Informe de TP N 2.

Mara Vera

Informe de Trabajo Prctico N 2:

Espectrometra de Fluorescencia.

Asignatura: Tcnicas Analticas Instrumentales.

Profesor a cargo: Dr. Gerardo Manuel Caballero

Profesor instructor: Dra. Carolina Martnez

Alumnos: Vera, Mara.

Fecha: 02/05/2016.

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Informe de TP N 2.
Mara Vera

Objetivos:
La finalidad del trabajo prctico fue conocer el manejo del espectrofotmetro Nanodrop 1000 y del
fluorespectmetro Nanodrop 3300 (ThermoScientific).
Obtener las curvas de calibracin de espectrometra UV-Vis y de fluorescencia de la fluorescena empleando
muestras de diluciones seriadas con dichos equipos y posteriormente comparar los resultados obtenidos con
cada uno.

Resumen:
Se realizaron diez diluciones seriadas a partir de una solucin madre de fluorescena 0,1 M en PBS y se las
utilizaron para obtener una curva de calibracin, empleando Nanodrops 1000 y fluorespectmetro Nanodrop
3300. Luego se compar los resultados obtenidos con cada equipo para comparar la sensibilidad de cada
mtodo.

Introduccin:
Espectrometra de Fluorescencia
La fluorescencia es un proceso fotolumuniscente en el que los tomos y molculas se excitan con la absorcin
de la radiacin electromagntica. Despus, la especie excitada se relaja al estado fundamental y emite su
exceso de energa como fotones. La caracterstica ms atractiva de la fluorescencia molecular es su
sensibilidad inherente, habitualmente de uno a tres rdenes de magnitud mayor que con la espectroscopia de
absorcin. Otra ventaja de los mtodos de fluorescencia es su amplio intervalo de concentracin lineal,
significativamente mayor que en la espectroscopia de absorcin. Sin embargo, los mtodos de fluorescencia
tienen menos aplicaciones que los mtodos de absorcin, dado el nmero limitado de compuestos con
fluorescencia apreciable. Adems, esta ltima se ve sujeta a muchos ms efectos de interferencia ambiental
que los mtodos de absorcin.
Las transiciones ms frecuentes de dicho fenmeno son n->* y ->* (por mayor F y menor tiempo de vida
respecto a la desactivacin por emisin fluorescente, como se observa en el).

Espectros de emisin y de absorcin de la Fluorescena

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Diagrama de niveles de energa de molculas fotoluminiscentes

La medida de la intensidad de la fluorescencia permite la determinacin cuantitativa de la especie fluorescente

mediante:

F= K F I0 2,3 a b c (Ecuacin I)

O, cuando la energa de la radiacin incidente I0 es constante,

F= kc (Ecuacin II)

En donde F: intensidad de la fluorescencia

F: rendimiento cuntico de la fluorescencia
a: absorbancia
b: camino del paso ptico
c: concentracin
k: constante que depende de la eficiencia cuntica de la fluorescencia

La fluorescena es una sustancia orgnica hidrosoluble perteneciente al grupo de las xantinas de peso
molecular 332,306 g/mol. En soluciones alcalinas (pH 7) produce un color fluorescente verde intenso.

Fluorescena
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Materiales y Mtodos:
Materiales:
Para la realizacin del trabajo prctico se utiliz: Nanodrop 1000, del fluorespectmetro Nanodrop 3300
(ThermoScientific); fluorescena 0,1 M en PBS en agua; micropipeta y H2O (d).

Mtodos
Curva de calibracin:
Se realiz una solucin madre de fluorescena 0,1 M en PBS en agua. Luego se prepararon 10 diluciones
seriadas 1:5 en PBS con volumen final 500 l.

PRIMERA PARTE: Medicin de fluorescencia

Se realiz un barrido de emisin de la fluorescena en el rango de 400-750 nm para corroborar la longitud de
onda a la cual se produce la mayor intensidad de fluorescencia.
Se determin el RFU de los distintos patrones en la longitud de onda seleccionada, se realizaron las
mediciones en orden creciente de concentracin.

