Ao de la Diversificacin Productiva y del Fortalecimiento de la

Educacin

Universidad Nacional Del Per

Facultad de Medicina Humana
Escuela profesional de Enfermera

Practica de Laboratorio # 3
Cromatografa

ASIGNATURA: BIOQUIMICA

DOCENTES: DRA.VIOLETA MORIN GARRIDO

DR. CARLOS HOLGUIN MAURICCI

ALUMNA: FIORELLA DIOSESFERNANDEZ

Piura - 2015

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MARCO TEORICO
Cromatografa: La cromatografa es uno
de los principales mtodos para la
separacin de especies qumicas
estrechamente relacionadas en mezclas
complejas. La cromatografa es un mtodo
fsico de separacin basado en la
distribucin de los componentes de una
mezcla entre dos fases inmiscibles, una
fija o estacionaria y otra mvil.

Funciones:
Separar los componentes de la mezcla,
para obtenerlos ms puros y que
puedan ser usados posteriormente
(etapa final de muchas sntesis).
Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad
analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas suelen
ser muy pequeas.

Tipos de cromatografa:
Dependiendo de la naturaleza de la fase esttica y de la fase mvil se
pueden distinguir distintos tipos de cromatografa:
Cromatografa slido-lquido. La fase esttica o estacionaria es un
slido y la mvil un lquido.
Cromatografa lquido-lquido. La fase esttica o estacionaria es un
lquido anclado a un soporte slido.
Cromatografa lquido-gas. La fase esttica o estacionaria es un lquido
no voltil impregnado en un slido y la fase mvil es un gas.
Cromatografa slido-gas. La fase estacionaria es un slido y la mvil
un gas.

Segn el tipo de interaccin que se establece entre los componentes

de la mezcla y la fase mvil y estacionaria podemos distinguir entre.
Cromatografa de adsorcin. La fase estacionaria es un slido polar
capaz de adsorber a los componentes de la mezcla mediante
interacciones de tipo polar.
Cromatografa de particin. La separacin se basa en las diferencias
de solubilidad de los componentes de la mezcla en las fases
estacionaria y mvil, que son ambas lquidas.
Cromatografa de intercambio inico. La fase estacionaria es un slido
que lleva anclados grupos funcionales ionizables cuya carga se puede
intercambiar por aquellos iones presentes en la fase mvil.

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 PRACTICA DE LABORATORIO
Cromatografa
Es un mtodo analtico de separacin de sustancias de una mezcla, estas
sustancia puede ser colorada, o no, gases y compuestos volatilizables.
Partes del sistema cromatgrafo
1. Fase fija: es la parte donde se realiza la separacin del componente,
puede ser papel silicagel, gas inerte, etc.
2. Fase mvil: es el solvente que a travs de la fase fija va a eludir
arrastrando con el soluto que se quiere separar.
Caractersticas para la separacin:
1. Peso del soluto.
2. Polaridad del soluto y del solvente.
3. Afinidad al soluto por la parte fija
4. Coeficiente de participacin.
Fase de la cromatografa
1. Extraccin: procesamiento de la muestra para extraer el principio activo
por mtodo fsico: Mecnico y solubilidad.
2. Concentracin: aplicacin solvente orgnico voltiles.
3. Cromatograma: poner la muestra para su recorrido a travs de la fase fija
4. Revelado: usar sustancia patrones, densitmetro y reactivo apropiado.
Tipos de cromatografa
1. Cromatografa de papel (mono y bidimensional)
2. Cromatografa capa fina
3. Cromatografa de gas.
4. Cromatografa de participacin o reparto
5. Cromatografa de exclusin molecular Sphadex
6. Cromatografa de intercambio inico
7. Cromatografa de columna
8. Cromatografa por electroforesis
9. Cromatografa de exclusin molecular.
Precipitacin isoelctrica
La solubilidad de la mayor parte de protenas globulares se halla profundamente
influida por el pH del sistema, casi todas las protenas muestran un minino de
solubilidad aunque el pH al que ello ocurre varia de una a otra.
El pH al que una protena muestra un mnimo de solubilidad es su pH
isoelctronico definido como aquel valor del pH al que la molcula no posee carga
elctrica. Ejemplo: Ovoalbumina (huevo) , pH 4.6 , ureasa pH 5 en esas
condiciones no existe repulsin electrosttica entre molculas de protenas
vecinas agregados insolubles.
Puesto que las diferencias protenas poseen valores de pH isoelctrico diferente,
con frecuencia pueden separarse una de otra, mediante precipitacin

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isoelctrica, cuando el pH de una mezcla de protenas se ajusta al pH isoelctrico
de uno de sus componentes.
La mayor parte o casi todo el componente precipitar quedando solucin de
protenas cuyos valores de pH isoelctrico precipitado permanece en su
conformacin nativa y puede disolverse en un media a pH apropiado y
concentracin adecuada.

