
no fundo para que elas subam.
Incubar em banho-maria a 30C, com agitao e no escuro por 1 hora;
Coletar 1 mL da soluo dos tubos de ensaio e transferir para tubos de ensaio limpos;
Acrescentar 1 mL da soluo de sulfanilamida e 1 mL da soluo de N-Naftil
Incubar em banho-maria a 30C, com agitao e no escuro por 15 minutos;
Ler em espectofotmetro a 540 nm.

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Figura 1. A) Infiltrao vcuo; B) Detalhe da formao de bolhas na beirada das folhas, indicando que esta
ocorrendo a infiltrao

Branco do espectrofotmetro: Deve ser feito o mesmo procedimento da amostra, no entanto o


tampo de extrao deve ser substitudo pelo mesmo tampo sem adio de KNO3.

Dicas:

- Os segmentos foliares devem ser cortados com auxlio de uma tesoura ou gilete, sendo que os
segmentos devem ser os menores e mais finos possveis.

- Para deixar os tubos de ensaio no escuro tampe o banho-maria com sua tampa prpria ou com
auxlio de papel alumnio.

- No lave as vidrarias com detergente, pois esses podem conter nitrito e, assim, alterar os seus
resultados. O ideal ferver as vidrarias antes de utiliz-las.

1.3 Curva padro de nitrito (NO2)

Soluo estoque de 10 mM NaNO2


69 mg de nitrito de sdio (NaNO2)
Dissolver em gua destilada at atingir o volume de 100 mL.

Soluo de Nitrito para a curva padro


Pipetar 1,25 mL (ou 1250 L) da soluo estoque de NaNO2 e completar com gua destilada para um
volume final de 500 mL.

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Volume da soluo de Volume de gua Concentrao final de NO2


Tubo
nitrito (mL) destilada (mL) (nmol)
0 0 10 0
1 1 9 25
2 2 8 50
3 4 6 100
4 6 4 150
5 8 2 200
6 10 0 250

Em seguida proceder a incubao exatamente como apresentado na Tcnica (item 1.2) a partir
da primeira incubao em banhomaria. Com os resultados das leituras de concentrao de nitrito,
organizar os dados em planilha, para calcular a atividade da NR nos segmentos foliares, com unidade
final em nM NO2 h-1 g-1 MF.

2. Referncias Bibliogrficas
JAWORSKI, E.G. Nitrate reductase assay in intact plant tissues. Biochemical and Biophysical
Research Communications. v.43, p.1274-1279, 1971.

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41

Captulo 7
Anlise de protenas por Eletroforese Nativa
Mariana da Silva Caldeira
Marcos de Oliveira Bettini
Dayanne Fabrcio Bressan
Fernando Broetto

Introduo

Eletroforese em gel uma tcnica de separao de molculas que envolve a migrao


departculas em um determinado gel durante a aplicao de umadiferena de potencial (Figura 1). Esta
tcnica normalmente utilizada para separar protenas, molculas de DNA e molculas de RNA. As
molculas so separadas de acordo com a massa molecular, carga e conformao.

Figura 1. Esquema do sistema de eletroforese

O gel (suporte para a migrao eletrofortica) pode ser de acetato de celulose, gel de agarose,
gel de poliacrilamida, entre outros. Os gis de poliacrilamida so comumente utilizados na separao
de protenas em virtude de ser quimicamente inertes, facilidade de colorao com nitrato de prata
e corante azul de Coomassie (corantes como esses coram totalmente a agarose impossibilitando
a identificao das espcies no eletroforetograma), os poros so facilmente ajustveis atravs do
controle de acrilamida e bis-acrilamida que so os polmeros que formam o gel.
Gis de poliacrilamida so formados por copolimerizao de acrilamida e Bis-acrilamida (Bis)
na presena de persulfato de amnia e tetrametiletilenodiamina (TEMED) ou riboflavina e TEMED
sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED catalisa a liberao de radicais livres de persulfato
SO4- que, por sua vez, iniciam a polimerizao (ALFENAS e BRUNE, 1998). A acrilamida uma

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


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molcula linear, enquanto a Bis-acrilamida tem forma de T. Ao misturar-se essas duas molculas,
tem-se a formao de uma rede onde diferentes relaes entre as concentraes dessas molculas
permitem a criao de diferentes gradientes de separao.
De acordo com Esteves (2012) existem variantes da tcnica de eletroforese, que podem
ser divididas em: eletroforese nativa (em que as protenas migram de acordo com os trs fatores
mencionados anteriormente: carga, massa molecular e conformao), zimografia (em que as
condies de corrida e de deteco permitem que se detecte uma determinada atividade enzimtica)
e eletroforese em condies desnaturantes (mais conhecida por SDS-PAGE, em que as protenas so
desnaturadas previamente, sendo separadas apenas de acordo com a sua massa molecular).
Na eletroforese nativa, utilizada mais comumente para isoenzimas, existe o sistema contnuo
e o sistema descontnuo. No sistema contnuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampo usado na
preparao da amostra e do gel o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. A escolha da soluo-
tampo e de seu valor de pH depende da estabilidade e solubilidade da protena em estudo.
Por outro lado, existe uma verso em que no somente usam-se tampes diferentes para o gel
e para o tanque, mas tambm um sistema de duas fases usado, compreendendo um gel principal
ou de resoluo e um gel empilhador de poros pequenos, onde a amostra proteica aplicada. Esse
conhecido como sistema descontnuo. Sob eletroforese, as molculas migram da parte mais porosa
(gel empilhador) para a menos porosa (gel separador). Consequentemente, as molculas de protena
concentram-se numa faixa estreita e compacta entre o gel empilhador e o separador, produzindo
melhor resoluo que no sistema contnuo, pelo empilhamento no gel empilhador, rendendo elevada
concentrao das protenas em anlise.
Muitos tampes de gel diferentes e concentraes diferentes tm sido delineados para ambos os
sistemas, contnuos e descontnuos.
Neste captulo ser explanada a metodologia de eletroforese nativa em sistema descontnuo das
enzimas SOD (Superxido dismutase) e Catalase extradas de tecidos vegetais.
A SOD tem a funo de catalisar a dismutao do superxido em oxignio e perxido de
hidrognio, sendo assim, uma importante defesa antioxidante na maioria das clulas expostas ao
oxignio. J a catalase tem a funo de catalisar a decomposio do perxido de hidrognio, que
altamente txico para as clulas.

1. Procedimentos

1.1 Extrao de protenas

A coleta do material vegetal deve seguir recomendaes de coleta citadas no Captulo 1


deste livro.
Aps a coleta, prosseguir com os seguintes passos (Figura 2):

A) Homogeneizar 1 g de tecido vegetal em 2,5 mL de tampo de extrao em um almofariz a 4oC;


B) Peletizar o material no solvel por centrifugao por 5 min a 12000 xg;

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


43

C) Separar o sobrenadante em novo eppendorf e determinar a concentrao de protena bruta


(Bradford, 1976);
D) Congelar o sobrenadante imediatamente em nitrognio lquido a fim de preservar a integridade das
molculas e posteriormente armazenadas em ultrafreezer a 75oC.

Figura 2. Esquema da obteno do extrato proteico

1.2 Eletroforese

1.2.1 Preparo do sistema


Todos os componentes da cuba devem estar limpos antes de serem utilizados a fim de evitar
qualquer alterao em funo de contaminantes ou resduos de anlises anteriores. As placas de
vidros, borrachas de vedao e pentes devem ser limpos com soluo detergente, lavados com gua
destilada e posteriormente limpos com etanol. Depois de devidamente higienizado, o sistema deve
ser tocado apenas com luvas.
Para a montagem do sistema vertical, deve-se posicionar os dois espaadores (1 mm) entre as
placas de vidro e encaix-los no suporte de forma que o encaixe seja perfeito para completa vedao
com a borracha. Esta montagem deve ser perfeita para que no ocorra vazamento do gel e risco de
perda da amostra (Figura 3).

Suporte com vedao de borracha


Cuba

Pentes

Espaadores
Placas de vidro
Figura 3. Componentes de uma cuba de eletrosforese

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


44

1.2.2 Preparo do gel

A concentrao de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos componentes


que se deseja analisar. Segundo Alfenas e Brune (1998), usam-se gis na faixa de 7,5 a 10%. Para
variar a concentrao de acrilamida no gel, para um mesmo volume de soluo, basta alterar o volume
da soluo-estoque de acrilamida-Bis em relao ao da gua; as quantidades dos demais componentes
do gel permanecem inalteradas. Preparadas as solues com TEMED e persulfato, deve-se aplicar
imediatamente ao sistema pois a geleificao se processa em poucos minutos.

O preparo do gel se processa da seguinte maneira:

A) Com o auxlio de uma pipeta ou seringa aplicar a soluo do gel separador no espao entre
as placas de vidro at a altura de mais ou menos 1,5 cm abaixo da extremidade inferior do pente;
B) Imediatamente aps, aplicar um pequeno volume de isobutanol (ou etanol 70%) sobre o gel
para garantir a uniformidade da superfcie deste;
C) Aps a polimerizao do gel (cerca de 20 min) observa-se uma separao ntida entre o gel
e o isobutanol, que deve ser removido por decantao e uso de papel-filtro;
D) Aseguir, inserir o gel empilhador e, imediatamente, o pente. Evitar ao mximo a formao
de bolhas.
E) Esperar cerca de 20 min para que o gel se polimerize completamente e retirar o pente
cuidadosamente para no romper os poos. Obs: caso a utilizao do gel seja posteriormente, deve-se
cobrir o suporte com o gel com um saco plstico e manter em geladeira.

1.2.3 Preparo da amostra

Realizada a extrao de protenas, conforme descrito no item 1.1 deste captulo, misturar 2
volumes do extrato proteico (protena solvel) com 1 volume de glicerol (com azul de bromofenol).

1.2.4 Corrida do gel

A) Remover o pente do gel da amostra com as duas mos, puxando-o firmemente para cima,
evitando danificar os poos;
B) Montar o suporte com o gel na cuba de corrida;
C) Encher a cuba com tampo do reservatrio;
D) Remover possveis bolhas de ar na base do gel;
E) Pipetar cerca de 15 L de amostra em cada poo utilizando-se uma seringa Hamilton ou
pipeta com ponteira estrangulada (todos os poos devem ser cheios com amostra ou com soluo
tampo);
F) Para determinao da massa molecular aparente das protenas pipetar padres de massa

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


45

molecular conhecida no ltimo poo de corrida.


Um marcador bastante utilizado para massa molecular de protenas o LMW-Marker-Kit, da
BioRad, pode-se utilizar por exemplo 5 L de Marker-Kit mais 170 L de tampo Laemmli.
A corrida indicada de 180 mA, com voltagem constante, a 4 oC durante 90 min
(aproximadamente) (Figura 4).

