Manual de Prácticas de Microbiologia de Alimentos

DIVISIN DE INGENIERA EN SISTEMAS COMPUTACIONALES
Manual de prcticas de Microbiologa de Alimentos
MANUAL DE
PRCTICAS DE
MICROBIOLOGA DE
ALIMENTOS
INGENIERIA EN UNDUSTRIAS
ALIMENTARIAS
Instituto Tecnolgico Superior del

Occidente del Estado de Hidalgo
1
Autora:
Q.B.P. Elda Prez Ortiz

Docente de Ingeniera en Industrias Alimentarias
Instituto Tecnolgico Superior del Occidente del Estado de Hidalgo
2
Contenido
PRACTICA No. 1 .............................................................................................................................. 4
RECUENTO DE ORGANISMOS INDICADORES .................................................................. 4
PRACTICA No. 2 ............................................................................................................................ 12
DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y
Escherichia coli POR LA TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MLTIPLE (NMERO
MS PROBABLE O NMP) ........................................................................................................ 12
PRACTICA No. 3 ............................................................................................................................ 19
RECUENTO DE ORGANISMOS ENTEROCOCOS ............................................................. 19
PRACTICA No. 4 ................................................................................Error! Bookmark not defined.
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUA POTABLE Y HIELO ........... Error! Bookmark not
defined.
PRACTICA No. 5 ............................................................................................................................ 23
IDENTIFICACIN DE Salmonella EN ALIMENTOS ............................................................ 23
PRACTICA No. 6 ............................................................................................................................ 33
RECUENTO DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS................................................. 33
3
PRACTICA No. 1
RECUENTO DE ORGANISMOS INDICADORES
OBJETIVOS
Identificar a los organismos mesofilicos aerobios, coliformes totales y hongos y
levaduras como indicadores
Emplear las tcnicas de las NOM-092-SSA1-1994, NOM-113-SSA1-1994, NOM-
111-SSA1-1994, para su recuento.
Identificar las caractersticas generales de estos microrganismos como grupo
indicador en alimentos
Interpretar la presencia de estos microorganismos como grupo indicador en
alimentos
Conocer el significado sanitario de un nmero elevado de estos organismos en los
alimentos
MARCO TERICO
Mesfilos aerobios (o cuenta total)

Esta determinacin indica el grado de contaminacin de una muestra y las condiciones que
han favorecido o reducido la carga microbiana. Desde luego, no se aplica a alimentos
fermentados, y puede dar escasa informacin sobre el manejo del alimento cuando ste es
poco favorable para el desarrollo microbiano por su pH aw, por ejemplo. Este grupo es un
indicador importante en alimentos frescos, refrigerados y congelados, en lcteos y en
alimentos listos para consumir (RTE por sus siglas en ingls: ready to eat).
Se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas
vertidas de agar triptona glucosa extracto o agar cuenta estndar.
Las placas se incuban en condiciones de aerobiosis, a 35 C durante 24 a 48 horas. Es
importante aplicar las reglas para el recuento, de la NOM-092-SSA1-1994. Bienes y
Servicios. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa
4
Coliformes totales
Las bacterias del grupo coliforme se definen como: bacilos cortos, Gramnegativos,
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa a 35 C, en menos de 48
h, con produccin de cido y gas. Incluye los gneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella
y Citrobacter. Durante mucho tiempo se consideraron evidencia de contaminacin fecal,
pero se ha demostrado que muchos de ellos pueden vivir e incluso crecer en el suelo, el
agua y otros ambientes. Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia
de los procesos de sanitizacin y desinfeccin, as como de calidad sanitaria en agua,
vegetales y diversos productos procesados.
Tambin se pueden detectar por cuenta en placa utilizando agar bilis-rojo violeta (ABRV
RVBA por sus siglas en ingls) en el cual las colonias fermentadoras de lactosa causan el
vire del indicador; pueden detectarse por filtracin en membrana (Millipore) e incubacin en
medios adecuados, por mtodos rpidos como Petrifilm y reacciones cromognicas o
fluorognicas.
Hongos y levaduras
Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, por lo
que son frecuentes en la microbiota habitual de muchos alimentos; se dispersan fcilmente
por el aire y el polvo. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin
de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin.
Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se
manifiestan en los alimentos donde las condiciones no favorecen el crecimiento bacteriano,
por ejemplo: pH cido, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja
temperatura de almacenamiento, presencia de antibiticos u otros antibacterianos. Como
grupo indicador son tiles para evidenciar grado general de contaminacin en alimentos
con estas caractersticas o cuando los mesfilos aerobios no son tiles, como en alimentos
fermentados. Tambin son indicadores del riesgo de desarrollo de hongos toxignicos en
alimentos como frutos secos, especias, cereales y otros granos, y sus derivados.
Se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas
vertidas de papa dextrosa agar (PDA) y agar extracto de malta (AEM) acidificados con cido
tartrico, para favorecer a los hongos y levaduras e inhibir bacterias (NOM-111-SSA1-1994.
5
Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos). En algunos