SEGUNDA PARTE: Medicin de UV-Visible

Se obtuvo el espectro de absorbancia de la fluorescena en el rango de 220-750 nm, y se determin la
longitud de onda mxima. Posteriormente se midieron las absorbancias para cada solucin.

Resultados:

Curva de calibracin

Se determin que la concentracin de las soluciones seriadas 1:5 a partir de la solucin madre de
fluorescena 0,1 M fueron las siguientes (para cada dilucin se tom 100l de la solucin anterior y se diluy
hasta completar 500 l con PBS en agua):

N Dilucin Concentracin terica de fluorescena (M)

1 0,02

2 4 x 10-3

3 8 x 10-4

4 1,6 x 10-4

5 3,2 x 10-5

6 6,4 x 10-6

7 1,28 x 10-6

8 2,56 x10-7

9 5,12 x 10-8

10 1,02 x 10-8

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PRIMERA PARTE: Medicin de fluorescencia con Nanodrop 330

N Dilucin cc fluorescena RFU (512 nm)

1 0,2 19768,2
2 4x 10-3 20984,9
3 8x 10-4 9534,7
4 1,6 x 10-4 11064,7
5 3,2 x 10-5 958,2
6 6,4 x 10-6 0

Grfico de RFU () vs Concentracin de fluorescena

25000
y = 496105x + 1868.6
20000 R = 0.9334

15000
RFU

10000

5000

0
0 0.01 0.02 0.03 0.04
Concentracin (M)

Grfico N 01: se eliminaron los valores que no contribuan a la linealidad de la recta (correspondientes a las
diluciones N 1 y 4)

SEGUNDA PARTE: Medicin de UV-Visible Nanodrop 1000

N dilucin cc fluorescena Abs. 230 Abs. 490

1 0,2 0,887 1,820
2 4x 10-3 0,986 1,254
3 -4 0,622 0,767
8 x 10
4 1,6 x 10-4 0,370 0,437
5 3,2 x 10-5 0,249 0,242
6 6,4 x 10-6 0,137 0,124
7 1,28 x 10-6 0,054 0,040
8 2,56 x10-7 0,028 0,019
9 5,12 x 10-8 0,003 0,002
10 1,024 x 10-8 0 0

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Grfico de Abs 230nm vs concentracin de fluorescena

0.16 y = 2002.2x + 0.0124

0.14 R = 0.9489
0.12
Absorbancia

0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006
Concentracin (M)

Grfico N 02: se eliminaron los valores que no contribuan a la linealidad de la recta (correspondientes a las
diluciones N 1, 2, 3,4 y 5)

Grfico de Abs 490 nm vs concentracin de fluorescena

0.14
0.12 y = 1851.9x + 0.0075
R = 0.9787
0.1
0.08
Absorbancia

0.06
0.04
0.02
0
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 0.00006
Concentracin (M)

Grfico N 03: se eliminaron los valores que no contribuan a la linealidad de la recta (correspondientes a las
diluciones N 1, 2, 3,4 y 5)

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Conclusiones:

Maria: la idea de hacer este ensayo es que apliques tu criterio a la hora de armar una curva
de calibracin y evaluar su rango de linealidad (zona efectiva de trabajo). Qu puntos
debes descartar en este caso?Por qu?
Analiz de nuevo estos grficos y me mandan el informe nuevamente. Seguramente
cambies la discusin y conclusin