Figura 4. Esquema da corrida das amostras em gel a 4 oC

1.3 Atividade das enzimas

1.3.1 Superxido Dismutase SOD E.C. 1.15.1.1

Para analisar a SOD, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo (Figura 5):
A) Incubar o gel de poliacrilamida poroi 30 min em 50 mL de soluo corante no escuro;
B) Aps o incubamento no escuro, incubar na presena de luz at que as bandas de atividade
fiquem claramente visveis;
C) Parar a reao pela lavagem dos gis em gua bidestilada
D) Para inibir a Cu/Zn-SOD adicionar soluo de KCN 3 mM (10 mg de KCN em 50 mL da
soluo corante) ou ainda para inibir tambm Fe-SOD, adicionar 24,3 L 35% H2O2 (concentrao
final de 5 mM) em 50 mL da soluo corante. Na presena de H2O2, alm das bandas de SOD, as
bandas de atividade de catalase tambm se tornam visveis.

Figura 5. Esquema de revelao da SOD

1.3.2 Catalase -CAT

Para analisar a CAT, deve-se seguir o procedimento descrito abaixo:

A) Lavar o gel por 10 min, sob agitao, descartar a gua;


B) Lavar novamente por 5 minutos, sob agitao e descartar a gua (realizar essa etapa duas

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


46

vezes);
C) Incubar o gel por 5 min em soluo de 0,03 % (v/v) de H2O2 sob agitao. Para preparar a
soluo de perxido de hidrognio, pipetar 0,1 mL de H2O2 (30 vol) w misturar em 99,9 mL de gua
bidestilada.
D) Lavar novamente o gel com gua bidestilada;
E) Incubar o gel na soluo corante (tampo de colorao para CAT) at que as manchas
fiquem visveis (aproximadamente 2 min) e parar a reao com lavagem em gua bidestilada.

2. Reagentes
2.1 Utilizados no preparo dos gis

Na tabela a seguir (Tabela 1) esto os reagentes utilizados para o preparo dos gis de eletroforese
Tabela 1. Reagentes necessrios no preparo dos gis de eletroforese

Substncia Massa molecular (g mol)


Persulfato de amnia (APS), pA 228,20
Azul de bromofenol 691,94
Ditiotreitol (DL-) (DTT) 154,24
Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10
GlicinA, p.A. 75,07
Kaleidoscope Prestained Standards -
LMW-Marker-Kit -
Mercaptoetanol (-) 78,13
TEMED, electr 116,21
Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17
Tris [Tris(hidroximetil)aminometano] 121,14

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47

2.2 Utilizados para extrao e atividade protica

Na tabela a seguir (Tabela 2) esto os reagentes utilizados para extrao e atividade protica.

Tabela 2. Reagentes necessrios no preparo das solues de extrao e revelao

Substncia Massa molecular (g mol)


Azul de bromofenol 691,94
Di-potssio hidrogenofosfato (K2HPO4) x 3H2O 228,23
DL-Ditiotreitol (DTT) 154,24
EDTA (cido Etilenodiamina Tetractico) 380,2
EGTA[etilenoglicol-bis-(-aminoetilter)N,N,N,N-cido
380,4
tetraactico]
Glicerol, p.A (87% (v/v)) 92,10
Perxido de hidrognio (H2O2), 35% (v/v) 34,02
Sulfato de magnsio (MgSO4) x 7 H2O 246,48
NBT (Azul de nitro tetrazlio), grade II 817,6
Cianeto de potssio (KCN), pA 65,12
Potssio dihidrogenofosfato (KH2PO4), pA 136,09
Riboflavina (vitamin B12) (C17H20N4O8) 376,4
TEMED, electr 116,21
Tricina, (N-[2-Hidroxi-1,1-Bis (Hidroximetil) Etil] Glicina) 179,17

3. Solues

3.1 Gel de separao


Soluo para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 3):
Tabela 3. Protocolo utilizado para gel de separao em trs diferentes concentraes.
Soluo L para 10% T L para 12,5% T L para 15% T
gua bidestilada 5352 4265 3185
Lower Tris (1) 3280 3280 3280
Sol. Acrilamida 4333 5420 6500
TEMED 10 10 10
Start: APS (2) 25 25 25
(1)
Lower Tris: 1,5M Tris, pH 8,8 manter em temperatura ambiente.

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48

Para 100 mL de soluo, dissolver 18,17g de Tris em 75 mL de gua bidestilada, ajustar para
pH 8,8 com HCl concentrado e completar para 100 mL com gua bidestilada.

Persulfato de amnia (APS) 50% (p/v) - armazenar a soluo a 4oC. Dissolver 5 g de APS em 10
(2)

mL de gua bidestilada. Esta soluo pode ser utilizada por vrias semanas.

Ateno: Durante o manuseio com acrilamida usar luvas, pois seus monmeros e derivados so
altamente txicos, podem causar cncer e/ou destruir tecidos nervosos.

3.2 Gel de empilhamento

Soluo para 2 Mini-Protean II (0,8% C) (Tabela 4)


Tabela 4. Protocolo utilizado para preparo do gel de empilhamento

Soluo L para 5% T
gua bidestilada 2882
Upper Tris (1) 1250
Sol. Acrilamida 833
TEMED 10
Start: APS(2) 20
(1)
Upper Tris: 0,5M Tris, pH 6,8 manter em temperatura ambiente
Para 100 mL de soluo dissolver 6,06 g de Tris em 75 mL de gua bidestilada, ajustar para
pH 6,8 com HCl 2 N e completar para 100 mL com gua bidestilada.
(2)
Persulfato de amnia (APS) 50% (p/v) - armazenar a soluo a 4oC

3.3 Tampo de reservatrio

Tris glicina, 4X concentrada:


0, 1 M Tris base.................................................12,11 g
0,77 M glicina....................................................57,80 g

Dissolver em gua bidestilada, completar para 1L e conservar a 4 oC. Antes do uso diluir a
soluo a 1:4. Para solues 10X concentrada, diluir a 1:10. No necessrio ajustar o pH pois na
diluio o pH cair para aproximadamente 8.9.

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49

3.4 Tampo de extrao

Para 100 mL:


100 mM Tricina.................................................1,79 g
3 mM MgSO4.....................................................74 mg
3 mM EGTA.......................................................114 mg

*Para espcies oleaginosas ou resinosas deve-se adicionar 0,5 (p/v) PVPP (=0,05 g).

Dissolver em 75 mL de gua bidestilada, ajustar o pH 8,0 com Tris e completar o volume para
100 mL. No momento em que for utilizar adicionar 1 mM de DTT (= 15 mg).

3.5 Tampo fosfato


Para obteno do tampo fosfato 50 mM, pH 7,8, misturar as solues 6,81 g KH2PO4 e 11,41
g L K2HPO4 em 1 L e gua bidestilada e ajustar o pH.

3.6 Tampo de colorao para SOD

Para 200 mL:


10 mM EDTA....................................................760 mg
28 mM TEMED..................................................651 g
30 M riboflavina..............................................2,3 mg
245 M NBT.......................................................40 mg
Dissolver em 200 mL de tampo fosfato e manter no escuro.

3.7 Tampo de colorao para CAT

Soluo de 2% de FeCl3 e 2% de K3Fe(CN)6.

Soluo de 2% de FeCl3: 0,5 g em 25 ml de gua bidestilada

Soluo de 2% de K3Fe(CN)6: 0,5 g em 25 mL de gua bidestilada.

Misturar as solues no momento em que for utiliz-la e completar para 200mL com gua
bidestilada.

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50

4. Referncias Bibliogrficas

ALFENAS, A.C.; BRUNE, W. Eletroforese em gel de poliacrilamida. In: Eletroforese de isoenzimas


e protenas afins: fundamentos e aplicaes em plantas e microrganismos. Editado por
Acelino Couto Alfenas. Viosa: UFV, 1998, 574p.
BEAUCHAMP, C.. FRIDOVICH, I. Superoxide dismutase: improved assays and na assays
applicacle to acrylamide gels. Analytical Biochemistry. 44, p. 276-287, 1971.
ESTEVES, A.C. Anlise de protenas por eletroforese. Disponvel em: <http://molar.crb.ucp.pt/
cursos/>. Acesso em 15 mar 2012.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins of the head of bacteriophage T4. Nature:
London, 227, p. 680-685, 1970.
MISZALSKI, Z.; SLEAK, I.; NIEWIADOMSKA, E.; BISCZEK, R.; LUTTGE, U.; RATAJCZAK,
R. Subcellular localization and stress responses of superoxide dismutase isoforms from leaves in
the C3-CAM Intermediate halophyte Mesembryanthemum crystallinum L., accepted.
VOET, D.; VOET, J.G.; Bioqumica. Artmed, Porto Alegre. 3.ed. 2006.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 07, p.35-44.


51

Captulo 8
Atividade da Invertase de Levedura:
valores da constante de Michaelis-Menten
(Km) e velocidade mxima (Vm)
Sthefany Rodrigues Fernandes Viana
Djanira Rodrigues Negro
Fernando Broetto

Introduo

A anlise da atividade da invertase contribui significativamente para formulao de hipteses


relativas a cintica da interao entre uma enzima e seu substrato (GRACIDA-RODRGUEZ, 2005).
Dos dados obtidos da cintica da invertase Michaelis e Menten propuseram que uma molcula
enzimtica reage com seu substrato para formar o complexo enzima-substrato.
Invertase encontrada em um grande nmero de tecidos de plantas e so freqentes os relatos
que a associam com a parede celular. Em muitos tecidos de reserva tais como razes e tubrculos
de batata, chicria, cenoura e beterraba, a atividade da invertase baixa em tecidos normais (no
injuriados). Entretanto, quando esses tecidos so cortados em discos e lavados em gua estril ou
tampo, h um grande aumento na sua atividade. As leveduras utilizam a invertase para quebrar
a molcula de sacarose do meio para absorver a molcula de glicose e frutose que so menores e
transform-las em etanol (Figura 1). Nas leveduras a invertase uma exoenzima.

Figura 1. Reao da invertase

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 08, p.45-49.


52

O objetivo deste experimento levar o aluno a aprender uma tcnica de medida da atividade
da enzima e utilizando os dados obtidos calcular dois parmetros da cintica enzimtica que so a
constante de Michaelis e a Velocidade Mxima da reao, parmetros estes que ajudaram Michaelis
e Menten a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reaes enzimticas.

1. Invertase de Levedura
1.1. Reao a ser estudada

Sacarose + gua glicose + frutose

C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

1.2. Determinao de Km e Vm da Invertase de Levedura


Para compreender a cintica da invertase, esse captulo abordar a tcnica experimental de
medida da atividade da enzima utilizando os dados obtidos para calcular dois parmetros da cintica
enzimtica. Estes parmetros so a constante de Michaelis e a Velocidade Mxima da reao, que
ajudaram Michaelis e Menten a comprovar sua teoria sobre o mecanismo das reaes enzimticas.
A determinao dos parmetros constante de Michaelis e velocidade mxima feita medindo
a atividade da enzima em vrias concentraes do substrato. Este experimento tambm denominado
efeito da concentrao do substrato na velocidade da reao.

