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ELABORADO POR:
M. en C. Paola Berenice Zárate Segura
I. Bt. César A. Jiménez Sierra
Dr. Jesús Agustín Badillo Corona
Dr. Claudio Garibay Orijel
Dra. María del Carmen Oliver Salvador
Manual elaborado por Paola Berenice Zárate Segura, César Agustín Jiménez Sierra, Jesús Agustín Badillo Corona y Claudio 1
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Relación de prácticas
PRÁCTICA 1. Bioseguridad
PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
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PRÁCTICA 1. Bioseguridad
Según la Ley de Bioseguridad de organismos genéticamente modificados publicada en el
Diario Oficial de la Federación el 18 de marzo del 2005 (1), bioseguridad se define como:
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Tabla 1. Niveles de bioseguridad recomendados para el trabajo con agentes infecciosos (2)
Grupo de Barrera Primaria Barrera Secundaria Tipo de
NIVEL Agentes Prácticas
Riesgo (Equipos) (Instalaciones) Laboratorio
Que no causen
Mesa de Laboratorio
Bajo riesgo enfermedad en
con servicio de agua y
individual individuos Prácticas
Campana de drenaje. Enseñanza
I Bajo, adultos microbiológicas
flujo laminar Básica
Riesgo saludables comunes
Comunitario (Cepas
silvestres)
NBS 1. Acceso
Asociados con Limitado. Deben
enfermedad en utilizarse Gabinetes de
humanos, en señalamientos, se Bioseguridad
donde haya deben tomar medidas Clase I o II, Servicios de
riesgo de de precaución en equipo para salud, Hospital
Moderado
infección por material punzo prevenir de nivel
riesgo
heridas cortante. Debe contar derrames o primario,
individual, NBS 1. Además, debe
II percutáneas, con manual de difusión de laboratorios de
Riesgo existir autoclave.
ingestión y Bioseguridad aerosoles. El diagnóstico y
comunitario
exposición de definiendo personal debe Laboratorios de
limitado
membrana procedimientos y utilizar Bata, nivel
mucosa políticas de guantes y cubre Universitario
(Shigella, confinamiento, bocas o careta,
Staphylococcus, desinfección de zonas de ser necesario.
Sporotrix) y materiales y
atención médica.
Agentes
autóctonos o NBS 2, Separación de
exóticos con NBS 2. Acceso los corredores de
Todas las
riesgo de controlado. acceso, puertas dobles
Alto riesgo anteriores,
transmisión por Procedimientos (sistema de exclusa). Laboratorios de
individual, incluyendo
III aerosoles y que rutinarios de Debe evitarse la Diagnóstico
Bajo riesgo protección del
causen desinfección de ropa, recirculación del aire. Especializado.
comunitario sistema
enfermedades desechos y material Presión de aire
respiratorio.
serias o letales previo al lavado. negativa en el área de
(Brucilla, trabajo
Hystoplasma)
Agentes
peligrosos o
exóticos con alto Gabinetes de
NBS 3. Ropa (trajes) NBS 3. Debe ser una
riesgo de causar Bioseguridad
individuales, zona aislada, con
enfermedad Tipo 3. Trajes
equipados en cuartos sistemas individuales Laboratorios
Alto riesgo mortal por individuales
previos al área de de obtención y que trabajan con
Individual, transmisión por sellados con
IV trabajo. Regadera a la liberación de vacío, agentes
Alto riesgo aerosoles o sistema de
salida del Laboratorio. sistema de suministro patógenos
Comunitario agentes similares respiración
Mecanismo de y descontaminación de peligrosos
con forma de autónomo y
descontaminación del aire, generador de
transmisión presión de aire
área de trabajo. energía auxiliar.
desconocida positiva
(EBOLA, SARS,
B. Antracis)
NBS = Nivel de Bioseguridad
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OBJETIVO
• Informar y motivar a los alumnos sobre principios y normas de bioseguridad para su
aplicación activa en el trabajo de laboratorio
ACTIVIDADES
Actividad dinámica por los alumnos para identificar los posibles riesgos en el laboratorio y
las medidas necesarias que se pueden llevar a cabo para minimizarlos.
Identificar y describir los equipoa en el laboratorio. Entender los procedimientos adecuados
para la utilización de estos equipos.
REFERENCIAS
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PRÁCTICA 2. Cuantificación de ADN
INTRODUCCIÓN
En la mayoría de los casos cuando se trabaja con ADN es importante realizar una
cuantificación de la cantidad con la que se dispone. La cuantificación del ADN se puede
llevar a cabo por estimación de la intensidad de una banda en geles de agarosa en el que el
ADN es teñido por algún colorante como Bromuro de Etidio, Syber Green o Gel Red, o
bien mediante técnicas de espectrofotometría de luz ultravioleta.
Los dobles enlaces conjugados de las bases nitrogenadas hacen que los ácidos
nucleicos absorban luz ultravioleta (UV). El espectro de absorción característico de AN
presenta un máximo a λ ~ 260 nm. Si bien el coeficiente de extinción de un ácido nucleico
en particular depende de la secuencia de nucleótidos, algunas reglas empíricas permiten
estimar la concentración a partir del valor de A260 nm. Así, una unidad de absorbancia a 260
nm corresponde aproximadamente a una concentración de 50 µg/mL de ADN doble hebra,
40 µg/mL de ARN o 33 µg/mL de fragmentos cortos de ADN monohebra.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Llevar a cabo al cuantificación de ADN por métodos espectrofotométricos
Objetivos específicos
Conocer las partes y el funcionamiento de las micropipetas,
Adquirirá destreza en la utilización de pipetas para la medición de volúmenes
pequeños.
