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Este es un tipo de cromatografa cuyo principio fue sugerido en 1961 por Hellferich quin
la nombr Cromatografa de Intercambio de Ligando (LEC) y en 1975 Porath y col.
publicaron un trabajo donde la llamaron Cromatografa de Afinidad por Quelatos Metlicos
(MCAC) y posteriormente se han usado otros nombres tal como Cromatografa de Afinidad
por el Ion Metal Inmovilizado (IMAC).
Independientemente del nombre que se le haya dado, esta cromatografa se basa en dos
principios fundamentales:
Primero: La habilidad que tienen muchos metales de transicin (Ni, Co, Zn, Cu) de formar
complejos estables con compuestos (Ligandos) capaces de enlazarse a metales,
previamente inmovilizados en una matriz cromatogrfica.
Segundo: La afinidad que tienen las protenas, dado fundamentalmente por los residuos
aminocidos Cistena e Histidina, de formar complejos reversibles con estos metales.
Dentro de los Ligandos utilizados para la formacin del quelato con el metal tenemos:
aminocidos carboximetilados, cidos salislico, 8-hidroxiquinolina, EDTA y el cido
imidodiactico (IDA), que es el ms usado ya que forma diferentes complejos metlicos
multicoordinados de acuerdo con su situacin espacial (Figura 1).
Las diferentes etapas del proceso cromatogrfico por IMAC se resumen en la Figura 2.
Los iones metlicos mencionados pueden formar enlaces de coordinacin con molculas
que contengan O, N y S por interacciones Ion-dipolo.
La estructura del complejo formado debe ser tal que algunos sitios de coordinacin queden
libre para enlazar las molculas de soluto o solvente. Estos ltimos ocuparn los sitios de
coordinacin libres del metal, en ausencia de soluto con mayor afinidad por el Ion metal.
Ocurre mediante el desplazamiento de las molculas del solvente o buffer e interaccin del
metal con los grupos imidazoles de las Histidinas y los tioles de las Cistenas expuestos en
la superficie de la protena o sea que se ha observado que el sitio de enlace est separado
del sitio catalticamente activo, por ejemplo la enzima Nuclesido difosfatasa enlazada a
geles con Zn 2+ y Cu2+ exhibi prcticamente toda su actividad cataltica. Por otra parte se
ha demostrado que el Fe 3+ enlazado a IDA Sepharose tiene una afinidad especfica para
protenas que contienen tirosina.
Esta desorcin puede ser debido a diferentes molculas o iones que entran a formar
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Cromatografa de Enlazamiento Metlico
complejos ms estables o debido a que el complejo se colapsa cuando el medio es
alterado.
Una vez eluida la protena, se regenera la matriz. Esta regeneracin puede ser pasando
una solucin que contenga el ion metlico (Ej. Sulfato de cobre 50 mM) usada
fundamentalmente cuando se va a continuar trabajando o pasando un agente quelante.
(Ej. EDTA), para eliminar el metal, y luego incorporarlo nuevamente, usado cuando se
emplean iones con fuerza complejante dbil (Co 2+, Zn2+ ). No obstante como regla general
se recomienda, entre corridas, eliminar el ion metal de la matriz y recargar el soporte
antes del prximo experimento.
Esta tcnica ha sido utilizada con xito en la purificacin de protenas, cidos nucleicos y
para inmovilizar enzimas.
Para una protena con propiedades desconocidas, se recomienda usar Cu 2+ como metal y
buffer de acetato o fosfato a pH neutro con NaCl 0,15-0,5 M en los experimentos iniciales.
Si los resultados no son satisfactorios se realizaran otros experimentos con variacin del
ion metal, pH y composicin del buffer.
La muestra debe estar previamente equilibrada con buffer inicial por dilisis para eliminar
componentes por ejemplo aminas que pueden interferir en el paso de adsorcin.
La elucin se puede hacer por gradientes descendientes de pH, elucin competitiva por
gradientes ascendentes de sulfato de amonio, histidina o imidazol, por adicin de solventes
orgnicos y tambin por adicin de agentes quelantes como el EDTA. En este ltimo caso,
todas las protenas adsorbidas eluirn indiscriminadamente con el ion metal.
Algunas aplicaciones.
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Cromatografa de Enlazamiento Metlico
Figura 3. Cu2+-IMAC de Cu, Zn SOD. (A) Aplicacin de una solucin de SOD (365 mL),
lavando con 3200mL 10 mM de un buffer de fosfato de potasio, pH 6,4, conteniendo 1 M
de NaCl , 400mL de mismo buffer sin NaCl y (B) con 300 mL de 10 mM de acetato de
sodio. La elucin de la enzima con 20 mM de un buffer de citrato, pH 5,0. Velocidad de
flujo 150 mL /h.
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