Procedimento
A saber:
Sacarose + gua + Invertase Glicose + Frutose
C12H22O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

Para a determinao de Km e Vm da invertase de levedura necessrio pipetar, em tubos de


ensaio, os volumes das solues como indica a Tabela 1. Assim que os tubos atingirem a temperatura
37C em banho-maria, acrescenta-se a soluo enzimtica manter em incubao por 15 min. Aps
esse tempo, cada tubo receber 1 mL de reativo Somogy o qual interromper a reao enzimtica.
Em seguida, aps os tubos serem fervidos durante 10 min, deve-se resfria-los em gua corrente e
adicionar 1 mL do reativo de Nelson. Agitar e completar o volume a 10 mL com gua destilada. Ler a
absorbncia a 530 nm no espectrofotmetro e transformar as leituras em quantidades de acar redutor
formado por 15 minutos da reao, consultando a curva de calibrao previamente estabelecida.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 08, p.45-49.


53

Tabela 1. Volumes estipulados a serem acondicionados em tubos de ensaio


Tubo Sacarose H20 Sol. Enzima Sol. Somogy Sol. Nelson

Banho Maria a 100C por


(mL) (mL) (mL) (mL) (mL)

Banho Maria a 37C por


0 0,0 1,0 0,2 1 1

15 minutos

10 minutos
1 0,2 0,8 0,2 1 1
2 0,4 0,6 0,2 1 1
3 0,6 0,4 0,2 1 1
4 0,8 0,2 0,2 1 1
5 1,0 0,0 0,2 1 1
Dados: Concentrao de Sacarose 0,01 mol/L

Resultados:
Para a determinao das anlises enzimticas segundo Lineweaver-Burk, deve-se utilizar a
seguinte frmula:
Equao de Lineweaver-Burk: 1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1/Vmax onde,

Y = a x + b
Equao de Michaelis-Menten, sendo:
Vo=Vmax . [S]
Km + [S]

Aps obteno dos dados (Tabela 2), deve-se construir um grfico, colocando no eixo
das abscissas o inverso da concentrao do substrato (1/S) e no eixo das ordenadas o inverso da
velocidade da reao (1/V) que igual quantidade de acar redutor formado durante os 15 minutos.
Os valores de R obtidos no grfico representam uniformidade nas concentraes, portanto, quanto
mais aproximado de 1, melhor os resultados.

Tabela 2. Valores de absorbncia aps hidrlise da sacarose.

mL Sacarose Leituras
0 0,000
20 0,054
40 0,084
60 0,111
80 0,157
100 0,186

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 08, p.45-49.


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Figura 1. Grfico representativo das leituras aps a inverso da sacarose

Conforme os dados apresentados na Figura 1 e Tabela 2, pode-se calcular os valores de Vmax


e o Km, usando a equao de Lineweaver-Burk. Desde modo, substituindo os valores obtidos no
grfico, obtm-se:

Dados:
Y = ax + b Y= 0,0018x + 0,0082
Sabendo-se que:
1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]
Ento:
1/Vo = 0,0018 . 1/[S] + 0,0082
Portanto:
1/Vo = 0,0082 Vmax = 121,95 g L.h
Logo,
Km/Vmax = 0,0018 Km = 121,95 . 0,0018 Km = 0,220 g/L

Tabela 3. Obteno da reta-padro da glicose


Tubo Glicose mL H20 mL g glicose Nelson H20 mL Leituras
Banho maria a 100C por

()
0 1,0 0,0 100 1 7 0,474
20 min - esfriar

1 0,8 0,2 80 1 7 0,365


2 0,6 0,4 60 1 7 0,291
3 0,4 0,6 40 1 7 0,174
4 0,2 0,8 20 1 7 0,074
5 0,0 1,0 0 1 7 0,000

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 08, p.45-49.


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Figura 2. Grfico representativo das leituras da glicose (reta padro)

Calculando os valores de Vmax e Km, conforme a equao de Lineweaver-Burk. Substituindo


os valores obtidos e descritos na Figura 2, tem-se:
Dados:
Y = ax + b Y= 0,0048x + 0,0103
Sabendo-se que:
1/Vo = Km/Vmax . 1/[S] + 1[Vmax]
Ento:
1/Vo = 0,0048 . 1/[S] + 0,0103
Portanto:
1/Vo = 0,0103 Vmax = 97,09 g/L.h
Logo,
Km/Vmax = 0,0048 Km = 97,09 . 0,0048 Km = 0,466 g/L

A concentrao de glicose pode ser calcular atravs da frmula Y=ax+b, onde x expresso
em g glicose ou pelos dados:

100 mg glicose em 100 mL 1mg/mL


100 mL da soluo em 100 ml 10 mg/mL

Portanto: 100 ml de soluo ------ 10 mg


1 mL -------------------------- x
X= 0,1 mg ou 100 g

2. Referncias Bibliogrficas
GRACIDA-RODRGUEZ, J.; FAVELA-TORRES, E.; PRADO-BARRAGN, A.; HUERTAOCHOA,
S. SAUCEDO-CASTAEDA, G. Invertases. In: PANDEY, A.; WEBB, C.;SOCCOL, C.R.;
LARROCHE, C. (Ed.) Enzyme Technology. New Delhi: Asiatech Publishers, 2005. p. 449-464.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 08, p.45-49.


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Captulo 9
Solues Tampo: Conceito e Preparao
Jos Pedro Serra Valente
Fernando Broetto

Introduo

A principal finalidade de uma soluo tampo, ou simplesmente um tampo, controlar o pH


de uma soluo. Secundariamente os tampes podem ser utilizados para controlar a fora-inica de
um meio, estabilizar a estrutura do cido nuclico, controlar a atividade etc.
Neste texto vamos considerar o principal uso. Assim, podemos dizer que um tampo uma
soluo que no varia significativamente de pH com a adio de pequenas quantidades de cidos,
bases ou por efeito de diluio (adio de gua) ou da concentrao (evaporao do solvente gua).
As solues tampo tambm so chamadas de:
Solues reguladoras de pH
Solues estabilizadoras de pH
Solues que contm acidez e alcalinidade de reserva
Exemplo:

Comparao entre a variao do pH da gua e do sangue aps a adio de 0,01 mol de HCl e
0,01 mol de NaOH?

0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH

1 Litro de 1 Litro de
gua pura gua pura

pH=7 pH=2 pH=7 pH=12

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


57

A acidez alterada rapidamente em cinco ordens de grandeza.

0,375 g de HCl 0,400 g de NaOH

1 Litro de 1 Litro de
sangue sangue


pH=7,4 pH@7,3 pH=7,4 pH@7,5

O pH praticamente se mantm estvel.

O sangue possui um sistema tampo que estabiliza o pH quando aumentado a concentrao


do cido ou base.
Isto ocorre devido ao sistema H2CO3/HCO3- (cido carbnico/ bicarbonato) e HPO42-/H2PO4-/
(monohidrogenofosfato/ dihidrogenofosfato) existente no sangue. O H2CO3 um cido fraco e o
HCO3- sua base conjugada, o mesmo ocorre para o sistema fosfato, o HPO42- uma base fraca (mais
forte que o H2PO4-) e o H2PO4- seu cido conjugado. Um par conjugado so duas espcies qumicas
cuja diferena um hidrognio.
A classificao como cido ou base depende da constante de equilbrio, pKa ou pKb. Em um
par conjugado quem tem menor pKa cido e quem tem maior pKa bsico.
Tampo a traduo da palavra Buffer do ingls que significa amortecer, pra-choque, isto
porque a soluo amortece a variao do pH.
Quando adicionado um cido em um meio, o pH tende a cair, mas imediatamente volta a
condio inicial pelo restabelecimento do equilbrio, como se fosse um impacto amortecido por um
colcho ou mola.

APLICAO

A) Qumica:

Muitas reaes qumicas so favorecidas ou so mais quantitativas em um pH especifico ou


faixa estreita. Desta maneira quando necessrio manter o pH constante adicionado na soluo
de interesse um pequeno volume de tampo com o pH estabelecido, favorecendo, assim, a reao
qumica desejada.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


58

As solues tampo tambm so utilizadas para calibrao de pHmetros, eletroforese,


cromatografia lquida, cromatografia de ons etc.

B) Bioqumica:

Os sistemas biolgicos so dependentes de reaes bioqumicas que ocorrem em pH constante


ou em faixa muito estreita. Assim, muitos sistemas biolgicos possuem naturalmente um sistema
tampo, permitindo que ocorram as reaes bioqumicas necessrias para a manuteno da vida e/ou
sade. Por exemplo, o sangue possui um pH entre 7,35 e 7,45, nessa faixa consome o cido lctico
que produzido nos exerccios e que deve ser eliminado rapidamente para que o pH das clulas do
corpo no caia e produza a morte das clulas. Quando o dixido de carbono dissolvido no sangue
aumenta a acidez e diminui a capacidade do sangue de transportar oxignio. Em condies em que
introduzido pouco cido ou base, os sistemas H2CO3/HCO3-, H2PO4-/HPO42-e algumas protenas,
presente no sangue, mantm o pH do sangue na faixa desejada. Uma alta introduo de cido no
sangue pode causar acidose ou mesmo a morte celular, e uma alta introduo de base pode causar
alcalose ou morte celular.
As enzimas s so ativas em faixas de pH muito estreita. Em outros pHs pode ocorrer
diminuio ou perda total da atividade da enzima com a desnaturao.
Solues tampes so utilizadas para estabilizar cidos nucleicos e complexos protenas - cidos
nucleicos, meios de cultura como fermentaes etc.

pH E MECANISMO DO FUNCIONAMENTO DO TAMPO

Os tampes so geralmente preparados misturando um cido fraco e um sal da base conjugada


ou uma base fraca e um sal do cido conjugado, para obter uma soluo com pH definido.
Vamos considerar um cido fraco (um prton ligado a um nion A-):
HA H+ + A- (equilbrio qumico em meio aquoso)
Muito pouco pouco

e um sal solvel (eletrlito forte) com o nion igual ao do cido, ligado a um ction (C+) em meio
aquoso:

CA C+ + A- (no existe equilbrio qumico)


Nada muito muito

A equao de equilbrio do cido :


Kc = [H+] [A-] (Constante de Dissociao)
[HA]

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


59

Quando o interesse o pH podemos rearranjar a equao:


[H+] = Kc[HA]
[A -]

Multiplicando ambos os lados por p = -log, temos:


pH = pKa + log [cido] (equao de Henderson-Hasselbalch)
[Sal]

Considera-se que a concentrao total do nion A- seja igual ao do sal visto que a
contribuio do on comum pelo cido desprezvel:
Esta equao, denominada de Henderson-Hasselbalch, fornece o pH atravs do pKa e razo
das concentraes de um par conjugado cido base, do sistema tampo considerado.

Mecanismo do tampo:

Exemplo: Tampo cido de actico 0,2 mol/L


HAc : Na+Ac- Onde, Ac- = Acetato

0,1 mol/L 0,1 mol/L


H+ ou OH-

HAc Ac- + H+
muito pouco pouco

Na+Ac- Ac- + Na+


nada muito muito

Na mistura, em meio aquoso, temos muito Ac- e HAc, pouco H+ e o Na+ que inerte, no participa
das reaes apenas participa do equilbrio eltrico do meio.
Adicionando H+ nessa mistura:
O excesso de Ac- (bsico) reagir com o H+ adicionado formando o cido no ionizado,
mantendo o pH constante.
Ac- + H+ HAc

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60

A base Ac- est relativamente em grande concentrao e no significativa a alterao da


sua concentrao ao consumir o H+.
Adicionando OH- na mistura:
Os ons OH- reagem com os ons H+ formando H2O.
OH- + H+ + H2O
O equilbrio restabelecido com o HAc no dissociado liberando H+ para repor o H+
consumido, mantendo o pH constante.
HAc Ac- + H+

Isto significa que a soluo possui acidez de reserva, o HAc dissocia mantendo a
concentrao inicial de H+ praticamente constante.
O deslocamento do equilbrio para o lado contrrio ao da espcie adicionada explicado
pelo princpio de Le Chatelier.
A soluo tampo deve consumir a maioria dos ons H+ ou OH- adicionados caso contrrio o pH
ser alterado significativamente.

