Journal of Farmakognosi

alkaloid pyrrolizidine dalam teh obat 23 (3): 425-432, Mei / Juni 2013

bandotan
Brasileira de Farmacognosia Brasil

Cristiane F. Bosi, 1 Daniela W. Rosa, 1 Raphael Grougnet, 2 Nikolaos Lemonakis, 3 Maria

Halabalaki, 3 Alexios Leandros Skaltsounis, 3
online 26 Mar 2013 Revista
Maique W. Biavatti *, 1

1 Departamento de Ciencias Farmacuticas, Centro de Ciencias da Sade, Universidade Federal de

Artikel
Diterima 19 Feb 2013 Tersedia
Santa Catarina, Brasil,
2 Laboratoire de Pharmacognosie, UMR / CNRS 8638, Facult des Sciences Pharmaceutiques et

Biologiques, Universit Paris Descartes, Sorbonne Paris Cit, Perancis,

Menerima 22 Nov 2012
3 Departemen Farmakognosi dan Produk Natural Kimia, Fakultas Farmasi, Nasional dan Kapodistrian
Universitas Athena, Yunani.

Abstrak: Sekarang secara luas diakui bahwa pandangan bahwa obat herbal tidak memiliki efek samping dan
/ atau toksisitas tidak benar; beberapa tanaman tradisional digunakan dapat hadir toksisitas. Penggunaan Kata kunci:
populer mapan bandotan telah menyebabkan dimasukkan dalam kategori simplisia obat dibuat oleh Badan bandotan
chromenes
Pengawasan Kesehatan Brasil. Ageratum milik suku Eupatorieae, Asteraceae, dan digambarkan sebagai
Asteraceae
mengandung alkaloid pyrrolizidine beracun. ekstrak air dari bandotan L. dipanen di Brazil (komersial, fl
lycopsamine flavonoid
owering dan non-fl owering sampel) disiapkan sesuai dengan metode yang ditentukan dan dianalisis dengan
methoxylated alkaloid
HPLC-HRMS. Alkaloid pyrrolizidine lycopsamine, dihydrolycopsamine, dan asetil-lycopsamine dan mereka N- pyrrolizidine
oksida, terdeteksi dalam ekstrak dianalisis, lycopsamine dan yang N- oksida menjadi hepatotoxins dikenal
dan tumorigens. Bersama dengan alkaloid pyrrolizidine mengindentifikasi ed oleh HPLC-HRMS, tiga belas
senyawa fenolik yang ed identifi, terutama, methoxylated fl avonoids dan chromenes. studi toksikologi pada A.
conyzoides diperlukan, seperti pemantauan penggunaan klinis. Untuk saat ini, tidak ada pedoman
keselamatan yang ditetapkan pada pyrrolizidine alkaloid yang mengandung tanaman, dan penggunaannya
di Brazil.

ISSN 0102-695X
DOI: 10,1590 / S0102-695X2013005000028

pengantar Penggunaan populer mapan tanaman ini telah

Itu Ageratum genus, Asteraceae, terdiri
ca tiga puluh spesies yang belum baik diteliti. Spesies neotropical
luas bandotan L. merupakan tanaman aromatik tahunan yang
dianggap sebagai gulma invasif dan kosmopolit yang tumbuh di
daerah tropis, dan sangat umum di Brasil. bau aneh yang telah
disamakan dengan bau kambing, sehingga menimbulkan nama
populer goatweed. Di Brazil memiliki beberapa nama, seperti
mentrasto, maria-preta, pico-branco; pico-Roxo, Erva-de-
so-joo, Erva-de-so-jos, Erva-de-santa-Lucia. bandotan memiliki
sejarah panjang penggunaan obat di beberapa negara tropis di
seluruh dunia, dan memiliki berbagai indikasi, penyakit kulit
gangguan mental dan penyakit menular (Okunade, 2002).
Di Brazil, bagian udara yang banyak digunakan (internal
maupun eksternal, segar atau kering, di tincture atau infus) untuk
seharusnya analgesik dan sifat anti-inflamasi, dan biasanya
digunakan untuk mengobati kram menstruasi, arthritis, rematik,
dan diare (Okunade 2002; Lorenzi & Matos, 2008).
menyebabkan dimasukkan dalam daftar obat herbal notifi ed,
kategori simplisia obat yang dibuat oleh Surveillance Kesehatan
Badan Brasil, Anvisa (RDC No. 10, 9 Maret 2010). Ini berarti obat
mentah (bagian udara, hancur atau bubuk) kini resmi untuk
pemasaran tanpa resep dokter, untuk digunakan dalam
penyusunan infus.
Mayoritas publikasi pada aktivitas biologis A. conyzoides fokus
pada minyak esensial, dan bukan pada zat terisolasi dari ekstrak,
seperti pyrrolizidine alkaloid (PA), yang diisolasi dari
A. conyzoides dikumpulkan di Kenya (Wiedenfeld & Roder,
1991). Alkaloid ini berpotensi hepatotoksik, dan intoksikasi akut yang
disebabkan oleh PA ditandai dengan nekrosis hati hemoragik pada hewan,
yang jarang terjadi pada manusia. Masalah utama yang terkait dengan PA
adalah bahwa paparan jangka panjang dapat menyebabkan megalocytosis
hati dan penyakit veno-occlusive (pada tingkat lebih rendah di paru-paru),
lemak degenerasi hati dan sirosis, dan proliferasi epitel saluran empedu.
Selain itu, banyak PA yang genotoksik dan karsinogenik pada hewan
pengerat (Chen & Huo, 2010).