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Figura 1. Micropipeta. Se muestran las diferentes partes de la pipeta así como puntas de
diferente tamaño para la medición de diferentes volumenes.
MATERIALES
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Agua desionizada
Balanza analítica con límite de 0,0001 g
Tapas de cajas de petri de plástico
Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
Muestra de ADN en solución de concentración desconocida
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
MANEJO DE LA MICROPIPETA
1) Partes de la micropipeta
a) Identificar las partes de la micropipeta ayudándose de la imagen en la Figura 1.
b) Observar las diferencias entre la micropipeta a usar y la mostrada en al Figura
2) Llenado de la pipeta
3) Expulsión de la muestra
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d) Lo anterior es cierto para la mayoría de soluciones acuosas, excepto para las
soluciones de alta viscosidad como el Glicerol. Si es usada inadecuadamente, la
micropipeta transferirá volúmenes inexactos.
4) Calibración de Micropipeta
Valor medio
X = Σ Xi /n donde Xi= pesadas, n= numero de pesadas
Volumen medio
V=X.Z donde X= valor medio y Z= factor z (1/densidad)
Desviación estándar
S = Z . √ Σ(Xi – X)2
n–1
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Coeficiente de Variación
CV= (S*100)/V
1 0.8
5-10
6) Cuantificación de ADN
REFERENCIAS
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Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza.
Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de CsCl o
una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio
no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas (laboriosas y/o
caras) en los protocolos de purificación.
Homogenización de la muestra
El método para desintegrar el tejido debe estar adaptado a las características de éste. Para
grandes volúmenes de tejidos blandos, suelen usarse licuadoras esencialmente iguales a las
licuadoras domésticas. Para volúmenes menores, en general es suficiente un
homogeneizador, el cual consiste en un tubo de vidrio de paredes gruesas y un pistón (de
vidrio o de teflón). La rotación del pistón dentro del tubo (propulsión manual o por un
motor), disgrega la muestra. Tejidos más resistentes, como por ejemplo hueso o diente,
necesitan tratamientos mecánicos especiales. Aquellos tejidos con células cuya pared
celular es resistente, como por ejemplo vegetales, hongos o bacterias, requieren también
condiciones drásticas. Uno de los métodos más utilizados consiste en congelar la muestra
en nitrógeno líquido y, manteniéndola congelada, pulverizarla con un mortero. Así, además
de desintegrar la muestra, se logra que ésta se mantenga a muy baja temperatura durante el
tratamiento, con lo cual se evita la acción de nucleasas endógenas que pudieran degradar el
material de interés.
Como puede deducirse de los párrafos anteriores, se han descrito diversos métodos
particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en el caso particular de células
bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que cataliza la degradación de la
pared celular. Para facilitar a la solubilización de los componentes celulares, y a la ruptura
de membranas y complejos proteicos, la solución de lisis contendrá un detergente iónico
(dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa los componentes de las
membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis contiene además el agente
quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de las ADNasas
(dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las ribonucleasas
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forma parcial, por lo que se obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente
entre 20 y 200 kb). El grado de fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos
utilizados para la homogeneización y purificación. Los métodos más vigorosos por lo
general permiten mayores rendimientos, al maximizar el número de células lisadas, pero
por la misma razón llevan a una mayor fragmentación del ADN.
OBJETIVOS
Objetivo General
• Extraer ADN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Objetivos específicos
• Conocer la metodología básica para la extracción de ADN
• Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ADN
• Determinar la integridad del ADN por electroforesis en gel de agarosa
MATERIALES
• Reactivos y Materiales
• Acetato de Sodio (3 M)
• Etanol absoluto
• Etanol 70%
• Fenol
• Cloroformo
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• Agua desionizada
• TE (pH 8.0)
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Gradillas
• Medio LB líquido
• Termobloques
• Tubos de polipropileno 1.5 mL
• Centrifuga
• Vortex
Muestras biológicas
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de >200 rpm.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
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precipitado no debe de ser recuperado, ya que son proteínas que pueden contaminar la
muestra e inhibir reacciones posteriores.
13. Agregar 225 µL de cloroformo.
14. Agitar vigorosamente durante 30 s utilizando un vortex.
15. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
16. Recuperar la fase acuosa (fase superior, aprox. 200 µL) y colocarla en otro tubo de 1.5
mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
17. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
18. Agitar en vortex 20 s.
19. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
20. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
22. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado, evitando resuspender la
pastilla.
23. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
24. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
25. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
26. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar a -20°C.
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mL, teniendo las mismas precauciones que en el paso 12.
14. Agregar 20 µL de Acetato de Sodio (3M) a la fase acuosa.
15. Agitar en vortex 20 s.
16. Agregar 440 µL de etanol Absoluto frío a la fase acuosa.
17. Centrifugar a 19000 g durante 30 min. Es importante colocar los tubos un la misma
orientación siempre, para saber en qué lado del tubo está el ADN precipitado. Mientras
se está llevando a cabo la centrifugación, se debe hacer el gel de agarosa.
18. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
19. Agregar 500 µL de etanol al 70% al tubo que ha sido vaciado.
20. Centrifugar a 19000 g durante 5 min.
21. Decantar el sobrenadante a un tubo nuevo y mantenerlo en hielo durante el resto del
experimento.
22. Colocar el tubo que ha sido vaciado encima de una servilleta de papel y boca abajo,
hasta que todo el etanol haya sido evaporado.