1. Clculo do PH de uma Soluo Tampo


A) Tampo cido (cido fraco ou sal do cido e sal da base conjugada)

O pH de uma soluo tampo depende do pKa e razo entre as concentraes do cido e sal
que contm a base conjugada do cido. A equao de Henderson-Hasselbalch para um tampo cido
:

B) Tampo bsico (base fraca e sal do cido conjugado)

O pH do tampo bsico determinado subtraindo o pOH de 14. O pOH determinado somando


o pKb (pKb=14-pKa) e a razo entre as concentraes da base fraca e sal que contm conjugado o
cido conjugado da base. A equao de Henderson-Hasselbalch para o tampo bsico :

Sendo,
Ca=concentrao nominal de cido fraco ou sal do cido em mol/L
Cb=concentrao nominal da base fraca em mol/L
Cs= concentrao nominal do sal que fornece o cido ou base conjugada em mol/L

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61

2. Capacidade Tamponante (Ct) ou Freadora (Cf)

Capacidade tamponante ou freadora a capacidade do sistema tampo em consumir ons H+


ou OH-, acrescentados na soluo, resistindo a variao de pH. Esta capacidade limitada e uma
medida da eficincia do tampo.

1) A CT maior quando a relao das concentraes do par conjugado igual a unidade:

Alm de ser mais eficiente, mais fcil de escolher o pH, pois igual ao pKa:

quando Cs = Ca

pH = pKa + log 1 Como o log de 1 zero, o

pH = pKa

Quando a concentrao do tampo alta e o pH = pKa a capacidade tamponante mxima.

2) Quando a razo de est entre 10 e 0,1 a CT satisfatria.

Isto implica: pH = pKa 1

Isso significa que concentrao do sal pode ser dez vezes maior ou menor que a do cido. Na
prtica quando o valor for superior a um, ou inferior a um no temos uma soluo tampo.

3) A princpio a CT de uma soluo tampo aumenta com as concentraes efetivas dos seus
componentes.

Na prtica, em geral, as concentraes em que os tampes funcionam bem esto entre 0,050
e 0,200 mol/L (50 e 200 mmol/L).
A escolha da concentrao do tampo depende da estimativa do consumo de H+ ou OH-. Se
no meio ser adicionado muito H+ ou OH- escolher uma concentrao maior, se pouco uma
concentrao menor.
Se no meio tamponado no for acrescentado significativamente H+ ou OH-, utilizar uma
concentrao entre 50 a 100 mmol.
Se for necessrio um meio com uma fora-inica grande, escolher uma concentrao do
tampo maior ou adicionar um sal inerte como NaCl, KCl, Na2SO4 etc.
Se esperado diminuir o pH durante o experimento deve-se escolher um tampo com pKa um

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


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pouco abaixo do pH de trabalho e inversamente se o pH for aumentar.


Na preparao de uma soluo tampo deve-se sempre procurar um cido que tenha pKa igual
ou prximo ao pH desejado, isso favorece a capacidade tamponante, aumenta a capacidade de
neutralizar H+ e OH-.

Concentrao de uma soluo tampo:


a soma da concentrao do cido (ou base) e sal (cido conjugado ou base conjugada), em
mol/L.
Exemplo: Tampo acetato 0,1 mol/L
Esta concentrao pode corresponder a vrias propores da razo , de acordo com o pH
estabelecido, por exemplo:
cido actico 0,05 mol/L + acetato de sdio 0,05 mol/L = 0,1 mol/L;
cido actico 0,06 mol/L + acetato de sdio 0,04 mol/L = 0,1 mol/L etc.

No preparo de uma soluo tampo devemos sempre estabelecer a concentrao desejada. A


concentrao do tampo importante para avaliar a capacidade tamponante e fora-inica.

3. Prtica: Preparao da Soluo Tampo

O melhor procedimento para obteno de uma soluo tampo seguir o procedimento dado
pelo protocolo experimental.

Em uma situao nova ou falta de um protocolo de procedimento existem vrios mtodos para
a preparao de um sistema tampo. Os dois mtodos principais so:

A) Quando existe no laboratrio os dois reagentes, o cido (ou base) e o sal do conjugado
Aps definir a concentrao da soluo tampo e a proporo dos componentes da mistura,
para obter o pH desejado, pesar o cido (ou base) e o sal separadamente, dissolver os mesmos em
gua e completar o volume desejado em um balo volumtrico.

Exemplo:
Como preparar um litro de tampo de fosfato com pH = 7,5 e concentrao 0,2 mol/L?
Consultando uma tabela de pKa encontramos:
H3PO4 pKa1 =2,15 pKb=11,85
H2PO4- pKa2 =7,21 pKb=6,79
HPO4 2-
pKa3=12,67 pKb=1,33

O H2PO4- bsico em relao ao conjugado H3PO4 e cido em relao ao conjugado HPO42-.


Para fazer o tampo deve-se se escolher o cido com pKa mais prximo do pH desejado, o
H2PO4 pKa2 =7,21, e o conjugado bsico em relao ao cido, o H2PO4- pKa=12,67.
-

Os nions derivados do cido fosfrico so encontrados como sais de sdio ou potssio. Esses
ctions so inertes na maioria das situaes.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


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Como o pH desejado no igual ao pKa devemos ajustar a proporo das concentraes da


base H2PO4- e o seu conjugado HPO4-, na equao de Henderson-Hasselbalch para tampo bsico.

pKb = 6,8
HPO42- + H+ H2PO4-

Base cido (sal)

1. opo de clculo:
Dados:

Volume do tampo = 1 litro


Podemos substituir Cb e Cs por:
pH = 7,5
[HPO42-] = concentrao mol/L da base pKb = 6,8

[H2PO4-] = concentrao mol/L do sal do cido conjugado


Concentrao do tampo:
[Base] + [Sal] = 0,2
[Base]= 0,2 [Sal]

Massa molar (M):


0,2-[Sal] = 1,95[Sal] (vide dados)
M(K2HPO4)=136,1 g/mol
0,2=2,95[Sal]
M(KH2PO4)=174,29 g/mol
[Sal]=0,068 mol/L de KH2PO4 (cido conjugado)

Massa do sal?

1 litro da soluo tem 0,068 mol de KH2PO4

m=n.M
m = 0,068mol . 136,1 g/mol
m = 9,26 g de KH2PO4

Massa da base ?

[Base]= 0,2 [Sal]


[Base] = 0,2-0,068
[Base] = 0,132 mol/L de K2HPO4

1 litro da soluo tem 0,132 mol de K2HPO4

m= 0,132 g/mol.174,2 g/mol


m = 23,0 g de K2HPO4

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2. opo de clculo:

Podemos chegar ao mesmo resultado prtico utilizando o pKa e a equao do tampo cido:

pKa2 = 7,2
H2PO4 -
HPO42- + H+

cido (sal) base

como [Sal] + [cido] = 02 [Sal] = 0,2 - [cido] temos:

0,2-[cido] = 1,95[cido] (vide dados em 1. opo)


0,2=2,95[cido]
[cido] = 0,068 mol/L = 9,26 g de KH2PO4/L (na realidade o sal do cido)
[Sal] = 0,2 0,068 = 0,132 mol/L = 23,0 g de K2H PO4/L (na realidade a base)

Os dois componentes so adicionados na forma do sais contendo os conjugados. Estamos chamando


de sal a base (maior pKa).

4. Parte Experimental

Dissolver 23,0 g de K2HPO4 e 9,26 g de KH2PO4 em cerca de 900 mL de gua, medir o pH e


corrigir se necessrio com um cido forte (Por exemplo, HCl) ou base forte (por exemplo, NaOH),
finalmente completar o volume para 1000 mL em um balo volumtrico.

A) Quando existe s um dos reagentes

Se houver s o cido (ou base) este dissolvido ou diludo em um pouco de gua e em seguida
adicionado uma quantidade (calculada) de base forte (ou cido forte) para obter o pH desejado.

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Se houver s o sal (base conjugada), adicionar a quantidade de cido forte necessria para obter
o pH desejado.

Exemplo 1:

Como preparar 1000 mL de uma soluo tampo Tris com pH 8,1 e concentrao 0,1 mol/L,
tendo apenas a base Tris.

Para isso temos que ter HCl 1,0 mol/L para adicionar na base Tris e gerar o sal do conjugado.

O Tris (trishidroximetilaminometano) tem massa molar igual a 121,14 g/mol, pKa=8,1(25oC)


(bsico, pKb=5,9).
Tris-Base + HCl Triscido

Para saber o volume de HCl 1,0 mol/L necessrio adicionar na base Tris para obter o
tampo com pH 8,1 devemos utilizar a equao de Henderson-Hasselbalch para tampo bsico:

Isto significa que a concentrao do [Sal] tem que ser igual a da [base], ento metade da base
deve ser convertida em sal, para que ambas concentraes sejam iguais (0,05 mol/L).

Na reao do Tris-Base com o HCl a proporo de 1:1.

Como deve ser convertido 0,05 mol de Tris-Base para Tris-cido necessrio 0,05 mol de
HCl. Se em 1000 mL de HCl 1 mol/l temos 1 mol de HCl, em 50 mL teremos 0,05 mol de HCl.

Preparo

Devemos dissolver 0,1 mol da Tris-Base (cristalino) que corresponde a 12,1 g (0,1 mol x
121 g/mol) em 900 ml de gua e a seguir adicionamos 50 mL de HCl 1,0 mol/L. Medir o pH, se
necessrio ajustar com HCl ou NaOH.

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Alternativamente podemos dissolver 12,1 g da base cristalina em 900 mL de gua e titular


com HCl 1,0 mol/L at pH = 8,1, finalmente completar o volume para 1000 mL.
Comercialmente encontrado o Tris-Base (mais comum) e o TrisHCl (tris cloridrato de
Tris, pKa=8,06 e Massa Molar 157,6 g/mol), que titulado com NaOH ou KOH para obter o sal. O
Tris muito dependente da temperatura, a 20oC o pKa=8,3.

Exemplo 2:

Preparo de um tampo a partir de uma soluo estoque

O Tris vendido tambm na forma de soluo estoque.

Como preparar 25,00 mL de um tampo Tris com pH 7,8 e concentrao 100 mmol (0,100
mol/L) a partir de uma soluo estoque 2000 mmol (2,000 mol/L) e HCl 1 mol/L (pKa=8,1).