Luego de realizarse las mediciones de las muestras patrones de concentracin conocida de fluorescena
utilizando Nanodrop 330 se analizaron los datos obtenidos para la posterior realizacin de una curva de
calibracin de RFU () vs concentracin (M). Para poder obtener la ecuacin de la curva de calibracin no se
tuvo en cuenta la dilucin N1 y la N4, ya que los valores de RFU no contribuan a la linealidad de la recta. La
dilucin N4 presentaba mayor RFU que el esperado, en estos casos para mejorar la medicin se debe
realizar mezclar ms enrgicamente la muestra para que no existan desviaciones en los resultados, por otro
lado es conveniente realizar ms de una medicin de la dilucin (se puede calcular el promedio de estas
mediciones y obtener un valor promedio con menor error). En el caso de la dilucin N1 es probable que la
muestra no haya sido mezclada correctamente, presentndose menor RFU que la dilucin N2 (para
solucionar este problema se puedo proceder de la misma manera que con la muestra 4). A la hora de
corroborar que el valor obtenido de la ecuacin de la recta sea lo ms efectiva posible para trabajar, se
verific que el valor del R2 sea lo ms cercano a 1, en este caso lleg a obtener un valor de 0,9334, que es
bastante aceptable. Podemos concluir que mediante la ecuacin de la recta (y = 496105x + 1868,6), se puede
determinar concentraciones de muestras de fluorescena desconocidas, siempre y cuando las
concentraciones estn dentro de la zona efectiva de trabajo. VER EJERCICIOS QUE RESOLV EN LA GUA
Al realizar las mediciones de UV-VIS con el Nanodrop 1000 se pudo obtener dos curvas de calibracin una a
230nm y la otra a 490nm (estas longitudes corresponden a los mximos de absorbancia de la fluorescena). A
la hora de realizar las curvas de calibracin se observ que a mayor concentracin el compuesto sufra
interacciones entre sus molculas produciendo desviaciones en los resultados, por esta razn para mejorar
los R2 se despreciaron estos valores de concentracin y absorbancia que no contribuan con la linealidad de la
recta. Por ejemplo se observ que la dilucin N1 mostraba una absorbancia mayor a 1 a 490nm siendo este
un valor que no permite ser tomado en cuenta porque a esta concentracin (mayor a 10 -2M) las molculas
presentar interacciones y no es posible aplicar la Ley de Lambert-Beer. La dilucin N2 tambin reflej este
efecto con absorbancia mayor a 1, por esta razn tampoco fue tenido en cuenta. Al analizar las limitaciones
del mtodo tambin se pudo corroborar que a concentraciones altas la exactitud del mismo menor y por eso
para obtener un mejor valor de R2, no se tuvo en cuanta las diluciones N 3, 4 y 5, que presentaban
desviaciones en sus resultados.
De esta manera podemos concluir que el mtodo de espectrofotometra de absorbacia UV-VIS slo es
conveniente utilizarlo cuando se trabaja con muestras muy diluidas que no deben ser mayores a
concentraciones de 10-2 M, a diferencia de la espectrofotometra fluorescencia que es mucho ms sensible y
se puede usar en un rango ms amplio de concentraciones.

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En el trabajo prctico pudimos estudiar el efecto de la concentracin en la intensidad de la fluorescencia. La

misma aumenta proporcionalmente a medida que se aumenta la concentracin del compuesto fluorescente.
Al observar los grficos se pudo ver que la energa radiante fluorescente de una solucin en funcin de la
concentracin de la especie fluorescente es lineal si las concentraciones son bajas. Cuando c aumenta lo
suficiente para que la absorbancia sea mayor que 0,05 la relacin correspondiente a la ecuacin II pierde
linealidad y F se ubica bajo la extrapolacin de la grfica lineal (este efecto es consecuencia de la absorcin
primaria, en la que el haz incidente se absorbe con tanta fuerza que la fluorescencia ya no es proporcional a la
concentracin). A concentraciones muy altas, F alcanza un mximo e incluso podra empezar a disminuir con
el aumento de la concentracin debido a la absorcin secundaria.
Al analizar los mtodos utilizados pudimos corroborar que los mtodos fluorescente son en general ms
sensibles que los basados en absorcin. Pero una de las desventajas de la fluorescencia es que son pocas
las especies que pueden someterse a este mtodo en comparacin con espectrofotometra de absorcin.
Adems los aparatos de fluorescencia son ms costosos que los de absorcin.
As que dependiendo del comportamiento que la muestra incgnita tenga podr elegir que mtodo ser el
ms adecuado para realizar una prueba cuantitativa, teniendo en cuenta las ventajas y desventajas que
aporta cada mtodo.

Bibliografa:
- Harris, D. Anlisis Qumico Cuantitativo, Editorial Reverte, 2001.
- Douglas A. Skoog, Donald M. West, F. James Holler, Stanley R. Crouch Edicin: Octava edicin. Editorial:
Thomson.