23. Resuspender el ADN en 50 µL de TE pH 7.8 o agua desionizada.
Guardar -20°C DEPENDIENDO DEL AVANCE CONTINUAR
24. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
25. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
26. Cuantificar el ADN utilizando un espectrofotómetro a una longitud de onda de 260 nm.
27. Realizar una electroforesis en gel de agarosa para visualizar el ADN (práctica 4).
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PRÁCTICA 4. Cuantificación de ADN en gel de agarosa
INTRODUCCIÓN
Una vez que se ha realizado la extracción de ADN es necesario revisar la integridad y la
cantidad del mismo, esto se efectúa mediante la separación por electroforesis en geles de
agarosa o de poliacrilamida. La agarosa es más comúnmente utilizada puesto que no es
tóxica. A los valores de pH en los cuales usualmente se trabaja con ácidos nucleicos, los
grupos fosfato confieren carga neta negativa a estas moléculas. En la electroforesis en geles
de agarosa, las moléculas de ADN lineales migran según su tamaño y se pueden visualizar
mediante tinción. Los geles son teñidos con diferentes colorantes para visualizar el ADN.
Los más comunes son: el bromuro de etidio, el nitrato de plata, y recientemente el SYBER
SAFE, Gel Red, Syber Green, Syber Gold, etc.
Los geles de agarosa se preparan fundiendo agarosa en presencia del buffer adecuado hasta
que se logre una solución transparente. La solución fundida es puesta en un molde donde
gelifica. El gel forma una matriz cuya densidad está determinada por la concentración de
agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN migra hacia el
ánodo. La velocidad de migración está determinada por varios parámetros, algunos de los
cuales son detallados a continuación.
(a) Tamaño del ADN:
Las moléculas de ADN lineal de doble hebra migran a través del gel a velocidades que son
inversamente proporcionales al log del número de pares de bases.
Dado que la carga del ADN está dada por los grupos fosfato y que por cada par de bases
hay dos grupos fosfato, la relación carga/masa es la misma para moléculas de ADN de
diferente tamaño. Pero, debido a la fricción que impone la malla del gel de agarosa, las
moléculas de mayor tamaño serán retardadas respecto a las de menor tamaño.
(b) Concentración de la agarosa:
Un fragmento de ADN lineal migra a diferentes velocidades dentro de geles con diferentes
concentraciones de agarosa. La tabla siguiente muestra concentraciones de agarosa usadas
para resolver fragmentos de ADN en los intervalos indicados.
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OBJETIVOS
Objetivo General
Determinar la cantidad de ADN por densitometría de las bandas en un gel de
agarosa
Objetivos específicos
Adquirir destreza en el corrimiento de muestras de ADN en geles de agarosa
Cuantificar el ADN en geles de agarosa por densitometría
MATERIALES
Materiales y Reactivos
• Solución de Agarosa 0.5% w/v
• Solución para teñir ADN
• Regulador para electroforesis TBE 1X
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• Regulador de carga 6x
• 1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
• Agua desionizada
• Puntas de diferentes capacidades (10, 200 y 1000 µL)
• Muestras de ADN
• Cámara de Electroforesis
• Fuente de Poder
• Marcador de Peso Molecular (100pb)
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. Colocar 20 mL de TBE en un vaso de precipitado de 100 mL (para un volumen de
gel de 20 mL, si es mayor hacer los cálculos conservando la proporción de la
concentración del gel)
2. Agregar 100 mg de agarosa
3. Calentar en parrilla de calentamiento hasta fundir completamente
4. Adicionar 0.5µL de reactivo para teñir ADN (Rojo Texas, Syber green, etc.)
5. Mezclar
6. Verter la solución en una canastilla para electroforesis
7. Colocar el formador de pozos (peine) en la canastilla
8. Dejar gelificar (cubrir el gel con papel aluminio)
9. Colocar la canastilla adentro de la cámara de electroforesis
10. Agregar buffer de corrimiento (TBE)
11. Preparar las muestras a analizar (con buffer de carga, no más de 10 µL en total)
12. Colocar las muestras adentro de los pozos
13. Llevar a cabo la electroforesis a 100 V durante 30 a 45 min
14. Visualizar el gel en el transiluminador y cuantificar según instrucciones.
REFERENCIAS
COMPOSICIÓN DE SOLUCIONES
6x Amortiguador de carga
Azul de bomofenol 0.25% (w/v)
Glicerina en agua 30% (v/v)
TBE
Prepare una solución madre 5x en 1 litro de H2O
Tris base 54 g, Ácido Bórico 27.5 g , EDTA 0.5 M (pH 8.0) 20 mL
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OBJETIVOS
Objetivo General
Extraer ARN de diferentes muestras por métodos físico-químicos
Objetivos específicos
Conocer la metodología básica para extracción de ARN,
Adquirir destreza en la manipulación de diversas muestras biológicas para la
extracción de ARN.
Determinar la integridad del ARN por electroforesis en gel de Agarosa
MATERIALES
Cloroformo: alcohol isoamílico (49:1, v/v)
Etanol
Isopropanol
Nitrógeno liquido
Fenol
Acetato de sodio (2 M, pH 4.0)
Solución D (solución desnaturalizante)
Agua desionizada
1 juego de micropipetas P1000, P200 y P10 por equipo
Gradillas
Termobloques
Tubos de polipropileno 1.5 mL
Centrifuga
Vortex
Material biológico
Una alícuota de 3 mL de un cultivo líquido de E. coli incubado por 14-16 h a 37°C con
agitación constante de >200 rpm.
Una planta de tabaco o de lechuga fresca.
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Sesión 1. Preparación de los cultivos de
1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a
37°C con agitación constante de >200 rpm.