Dados:
Tris-Bsico pKa = 8,1
Concentrao da soluo estoque do Tris-Basico = 2,000 mol/L
Concentrao do tampo: [Tris-Base] + [Tris-HCl] = 0,100 mol/L =>[Tris-Base] = 0,100 - [Tris-
HCl]

Volume para preparar = 25,00 mL


Inicialmente deve-se diluir a soluo estoque:

C1V1 = C2V2 (lei da diluio)


2,000 mol/L . V1 = 0,100 mmol/L . 25,00 mL
V1 = 1,25 mL

Assim deve-se transferir 1,25 mL da soluo estoque para um balo volumtrico de 25,00 mL
com um pouco de gua. Em seguida adicionar o volume calculado de HCl 1,0 mol/L para obter o
tampo e completar o volume para 25,0 mL com gua em balo volumtrico.
Clculo:

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A equao de Henderson- Hasselbalch para tampo BSICO :

Substituindo [Tris-Base] pela concentrao fornecida nos dados:


[Tris-HCl] = 2(0,100-[Tris-HCl]) [Tris-HCl] = 0,200 - 2[Tris-HCl])

3[Tris-HCl]=0,200 [Tris-HCl] = 0,0667 mol/L


Ento [Tris-Base] = 0,100 0,0667 = 0,0333 mmol/L

Se em 1000,0 mL h 0,0667 mol de Tris-HCl, em 25,00 mL temos 0,00167 mol.

A proporo de Tris-Base com HCl para formar Tris-HCl de 1:1, ento para formar 0,00167
mol (1,67 mmol) de Tris-HCl so necessrios 0,0167 mol de HCl.

1000,0 mL do HCl possui 1,0 mol de HCl, ento em 1,67 mL deste cido h 0,00167 mol de HCl.
Assim, se deve acrescentar 1,67 mL de HCl 1,0 mol/L no balo volumtrico com 1,25 mL
da soluo estoque de Tris-Base, adicionar outros reagentes como MgCl2 e EDTA, se a metodologia
determinar, e completar o volume para 25,00 mL com gua ultrapura, para obter a soluo tampo
desejada.
Medir o pH e ajustar com cido forte ou base forte se necessrio, antes de completar o volume
para 25,00 mL.

INTERNET

Na internet h um site da University of Liverpool (Liverpool L69 3BX


United Kingdom) com uma calculadora on line que fornece receitas para preparao das principais
solues tampo:
http://www.liv.ac.uk/buffers/buffercalc.html
Para obter a receita de preparao do tampo necessrio informar:

a) Tipo de tampo (acetato, fosfato, tris etc.)


b) Volume desejado
c) pH desejado
d) Concentrao do tampo
d) Temperatura de preparo
e) Temperatura de uso
f) Se for necessrio controlar a fora inica, qual a fora-inica desejada (em mmol/L). Tem opo
de escolha do sal a ser utilizado para controle da fora-inica (NaCl, KCl, Na2SO4 etc)

Alguns cuidados na preparao e armazenamento da solues tampo:

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Em geral as solues tampo so estveis e mantm o pH constante por um longo perodo,


para isso necessrios alguns cuidados:
recomendado utilizar gua ultrapura com resistividade 18,2 M-cm (0,055 S/cm), a 25oC.
Esta gua tem um pH neutro na sada do sistema de purificao (sem gs carbnico), mas ela
rapidamente contaminada pelo CO2 do ar at um pH~5,5. A gua destilada obtida com
CO2 e no contato com o ar ocorre aumento da contaminao. Caso s se tenha gua destilada
comum, eliminar o gs carbnico em um destilador, com o condensador na vertical, e fechar
rapidamente o frasco de armazenamento aps a separao da gua para minimizar novas
entradas.
Aps o uso da soluo tampo, fechar rapidamente o frasco para evitar a entrada de
contaminantes da atmosfera. O gs carbnico o principal contaminante atmosfrico dos
tampes bsicos e a amnia dos tampes cidos.
Um tampo cido deve ser armazenado em frasco de vidro.
No armazenar tampo bsico em frascos de vidro comum, impurezas do vidro como slica
podem dissolver contaminando o tampo.
A contaminao microbiana pode acontecer em pHs prximos de 7. Para evitar a contaminao
recomendado a esterilizao, refrigerao ou aumento da fora-inica, por exemplo, utilizar
uma concentrao de 500 mmol/L para um tampo de fosfato.
Alguns ons existentes na soluo tamponada podem interagir com componentes do tampo.
Ex. Ca2+ com o fosfato precipita, Cu2+ com a amina do Tris se ligam fortemente.
Sais de potssio so mais prontamente solveis em algumas solues orgnicas.
Tomar cuidado no armazenamento dos reagentes, por exemplo, os sais anidros so
mais higroscpicos que os hidratados, assim a hidratao pode causar erro na pesagem e
consequentemente na proporo cido e base.
A melhor maneira de evitar alterao na fora-inica de um tampo utilizar as quantidades
fornecidas pela razo dos componentes na equao de Henderson-Hasselbalch. No preparo
do tampo, o volume gasto para ajustar o pH, antes de completar o volume final, deve
corresponder no mximo a cerca de 10% do volume final (a ser preparado). Nesta condio
o volume de cido ou base gasto para o ajuste do pH so pequenos e no causam mudanas
significativas na fora-inica.

5. Limitaes da Equao de Henderson- Hasselbalch com Base nas


Concentraes Nominais (Analticas)

Quando se faz uma soluo tampo com base nas concentraes calculadas na equao
Henderson- Hasselbalch utilizado um eletrlito forte (sal), assim fora-inica significativa e
o pH obtido difere ligeiramente do esperado. Isto acontece porque a concentrao real (atividade

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


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inica) do tampo menor que a concentrao nominal (analtica). Assim as equaes de equilbrio
deveriam ser expressas em termos de atividade inica (a) e no da concentrao nominal.
Dessa forma, o pH de uma soluo feita com base nas concentraes analticas possui um pH
ligeiramente diferente do esperado e deve ser ajustado no final do preparo da soluo tampo.
Os clculos feitos atravs das equaes de equilbrio qumico em termos de concentrao s
so exatos para solues ideais (concentraes muito baixas) em que as partculas esto afastadas
uma da outra no havendo interaes entre elas.
Uma soluo feita com um eletrlito forte (sal solvel) produz uma fora-inica significativa
causando a formao de aglomerados inicos, diminuindo a concentrao efetiva (real). Cada
aglomerado inico age como se fosse uma partcula individual, assim a soma de aglomerados e
partculas chamada de atividade inica (concentrao efetiva/ real) menor que a concentrao
nominal ou analtica. Concentrao analtica a concentrao encontrada em uma anlise qumica
atravs de reaes qumicas, ou seja, quantifica todos os ons adicionados em um meio.

6. Referncias Bibliogrficas

Alcard, J.C. e Mattiazzo Prezotto, M.E. Equilbrio Qumico: Atividade Inica. Dep. Qumica, Escola
Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba-SP, 1990.
Beynon, R.J. e Esaterby, J.S. Buffer solution: The basics. Oxford: Bios Scientific Publisherss, 1996.
Brown, T.L., Jr. H.E.L., Bursten, B.E. Chemistry The Central Science, Sixth Edition, New Jersey
USA: Prentice Hall, Inc., 1977.
Harris, D.C. Quantitative chemical analysis, fifth edition, New York: W.H.Freeman, 199.
Skoog, D. A., West, D.M. e Holler, F.J. Fundamental of Analytical Chemistry, Seventh Edition,
Orlando USA: Saunders College Publishing., 2001
Pfannkoch, E.A. Molecular Biology Problem solver: A Laboratory Guide. Wiley-Liss, Inc. Cap. 3,
2001.
Chemistry 1B Experiment 11, Buffer solutions. College of Alameda, California USA.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 09, p.50-63.


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Captulo 10
Espectrofotometria Quantitativa na Regio do
UV-Vis (180 - 800 nm)

Jos Pedro Serra Valente


Fernando Broetto

Introduo

Espectrofotometria um mtodo de anlise qumica baseado na absoro de ftons (energia)


correspondente aos comprimentos de onda () (ou freqncia) da regio do Ultravioleta e do Visvel,
por espcies qumicas.
As espcies qumicas (tomos, molculas, ons e radicais) absorvem energia quantizada
(ftons).

Equao de Planck/Einsten

E = energia do fton
h = constante de Planck
c = velocidade da luz (constante)
= comprimento de onda
= frequncia

A energia do fton varia com o ou .


Fton uma partcula de energia da
radiao eletromagntica.
Radiao monocromtica um fluxo
(feixe) de ftons com o mesmo e
mesma energia.

Figura 1. O fornecimento de ftons com energia mnima igual diferena entre dois nveis de energia

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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causa a absoro e transio de um eltron no estado fundamental para excitado.


Quando a soluo da espcie qumica colorida ela absorve ftons de luz visvel (400-780 ou
800 nm) quando incolor pode absorver ftons de luz ultravioleta (180-400 nm).
Embora a energia de transio eletrnica seja a principal energia que participa do processo,
outros tipos de energia esto envolvidos.
Energia da Molcula:
ET = Ee + Er + Ev
ET = energia total da molcula
Ee = energia eletrnica
Energia devida transio de eltrons de valncia, do estado fundamental
para um nvel ou subnvel de energia superior (excitado)
Ev = energia vibracional de tomos na molcula
Energia devida ao aumento das vibraes dos tomos da molcula entre os
subnveis vibracionais.
Er= energia rotacional da molcula
Energia devida ao aumento das rotaes das molculas na transio entre os
subnveis rotacionais.

Figura 2. Movimentos que ocorrem na molcula quando recebe ftons com energia
correspondente a frequncia do movimento.

Estas energias variam aproximadamente de acordo com os valores a seguir:


Er < Ev < Ee

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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1 : 50 : 1000

Como se nota a energia eletrnica (de transio nos nveis energticos) mais importante.

1. Banda de Absoro da Molcula e Absorbncia Mxima (max.).

Figura 3. O comprimento de onda associado ao pico da banda corresponde


ao mximo de absorbncia da molcula.

Quando uma amostra contendo determinada molcula varrida por um espectro de radiao
(faixa de comprimentos de ondas variando continuamente) e registrada simultaneamente a energia
absorvida (absorbncia) temos um grfico como acima, denominado de banda ou espectro de absoro.
O pico de absorbncia fornece o comprimento de onda que mais absorvido pela molcula.
No espectro de absoro nota-se que a molcula absorve vrios comprimentos de ondas com
intensidade diferente, um deles mximo (max.). Isto devido existncia de diferentes nveis e
subnveis na molcula (vibracional, rotacional e eletrnico). Sendo que o (max.) inclui a transio
eletrnica principal (preferencial).
Os espectros de banda tambm so utilizados para a anlise qualitativa de grupos funcionais
de molculas orgnicas. As bandas obtidas nas amostras so comparadas com as bandas obtidas com
padres.

Figura 4. Transies eletrnicas quantizadas possveis pela absoro de ftons com energia igual a
diferena entre os nveis e subnveis.

Entre dois nveis ou subnveis de energia existe uma zona proibida onde os eltrons no podem

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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permanecer, apenas podem atravessar.