425
alkaloid pyrrolizidine dalam teh obat bandotan
Cristiane F. Bosi et al.

Karena tidak ada makalah yang diterbitkan yang
menegaskan kehadiran PA di Brasil bandotan,
pekerjaan ini menyelidiki keberadaan PA dalam teh (ekstrak air) yang
diperoleh oleh infus tanaman dipanen (dengan dan tanpa bunga) dan
dari sampel komersial (dibuat sesuai dengan prosedur Anvisa). Hal ini
juga berusaha untuk mengisolasi PA dan konstituen lebih lanjut dari
tanaman obat ini.
spesies dipisahkan dan dikeringkan pada 50 C (enam hari),
kemudian hancur, dan disimpan dalam kulkas (4 C). Ekstrak air
(infus) disiapkan dengan menempatkan 3 g obat mentah di 150 ml
air mendidih (menurut RDC 10/10, Anvisa). ekstrak air yang
dihasilkan diliofilisasi dan kemudian dianalisis dengan NMR dan
HPLC-HRMS. Sampel berikut disiapkan: Berbunga bagian udara
(FS), bagian udara non-berbunga (NFS), sampel komersial (CS),
dibeli dari apotek di Ouro Preto (MG).

Bahan dan metode

bahan tanaman
Seluruh tanaman ( bandotan L.,
Asteraceae) dipanen dari Taman Tanaman Obat dari Rumah Sakit
Universitas Universidade Federal de Santa Catarina dan dari
banyak kosong dekat Praia Brava Beach, Florianpolis, SC.
Sebuah voucher diidentifikasi oleh ahli botani Renato Zchia dan
disimpan di Herbarium dari Universidade Federal de Santa Maria
(No. SMDB 13,138). Sampel komersial dibeli dari apotek di Ouro
Preto, MG.
pabrik pengolahan dan ekstraksi
Bagian udara berbunga dan non-berbunga
Dalam rangka untuk mengisolasi senyawa utama, ekstraksi
selektif dari simplisia dengan bunga (1 kg) dilakukan dengan pelarut
meningkatkan polaritas, menggunakan
n heksana (28 g n ekstrak heksana), diklorometana (34 g ekstrak
diklorometana), etil asetat (3 g ekstrak etil asetat) dan etanol (11 g
ekstrak etanol). Dari
n ekstrak heksana, senyawa yang diketahui berikut diperoleh klasik CC
silika gel, dengan menggunakan beberapa proporsi dari
heksana-aseton sebagai eluen (data spektral sesuai dengan literatur):
(. Kongduang et al, 2008) beta-sitosterol dan stigmasterol, kumarin ( 1) ( Kupriyanova,
1997), precocene II ( 2) ( Adebayo et al., 2010), encecalol dan
demethoxyencecalol ( 3 dan 4) ( Gonzlez et al., 1991), sesamin ( 5) ( Moazzami
et al., 2007), linderoflavone B ( 6)
(Saxena, Shrivastava, 1994), 3'-hidroksi-5,6,7,8,4' ,
5'hexamethoxyflavone ( 7) ( Herz & Kulanthaivel, 1982), 5'

H 3 CO H 3 HAI HAI
OO H 3 BERSAMA HAI

C H3 C
H 3 BERSAMA
OH OH

1 2 3 4

OO

OH

OCH 3 OCH 3
HAI
OCH 3
H 3 BERSAMA HAI
OO
H 3 BERSAMA HAI
OCH 3
H 3 BERSAMA
HAI H 3 BERSAMA
CH 3 HAI O
CH 3 HAI O

OO
5 6 7

OCH 3 OCH 3 BERSAMA 2 H

OCH 3
OCH 3 OCH 3
OH
H 3 BERSAMA HAI H 3 BERSAMA HAI
OCH 3 OO
10

H 3 BERSAMA H 3 BERSAMA BERSAMA 2 H

CH 3 HAI O CH 3 HAI O
OH

8 9 11

426 Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23 (3): May / Juni 2013
 alkaloid pyrrolizidine dalam teh obat bandotan
Cristiane F. Bosi et al.