PRIMER PARTE
METODOS CROMATOGRAFICPS Y DE SEPARACION E LA
DETERMINACION DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS.
1. DISEO EXPERIMENTAL
a. Cromatografa en papel
Les ser dado un papel Whatman N-1 cortado en tiras de 15*25
cm aproximadamente, manipule el papel por las esquinas
evitando agarrarlo en lo posible, colquelo sobre un papel
limpio.
Engrape, un hilo a la parte superior del papel Whatman.
Con un lpiz marque el punto de origen, trazando una lnea,
esta debe estar por encima de la altura de solvente.
Aplique utilizando los tubos capilares las diferentes muestra
segn el esquema (no toque el papel con los dedos)

NOTA: Para aplicar la muestra tocar el papel levemente con el

tubo capilar puesto verticalmente. Retire el tubo cuando la
mancha halla alcanzando unos 3 mm. De dimetro. Una vez
seca la mancha repetir la aplicacin dos veces ms.

Coloque el papel en la cmara dejando que el borde inferior

quede sumergido 1 o 2 cm. En el solvente.
Dejar el papel en posicin rectal asegurando los hilos a los
lados de la cinta adherida.
Una vez que la muestra haya corrido, sacar el papel y marca el
lmite de migracin de frente del solvente.
Secar los papeles en un horno.
Rociar una solucin reveladora, Ninhidrina colina-cido
actica glacial.
Calentar el papel en un horno a 100C hasta que aparezcan las
manchas de los aminocidos.
Calcular el Rf de cada mancha, y haga la identificacin tentativa
de los aminocidos, comparando los Rf, obtenidos con la
muestra problema.

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2. EXPERIMENTACION Y OBSEVACIONES
a. Cromatografa en papel
Ante que todo analizamos por qu se da el fenmeno de arrastre de
las protenas, en debate, se concluy que las causas son:
El peso molecular
La polaridad
La disolvancia
Ahora pasamos en si al experimento:
1. Tenemos en primer lugar las muestras:
En dos cristales se chancaron dos tipos de hojas, una verde y
otra roja (por el caroteno) para extraer, las protenas en dos
pequeos frascos. Se prepar tambin un tercer frasco con una
muestra de la mezcla de ambos lquidos, el cual actuar como
el desconocido.
2. Ahora procedemos a echar la gota del liqido obtenido sobre la
fase fija, que es papel filtro de celulosa. La fase fija se marca de
las siguientes manera :

Frente del solvente: se

marca despus de realizado
el efecto

Lnea de inicio: se marca antes

de echar las gotas para que
todas estn a una misma

3. Ahora colocamos la fase de solvente, que constituye la fase

mvil: se usa generalmente metanol o piridina. Y procedemos a
utilizar el efecto de arrastre y dejamos que el rastro cromtico
de las protenas suba. En este punto ya se marca el frente del
solvente.

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 CUESTIONARIO

1. Que entiende por cromatografa?

Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva,
cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla,
permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los
compuestos dan como resultado una retencin diferencial sobre la fase
estacionaria y, por tanto, una separacin efectiva en funcin de
los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla.

2. Diga tres aplicaciones de la cromatografa en muestra biolgicas

Conservantes antioxidantes: se usa el gradiente de HPLC con un
detector colorimtrico para medir simultneamente los nueve
antioxidantes ms comunes.

Anlisis de carbohidratos en bebidas: la adicin de mono y disacridos

a bebidas y zumos sirve como propsito de enriquecer el sabor. Para
determinar si la cantidad aadida es correcta se miden los azucares
usando HPLC de intercambio inico con deteccin de pulso
amperomtrico con detectores de refraccin o ultravioletas

Ismeros de carotenoides: el HPLC en combinacin con detectores

calorimtricos permite el anlisis de los carotenoides dietticos en tejidos
animales y vegetales.