As regies onde os eltrons podem permanecer so denominadas de nveis e subnveis de


energia e possuem energia definida. Quanto mais distante do ncleo estiver do nvel e subnvel, maior
a energia do eltron. Estas diferenas de energia entre nveis e subnveis so caractersticas de cada
espcie qumica.
Um eltron para ir de um nvel ou subnvel a outro deve receber ftons com energia no
mnimo igual diferena entre os nveis e subnveis. Um eltron ao receber energia no livre para
permanecer onde esta, sofre transio. Aps a transio o eltron dissipa a energia e volta ao estado
inicial (fundamental). O estado excitado transiente, tem um tempo de vida curto e decai para o
estado fundamental por emisso de ftons, em nanosegundos.
A energia necessria para a transio de um estado fundamental para um estado excitado
especfica para cada espcie qumica, assim cada molcula absorve de maneira particular.

2. Processo de Absoro de Radiao UV-Vis da Molcula (m)


Todas as molculas orgnicas so capazes de absorver radiao eletromagntica porque todas
contm eltrons de valncia que podem ser excitados a nveis de energia mais altos. O processo
ocorre em duas etapas:

1) Excitao por absoro de ftons

M + h M*

O tempo de vida da espcie qumica excitada de 110 ns (nano segundo). Aps ocorre
um processo de relaxao em que o excesso de energia dissipado e a molcula volta para estado
fundamental.

2) Relaxao

a) Ocorre por liberao de calor:


M* M + calor
b) Decomposio de M* (reao fotoqumica/ fotlise)
M* A + B (ocorre em condies mais energticas)

c) Reemisso de radiao por fluorescncia ou florescncia

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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Estado fundamental e Estado excitado e emisso Emisso de luz fluorescente


de calor ou fosforescente
absoro de luz
Ef = E3-E2 Ef = E2-E1
Ef = E3 E1

Figura 6. Transio eletrnica com absoro e emisso de radiao

Se os ftons absorvidos tivessem a Ef = E2-E1 a volta para o estado fundamental se daria


apenas com emisso de calor.
A quantificao da energia absorvida por uma espcie qumica permite determinar a
concentrao do analito1 em uma amostra. A tcnica que permite isso chamada de espectrofotometria
e o equipamento de espectrofotmetro.

3. Princpios da Espectrofotometria Quantitativa no UV - Vis

A espectrofotometria quantitativa baseada na medida da absorbncia (A) ou transmitncia (T)


de um feixe de luz monocromtica, aps passar por uma amostra contendo um analito. A concentrao
do analito proporcional a absorbncia de acordo com a lei de Lambert-Beer.

Figura 7. Absoro de radiao monocromtica (ftons com o mesmo )


pelo analito na amostra.
Quando uma parte da luz incidente absorvida (It < Io)
Absorbncia: A = Io/It
Transmitncia: T = It/Io

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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Io : Intensidade do feixe de luz incidente


It ; Intensidade de feixe de luz transmitido

Quando um feixe de radiao monocromtica com max atravessa uma soluo que contenha
uma espcie absorvente (centros absorventes) uma parte da energia radiante absorvida enquanto a
outra transmitida pelo meio.

3.1 Lei de Lambert


Esta lei diz que a absorbncia de uma radiao monocromtica por um analito proporcional
ao comprimento do caminho ptico na soluo.

A = 1 b

A = absorbncia (sem unidade)

b = comprimento de caminho ptico (cm) (espessura da cubeta, em geral 1 cm)

1 = constante de proporcionalidade, caracterstica de cada soluo

3.2 Lei de Beer


Esta lei diz que a absorbncia da luz monocromtica por uma soluo, com solvente
transparente, proporcional a concentrao do analito.

A = 2 C

C = concentrao em mol L-1 ou g L-1

2 = constante de proporcionalidade, caracterstica de cada soluo

3.3 Juno das duas Leis

Lei de LambertBeer
Juntando a lei de Lambert e lei de Beer temos:
A = 1 b . 2 C 1 2 = ou 1 2 = a
A=bC ou A= abC
A = Absorbncia
T = transmitncia
C = concentrao do analito absorvente em mol.L-1 ou g L-1

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(epsilon) = absortividade molar (cm-1.mol-1.L) (caracterstico do analito absorvente) =


capacidade da molcula em absorver energia com determinado e solvente
(utilizado para C em mol L-1)

a = absortividade (cm-1.g-1.L) (caracterstico do analito absorvente) = capacidade da

molcula em absorver energia com determinado e solvente (utilizado para C

em g L-1)

Outras consideraes

A = -log T

T = Pt/Po ou T(%) = P/Po x 100

Po = potncia do feixe de radiao incidente (quantidade de energia de um feixe de energia


monocromada transportada de uma fonte por segundo)

Pt = potncia do feixe de radiao transmitida aps atravessar a soluo do analito

Embora as medidas experimentais sejam realizadas em funo da potncia radiante de uma fonte
mais comum encontrar o termo intensidade de radiao para definir a transmitncia:

T = It/Io

Io = Intensidade do feixe incidente

It = Intensidade do feixe transmitido

Potncia radiante e intensidade da radiao no correspondem mesma coisa, mas esto


relacionadas entre si. A intensidade de radiao, I, definida como a razo entre a potncia radiante e
a rea irradiada. Intensidade (Io) o nmero de ftons incidente.

Quando um feixe de radiao passa por uma substncia absorvente, a intensidade da radiao
incidente (Io) ser menor que da radiao emergente.

A intensidade do feixe de radiao (monocromtica) transmitida decresce exponencialmente


com o aumento da espessura da cubeta, T = It/Io = 10 b C:

Outras formas de expressar a lei:

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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T = 10 b C
log T = log 10 b C
log T = -C b
-log T = C b
log 1/T = C b
log Io/It = absorbncia (A) = C b

4. Aspectos Prticos

Resumo da lei de Lambert-Beer

A = kC
A = -log T = b C ou b = k (inclinao/slope)
A = -log T = a b C ab=k C = A/k

A = -log T C = (A-cL )/ ca (Equao


da reta recomendado)

A= absorbncia de luz monocromtica pelo analito (sem unidade)


T= transmitncia da luz monocromtica
= absortividade molar do analito (capacidade da espcie qumica absorver /constante)
(unidade: cm-1 mol-1 L).
a = absortividade do analito (unidade: cm-1 g-1 L).
b = comprimento do caminho ptico (espessura da
cubeta/geralmente 1 cm)
C = concentrao do analito (mol L-1ou g L-1) (equao da reta da curva de calibrao)
cL = Coeficiente linear da reta (intercepto y)(equao da reta da curva de calibrao)
ca = Coefciente angular da reta (regreo linear da curva de calibrao)
k = inclinao da reta (curva de calibrao)

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5. Requesitos para Quantificao do Analito:

1) Para utilizar a faixa do visvel necessrio que o analito em soluo seja colorido
(absorva luz visvel). Geralmente necessrio fazer um pr-tratamento qumico na
amostra. Por exemplo, para determinar a concentrao total de um elemento ou on,
em geral feito uma digesto com cidos e oxidantes, para liberar o analito em uma
forma definida (igual ao da forma utilizada na soluo de referencia utilizada para
fazer a curva de calibrao) e reagir com reagentes que formaro uma espcie qumica
colorida (centro absorvente), proporcional a concentrao do analito.
2) Conhecer o max (comprimento de onda com mxima absorbncia pelo analito). Este
o melhor comprimento de onda, dentro do espectro de absoro, porque permite a
deteco de concentraes mais baixas do analito. Este max obtido no desenvolvimento
da metodologia da anlise e pode ser checado facilmente fazendo uma varredura do
espectro na amostra.
3) Fazer uma soluo estoque do analito e fazer diluies da soluo estoque de acordo
com a metodologia.
4) Fazer a reao do analito com reagentes para obter uma soluo da espcie qumica
que absorva luz monocromtica proporcional a concentrao do analito.
5) Fazer um branco com gua destilada e os reagentes utilizados nos padres.
5) Fazer as medidas de absorbncias para obter a curva de calibrao (referncia).
6) Construir a curva de referncia (A vs. C) para determinao de concentraes
desconhecidas de analitos em amostras.

6. Validade da Curva de Referncia

A curva de referncia ser vlida enquanto no for alterado algum acessrios do aparelho e
forem utilizados os mesmos reagentes utilizados para fazer a curva de calibrao.

Quando houver alguma modificao ou em caso de alguma suspeita pode-se utilizar uma
soluo com concentrao exatamente conhecida (padro) como amostra e checar o resultado na
curva. Se o erro no for aceitvel deve-se fazer outra curva de referncia.

O ideal sempre correr um padro junto com as amostras quando for realizar medidas, alguns
reagentes so instveis e podem ocorrer alteraes ou contaminao.

7. Determinao da Concentrao do Analito na Amostra:

1) Fazer o pr-tratamento qumico da amostra de acordo com a metodologia.


2) Processar as reaes para obter o analito colorido na soluo da amostra, para determinao no
visvel. Se a amostra for incolor, usa-se a luz no UV. Muitas substncias orgnicas absorvem na regio

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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ultravioleta e nestes casos o pr-tratamento s envolve eliminao de interferentes


3) Fazer um branco com gua destilada e os reagentes
4) A radiao incidente pode sofrer reflexo, refrao e espalhamento no sistema cubeta-amostra,
sendo, portanto, contabilizada como energia absorvente. O branco desconta este erro, desde que seja
utilizado sempre mesma cubeta ou cubetas diferentes de alta qualidade, de preferncia da mesma
marca e lote.
5) Ajustar o espectrofotmetro e medir a absorbncia.
6) Calcular a concentrao do analito na amostra

8.Procedimento Bsico para Operao do Espectrofotometro

1) Ajustar o comprimento de onda para o descrito no protocolo de anlise.


2) Ligar o espectrofotmetro e esperar o tempo para estabilizao.
3) Zerar o espectrofotmetro.
4) Colocar a cubeta do branco no suporte e zerar novamente o aparelho em zero de absorbncia ou
100% de transmitncia.
5) Retirar o branco e colocar outra cubeta com a amostra de referncia ou desconhecida, ler a
absorbncia.
6) Se o espectrofotmetro tiver suporte para vrias cubetas (carrossel) colocar o branco e completar
o carrossel com as cubetas das amostras ou padres.
7) Se o espectrofotmetro for de duplo feixe, a cubeta do branco no alternada com a cubeta das
amostras. As leituras do branco e amostras so sempre feitas simultaneamente. O feixe monocromtico
da luz dividido em dois antes dois feixes, um vai para o branco e o outro para a amostra.

Observaes

1. O branco, dependendo do protocolo de anlise, pode ser a cubeta s com o solvente, geralmente a
gua, ou com o solvente e reagentes, conforme utilizado para amostras.
2. O objetivo do branco descontar os erros devido absoro da radiao pela cubeta, solvente,
reagentes e impurezas dos reagentes.

9. Procedimento para Tratamento dos Dados Experimentais:

9.1 Construo da curva de referncia e determinao da concentrao


desconhecida de um analito.