methoxynobiletin ( 8) ( Le-Van & Van Cuong Pham, 1979), dan
eupalestin ( 9) ( Herz et al., 1980). Dari ekstrak etanol, berikut ini
diperoleh: 2-hydroxycinnamic dan 2-hydroxydihydrocinnamic asam
( 10 dan 11)
(Gerothanassis et al., 1998).
Pyrrolizidine alkaloid prosedur ekstraksi
Dalam upaya untuk mengisolasi PA, metode yang dijelaskan
sebelumnya untuk A. conyzoides oleh Wiedenfeld & Roder direproduksi,
tetapi tidak berhasil. Selain itu, metode tradisional dan ditingkatkan untuk
ekstraksi PA digunakan, tetapi tidak ada alkaloid diisolasi (Frahn et al.,
1980, Mroczek et al., 2006).
pergeseran kimia NMR diberikan dalam ppm berhubungan dengan sinyal
TMS di 0.00 ppm sebagai referensi internal. The UHPLC-ESI- (+) - HRMS
dan UHPLC-ESI (+) - HRMS / MS analisis yang dilakukan menggunakan
sistem Accela (San Jose, CA, USA) yang dilengkapi dengan pompa biner,
autosampler, degasser vakum online, dan suhu yang dikendalikan kolom
kompartemen. resolusi tinggi spektrometri massa dilakukan pada
spektrometer massa LTQ-Orbitrap XL Penemuan hybrid dilengkapi dengan
probe ESI (Thermo scientifi c, San Jose, CA, USA).

ekstrak air fraksinasi

Dalam rangka untuk menyaring komposisi kimia dari

ekstrak air obat A. conyzoides, CC fraksinasi dilakukan dengan
resin Amberlite (Rohm dan Hass Co) XAD-4 (230 g) dan XAD-7
(250 g), menggunakan ekstrak air panas (10 L), disiapkan sesuai
dengan pejabat resmi metode Brasil (M & M) (Gambar 1). non
dipertahankan ekstrak dalam resin XAD-7 ( yaitu ekstrak air yang
dielusi dari resin, 21 g) dilarutkan dalam air dan dipartisi dengan n butanol.
Fraksi yang dihasilkan (5 g) dikromatografikan di silika gel dengan n heksana-etil
asetat-metanol gradien, yang mengarah ke kation identifi dua
senyawa (1,7 g asam 2-hydroxycinnamic, 16

dan asam 2-hydroxydihydrocinnamic, 17). Ekstrak air ditahan di XAD-4

(dielusi dengan metanol) menghasilkan
3,6 g, yang dipartisi dengan diklorometana (68,8 mg) dan
dikromatografi di silika gel dengan n hexane- etil asetat-metanol
gradien, perabotan 5,3 mg senyawa 16 dan 17 dan 8,5 mg
precocene II ( 8).
Semua fraksi lainnya yang diperoleh, ditunjukkan dalam Gambar
1, yang liofilisasi dan dianalisis dengan UHPLC-HRMS: XAD-4
fraksi air, XAD-4 fraksi air setelah partisi dengan diklorometana,
fraksi XAD-7 berair, XAD-7 fraksi berair setelah partisi dengan etil
asetat, dan ekstrak air tidak disimpan di XAD.
Peralatan
Data NMR untuk senyawa terisolasi dicatat pada Bruker
Avance 400 dan Avance III 400 NMR spektrometer, keduanya
beroperasi pada 9,4 T. 1 H dan
C inti yang diamati di 400,13 dan 100,61 MHz, masing-masing.
13
Spektrometer dilengkapi dengan baik 5 mm multinuclear deteksi
langsung probe dengan 95 B%, 16 sampai 17 min: 5% B dan 17 sampai 20 menit: 5% B. Volume
injeksi adalah 2 uL. Resolusi tinggi massa spektrometer hybrid
z gradien atau 5 mm multinuclear terbalik deteksi probe dengan z gradien.
Satu-ikatan dan jangka panjang 1 H- 13 C korelasi dari HSQC dan
HMBC NMR percobaan dilakukan dengan konstanta kopling rata 1 J
( H, C)
dan LR J ( H, C) dioptimalkan untuk 140 dan 8 Hz, masing-masing. Itu
Gambar 1. Mengalir bagan bandotan ekstrak air fraksinasi menggunakan
Amberlite XAD-4 dan XAD-7 resin.
UHPLC-ESI (+) - HRMS & HRMS / MS analisis dari ekstrak / senyawa
terisolasi
Pelarut yang digunakan dalam penelitian ini adalah dari LC-MS
kelas, yang dibeli dari Fluka / Riedel-de Haen (St. Gallen, Swiss). Ekstrak
beku-kering disimpan dalam gelap pada 4 Hai C sebelum persiapan untuk
LC-MS, yang diencerkan pada saat analisis dalam MeOH pada
konsentrasi fi nal dari 100 ug / mL. Sebuah Ekspres Emas C18 100 x 2,1,
3 m terbalik kolom fase (Thermo scientifi c, Brehmen, Jerman) digunakan
pada tingkat alir dari 300 uL / menit untuk pemisahan kromatografi. Fase
gerak terdiri dari pelarut A: air, 0,1% asam format dan B: ACN 0,1% asam
format. Sebuah metode gradien (waktu berjalan total 20 menit) digunakan
untuk profi ling dari sampel sebagai berikut: 0 sampai 5 menit: 5% B, 5
sampai 7 menit: 25% B, 7 sampai 14 menit: 95% B, 14 sampai 16 menit:
(LTQ-Orbitrap Penemuan XL) dioperasikan dalam mode ion positif di
bawah

Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23 (3): May / Juni 2013 427
alkaloid pyrrolizidine dalam teh obat bandotan
Cristiane F. Bosi et al.
kondisi berikut dioptimalkan: suhu kapiler, 270 C; tegangan kapiler, 20 V;
lensa tabung, 110 V; sumber tegangan, 3,5 kV; aliran gas selubung, 40 arb.
unit; aliran gas aux, 20 arb. unit. Analisis dilakukan dalam mode full scan,
dengan resolusi 30.000 di m / z 400 dan jangkauan pemindaian ditetapkan
untuk m / z 100 -1000.
Untuk analisis HRMS / MS, metode Data-dependent
digunakan, memungkinkan fragmentasi dari tiga puncak tertinggi
terdeteksi untuk setiap scan. Dua peristiwa pemindaian utama dilakukan
berturut-turut, hanya menggunakan analisis Orbitrap, yang pertama terdiri
dari full scan (3 microscans, waktu 50000 injeksi dan 50-1000 m / z Scan
range) dan yang kedua terdiri dari tiga HRMS / MS akuisisi dari tiga
puncak yang paling intens (2 microscans, 10000 waktu injeksi, 45V CID /
Q: 0,25).
Hasil dan Diskusi
Penggunaan tanaman herbal sebagai solusi alami, makanan
fungsional, dan suplemen makanan untuk perawatan kesehatan telah
meningkat di seluruh dunia. Perkiraan pasar menunjukkan bahwa tingkat
pertumbuhan penjualan produk obat tradisional dalam beberapa tahun terakhir
telah antara 5 dan 18% per tahun (Kohler & Baghdadi-Sabeti, 2011). Sekarang
dengan baik diakui bahwa konsep tidak ada efek samping dan / atau toksisitas
produk alami adalah salah satu yang salah (Li et al.,
2011). Hal ini sangat mungkin bahwa PA yang mengandung tanaman adalah
tanaman beracun paling umum yang mempengaruhi ternak, satwa liar, dan
manusia, dan mungkin juga fitokimia hepatotoksik dan tumorigenic terkemuka
yang berhubungan dengan penyakit manusia dan hewan.
Akibatnya, adalah tepat dan penting untuk mengidentifikasi
tanaman dan produk herbal yang mengandung racun PA, dan untuk menilai
risiko yang ditimbulkan oleh paparan zat ini hadir dalam produk herbal
(Molyneux et al., 2011). Telah dilaporkan bahwa 3% dari semua tanaman
berbunga mengandung PA, tetapi mereka terutama ditemukan dalam anggota
dari tiga keluarga tanaman: Asteraceae, boraginaceae dan Fabaceae (Fu et al,
2002.).
Ageratum milik untuk yang Eupatorieae
suku dari keluarga Asteraceae, yang Eupatorieae dan Senecioneae suku, menit, lycopsamine acetyl N- oksida, 17). Dalam HRMS / MS percobaan,
dua digambarkan sebagai mengandung senyawa PA beracun: alkaloid
1,2-dehydropyrrolizidine ester (dehydroPA, seperti dalam lycopsamine ( 12) spesifik karakteristik pada 138 m / z ( Meja
dan mereka
N- oksida) (Hartmann & Conner, 2009). Di seluruh dunia,
hepatotoksisitas manusia alkaloid karena 1,2-dehydropyrrolizidine
dapat dikaitkan dengan konsumsi obat herbal, masalah utama
yang terkait dengan kontaminasi makanan atau pakan (Edgar et
al., 2002).
Pada mamalia, tertelan dehydroPA dioksidasi dalam hati
oleh oksidase campuran-fungsi (sitokrom P450) ke pirol derivatif.
Sistem cincin pirol merender C-7 dan / atau C-9 posisi yang sangat
elektrofilik, dan mampu bereaksi dengan nukleofil jaringan,
bersamaan dengan pembelahan substituen ester, dengan demikian
mengikat