2. Asegurarse que la planta de tabaco y lechuga están en condiciones sanas y frescas.
9. Adicionar 3 mL de la solución D.
10. Homogenizar 15-30 segundos a temperatura ambiente en un homogenizador para el
caso del tejido vegetal (en caso de no tener pasar el macerado en una jeringa de
1mL 3 veces). Para el caso de bacterias es suficiente con macerar con un pistilo de
plástico pequeño.
11. Transferir el homogenizado a un tubo nuevo y adicionar 0.1 mL de Acetato de sodio
2 M, 1 mL de fenol y 0.2 mL de cloroformo-alcohol isoamílico por cada mililitro de
solución D.
12. Mezclar con un vortex vigorosamente por 10 s e incubar en hielo por 15 min.
13. Centrifugar a 9000 rpm. por 20 min a 4°C.
14. Transferir la fase acuosa a un tubo nuevo.
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15. Adicionar un volumen de isopropanol e invertir el tubo 5 veces para mezclar e
incubar a -20°C mínimo 1 hr.
16. Centrifugar a 10,000 g (9000 rpm.) por 30 min a 4°C.
17. Cuidadosamente decantar y disolver el ARN en 0.3 mL de la solución D.
18. Adicionar un volumen de isopropanol e incubar 1 h a -20°C.
19. Centrifugar 10 min a 4°C.
20. Decantar y adicionar un volumen de etanol al 70%.
21. Centrifugar a máxima velocidad durante 3 min.
22. Adicionar 50-100 µl de H2O. Almacenar la solución de ARN a -70°C.
23. Estimar la concentración de ARN midiendo la absorbancia de una dilución 1:200 de
la muestra a 260 nm
24. Separar 5 µL de la muestra de ARN por electroforesis en gel de agarosa al 1%.
Solución D
4 M Tiocianato de guanidina
25 mM citrato de sodio
0.5% (w/v) Lauril sarcosianato de sodio
0.1 M -mercaptoetanol
REFERENCIAS
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Cuando se desea introducir un gen para expresión en bacterias, es necesario que este gen se
encuentre en el vector adecuado para que se obtengan los niveles de expresión deseados. El
vector que se va a utilizar es generalmente amplificado en un cepa de E. coli a partír de la
cual se purifica. La extracción por lisis alcalina consiste en la lisis de las células utilizando
una solución con NaOH y SDS. Posteriormente la separación entre los restos celulares y el
ADN se logra por precipitación mediante la adición de una solución de acetato de potasio.
Para purificaciones más exhaustivas se utiliza una solución de fenol:cloroformo. Los ácidos
nucleicos se separan en la fase acuosa y las proteínas en la fase orgánica.
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos específicos
MATERIALES
Soluciones
Medios de cultivo
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
IMPORTANTE:
Además de los aspectos básicos de bioseguridad (bata obligatoria, zapatos cerrados) se
deberá usar en todo momento guantes de látex o vinilo.
Sesión 1. Preparación de los cultivos de
1. Crecer E. coli en medio LB (3 mL) durante toda la noche, incubado por 14-16 h a
37°C con agitación constante de >200 rpm.
Soluciones
50 mM glucosa
25 mM Tris-Cl (pH 8.0)
10 mM EDTA (pH 8.0)
Guardar a 4°C
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0.2 N NaOH
1% (w/v) SDS
Preparar la solución al momento.
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PRÁCTICA 7. Inserción de material genético en un plásmido bacteriano.
Objetivo General
Objetivos específicos
MATERIALES
• Plásmido (cuales
• Enzimas de restricción
• Material genético de interés.
• T4 ADN Ligasa
• Buffer de restricción.
• Buffer de Ligación.
• Termo-Bloque
MÉTODOLOGÍA
Sesión 1. Reacción de restricción
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5. Incubar a la temperatura indicada para la enzima durante 30 min en el termobloque.
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Objetivo General
Objetivos específicos
• Conocer la metodología básica para amplificar una cadena de interés por medio de
la reacción en cadena de la polimerasa.
• Identificará la correcta o incorrecta inserción de una cadena de interés en un vector
en base al tamaño del amplificado por medio de PCR.
MATERIALES
• Termociclador.
• ADN molde
• Tubos de polipropileno de 200 µL.
• Oligonucleótidos iniciadores (primers): sentido y anti sentido
• Taq DNA polimerasa
• Micro pipetas de diferentes capacidades (1000-100, 200-20 y 10-0.5 µL
• 10X PCR buffer
• MgCl2
• dNTPs: 1 mM dATP, 1 mM dGTP, 1 mM dCTP, 0.65 mM dTTP.
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
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PRÁCTICA 9. Método para preparar células competentes de Escherichia coli con CaCl2
Objetivo General
Objetivos específicos
MATERIALES
- CaCl2 (0.1 M)
- Espectrofotómetro
- Gradillas para tubos
- Hielo
- Medio LB líquido
- Micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Puntas para micropipetas de 200 µL y 1000 µL
- Termo-bloques
- Tubos de polipropileno 1.5 mL estériles
- Ultracentrífuga
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
1. Incubar E. coli a 37°C por 16 h en placas de agar LB
2. Transferir una colonia de E. coli a 5 mL de médio LB e incubar a 37°C con
agitación a >200 rpm durante toda la noche (12-16 h).
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3. Transferir 0.5 mL del cultivo a 50 mL de medio LB e incubar a 37°C con agitación,
hasta que la densidad óptica a 590 nm sea de 0.3 a 0.4 (aproximadamente 3-4 horas)
4. Transferir 50 mL de células a un tubo de propileno frío y estéril y mantenerlo por
10 min a 4°C.
5. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min
6. Decantar el sobrenadante
7. Resuspender el paquete celular en 25 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío)
8. Colocar el tubo en hielo durante 10 min a 4°C.
9. Centrifugar a 6000 rpm. por 10 min a 4°C.
10. Decantar el sobrenadante
11. Con la ayuda de una pipeta pero con extremo cuidado, resuspender el paquete
celular en 1-2 mL de CaCl2 0.1 M esteril y frío.
12. Las células competentes pueden ser usadas inmediatamente o almacenadas por 24-
48 h a 4ºC.
13. Para periodos de almacenamiento más largos, guardar en alícuotas de 100 µL en
tubos estériles de 1.5 mL.
14. Guardar la células competentes a -70ºC. Las células se mantienen viables por
aproximadamente 3 meses.
REFERENCIAS
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Objetivo General
Objetivos específicos
MATERIALES
• Células competentes
• Incubadora
• Placas de agar LB-Ampicilina
• Reacción de PCR (Práctica 8)
• Termo-Bloque (Práctica 7)
• Plásmido
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MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
A. Muestra de interés
REFERENCIAS
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El western blot es una técnica inmuno enzimática utilizada en biología molecular para la
detección de proteínas en muestras crudas o extractos celulares. Esta técnica tiene múltiples
aplicaciones, tanto en el área de investigación como en la de diagnóstico clínico, en donde
es utilizada ya sea independiente o conjuntamente con ELISA.
La técnica consiste en realizar la separación de las proteínas de la muestra por electroforesis
en gel de poli acrilamida (PAGE) y posteriormente transferirlas a una membrana (e.i
nitrocelulosa), ya sea por gravedad, difusión o un campo eléctrico.
Una vez en la membrana, la proteína es identificada mediante un inmunoensayo, en donde
se liga a la proteína de interés un anticuerpo específico contra ella ligado a una enzima, la
cual permite la detección.
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos específicos
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
A. Tratamiento de la muestra.
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4. Se limpia con etanol al 70% las placas de vidrio para remover contaminantes.
5. Colocar las placas de vidrio y los separadores en la base para preparar el gel.
6. Preparar el gel separador de acuerdo a lo indicado en la tabla 1 del anexo, adicionando
el persulfato de amonio y el temed al final.
7. Vaciar el gel separador en los vidrios evitando la formación de burbujas, y
alcanzando un nivel 3cm por debajo del borde superior. Dejar polimerizar por 20 a
30 minutos.
8. Preparar el gel concentrador de acuerdo a la tabla 2 del anexo.
9. Vaciar en la parte superior y colocar el peine, evitando la formación de burbujas.
Dejar polimerizar por 20 a 30 minutos.
10. Montar las placas de vidrio conteniendo el gel en su base, y esta en la cámara.
11. Preparar amortiguador decorrida 1x.
12. Llenar con amortiguador de corrida la cámara interna hasta el límite y la externa hasta
cubrir los electrodos.
13. Retirar con cuidado el peine. Cargar aproximadamente 20 µl de muestra y marcador
de peso molecular en los pozos.
14. Colocar la tapa de la cámara y conectar a la fuente de poder.
15. Correr a 50 V mientras las muestras se encuentren en el gel concentrador.
16. Correr a 100 V una vez alcanzado el gel separador y hasta que el frente de corrida
alcance el final del gel.
17. Detener la fuente de poder, recuperar el amortiguador de corrida y desmontar la
cámara.
18. Cuidadosamente recuperar el gel de los vidrios y colocar en amortiguador de
transferencia.
NOTA: En caso de existir un duplicado del gel, este puede ser teñido para observar
el corrimiento del gel antes de proseguir con la siguiente etapa.
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23. Colocar el cartucho en la cámara de electrotransferencia de manera que el gel quede
hacia el ánodo (-) y la membrana hacia el cátodo (+).
24. Llenar la cámara con amortiguador de transferencia hasta el nivel indicado.
25. Cerrar la cámara, conectar a la fuente de poder y transferir a 100 V por una hora,
cuidando que la temperatura del amortiguador no sobrepase los 60ºC.
26. Al terminar la transferencia, recuperar, con guantes, la membrana del cartucho.
NOTA: En caso de tener duplicado de la membrana, teñir una de ellas para
observar la transferencia de las proteínas antes de proseguir con el siguiente paso.
E. Reacción inmunoenzimática
REFERENCIAS
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ANEXO I
Tabla 1. Gel separador (para un volumen de 15 mL)
Sol. Acrilamida – bisacrilamida 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 6.0 6.5 7.5
Amortiguador pH 8.8 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75 3.75
Agua desionizada 8.75 8.25 7.75 7.25 6.75 6.25 5.25 4.75 3.75
Persulfato de amonio 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
TEMED 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01
TEMED 0.02
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES
• Acrilamida 30% - Bis-acrilamida 0.8%
Pesar 29.2 g de acrilamida (99.9% pureza) más 0.8 g de bis-acrilamida. Disolver en agua
bidestilada y aforar a 100 mL. Filtrar con papel Whatman 1. Guardar en frasco ámbar a 4°
C. Usar guantes al pesar ya que la acrilamida es un compuesto neurotóxico.
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• Amortiguador del gel separador pH 8.8
Pesar 9.081 g de Tris-base, y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador del gel separador pH 6.8
Pesar 3.027 g de Tris-base y 0.2 g de SDS, disolver en poca agua desionizada y ajustar el
pH con HCl (aprox. 1.5 mL). Aforar a 50 mL y almacenar a temperatura ambiente.
