Espectrofotometra:

Los mtodos espectrofotomtricos se basan en la interaccin materia-energa. La radiacin EM

interacciona con la materia produciendo algn efecto, se dice que materia absorbe energa. Se lleva la
materia desde un estado fundamental a un estado excitado. Dependiendo de la cantidad de energa
aplicada, la interaccin ocurrir a distintos niveles. Con ello se distinguen varios tipos de
espectroscopia segn sea el tipo de interaccin con la REM:

Para el caso de la espectrofotometra UV-visible la interracin ocurre a nivel de los e- de la capa de

valencia existe un cambio en la distribucin electrnica.

Absorcin UV-visble : Para que ocurra la absorcin de una radiacin UV-visible en molculas
orgnicas, se requiere que la energa absorbida corresponda al salto de un orbital poblado a uno
desocupado. En el caso molecular, los niveles no son tan discretos por lo que existe una gamma de
frecuencias posibles.

Absorcin y Emisin: Cuando se absorbe energa se pasa de un estado fundamental a un estado

excitado. Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de desfase,
ocurriendo emisin de radiacin (no siempre puede ocurrir, la energa se puede disiparse de otras
formas). Este fenmeno da origen a otro tipo de espectroscopa como la espectroscopia de
luminiscencia, fluorescencia.

Cada analito molecular tiene un mximo de absorcin en la zona del UV-visible. Atendiendo a esta
para cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiacin se disea un mtodo para
cuantificar la cantidad de sustancia .

La cubeta: Recipente de la muestra

Procedimiento experimental:

Una vez que se tiene la muestra, se obtiene una

solucin perfectamente disuelta y transparente que se
coloca en la cubeta.
En general se ocupan cubetas cuadradas de un cm de
paso. Si la disolucin es muy diluida, se ocupa una
cubeta ms ancha (mayor posibilidad de paso de luz
y absorcin).

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 Se ocupan cubetas de cuarzo (no absorbe radiacin visible ni UV).
Los fenmenos pticos (reflexin, dispersin) causan atenuacin del haz que atraviesa la solucin
que se deben considerar en la medicin. Para compensar estos efectos, se coloca una solucin
blanco que da cuenta de las perdidas anteriores. Esta se conoce como solucin o cubeta de
referencia.

Absorcin de la Luz

La figura ilustra la atenuacin (disminucin de energa por unid.

de area) de un haz de radiacin monocromatica, antes y despus
de haber atravesado una capa de solucin con un grosor de b cm y
una concentracin c. A causa de la interaccin entre los fotones y
las partculas absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po a P.

Se define la transmitancia T de una solucin como la fraccin de

radiacin incidente transmitida por la solucin:
Y el porcentaje de transmitancia como %T= (P/Po)*100
Los valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y
uno si pasa toda la luz.

Se define la absorbancia A de una solucin:

La absorbancia toma valores entre 0 e infinito. Obsrvese que la absorbancia aumenta conforme
disminuye la transmitancia.

Los instrumentos miden transmitancia, es decir, comparan la potencia incidente y emergente. Tienen
un procesador integrado que convierte los valores en absorbancia. En general , los instrumentos
comunes tienen una escala de absorbancia de 0 a 2.

Ley de Beer:

De acuerdo a la ley de Beer, la absorbancia esta relacionada linealmente con la concentracin de la

especie absorbente (c ) y con la longitud de la trayectoria (b) de la radiacin con el medio absorbente.

a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad. Si c esta en gr/L, a esta en Lgr-1m-1 y

se c esta en mol/L a se denomina absortividad molar y se designa por (unidades de Lmol-1cm-1)

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Anlisis Cuantitativo:

Para efectuar el anlisis la radiacin de la fuente luminosa

debe ser monocrmatica . Se debe elegir mximo para
obtener la mxima sensibilidad y minimizar los errores. El
espectrofotmetro contiene un monocromador, que
transforma la luz policromtica en monocromtica. Depende
de la calidad de este, que tan buena es esta transformacin.

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 Se debe establecer el rango de concentracin donde la relacin
con la absorbancia es lineal. Depende de la absorbilidad de la
sustancia. Solo debera usarse el rango lineal.

Existe un rango de absorbancia ptima para la medicin

(alrededor de 0.15-0.7). Esto debido a que en la zona de alta
absorbancia se producen desviaciones como consecuencia de que
la luz que logra pasar es casi nula y se confunde con el ruido de
fondo. Este rango depende de la calidad del aparato, incluso hay
algunos que llegan a valores de 3 en absorbancia, pero llevan implcito cierto error. Esto se conoce
como desviaciones instrumentales.