428 Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23 (3): May / Juni 2013
protein dan / atau asam nukleat. Hal ini, pada gilirannya, dapat mengubah fungsi sel,
menyebabkan kerusakan sel atau kematian sel (Molyneux et al., 2011).
Kehadiran dehydroPA dan yang N- oksida telah
dilaporkan di A. conyzoides dipanen di Kenya (Wiedenfeld &
Roder, 1991), Ethiopia (Wiedenfeld,
2011) dan Hawaii (Molyneux et al., 2011). PA dan racun lainnya terjadi pada
konsentrasi rendah, dan seperti yang diperkirakan oleh hipotesis pertahanan
pergeseran, konsentrasi racun secara signifikan lebih tinggi dalam spesies
gulma invasif dibandingkan spesies asli (Doorduin & Vrieling, 2011). Ageratum adalah
asli Amerika tropis, dan sangat invasif, terutama di bawah kondisi kekeringan,
yang asing bagi lingkungan alam. Hipotesis pertahanan pergeseran bisa
membantu menjelaskan mengapa, dalam pekerjaan ini, itu tidak mungkin untuk
mengisolasi alkaloid menggunakan metode khusus yang dijelaskan untuk
dehydroPA ini atau menggunakan metode yang sama seperti yang sebelumnya
digunakan untuk spesies yang sama (M & M).
ekstrak air dari A. conyzoides dipanen di Brasil Selatan
(sampel FS, NFS, CS), dan fraksi XAD nya, dianalisis dengan
HPLC-HRMS (Tabel 1) dalam mode full scan, untuk menyelidiki
keberadaan dehydroPA sebelumnya terisolasi isomer lycopsamine dan
echinatine, dan lainnya biogenetically terkait PA, seperti
asetil-lycopsamine, dihydrolycopsamine dan mereka N- bentuk oksida.
Dalam analisis HPLC-HRMS scan penuh, hanya ada
beberapa puncak yang mewakili isi relatif lebih tinggi dari komponen di
TIC (Gambar 2, 1 st garis); Namun, dalam kromatogram ion yang
diekstrak (XIC, 2 nd 7 th garis pada Gambar 2), enam PA terdeteksi. Untuk
memverifikasi identitas mereka, HRMS / MS, yang dihasilkan oleh data
metode baru dikembangkan senyawa-dependent untuk PA, dicatat.
Yang dihasilkan kali retensi, massa tepat ion molekul terprotonasi, dan
ion fragmen karakteristik diringkas dalam Tabel 1 dan 3. Dalam scan
penuh (TIC), enam puncak dengan ion molekul ([M + H] +) terprotonasi
diamati di m / z 300.1805 (3.05 min, lycopsamine; 12),
316.1755 (3,36 menit, lycopsamine N- oksida, 13), 302.1962 (3,38 menit,
dihydrolycopsamine, 14), 318.1911 (3,75 menit, dihydrolycopsamine N- oksida,
15), 342.1911 (4.62 min, asetil-lycopsamine, 16), dan 358.1860 (4,83
enam puncak ini menunjukkan jenis retronecine- ion fragmen diagnostik
3). Dari enam alkaloid ini diidentifikasi, hanya dua puncak yang terkait dengan
bentuk dihydroPA dari lycopsamine dan yang
N- oksida, yang tidak ditandai sebagai karsinogenik atau hepatotoksik.
Penting untuk dicatat bahwa bersama-sama dengan yang disebutkan PA,
beberapa isomer massa di atas, terutama dari dihydroPA, juga hadir
(Gambar 2, Tabel 1).
Beberapa puncak yang diamati pada total kromatogram ion
(TIC), membenarkan bahwa kandungan PA dalam sampel rendah
(Gambar 2). Lycopsamine dan yang
N- oksida adalah dua PA utama (dikenal hepatotoxins dan tumorigens),
sementara yang lain PA diidentifikasi hanya
 alkaloid pyrrolizidine dalam teh obat bandotan
Cristiane F. Bosi et al.