Mtodo 1 (grosseiro): dois procedimentos

Colocar (plotar) as concentraes dos padres, C (abscissa) e absorbncias, A (coordenada)

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em um papel milimtrico para obter a curva de calibrao, C vs. A.

a) O resultado da concentrao da amostra desconhecia obtido por interpolao na curva de


referncia.

b) Calcular a inclinao da reta (k) k = b => A = k C

O resultado (C) obtido dividindo A/k

Figura 8. A curva de referncia descreve a relao linear entre a absorbncia e a concentrao, em


uma faixa de concentrao onde a lei de Lambert-Beer obedecida.

Mtodo 2: determinao da equao da reta (mtodo estatstico/recomendado)


Sabe-se que a equao da reta calculada pela expresso:
ax + b y = 0,
y = ax + b
onde,
x = concentrao (C)
y = absorbncia (A)
a = coeficiente angular da reta (slope)
b = coeficiente linear da reta (intercept y)
Equao da reta:
A = aC + b < = > C = (A - b)/a
Cd = (Ad intercept)/Slope
Cd = Concentrao desconhecida
Ad = Absorbncia da amostra com concentrao desconhecida

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Matematicamente, a estimativa dos coeficientes de uma curva de calibrao a partir de um


conjunto de medidas experimentais pode ser obtida atravs da regresso linear
Clculo de a e b pelo mtodo dos mnimos quadrados
a = [n(CA) - (C)(A)]/ [n(C2 ) - (C)2 ] (coeficiente angular)
b = [(A)(C2)-(C)(C.A)]/[n(C2)-(C)2] (coeficiente linear)
n = nmero de medidas (incluindo o branco)
A = Absorbncia
C = concentrao
n = nmero de medidas

Alm dos coeficientes de regresso a e b, pode-se calcular o coeficiente de correlao (r) que
permite obter uma estimativa da qualidade da curva obtida. Quanto mais prximo de um, melhor a
qualidade da curva. Uma curva boa deve ter pelo menos trs noves aps a vrgula.
Clculo do coeficiente de correlao (r):
r = [n(C A) (C) (A)]/ { [n(C2)-( C)2][n(A2) (A)2]}

10. Espectrofotmetro

O equipamento utilizado, um espectrofotmetro, relativamente barato pela sua versatilidade.


Possibilita a quantificao de um grande nmero de analitos, possui boa sensibilidade e de fcil
manuseio. Possivelmente o espectrofotmetro o aparelho para anlise qumica mais utilizado no
mundo. Em geral os espectrofotmetros possuem:

1) Fonte radiao
Para radiao no visvel a fonte mais utilizada uma lmpada incandescente com filamento de
tungstnio (350-2500 nm), utilizado tambm tungstnio-halognio fornecendo tambm >350 nm
(tempo de vida de 10.000 horas).
Para radiao UV so utilizadas lmpadas fluorescentes de hidrognio, deutrio e hlio que
emitem radiao entre 180 e 370 nm (tempo de vida de 1.000 horas).
Dependendo do espectrofotmetro pode-se ter:
1 lmpada (360-1000 nm): para determinaes no espectro do visvel
2 lmpadas (190-1100 nm): para determinaes no UV-Vis
2 lmpadas (175-3300 nm): para determinaes no UV-Vis e Infravermelho

O feixe da radiao direcionado para a face de um prisma ou para uma rede de difrao,
atravs de um sistema colimador, para decompor a luz e separao da luz monocromtica.

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(a) (b)

Figura 9 . Representao de uma rede de difrao (a) e um prisma (b)

2) Monocromador:

O monocromador um sistema utilizado para dispersar a luz e selecionar um feixe


de comprimentos de ondas estreito, idealmente s com um comprimento de onda (radiao
monocromtica). O monocromador constitudo por um sistema colimador, ou seja, um tubo que
recebe a luz da fonte e atravs de uma fenda de entrada, cuja largura ajustvel, conduz a luz para
lentes convergentes para aperfeioar o paralelismo da radiao. A luz colimada incidida em um
prisma ou rede de difrao para ser decomposta. Aps a luz ser fracionada, a rede de difrao ou prisma
girado para sair a luz monocromtica por uma fenda em direo a cubeta contendo a amostra. Para
espectrofotmetros de duplo feixe h um jogo de espelhos que divide o feixe da luz monocromtica
em dois, um vai para a cubeta da amostra e o outro para a amostra.

3) Compartimento de cubetas:

As cubetas so utilizadas para colocar as amostras contendo o analito. Em geral se utiliza


cubetas com um caminho ptico de 1 cm. Alguns protocolos de anlise recomendam cubetas de at
10 cm de caminho ptico para aumentar a sensibilidade da determinao. O aumento da sensibilidade
proporcional a espessura da cubeta (lei de Lambert). Para isso necessrio trocar o adaptador de
cubetas para a espessura desejada.

As cubetas devem ser transparentes a radiao e podem ser de:

Vidro ou plstico para o visvel. No caso de plstico o solvente da amostra no deve atacar o
plstico.
Cubetas de quartzo para o UV e Visvel. Nas medidas com radiao UV s utilizar cubeta de
quartzo.
Quando o espectrofotmetro tambm faz medicas de infra-vermelho (IR) utilizar cubetas de
quartzo livre de OH medidas no IR prximo.
As cubetas devem estar sempre bem limpas e sem marca dos dedos.

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4) Detector:

O detector mede a intensidade da luz transmitida aps a radiao passar pela cubeta com a
amostra e medida em uma clula fotoeltrica ou fotmultiplicador e amplificador (galvanmetro).

10.1 Esquema do Espectrofotmetro:

Figura 10. Esquema bsico de um espectrofotmetro

Espectrofotometro de duplo feixe

Os espectrofotmetros podem ser de um feixe ou de duplo feixe. Nos de duplo feixe a radiao
antes de atingir a amostra desdobrada em dois feixes, um vai para a cubeta com a amostra e o
outro para a cubeta do branco. As medidas so realizadas simultaneamente e a absoro do branco
descontada da amostra automaticamente.

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Figura 11. Esquema de um espectrofotmetro UV-Vis de dois feixes.

Os espectrofotmetros mais modernos aps a calibrao fornecem a curva de calibrao,


coeficiente de correlao, equao da reta e os resultados das absorbncias e concentraes.

11. Limitaes da Lei de Beer (Distores da linearidade/erros)


Quando a reta no passa pela origem e foge da linearidade est ocorrendo desvios da Lei de
Beer.

Os fatores que causam os desvios so chamados de desvios reais, qumicos e instrumentais.


a) Desvios Reais

A lei de Beer considera que os centros absorventes (espcies qumicas) no interagem entre
si, isso s acontece para solues ideais, muito diludas. Quando a soluo concentrada (desvios
reais), ocorrem interaes entre as molculas ou ons, com formao de aglomerados, e a atividade do
analito torna-se menor que a concentrao analtica, reduzindo a absoro de luz. O ndice de refrao
tambm a afetado em concentraes altas. Assim, a Lei de Beer s vlida para solues diludas
(<0,01 mol/L).
O solvente no deve absorver a radiao utilizada para anlise do analito.

b) Desvios qumicos

Surgem quando parcialmente um analito se dissocia, associa, forma complexo, polimerizao,


solvlise ou reage com o solvente para dar um produto que tem um espectro de absoro diferente
do analito na forma principal (desvios aparentes), pois a Lei de Beer estabelece que a absorbncia
diretamente proporcional concentrao real da espcie absorvente, mas no necessariamente
concentrao total de um componente (soma do analito em todas as formas qumicas),

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Um equilbrio qumico afetado pela diluio, o grau de dissociao depende da concentrao.


Assim, quando o analito est envolvido em um equilbrio qumico e no preparo da amostra para anlise
ocorrem diluies com os reagentes e o solvente, para ajustar a concentrao dentro da linearidade
da lei de Beer, alterdao a concentrao inicial do analito. Por exemplo, o grau de ionizao de um
cido fraco varia com a diluio. Quando a diluio for pequena, isso pode ser solucionado com uso
de um tampo.

c) Desvios Instrumental

So desvios causados pela qualidade e limitaes dos aparelhos (desvios aparentes), como por
exemplo, instabilidade da fonte, no linearidade do detector, introduo de radiao policromtica,
limites para conseguir isolar faixas espectrais muito estreitas etc.
A lei s vlida para radiao monocromtica, ou seja, para um nico comprimento de onda
(), na prtica impossvel de obter.

12. Regra Prticas para Diminuir os Desvios da Lei de Beer


Uma concentrao alta do analito na amostra principal causa dos desvios da lei. A
absorbncia aumenta proporcionalmente com a concentrao, mas a partir de um ponto esta
proporcionalidade deixa de existir e a reta comea subir exponencialmente, conforme a figura
9.

A lei de Beer somente valida dentro do limite de linearidade.

Figura 9. Desvio da lei de Beer para concentraes elevadas

Para evitar este desvio (diminuir o erro) deve-se trabalhar em uma faixa em que a
absorbncia fique entre 0 e 1.
Se a absorbncia da amostra foi alta, diluir a amostra e repetir a anlise.
No UV muitas molculas orgnicas, que no absorvem no visvel (incolor) absorvem na
mesma banda (intervalo do espectro de absoro), ou seja pode ocorrer sobreposio

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.65-80.


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de parte das bandas, assim necessrio fazer um pr-tratamento qumico para eliminar
o possvel interferente do analito (espcie qumica de interesse).
S utilizar cubetas de alta qualidade.
S utilizar cubeta de quartzo no UV. Cubetas de vidro absorvem luz UV.

13. Referncias Bibliogrficas


Ohweiler, O. A., Qumica Analtica Quantitativa, vol. 3, Livros Tcnicos Cientficos SA, Rio de Ja-
neiro, (1974).
Voet, D, Voet, J. G., Biochemistry, 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc. New York, (1995).
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University Press, 2006.
Gore, Michael. Spectrophotometry & Spectrofluorimetry. New York: Oxford University Press,
2000.
Owen, T., Fundamentals of Modern UV-Visible Spectroscopy, 1996.

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 10, p.64-80.


87

Captulo 11
Protelise enzimtica da carne
Luis Artur Loyola Chardulo
Jessica Moraes Malheiros
Victor Augusto Domingos Dias
Ana Paula Costa Rodrigues Ferraz
Fernando Broetto

Introduo

A sequncia de eventos bioqumicos que influenciam o msculo no perodo ante e


postmortem so de suma importncia para o entendimento da qualidade da carne. Aps o abate
dos animais ocorre o rigor mortis, conhecido tambm por rigidez cadavrica, convertendo
assim o msculo em carne e dando incio a degradaes enzimticas e desnaturao protica
que variam de acordo com os procedimentos de conservao utilizados, tornando menos rgida
carcaa.
A maciez da carne o resultado de diferentes fatores, tais como a quantidade e
solubilidade do tecido conjuntivo, o encurtamento do sarcmero durante o desenvolvimento
do rigor e postmortem e a protelise das protenas miofibrilares (Koohmaraie & Geesink, 2006).
O amaciamento da carne ocorre devido a alteraes ultra-estruturais, que enfraquecem
a integridade das fibras musculares no tecido muscular. Uma indicao da degradao das
protenas miofibrilares musculares sob condies de pos mortem pode ser alcanado atravs da
determinao do grau de fragmentao de miofibrilas que define o comprimento mdio destas,
sabendo que quanto menor so as miofibrilas maior a maciez.
As medidas da degradao das protenas musculares no postmortem tm sido realizadas
atravs de diferentes tcnicas, dentro das quais se destacam a eletroforese, a determinao
dos aminocidos livres e a fragmentao das miofibrilas. Quanto aos mtodos utilizados para
se calcular o ndice de fragmentao miofibrilar (MFI), podemos citar dois. A primeira tcnica
descoberta requer homogeneizao do msculo e verificao das miofibrilas pela anlise
microscpica, e a segunda, atualmente mais utilizada, tambm requer homogeneizao do
msculo seguido da determinao total de protena e medida da turvao das amostras ajustadas
para uma concentrao comum de protena (Hopkins et al., 2000). Este mtodo reflete o grau
de protelise, indicado atravs da ruptura e quebra de ligaes miofibrilares na banda I (Taylor

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 11, p.81-86.