• Amortiguador de corrida 5X / SDS
Pesar 7.55 g de Tris-base, 36 g de glicina y 2.5 g de SDS, disolver con agua desionizada y
aforar a 500 mL. Al usar ajustar a 1X.
• Amortiguador de muestra pH 6.8
Pesar 1.52 g de Tris-base y 2.0 g de SDS. Disolver en 40 mL de agua desionizada y ajustar
el pH a 6.8 con HCl (aprox. 2.0 mL). Adicionar 20 mL de glicerol y ajustar el volumen a
100 mL.
• Persulfato de amonio al 10%
Se prepara al momento de usarlo. Preparar el volumen mínimo necesario.
• Solución de azul de bromofenol 10 mg/mL
Pesar 100 mg de azul de bromofenol y disolverlo en 10 mL de agua desionizada. Guardar
en refrigeración.
• Solución teñidora
Para preparar 100 mL se usan 50 mL de Metanol, 10 mL de ácido acético y 40 mL de agua
desionizada y 0.05 g de azul de Coomassie. Disolver el azul de Coomassie en el metanol y
adicionar el ácido acético. Aforar con el agua desionizada.
• Solución desteñidora
Para preparar 500 mL se usan 25 mL de ácido acético, 82.5 mL de metanol y 392.5 mL de
agua desionizada.
• Amortiguador de transferencia
(Tris 0.025M, glicina 0.192M, pH 8.3, metanol 20% v/v). Medir 125 mL de Trizma-base 2
M y agregar 14.49 g de glicina, añadir 200 mL de metanol, aforar a 1000 mL con agua
bidestilada. Guardar a 4 ºC. Nota: No ajustar pH oscila entre 8.1 y 8.4 dependiendo de la
calidad del tris, el metanol debe ser grado analítico, este amortiguador se puede usar hasta 3
veces, después de cada uso filtrar con papel Whatman nº 1.
• Solución salina de fosfatos 0.01 M, NaCl 0.15 M, pH 7.2 (PBS)
Medir 800 mL de agua desionizada y agregar 100 mL de PB 10X y 8.75 g de NaCl.
Disolver las sales y ajustar el pH. Aforar a 1 L con agua desionizada. La solución de PB se
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prepara con 2.62 g de fosfato de sodio monobásico monohidratado y 11.5 g de fosfato de
sodio dibásico anhidro. Disolver en 200 mL de agua desionizada y aforar a 1 L con agua
desionizada.
• Amortiguador de lavado (PBS-Tween 20, 0.05%)
A un litro de PBS pH 7.2 añadir 500 µL de Tween 20.
• Solución de bloqueo.
Pesar 5 g de leche descremada en polvo y disolverlo en 100 mL de PBS-Tween 20. Guardar
a –20 °C.
• Rojo de Ponceau 0.2% en ácido tricloroacético 3%
Pesar 200 mg de rojo de Ponceau y añadir 3 g de ácido tricloroacético. Aforar a 100 ml con
agua desionizada. Mantener a 4° C en frasco color ámbar.
• Solución cromógeno / sustrato
Pesar 25 mg de 4-cloro-1-naftol, añadir 5 mL de metanol absoluto y 25 mL de PBS, agregar
25 µl de peróxido de hidrógeno al 3%. Nota: esta solución se prepara inmediatamente antes
de usarla.
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ANEXO II
PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO
DE AMONIO.
INTRODUCCIÓN.
OBJETIVO.
Purificar gamma globulinas de conejo y de humano por precipitación con sulfato de amonio
a una saturación final del 33% y detección por medio de un gel de electroforesis con
gradiente desnaturalizante.
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MATERIALES.
1 centrífuga clínica.
6 agitadores magnéticos
5.0 mL de BaCI2 al 10%.
1 parrilla con agitación.
10 mL de suero de conejo
10 mL de suero de humano.
20 mL de solución sobresaturada de sulfato de amonio.
5.0 mL de NaOH 2N.
50 mL de solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8.
20 mL de salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Papel indicador de pH.
Tubo para diálisis.
10 cm de hilo grueso.
2 tubos falcón de 15 mL, graduados.
2 vasos de p.p. de 100 mL
2 pipetas serológicas de 5.0 mL.
1 pipeta serológicas de 1.0 mL.
2 pipetas Pasteur y bulbo de hule.
1 matraz Erlenmeyer de 25 mL.
METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
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9. Dializar contra SSRB en frío (4° C) y con agitación, durante 2 días, realizando 2 cambios
diarios de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para
saber si efectivamente se eliminó el sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de diálisis
se le agregan unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera completa si ya
no se observa la formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm.
durante 10 min para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Guardar las gamma globulinas para la separación de isotipos.
12. Determinar la concentración de proteínas por el método de Bradford.
13. Correr un gel de SDS-PAGE para observar las gamma globulinas.
REFERENCIAS.
Campbell, D.H.; Garvey, LS.; Cremer, N.E.; Sussdorf, D.H. 1970. Methods in
Immunology. 2. ed. W.A. Benjamin. Editor.
Kabat, E.A.; Mayer, M.M. 1968. Inmunoquímica Experimental. 1a. ed. Editorial La Prensa
Médica Mexicana.