Tabel 1. Data LC-HRMS senyawa diidentifikasi dalam sampel ekstrak air bandotan.

analisis LC-HRMS sampel

[M + H] +
Identifikasi
senyawa Eksperimental Delta CS FS NFS
t R ( min) Teoritis
m/z m/z (Ppm) RDB MolekulerRumus

1 3.05 300.1805 300.1811 2.00 3,5 C 15 H 25 HAI 5 N lycopsamine ( 12) ++ +++ +

2,90 302.1966 1,32 dihidro-lycopsamine ( 14)

+ + +
2 3,38 302.1962 302.1967 1,65 2,5 C 15 H 27 HAI 5 N mungkin isomer Aku
+ + +
4,03 302.1966 1,32 mungkin isomer II

3 4.65 342.1911 342.1917 1,75 4,5 C 17 H 27 HAI 6 N asetil-lycopsamine ( 16) + +++ ++

4 3.36 316.1755 316.1760 1,58 3,5 C 15 H 25 HAI 6 N lycopsamine N- oksida ( 13) +++ ++ +

3.21 318.1915 1,26 + + +

5 3,75 318.1911 318.1915 1,26 2,5 C 15 H 27 HAI 6 N dihidro-lycopsamine N- oksida
mungkin ( 15)
isomer Aku ++ + +++
3,94 318.1915 1,26 mungkin isomer II ++ + +++

4.83 358.1866 1,68 asetil-lycopsamine N- oksida ( 17) ++ + +++

6 358.1860 4,5 C 17 H 27 HAI 7 N
11.99 358.1869 2,51 mungkin isomer Saya + ++ +++

7 12.50 417.1180 417.1174 - 1,44 11,5 C 21 H 20 HAI 9 eupalestin ( 9) + + +

8 11.87 433.1493 433.1486 - 1,62 10,5 C 22 H 24 HAI 9 5'-methoxynobiletin ( 8) + + +

9 4.83 205.1223 205.1219 - 1,95 5.5 C 13 H 16 HAI 2 demethoxyencecalol ( 4) + + +

10 12.70 235.1329 235.1327 - 0.85 5.5 C 14 H 18 HAI 3 encecalol ( 3) + + +

12 12.66 167.0703 167.0700 - 1.80 4.5 C 9 H 10 O 3 2-hydroxydihydrocinnamic acid ( 11) + + +

13 10.95 163.1117 163.1113 - 2.45 4.5 C 11 H 14 O 2,2-dimethylchromane + - -

14 5.96 223.1329 223.1324 - 2.24 4.5 C 13 H 18 O 3 3,4-dihydroprecocene II - - -

3-hydroxy-5,6,7,8,4,5-
15 10.66 419.1337 419.1336 - 0.24 10.5 C 21 H 22 O 9 + + +
hexamethoxyflavone( 7)

16 11.68 387.1074 387.1065 - 2.32 11.5 C 20 H 18 O 8 linderoflavoneB( 6) + + +

17 7.49 147.0441 147.0437 - 2.72 6.5 C 9 H 6 O 2 coumarin ( 1) + + +

18 12.14 221.1172 221.1169 - 1.36 5.5 C 13 H 16 O 3 precocene II ( 2) - + +

19 11.41 403.1387 403.1392 1.24 10.5 C 21 H 22 O 8 5,6,7,3',4',5'-hexamethoxyflavone + + +

20 10.26 389.1231 389.1239 2.06 10.5 C 20 H 20 O 8 ageconyflavoneC + - -

Commercialsample;Floweringsample;Non-floweringsample.

were commercially available. In this work, we used

H3 C CH 3 H3 C CH 3 onlynon-rhizomatousspecimensforthenon-floweringsample.
OR
9 O CH 3 O CH 3
Indeed, semi-quantitative comparison with the
HO
7 1 floweringandcommercialsamplesshowedthattheiralkaloid
O OHOH O OHOH
2
contents were very similar.
N N
Together with the PA identified by HPLC- HRMS,
12 R=H 14 15 N O thirteen phenolic known compounds were detected in
13 R=H; N O
16 R=Ac the aqueous extract, particularly methoxylated flavonoids and
17 R=Ac; N O
chromenes, together with coumarin and simple phenolics. Table 2
shows the PA distributed in various fractions, similar to the
minor ingredients in the plant. Analysing the data shown
flavonoids after XAD fractionation, which was performed as shown
inTable1,itcanbeclearlyseenthatinthenon-floweringsample, the
in Figure 1. The possible role of these abundant phenolics in the
dihydro and N- oxide forms were predominant, but toxic dehydroPA
medicinal qualities of this plant should also be explored, to
were also present, contrary to the expectation that the plant would only
determine both its beneficial and its adverse effects.
produce these
alkaloidswheninflower,oronlyintheflowers,sequesteredbybutterflies(Hartmann&Ober,2000).Moreover,duetothe
rhizomatous propagation of A. conyzoides, it is very
difficulttoseparatethenon-floweringfromthefloweringspecimens.
Conclusions
Despite the recommendation of Brazilian Health Surveillance Agency
regarding the marketing of
In the present study, hepatotoxic and tumorigenic PA and N- oxidePAwereidentifiedin
thenon-floweringplant,onlysamplescontainingflowers
A. conyzoides. The

Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23 (3): May / Juni 2013 429
Pyrrolizidine alkaloids in medicinal tea of Ageratum conyzoides
Cristiane F. Bosi et al.

Table 2. LC-HRMSdataofcompoundsidentifiedinXADfractionsof Ageratum conyzoides.