Tambin pueden ocurrir desviaciones qumicas de la ley de Beer producto de que las especies que
forman la muestra interactan y se desva de la linealidad. Esto ocurre a altas concentraciones.
Para construir la curva de calibracin se toman valores limite de concentracin en los valores 0.15-0.7
de A y luego se toma un par de puntos ms. Lo ideal es que la curva de calibracin se construya en las
mismas condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando no procede esto, se puede eliminar el
efecto de la matriz si se aplica el Mtodo de Adicin Estndar.

Componentes de un Espectrofotmetro

1. Monocromador: Dispersa la luz y selecciona una longitud de onda

2. Colimador: Selecciona de la franja de luz una determinada longitud de onda
3. Detector: Transforma los fotones recibidos en una seal elctrica.
4. Fuentes radiante: Origen de luz (lamparas)

Generalmente se toman dos extremos:

Blanco 100% de transmitancia
Objeto opaco 0% de transmitancia
Luego se toma el valor para la muestra.

Fuentes radiantes:

Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en

su radiacin, lo que obliga a calibrar el instrumento cada vez que se
cambia la longitud de onda.
Permite medir solo en el rango del espectro visible.

Lmpara de Deuterio Tambin tiene intensidad variable en la longitud

de onda lo que obliga a recalibrar el instrumento cada vez que se varia la
longitud de onda. Sirve para medir en el rango UV.

Selector de Longitud de Onda Dispositivo que selecciona la longitud de

onda que ser utilizada a una banda estrecha que es absorbida por el analito.
Con esto se garantiza de que al analito siga la ley de Beer, se asegura una
mayor selectividad ya que no es probable que interfieran sustancias con un
mximo de absorcin en regiones de otras longitudes de onda y adems se
aumenta la sensibilidad ya que una banda estrecha origina una mxima variacin en la absorbancia al
variar la concentracin.

Monocromador: Dispositivo que dispersa un haz de radiacin policromtico en las longitudes de onda
que lo componen, para luego selecciona una longitud de onda determinada del espectro.

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Filtros de Absorcin y rejilla de reflexin: En este tipo de
monocromadores la dispersin angular se origina por la
difraccin que se produce en la superficie reflectante. Se genera
una dispersin pareja de la luz, es decir, la dispersin de la
longitud de onda es independiente de la longitud de onda.

Prisma: La difraccin en las dos caras del prisma da

lugar a una dispersin angular de la radiacin.
Algunas longitudes de onda son ms dispersadas que
otras. La dispersin producida por un
monocromador de prisma es mayor a longitudes de
onda cortas que a longitudes de onda largas.

Portamuestras, cubetas:
Material Rango UV: cuarzo
Rango visible : cuarzo, vidrio, plstico
La cubeta debe estar perfectamente limpia (no tocar con las manos)
No debe tener burbujas
En general, el largo es de 1 cm. Cuando las soluciones son muy diluidas se debe utilizar una cubeta
ms ancha para aumentar la sensibilidad (5-10 cm)

Detectores:

Espectrofotmetro de haz simple:

Del tipo que se ha visto anteriormente, el problema es la sensibilidad del detector, ya que el detector
puede ser ms sensible para una longitud de onda y menos para otras. Este tipo de espectrofotmetro
esta bien adecuado para mediciones de absorcin de una sola longitud de onda.

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Espectrofotmetro de doble haz:
Para compensar lo anterior, se invent un sistema de doble haz. Un haz pasa por un divisor de haz
(espejo en forma de V) formando dos haces en el espacio. Un haz pasa por una celda de referencia y
otra por una celda de muestra simultneamente (se requieren dos cubetas), luego los haces pasan por
dos fotodetectores idnticos. Lo que se mide al final es la diferencia entre las dos mediciones (se
utiliza un amplificador de diferencia). Es decir, cada medicin implica una recalibracin automtica.
Con este tipo de instrumentos se puede obtener espectros de absorcin de una sustancia ya que se hace
un barrido de las longitudes de onda.

Espectrofotmetro de Fotodiodos (arreglo de diodos):

La luz separada (mltiples longitudes de onda) se hace incidir en un arreglo de diodos que absorbe a
las distintas longitudes de onda. El corazn del instrumento es la disposicin de varios centenares de
diodos detectores de silicio que se fabrican de lado a lado sobre un solo chip de silicio. Estos perciben
para cada una de las distintas longitudes de onda de manera electrnica mediante un arreglo de
circuito.
Experimentalmente se coloca primero un blanco y luego la muestra. Se percibe una menor seal de la
muestra , es decir, con menos seales en el espectro.
Con este instrumento se puede detectar el espectro completo en fraccin de segundos, es mucho mas
til. Incluso, la cubeta puede estar en un lugar accesible a la luz ambiente, no se afectan las
mediciones.

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