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El inmunoensayo enzimático, conocido como ELISA por sus siglas en inglés (enzyme
linked immunosorbant assay) fue descrito en 1971 por Engvall y Perlman.En este método
se utilizan anticuerpos conjugados a una enzima. El anticuerpo conserva su capacidad de
unión específica al antígeno, mientras la enzima es capaz de catalizar una reacción de
oxido-reducción, en la cual el sustrato se transforma en un producto colorido. En este
sistema el antígeno o el anticuerpo se adsorbe a una fase sólida insoluble (micro pozos,
tubos o perlas de polivinilo o estireno). El método de ELISA tiene aplicaciones muy
variadas, lo cual lo hace muy versátil: diagnóstico de enfermedades infecciosas, virales o
parasitarias, cuantificación de hormonas, cuantificación de haptenos, titulación de
anticuerpos en bajas concentraciones, determinación de anticuerpos no precipitantes
Existen diversas variantes del método de ELISA, como son los métodos directo, indirecto y
en “sándwich”, y el método de ELISA competitivo. Estos permiten la determinación de
antígenos en fluidos biológicos, a excepción del método indirecto con que se detectan
anticuerpos.
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos específicos
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MATERIALES
Estufa regulada a 37 °C.
Placas de ELISA de poliestireno (fase sólida)
Antígeno “H” u “O”, solución al 5% en solución salina 0.85%.
Pipetas automáticas de 20-200 ml
Anticuerpo anti-IgG purificado y conjugado con HRP
Suero humano control positivo y suero humano control negativo
Sustrato: 4 mg de orto-fenilen diamina, 4 ml de H2O2 al 30% (v/v) en 10 ml de regulador de
citratos 0. XM pH 5.0
Regulador de bloqueo: 0.25 % de gelatina ó 2% de albúmina sérica bovina (BSA), en
regulador de fosfato borato sal (PBS) 0.1M pH 9.6
Regulador de lavado: regulador de salina-fosfatos 0.01M pH 7.2 adicionado de 0.05%
Tween 20.
Diluyente del suero (PBSG): regulador de salina-fosfatos 0.01M, pH 7.2 adicionado de
0.25% de gelatina.
MÉTODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Método de ELISA indirecto.
1. Adicionar 0.2 mL de antígeno en los pozos de poliestireno. Incubar la placa a 4°C
durante 24 horas para permitir la adsorción del antígeno a la fase sólida.
2. Eliminar las soluciones por inversión de la tira de pozos, y desechar el líquido
remanente sacudiendo fuertemente la tira sobre papel absorbente.
3. Lavar los pozos con 0.1 mL de solución de lavado. Dejar los pozos llenos con esta
solución durante 3 minutos. Al cabo de este tiempo, eliminar la solución de la manera
descrita en el paso 2. Repetir dos veces más con el fin de eliminar todo el antígeno no
adsorbido.
4. Bloquear con 0.1 mL de una solución de 0.25% de BSA en PBS e incubar los pozos a
37°C durante 30 min para permitir el bloqueo de los sitios a los que no se adsorbió el
antígeno.
5. Repetir el paso 2.
6. Adicionar 0.1mL de los sueros control negativo, positivo y problema uno en cada pozo.
Si lo requiere puede hacer diluciones del suero. Incubar a 37°C durante 30 minutos para
permitir la reacción antígeno-anticuerpo.
7. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de suero que no reaccionó.
8. Adicionar 0.1mL de conjugado diluido en PBSG, a todos los pozos. Incubar a 37°C
durante 30 min. Para permitir que el conjugado reaccione con los anticuerpos humanos
que se hayan unido al antígeno en la fase sólida.
9. Repetir los pasos 2 y 3 para eliminar el exceso de conjugado que no haya reaccionado.
10. Adicionar 0.1 mL de una solución recién preparada del sustrato de la enzima: H2O2 al
0.04% en regulador de salina-fosfatos pH 5.0 y adicionado de ortofenilendiamina al
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0.04% (como cromógeno). Incubar en oscuridad para permitir la reacción enzimática y
el consecuente desarrollo de color (Nota: el cromógeno es fotosensible)
11. Detener la reacción enzimática adicionando 12 mL de H2SO4 8N en cada pozo.
12. Determinar la presencia o ausencia del antígeno de interés contra los controles de
manera visual, o de contarse, con un lector de placas de ELISA.
REFERENCIAS
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INTRODUCCION
La modificación genética de plantas tiene varios objetivos, entre los que se encuentran: la
generación de especies resistentes a condiciones de estrés (sequía, estrés osmótico, etc), la
mejora nutricional de la especies (aumento en el contenido de aminoácidos o precursores de
vitaminas, etc), obtención de plantas para fitoremediación (remoción de metales pesados),
la obtención de variedades con flores de color no convencional, la producción de alguna
proteína o metabolito con propiedades terapéuticas (vacunas, anticuerpos, alcaloides, etc).
Esta última es de gran interés para los Ingenieros Biotecnólogos ya que la producción de
metabolitos y proteínas en plantas presenta varias ventajas en comparación con el resto de
los sistemas de producción. Algunas de estas ventajas son: el costo de producción es en
muchos casos menor, hay una mayor facilidad de escalamiento, proteínas más complejas
(anticuerpos, proteínas con varios enlaces disulfuro, proteína que requieren un
procesamiento postraduccional, etc) pueden ser producidas. Adicionalmente, las semillas y
granos pueden ser utilizados como sitio de almacenamiento.
La modificación genética de plantas puede llevarse a cabo utilizando diferentes métodos los
cuales pueden ser químicos, físicos o biológicos. Entre los métodos químicos se encuentra
el método mediante el cual se permeabiliza la membrana con polietilenglicol (PEG) con lo
cual se facilita la introducción del material genético. Sin embargo, el tratamiento con PEG
tiene la desventaja de que requiere de protoplastos en lugar de células con pared celular
intacta (los protoplastos responden de manera menos eficiente en cultivo in vitro). Entre los
métodos físicos se encuentran principalmente la microinyección y el bombardeo de
micropartículas (también conocido como biobalística). Este último, que consiste en la
introducción del material genético al interior del núcleo utilizando micropartículas
aceleradas de oro o tungsteno, ha cobrado particular importancia en la última década, a
pesar del costo elevado, debido a que es altamente efectivo y reproducible.