Samples
Identification Not retained e
XAD4A a XAD4AG b XAD7A c XAD7AG d

lycopsamine ( 12) + + + + +

dihydrolycopsamine ( 14) + + + + -

acetyl-lycopsamine ( 16) - - - + -

lycopsamine N- oxide ( 13) + + + + +

dihydrolycopsamine N- oxide ( 15) - - - + -

acetyl-lycopsamine N- oxide ( 17) - + + + -

eupalestin ( 9) + + - + +

5'-methoxynobiletin ( 8) + + + + +

demethoxyencecalol ( 4) - - - - -

encecalol ( 3) - - - - -

2-hydroxydihydrocinnamic acid ( 11) + + - - -

2,2-dimethylchromane - - - - -

3,4-dihydroprecocene II - - - + -

3-hydroxy-5,6,7,8,4,5-hexamethoxyflavone( 7) - + + - -

linderoflavoneB( 6) + + + + +

coumarin ( 1) - + + + -

precocene II ( 2) - - - -

5,6,7,3',4',5'-hexamethoxyflavone + + + + +

ageconyflavoneC - + - - -
a XAD-4 aqueous fraction; b XAD-4 aqueous fraction after partition with dichloromethane; c XAD-7 aqueous fraction; d XAD-7 aqueous fraction after partition with ethyl acetate; e Aqueous

extract not retained in XAD.

Figure 2. Total ion chromatogram and extracted peaks obtained for the three analysed samples of Ageratum conyzoides aqueous extract, together with the
respective extracted ion chromatograms (XIC), with several PA detected.

430 Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23(3): May/Jun. 2013

 Pyrrolizidine alkaloids in medicinal tea of Ageratum conyzoides
Cristiane F. Bosi et al.

138.0912
(3.5)
155.0939
(3.0)

138.0909
172.0967
Main product ions m/z ( RDB)

(3.5)
(2.5)
138.0912

174.1121
226.1439
(3.5)

(3.5)

(1.5)

Acknowledgements

The authors are grateful to CNPq, UFSC and

138.0912

274.1647
156.1019

272.1495

CHEMBIOFIGHT (PIRSES-GA-2010-269301) for their

(2.5)
(3.5)
(2.5)

(3.5)

financialsupport.

Author contributions
PA-containing medicinal plants and their use in Brazil.
138.0911

177.0907
300.1802
282.1704

282.1700

298.1647

(3.5)

(5.5)
(3.5)
(3.5)

(4.5)

(4.5)

CFB and DWR harvested, extracted and isolated

compounds. RG
drug. To date, worked
there with
are no XAD resins.
established MH,guidelines
safety MWB andon NL
performed MS experiments. AS contributed to the manuscript. MWB
lycopsamine ( 14)

lycopsamine ( 16)

N- oxide ( 13)

N- oxide ( 15)

N- oxide ( 17)
lycopsamine

lycopsamine
Identification

lycopsamine

supervised the work and wrote the manuscript.

dihydro-

dihydro-
acetyl-

acetyl-
3.5 C 15 H 25 O 5 N lycopsamine ( 12)

toxic PA in plants are necessary, as is monitoring the clinical use of this

References
toxicological studies on A. conyzoides withaccuratequantificationof
Formula

AdebayoH,ZengGZ,ZhangYM,JICJ,AkindahunsiAA,
2.5 C 15 H 27 O 5 N

4.5 C 17 H 27 O 6 N

3.5 C 15 H 25 O 6 N

2.5 C 15 H 27 O 6 N

4.5 C 17 H 27 O 7 N

Tan NH 2010. Toxicological evaluation of precocene II isolated from Ageratum

is 1 ppm (1 mg per gram of plant) (Chen; Huo, 2010). Systematic
conyzoides L.(Asteraceae) in Sprague Dawley rats. Afr J Biotechnol 9: 2938-2944.
ChenZ,HuoJR2010.Hepaticveno-occlusivediseaseassociated
RDB

less than six weeks per year; and in Belgium, the limit for PA in plants
with toxicity of pyrrolizidine alkaloids in herbal preparations. Neth
J Med 68: 252-260. Doorduin LJ, Vrieling K 2011. A review of the
Table 3. HRMS/MS data of major PA found in Ageratum conyzoides aqueous extract.

1.62
2.00

1.32

1.78

1.58

1.26

phytochemical
recommended that daily exposure to PA be no more than 0.1 mg for
support for the shifting defence hypothesis. Phytochem Rev 10: 99-106.
[M+H]+

t R ( min) Theoretical m/z Experimental m/z Delta (ppm)

Edgar JA, Roeder

authorized within E, Molyneux
certain RJIn2002.
limits. Honeyfor
Germany, from plants it is
example,
LC-HRMS analysis

342.19171

358.18658

containing pyrrolizidine alkaloids: a potential threat to health. J Agr

302.1966

316.1760

318.1915
300.1811

Food Chem 50: 2719-2730. Frahn JL, Culvenor CCJ, Mills JA 1980.
a risk of liver damage.
Preparative Inofsome countries, its clinical use is only
separation
the pyrrolizidine alkaloids, intermedine and lycopsamine, as their
borate complexes. J Chromatogr A 195: 379-
harvested in Brazil; chronic exposure to these toxigenic PA can present
383.
358.1860
300.1805