casos, se utilizan antibiticos para hacer ms selectivo el medio de cultivo.
MATERIAL Y EQUIPO
Por grupo
1 Incubadora
4 Esptulas
1 Balanza analtica
1 Stomacher
1 Autoclave con dos canastillas
Agua destilada
Medios de cultivo
Por mesa
1 Matraz Erlenmeyer con 250 ml con 145 ml de agar mtodos estndar
1 Matraz Erlenmeyer con 250 ml con 145 ml agar PDA y agar RVBA
1 Matraz Erlenmeyer con 250 ml con 145 ml de agar RVBA
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml con 90 ml de agua peptonada estril
5 Tubos de ensayo con tapn de baquelita con 9 ml de agua peptonada estril
1 Bolsa para stomacher
4 Mecheros Fisher
1 Balanza granatara
1 Parrilla elctrica
1 Cuenta colonias
4 Agitadores de vidrio
Placas Petri desechables
2 Probetas de 100 ml
6
METODOLOGA
1. Sesin
RECUENTO DE MESOFILICOS AEROBIOS
1. Preparacin de la muestra de acuerdo a la NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y
dilucin de muestras de Alimentos para su anlisis Microbiolgicos
2. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la
adicin de medio de cultivo y homogenizacin, se puedan realizar cmoda y
libremente. Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a
su inoculacin y correr por duplicado.
3. Inocular 1ml de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6, en las cajas Petri previamente
rotuladas
4. Adicionar 15 a 20 ml de Agar mtodos estndar fundido y mantenido a 45C en un
bao de agua.
5. Homogeneizar el inoculo mezclndolo mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de
atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de
las cajas. Dejar solidificar.
6. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como
testigo de esterilidad.
7. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente
hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder
de 20 minutos.
8. Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo), a 352C durante 24 a
48 h.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

7
3. Inocular 1ml de las diluciones 10-2, 10-3, 10-4, en las cajas Petri previamente
rotuladas
4. Adicionar 15 a 16 ml de Agar Rojo violeta bilis fundido y mantenido a 45C en un
bao de agua.
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las
cajas. Dejar solidificar.
7. Despus de que est el medio completamente solidificado en la caja, verter
aproximadamente 4 ml del medio RVBA a 45 1,0C en la superficie del medio
inoculado. Dejar que solidifique. El tiempo transcurrido desde el momento en que la
muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de
cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
8. Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo), a 352C durante 242
hrs.
RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS

3. Inocular 1ml de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, en las cajas Petri previamente
rotuladas
8
4. Adicionar 15 a 16 ml de Agar Papa Dextrosa acidificado con cido tartrico al 10%

hasta pH 3 (aproximadamente 1.5 ml por 100 ml de medio), fundido y mantenido a
45C en un bao de agua. Ya acidificado el medio no debe reutilizarse.
incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de
las cajas. Dejar solidificar.
7. Incubar las cajas una serie de placas a 252C durante 5 das y la otra serie a
352C durante 48 horas.
8. Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer los recuentos correspondientes. En
caso de que no haya crecimiento de hongos continuar la incubacin hasta los 5 das.
9.
2. Sesin
RECUENTO DE MESOFILICOS AEROBIOS
1. Despus del periodo especificado para la incubacin, contar las colonias con el
contador de colonias.
2. Seleccionar las placas que contengan entre 25 y 250 colonias.
RECUENTO DE COLIFORMES TOTALES EN PLACA