A pesar de ello, el método por excelencia para la modificación genética nuclear de plantas
es el que utiliza Agrobacterium tumefaciens. A. tumefaciens y otras especies relacionadas
como A. rhizogenes y A. vitis son patógenos no destructivos de plantas que tienen la
capacidad de integrar establemente parte de su material genético dentro del genoma de su
hospedero. El impacto de este hallazgo ha tenido grandes aplicaciones en diversos campos
de la biología vegetal, agricultura y biotecnología [1].
Desde el año 1970 hasta la fecha se ha estudiado a detalle el mecanismo por el cual A.
tumefaciens induce la formación de tumores en plantas y el conocimiento adquirido ha sido
fundamental para su uso como herramienta en la ingeniería genética de plantas. Durante el
proceso de infección A. tumefaciens introduce en la célula vegetal una parte de su ADN
(ADN de transferencia; T-DNA) el cual es integrado dentro del genoma de la planta. Los
genes del T-DNA son expresados en su hospedero e inducen la formación de tumores y la
síntesis de aminoácidos no proteicos llamados opinas los cuales son utilizados por A.
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tumefaciens como fuente de carbono y nitrógeno. El T-DNA esta localizado en el plásmido
Ti (Plásmido inductor de tumor; tumor inducing plasmid), que además contiene los genes
vir que son necesarios para la transferencia e incorporación del fragmento de ADN en el
genoma de la planta. La especie A. rhizogenes produce el crecimiento vigoroso de las raíces
infectadas mediante un mecanismo semejante al de A. tumefaciens. En este caso el
plásmido que contiene el T-DNA es llamado Ri (plásmido inductor de raíces; root inducing
plasmid).
OBJETIVOS
Objetivo general
Conocer y aplicar la metodología para llevar a cabo la modificación genética
nuclear de Nicotiana tabacum (planta del tabaco) utilizando Agrobacterium
tumefaciens.
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Objetivos específicos
Conocer el principio básico de la modificación genética nuclear de plantas
utilizando un vector binario.
Conocer y llevar a cabo la metodología básica para la obtención de plántulas
modificadas genéticamente.
Conocer y llevar a cabo la metodología para la identificación de plantas
modificadas genéticamente.
MATERIALES
Materiales biológicos
• Plásmido pROK CRE. Este plásmido es un derivado del plásmido pBIN 19, el cual
contiene el gen CRE fusionado a la secuencia del péptido de transferencia RbcS y se
encuentra bajo el control del promotor 35S. Contiene además el gen nptII que
codifica para la enzima neomicin fosfotransferasa la cual confiere resistencia a
kanamicina en las células portadoras del gen.
• Cepa de A. tumefaciens LBA4404 que contiene en plásmido binario desarmado que
porta los genes vir.
• Plantas de N. tabacum cultivadas en condiciones de asepsia en un cuarto de cultivo
a 25°C durante 4-6 semanas.
• Primers para la amplificación total o parcial por PCR del gen nptII.
Equipos
• Campana de flujo laminar, autoclave, potenciómetro, balanza analítica, agitadora
orbital, incubadora a 37°C, parrilla, micro centrifuga,
Material de laboratorio
• Matraces Erlenmeyer, vasos de precipitados de 250 mL, juego de micropipetas,
cajas Petri desechables, algodón, bisturí, pinzas de disección, papel filtro, papel
aluminio, tubos desechables de 1.5 mL, tubos desechables de 50 mL, un horadador
de 0.5 cm de diámetro.
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METODOLOGÍA EXPERIMENTAL
Preparar los siguientes materiales y reactivos (Ver anexos para composición de soluciones
y reactivos)
Medio LB
Medio NBM
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2. Decantar el sobrenadante
3. Resuspender la pastilla celular en 5 mL de MS0 (mantener en hielo).
4. Disectar 3-4 hojas de plántulas de tabaco cultivadas en condiciones de asepsia.
5. Colocar las hojas sobre el papel filtro contenido en las cajas petri.
6. Cortar las hojas con el bisturí y pinzas (o con un horadador) para obtener explantes
de 0.5 cm x 0.5 cm aproximadamente. Realizar este paso de forma rápida y evitando
dañar de manera excesiva el tejido.
7. Recuperar los explantes e incubarlos directamente en la suspensión de A.
tumefaciens agitando ocasionalmente durante 30 min.
8. Recuperar los explantes con unas pinzas, secar por contacto ligero en papel filtro
estéril.
9. Colocar los explantes en las cajas con medio NBM con la epidermis inferior hacia
arriba. Presionar ligeramente para que los explantes entren en contacto con el
medio.
10. Incubar los explantes a 25 ºC con un fotoperiodo de 16 h luz durante 48 h.
Medio NBM
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a. Después de 4 semanas, transferir los explantes a medio fresco NBM con kanamicina
100 µg/mL. Tener cuidado de mantener la misma orientación y de no dañar el
tejido. Si los explantes se han expandido mucho y son demasiado grandes,
transferirlos a dos cajas.
BIBLIOGRAFIA.
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[2] Tzfira, t.; Vaidya, m. and Citovsky, V. Increasing plant susceptibility to Agrobacterium
infection by overexpression of the Arabidopsis nuclear protein VIP1. Proceedings of the
Natural Academy of Sciences USA. Vol. 99, No.16 (2002); p.10435-10440.
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Garibay Orijel