302.1962

316.1755
342.1911

318.1911

FuPP,YangYC,XiaQS,ChouMW,CuiYY,LinG2002.
Pyrrolizidine alkaloids - Tumorigenic components in Chinese herbal
human health, despite the low content of these substances in plants
medicines and dietary supplements. J Food Drug Anal 10: 198-211.
Gerothanassis I, Exarchou V, Lagouri V, Troganis A, Tsimidou
2.90
3.38

3.21
3.75

4.83
11.99
3.05

3.82

4.65

3.36

3.94

of this plant for medicinal preparations could potentially be harmful to

M,BoskouD1998.Methodologyforidentificationof
Compounds

Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23(3): May/Jun. 2013 431 use of extracts
1

6
Pyrrolizidine alkaloids in medicinal tea of Ageratum conyzoides
Cristiane F. Bosi et al.
phenolic acids in complex phenolic mixtures by highresolution
two-dimensional nuclear magnetic resonance. Application to
methanolic extracts of two oregano species. J Agr Food Chem 46: 4185-4192.
GonzlezAG,AguiarZE,GrilloTA,LuisJG,RiveraA,
Calle J 1991. Chromenes from Ageratum conyzoides. Phytochemistry
30: 1137-1139.
Hartmann T, Conner W 2009. Pyrrolizidine alkaloids: the
successful adoption of a plant chemical defense. Tiger moths and
woolly bears. Behavior, ecology and evolution of the Arctiidae, Conner
WE (ed.), Oxford University Press, p. 55-81.
Hartmann T, Ober D 2000. Biosynthesis and metabolism
of pyrrolizidine alkaloids in plants and specialized insect
herbivores. Biosynthesis: Aromatic Polyketides, Isoprenoids,
Alkaloids, Springer Berlin Heidelberg: p. 207-243.
Herz W, Govindan SV, Riess-Maurer I, Kreil B, Wagner H, Farkas
L, Strelisky J 1980. Isolation and synthesis of two new flavonesfrom Conoclinium Fitoterapia 73: 1-16.
coelestinum. Phytochemistry 19: 669-672.
Herz W, Kulanthaivel P 1982. Flavones from Eupatorium
leucolepis. Phytochemistry 21: 2363-2366. Kohler JC,
Baghdadi-Sabeti G 2011. The World Medicines
Situation 2011, 3rd Ed, World Health Organization. Kongduang D,
Wungsintaweekul J, De-Eknamkul W 2008.
Biosynthesisof-sitosterolandstigmasterolproceedsexclusively via
the mevalonate pathway in cell suspension cultures of Croton
stellatopilosus. Tetrahedron Lett 49:
4067-4072.
Kupriyanova G 1997. NMR studies of the electronic structure of
coumarins. J Struct Chem+ 38: 408-414.
Le-VanN,VanCuongPhamT1979.Twonewflavonesfrom 88040-900 Florianpolis-SC, Brazil maique@ccs.ufsc.br Tel./Fax:+
Eupatorium coelestinum. Phytochemistry 18: 1859-
1861.
432 Rev. Bras. Farmacogn. Braz. J. Pharmacogn. 23(3): May/Jun. 2013
Li N, Xia Q, Ruan J, Fu PP, Lin G 2011. Hepatotoxicity and
tumorigenicity induced by metabolic activation of pyrrolizidine
alkaloids in herbs. Curr Drug Metab 12:
823-834.
Lorenzi H, Matos FJA 2008. Plantas medicinais no Brasil
- Nativas e exticas. 2 ed. Nova Odessa: Instituto Plantarum.
Moazzami AA, Andersson RE, Kamal-Eldin A 2007. Quantitative
NMR analysis of a sesamin catechol metabolite in human urine. J Nutr
137: 940-944.
Molyneux RJ, Gardner DL, Colegate SM, Edgar JA 2011.
Pyrrolizidine alkaloid toxicity in livestock: a paradigm for human
poisoning? Food Addit Contam A 28: 293-
307.
MroczekT,WidelskiJ,GowniakK2006.Optimizationof
extraction of pyrrolizidine alkaloids from plant material.
Chem Anal-Warsaw 51: 567-580. Okunade AL 2002. Ageratum
conyzoides L. (Asteraceae).
Saxena V, Shrivastava P 1994. 4'-hydroxy-3, 6-dimethoxy-6'',
6''-dimethylchromeno(7,8,2'',3'')flavonefrom Citrus reticulata cv
blanco. Phytochemistry 36: 1039-1041. Wiedenfeld H 2011. Plants
containing pyrrolizidine alkaloids:
toxicity and problems. Food Addit Contam A 28: 282-
292.
Wiedenfeld H, Roder E 1991. Pyrrolizidine alkaloids from
Ageratum conyzoides. Planta Med 57: 578-579.
* Correspondence
Maique Weber Biavatti
CIF/CCS, Universidade Federal de Santa Catarina Campus Trindade,
55 48 3721 5075/9542