.
3. Diga el fundamento de 2 tipos de cromatografa
Cromatografa en placa fina: La
cromatografa en capa fina es una
tcnica analtica rpida y sencilla,
muy utilizada en un laboratorio de
Qumica Orgnica. Entre otras cosas
permite:
Determinar el grado de pureza de
un compuesto. Se puede determinar
as, por ejemplo, la efectividad de
una etapa de purificacin.
Comparar muestras. Si dos
muestras corren igual en placa
podran ser idnticas. Si, por el
contrario, corren distinto entonces
no son la misma sustancia.
Realizar el seguimiento de una
reaccin. Es posible estudiar cmo desaparecen los reactivos y
cmo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber
cundo la reaccin ha acabado. La muestra a analizar se deposita
cerca de un extremo de una lmina de plstico o aluminio que
previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente

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 (fase estacionaria). Entonces, la lmina se coloca en una cubeta
cerrada que contiene uno o varios disolventes mezclados (eluyente
o fase mvil). A medida que la mezcla de disolventes asciende por
capilaridad a travs del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la muestra entre el
disolvente y el adsorbente

La cromatografa de gases es una tcnica muy utilizada para

separar los diferentes compuestos voltiles de una muestra. La
fase mvil es un gas inerte, (nitrgeno o helio) que transporta la
muestra volatilizada en el inyector a travs de la columna
cromatogrfica. La fase estacionaria generalmente est constituida
por una columna de metil polisiloxano, o derivados de ste. Los
diferentes compuestos se separan en funcin de su grado de
volatilidad (punto de ebullicin, peso molecular) y su afinidad por la
fase estacionaria. Entre los detectores ms utilizados caben
mencionar el detector FID (ionizacin de llama) que por su alta
versatilidad, hace posible la deteccin de un elevado tipo de
compuestos.

4. Que entiende por punto isoelctrico de las protenas.

Punto isoelctrico de las protenas: Es el pH al que
un polianflito tiene carga neta cero. El concepto es particularmente
interesante en los aminocidos y tambin en las protenas. A este valor
de pH la solubilidad de la sustancia es casi nula.

5. Que entiende por coagulacin, precipitacin y desnaturalizacin de

protenas
COAGULACION: Las protenas, debido al gran tamao de sus
molculas, forman con el agua soluciones coloidales. Estas soluciones
pueden precipitar con formacin de cogulos al ser calentadas a
temperaturas superiores a los 70 C o al ser tratadas con soluciones
salinas, cidos, alcohol, etc.
La coagulacin de las protenas es un proceso irreversible y se debe a
su desnaturalizacin por los agentes indicados, que al actuar sobre la
protena la desordenan por la destruccin de su estructura terciaria y
cuaternaria.
PRCIPITACION: La precipitacin de las protenas consiste en la
desnaturalizacin de la estructura terciaria originando la formacin de
un "cogulo" que se observa como un "precipitado" en la solucin.
DESNATURALIZACION: es un cambio estructural de
las protenas o cidos nucleicos, donde pierden su estructura nativa, y
de esta forma su ptimo funcionamiento y a veces tambin cambian
sus propiedades fsico-qumicas.

6. Como se clasifican las protenas

Protenas fibrosas: las protenas fibrosas tienen una estructura
alargada, formada por largos filamentos de protenas, de forma

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 cilndrica. No son solubles en agua. Un ejemplo de protena fibrosa es
el colgeno.
Protenas globulares: estas protenas tienen una naturaleza ms o
menos esfrica. Debido a su distribucin de aminocidos (hidrfobo en
su interior e hidrfilo en su exterior) que son muy solubles en las
soluciones acuosas. La mioglobina es un claro ejemplo de las protenas
globulares.

Estas se dividen en:

Hlice alfa: esta estructura se desarrolla en forma de espiral sobre
s misma debido a los giros producidos alrededor del carbono beta
de cada aminocido. La mioglobina es un claro ejemplo de protena
de hlice alfa.
Hoja plegada beta: cuando la cadena principal se estira al mximo,
se adopta una configuracin conocida como cadena beta. La
tenascina es un ejemplo de las protenas hoja plegada beta.
Alfa/beta: Las protenas que contienen una estructura secundaria
que alterna la hlice alfa y la hoja plegada beta. Un ejemplo de
protena alfa/beta es la triosa fosfato isomerasa. Esta estructura es
conocida como un barril TIM. La helicoidal alterna y los segmentos
de hoja plegada beta forman una estructura de barril cerrado.
Alfa + Beta: En estas protenas, la hlice alfa y la hoja plegada beta
se producen en regiones independientes de la molcula. La
ribonucleasa A es un ejemplo de protena alfa + beta.
Protenas de membrana: son protenas que se encuentran en
asociacin con las membranas lipdicas. Esas protenas de membrana
que estn embebidas en la bicapa lipdica, poseen grandes
aminocidos hidrfobos que interactan con el entorno no polar de la
bicapa interior. Las protenas de membrana no son solubles en
soluciones acuosas. Un ejemplo de protena de membrana es la
rodopsina. Debes tener en cuenta que la rodopsina es una protena
integral de membrana y se encuentra incrustada en la bicapa. La
membrana lipdica no se muestra en la estructura presentada.
7. Diga las funciones de las protenas
Catlisis: Est formado por enzimas proteicas que se encargan de
realizar reacciones qumicas de una manera ms rpida y eficiente.
Procesos que resultan de suma importancia para el organismo. Por
ejemplo la pepsina, sta enzima se encuentra en el sistema
digestivo y se encarga de degradar los alimentos.
Reguladoras: Las hormonas son un tipo de protenas las cuales
ayudan a que exista un equilibrio entre las funciones que realiza el
cuerpo. Tal es el caso de la insulinaque se encarga de regular
la glucosa que se encuentra en la sangre.
Estructural: Este tipo de protenas tienen la funcin de dar
resistencia y elasticidad que permite formar tejidos as como la de
dar soporte a otras estructuras. Este es el caso de la tubulina que se
encuentra en el citoesqueleto.

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 Defensiva: Son las encargadas de defender el
organismo. Glicoprotenas que se encargan de
producir inmunoglobulinas que defienden al organismo contra
cuerpos extraos, o la queratina que protege la piel, as como
el fibringeno y protrombina que forman cogulos.
Transporte: La funcin de estas protenas es llevar sustancias a
travs del organismo a donde sean requeridas. Protenas como
la hemoglobina que lleva el oxgeno por medio de la sangre.
Receptoras: Este tipo de protenas se encuentran en la membrana
celular y llevan a cabo la funcin de recibir seales para que la clula
pueda realizar su funcin, comoacetilcolina que recibe seales para
producir la contraccin.

8. En que se fundamenta la electroforesis

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de
un campo elctrico; estas partculas migran hacia el ctodo o nodo
(electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de su carga, peso
molecular y estructura tridimensional.

Es de destacar que a escala analtica, los mtodos electroforticos son de

alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como mtodo
de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y
otras biomolculas, donde aportan un potente criterio de pureza. Se
pueden conocer tambin mediante estas tcnicas, las caractersticas
cido-bsicas de las protenas presentes en un extracto crudo, lo que da
la informacin necesaria si se pretende realizar una separacin
cromatogrfica basada en diferencias de carga. Es til adems para
determinar otros parmetros como peso molecular, punto isoelctrico y
nmero de cadenas polipeptdicas de las protenas.

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9. En que se fundamenta el mtodo cromatografa de exclusin e
intercambio inico , ejemplo medico

Cromatografa de intercambio inico (o cromatografa inica) es un

proceso que permite la separacin de iones y molculas polares basado
en las propiedades de carga de las molculas. Puede ser usada en casi
cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas,
pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es
usualmente llamada "muestra" y los componentes separados
individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en
purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.

10. En que se fundamenta la cromatografa liquida de alta precisin y ejemplo

de aplicacin medico
Cromatografa liquida de alta
precisin: La cromatografa es un
mtodo fsico de separacin basado en
la distribucin de los componentes de
una mezcla entre dos fases inmiscibles,
una fija o estacionaria y otra mvil. En la
cromatografa lquida, la fase mvil es un
lquido que fluye a travs de una
columna que contiene a la fase fija. La
cromatografa lquida clsica se lleva a
cabo en una columna generalmente de
vidrio, la cual est rellena con la fase fija.
Luego de sembrar la muestra en la parte
superior, se hace fluir la fase mvil a
travs de la columna por efecto de la
gravedad.
Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamao de
las partculas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamao de los
micrones, lo cual gener la necesidad de utilizar altas presiones para
lograr que fluya la fase mvil. De esta manera, naci la tcnica de
cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), que requiere de
instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones
requeridas.

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