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et al., 1995).
Ultimamente a determinao do mtodo do MFI frequentemente utilizada por
pesquisadores de diversos pases. A metodologia empregada e o processamento das amostras
nem sempre so os mesmos, encontrando assim alteraes impactantes nos valores observados
entre os diferentes estudos. De acordo com as diferenas na metodologia podemos citar a
utilizao de amostras frescas e congeladas, a velocidade e o tempo de homogeneizao, o tipo
de homogeneizadores e fatores utilizados para os clculos do ndice.
Na determinao do MFI normalmente so utilizadas amostras de carne fresca
(Koohmaraie, 1990), mas importante ressaltar que muitas vezes a nica opo vivel quando
h um grande nmero de amostras coletadas o congelamento destas, para posterior realizao
das anlises. Sendo o tempo entre o descongelamento e a homogeneizao muito curto, no
sendo suficiente para ocorrer alteraes na protelise (Hopkins et al., 2000). Diversos autores
optam pela opo da utilizao de amostras congeladas em seus trabalhos (Culler et al., 1978;
Mc Donagh, 1998). Em resultados observados por Hopkins et al. (2000), com amostras frescas
e submetidas ao congelamento, indicaram que a velocidade de homogeneizao interfere nos
valores de ndice de fragmentao miofibrilar, de tal modo que a velocidade de homogeneizao
a 15.000 rpm acaba com as possveis diferenas entre o uso de amostras frescas e congeladas.
A durao do tempo de homogeneizao demonstrada em vrios estudos como
interferente nos valores observados atravs de espectrofotmetro a 540 nm, sabendo-se que
os valores de MFI so baseados na quantidade de refrao de luz que ocorre na suspenso de
miofibrilas. Quando os valores aumentam existe um correspondente aumento do nmero de
partculas em decorrncia da fragmentao da estrutura miofibrilar pela atuao de enzimas
proteolticas (Veeramuthu; Sams, 1999). Utilizando o mtodo de turvao na anlise de MFI,
Olson et al. (1976) demonstrou que as amostras necessitam de pelo menos 60 segundos de
homogeneizao, a fim de fornecer resultados viveis. Portanto, de suma importncia pesquisar
as diferentes metodologias e as condies de cada experimento para melhor adequao do
mtodo a ser empregado.
O MFI tem sido amplamente adotado como mtodo de avaliao indireta da extenso da
atividade proteoltica, pois reflete o tamanho das miofibrilas, prediz mais de 50% da variao
da maciez da carne (Hopkins et al., 2000), demonstrando uma alta correlao com ndices de
maciez aferidos pela Fora de Cisalhamento utilizando o equipamento Warner Bratzler Shear
Force e anlise sensorial realizadas por panelistas treinados (Kriese et al., 2007; Culler et al.,
1978). Assim as miofibrilas mais curtas resultam em elevaes do MFI e diminuio dos valores
obtidos pelo shear force, evidenciando consequentemente maior maciez (Moller et al., 1973).
Segundo Culler et al. (1978), valores do ndice de fragmentao de 60 ou acima de 60 para o
msculo Longissimus dorsi denota-se uma carne muito macia, valores de 50 uma carne macia e
valores abaixo de 50 uma carne pouco macia.
Para msculos que no so grandes o suficiente para se determinar valores de shear force
ou anlise sensorial, este ndice torna-se bastante preciso e vivel sendo utilizado na anlise de
protelise muscular como indicador de maciez da carne (Veiseth et al., 2001).

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 11, p.81-86.


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1. Procedimentos e Extrao Protica

1.1 Preparo da amostra

A coleta das amostras para realizao da anlise deve ser de 3 g do msculo em questo,
livre de gordura e tecido conjuntivo, embaladas em papel alumnio e devidamente identificadas.
Aps a separao das alquotas a anlise pode ser realizada com as amostras estando frescas
ou congeladas.

1.2 Extrao das protenas

As amostras devem ser colocadas em tubos de centrfuga, para homogeneizao em Ultra


turrax com haste de cisalhamento (Marconi - MA102/E) a 18000 rpm em 30 mL de tampo de
ndice de fragmentao miofibrilar (TMFI) 2C (100mM KCl, 20mM de fosfato de potssio pH
7, 1mM EDTA, 1mM MgCl2 e 1mM NaN3, em pH 7,0) duas vezes por 30 segundos com mesmo
intervalo em gelo. Aps a homogeneizao as amostras devero ser centrifugadas a 1000 x g
por 17 minutos 2C e o sobrenadante ser descartado. O pellet dever ser ressuspendido em
30 mL de TMFI 2C e homogeneizado com basto de vidro.
As amostras sero centrifugadas a 1000 x g por 17 minutos 2C e o sobrenadante ser
novamente descartado. O pellet ser ento ressuspendido em 8 mL de TMFI 2C e submetido
ao Vortex at a amostra tornar-se bastante homognea para ser filtrada em filtro de polietileno
com malha de 1 mm aproximadamente. Ao filtrado sero adicionados 7 mL de TMFI 2C para
a lavagem do tubo de centrfuga e auxiliar na filtragem.
Ao trmino da filtragem as amostras devem ser armazenadas em tubos falcon (15 mL)
sobre refrigerao.

2. Anlises

2.1 Determinao da protena

As anlises sero realizadas em espectrofotmetro. Para isso, ser necessrio o


preparo de trs tubos de ensaio. O primeiro tubo ser o branco da amostra para a calibrao
do equipamento, contendo apenas 1,0 mL de soluo tampo e 4,0 mL de reagente/reativo de
Biureto. Os outros dois tubos iro conter 0,75 mL de soluo tampo, 0,25 mL de amostra e 4,0
mL de reagente/reativo de Biureto (O reagente de Biureto deve ser colocado por ltimo e com
o menor intervalo de tempo possvel entre as amostras, pois um reagente de cor e assim que
entra em contato com as protenas se inicia a reao).

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 11, p.81-86.


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Os tubos de ensaio devem ser agitados aps a adio do Biureto para que a reao
ocorra de maneira homognea e colocados em local escuro por 30 minutos. Realiza-se a leitura
de absorbncia em espectrofotmetro a 540 nm. As leituras obtidas pelo equipamento sero
anotadas para a determinao da quantidade de protena e fornecimento dos valores de tampo
e amostra que devem ser utilizados para realizao da segunda leitura.

2.2 Determinao do ndice de fragmentao miofibrilar

As anlises tambm sero realizadas atravs de leituras em espectrofotmetro. Para


isso, ser necessrio o preparo de dois tubos de ensaio, onde se deve adicionar quantidades
apropriadas de amostras e de soluo tampo (TMFI), para que a concentrao da soluo seja
de 0,5 mg protena/mL de soluo, num total de 4 mL de soluo.
Para zerar o equipamento utilizar a soluo tampo (TMFI), submeter os tubos de
ensaio com amostra e TMFI ao Vortex para homogeneizar e realizar a leitura da absorbncia no
comprimento de onda de 540 nm em espectrofotmetro.

Clculo

Para a determinao do ndice de fragmentao miofibrilar (MFI), ser necessrio usar


a seguinte expresso:

MFI = 200 x absorbncia

3. Preparo de Reagentes

A) Soluo extratora: Tampo de MFI (TMFI) com pH 7,0:


Para o preparo do tampo necessrio fazer a soluo utilizando gua destilada com
temperatura de 2-4C:
100 mM Cloreto de Potssio (KCl); 20 mM Fosfato de potssio monobsico (KH2PO4); 20 mM
Fosfato de potssio dibsico (K2HPO4); 1 mM cido etilenodiamino tetra-actico (EDTA); 1 mM
Cloreto de Magnsio (MgCl26H2O); 1 mM zida sdica (NaN3).
KCl............14,91 g
KH2PO4......2,72 g
K2HPO4......3,50 g
EDTA..........0,76 g
MgCl2..........0,41 g
NaN3...........0,13 g

Pesar os reagentes e dissolver em aproximadamente 700 mL de gua destilada. Acertar

Mtodos de Trabalho em Bioqumica Vegetal e Tecnologia de Enzimas, Cap. 11, p.81-86.


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o pH para 7,0 utilizando soluo de NaOH (Hidrxido de sdio - base) ou HCl (cido clordrico -
cido). Aps o ajuste do pH, transferir para um balo volumtrico de 2,0 L e completar o volume
com gua destilada. Armazenar em recipiente de vidro sob refrigerao.

B) Soluo reagente/reativo de Biureto


Deve-se dissolver 1,5 g de Sulfato de cobre (CuSO45H2O) e 6 g de Tartarato de sdio e
potssio (KNaC4H4O64H2O) em 500 mL de gua destilada. Preparar 300 mL de soluo de NaOH
a 10% e transferir ambas as solues para um balo volumtrico de 1,0 L e completar com gua
destilada. Armazenar a soluo em vidro mbar.

4. Resultado

Para melhor compreenso da utilizao do ndice de fragmentao miofibrilar em cortes


crneos, apresenta-se abaixo um roteiro para a determinao em animal da raa Nelore (Bos
indicus), animal Piemonts (Bos taurus), Frango e Cordeiro.
Conforme o procedimento descrito anteriormente, foram pesadas 3 g de msculo de
cada amostra livre de tecido adiposo e conectivo, foram extradas as protenas com o tampo de
extrao (TMFI).
Aps a realizao das leituras (Tabela 1) no equipamento espectrofotmetro utilizando
o comprimento de onda de 540 nm, foi efetuado o clculo para determinar o teor de protena e
o valor encontrado de ndice de fragmentao miofibrilar (MFI).

Tabela 1. Experimento prtico sobre a determinao de ndice de fragmentao miofibrilar (MFI)

Leituras em Absorbncia
Leitura [Protena] Volume Volume Leitura
Amostras MFI - 200
Protena Amostra Tampo MFI
Nelore 0,339 25,84 0,08 3,92 0,254 50,80
Piemonts 0,348 26,57 0,08 3,92 0,376 75,20
Cordeiro 0,328 24,95 0,08 3,92 0,383 76,60
Frango 0,391 30,06 0,07 3,93 0,342 68,40

Essa prtica um exemplo simples para demonstrar atravs do clculo o ndice de


fragmentao miofibrilar (MFI), sendo perceptvel a diferena entre as amostra analisadas.

5. Referncias Bibliogrficas
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fragmentation index to certain chemical, physical and sensory characteristics of bovine
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