1. Despus del periodo especificado para la incubacin, contar las colonias con el
contador de colonias.
2. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas
son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de
precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la
morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0,5 a 2,0
mm
RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS
9
1. Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer los recuentos correspondientes. En

caso de que no haya crecimiento de hongos continuar la incubacin hasta los 5 das.
Contar las colonias de hongos en la serie incubada a 252C.
Contar las colonias de levaduras en la serie incubada a 252C y en la incubada a
352C
2. Multiplicar por la inversa de la dilucin e informar Unidades formadoras de colonias
de hongos (UFC/g o ml) en placas de agar papa dextrosa acidificado, incubadas a
252C durante 5 das.
Unidades formadoras de colonias de levaduras (UFC/g o ml) en placas de agar papa
dextrosa acidificado, incubadas a 352C durante 48 horas.
RESULTADOS Y OBSERVACIONES
Incluir fotografas
Muestra:
Dilucin: 10-4 10-5 10-6 UFC/g o ml
48h
ANLISIS E INTERPRETACIN DE RESULTADOS

CONCLUSIN
REFERENCIAS
Manual de Microbiologa Sanitaria, ENCB, IPN
Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Preparacin y dilucin de muestras de
Alimentos para su anlisis Microbiolgicos
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, bienes y servicios. Mtodo para la cuenta
de bacterias aerobias en placa.
10

de coliformes totales en placa.
de mohos y levaduras en placa.
11
PRACTICA No. 2
DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y

Escherichia coli POR LA TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MLTIPLE (NMERO
MS PROBABLE O NMP)
OBJETIVO
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda
de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes
fecales.
Organizar e interpretar los resultados.
MARCO TERICO
La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms
Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la
lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C1C durante 48 h, utilizando un
medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la
fase presuntiva y la fase confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el
cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes
en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante
la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante
el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se
realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la
capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados
a una temperatura de 44.50.1C por un periodo de 24 a 48 h.
Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de
caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
12
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas
bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.
MATERIALES Y REACTIVOS
Por grupo
1 Incubadora
1 Stomacher
1 Autoclave
Reactivo de Kovac o Erlich
Medios de cultivo
Nota: para preparar el agua peptonada. Peptona 1g, NaCl 8.5g, Agua 1l
Por equipo
1 Matraz Erlenmeyer de 125 ml con 90 ml de agua peptonada estril
5 Tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de baquelita con 9 ml de agua peptonada
estril
5 Tubos de 16 x 150 con tapn de rosca con 10 ml de caldo lactosado o caldo lauril
sulfato triptosa con campana de durham
5 Tubos de 16 x 150 con tapn de rosca con 10 ml de caldo verde brillante bilis al 2%
con campana de durham
5 Tubos de 16 x 150 con tapn de rosca con 10 ml de caldo EC con campana de
durham
4 Placas con Agar Eosina Azul de Metileno
2 Tubos con caldo triptona
2 Tubos con caldo rojo de metilo-voges proskauer
2 Tubos con medio Citrato de Simmons
Alcohol al 70%
1 Parrilla Elctrica
4 Mecheros
2 Probetas de 100 ml
13
Nota: para preparar el agua peptonada. Peptona 1g, NaCl 8.5g, Agua 1l
METODOLOGA
1. Sesin
Prueba presuntiva. Coliformes Totales

1. Inocular con 1ml de cada dilucin en cada uno de los tres tubos con 10ml de caldo
lactosado o caldo lauril sulfato triptosa
2. Incubar los tubos a 352C. Examinar a las 24 2h
2. Sesin
1. Observar si hay formacin de gas en la campana de fermentacin, si no la hay,

continuar incubando hasta las 482h.
La presencia de gas en cualquier cantidad, dentro del periodo de incubacin hace
positiva la prueba.
Prueba confirmatoria para coliformes totales

1. Agitar suavemente los tubos que resultaron positivos en la prueba presuntiva
2. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo en un nmero igual de tubos con
caldo lactosa verde brillante bilis al 2%
3. Incubar a 352C por 242h,
Prueba confirmatoria para Coliformes fecales

1. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido de la prueba presuntiva
de la determinacin de coliformes totales a tubos con caldo EC.
2. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin.
3. Incubar a 44.5 0.1C durante 24 a 48 h.
14
3. Sesin
Coliformes totales
1. Considerar la prueba positiva si hay turbidez y formacin de gas en cualquier
cantidad. Si no se observa presencia de gas en la campana de fermentacin
prolongar la incubacin por 482h.
2. Determinar el nmero de organismos coliformes de acuerdo con la tabla
correspondiente, tomando como base el nmero de tubos en que se observe
produccin de gas
Coliformes fecales
1. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
2. Consultar la tabla de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes fecales/ 100 ml
Prueba confirmatoria para Escherichia coli

1. Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos de caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
2. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
4. Sesin
1. Transcurrido el tiempo de incubacin revisar las placas y seleccionar dos colonias
de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro,
planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una
o ms colonias lo ms parecido a E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta
estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas
bioqumicas.
Identificacin de Escherichia coli

A partir de las cajas de agar cuenta estndar, seleccionar una colonia para realizar la
confirmacin.
Morfologa microscpica
15
1. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos

cortos o cocobacilos Gram-negativos
Pruebas bioqumicas IMViC
1. Transferir con el asa bacteriolgica una la colonia a probar en 2 ml de solucin
salina isotnica para realizar las siguientes pruebas bioqumicas.
a. Produccin de indol (I)
1. Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con caldo triptona,
incubarlo a 35C por 24 2 h.
2. Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 ml de reactivo de Kovacs o Ehrlich.
3. La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera como
prueba positiva para la presencia de indol.
b. Produccin de cidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)
1. Tomar una azada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h.
2. Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
3. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
1. Tomar una azada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga
caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h.
2. Finalizada la incubacin, adicionar 0.6 ml de solucin KOH 40% (VP1), agitar y 0.2
ml de solucin alfa- naftol (VP2) y agitar.
3. Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilizacin del citrato (C)

1. Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo de agar citrato de
Simmons
2. Incubar a 35C de 24 a 48 h
3. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el
medio, indica prueba positiva
5. Sesin
16
a. Produccin de indol (I)

1. Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 ml de reactivo de Kovacs o Ehrlich.
2. La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera como
prueba positiva para la presencia de indol.
b. Produccin de cidos mixtos (o prueba de rojo de metilo, RM)

1. Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
2. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Color amarillo
es una prueba negativa.
c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

1. Finalizada la incubacin, adicionar 0.6 ml de solucin KOH 40% (VP1), agitar y 0.2
ml de solucin alfa- naftol (VP2) y agitar.
2. Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilizacin del citrato (C)

1. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el
medio, indica prueba positiva
OBSERVACIONES Y RESULTADOS
Incluir fotografas
Muestra:
UFC/g o ml
O.C. en placa
O.C. (NMP)
OCF (NMP
17
Morfologa colonial Microorganismo

presuntamente
identificado
EMB
Pruebas bioqumicas
Indol
RM
VP
Citrato de
Simmnons
Microorganismo
identificado
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero
ms probable, deteccin de coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli por
el nmero ms probable
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-112-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS.
DETERMINACIN DE BACTERIAS COLIFORMES. TCNICA DEL NMERO MS
PROBABLE.
18
PRACTICA No. 3
RECUENTO DE ORGANISMOS ENTEROCOCOS
OBJETIVO
Efectuar la tcnica para el recuento de organismos enterococos a partir de
alimentos.
Identificar el significado sanitario de la presencia de este grupo microbiano en agua
y alimentos
MARCO TERICO
Por grupo
Alcohol al 70%
TTC
Reactivos para tincin de Gram (Cristal violeta, Lugol, Alcohol-Acetona,
Safranina)
Aceite de inmersin
1 Incubadora
1 Stomacher
1 Autoclave
Por equipo
1 Balanza Granataria
1 Cuenta colonias
1 Puente de tincin
1 Parrilla Elctrica
4 Mecheros
1 Microscopio
3 Portaobjetos
19
1 Gradilla
1 Asa de platino o nicromel de aproximadamente 3mm de dimetro
Agua oxigenada
1 Frasco para toma de muestra de 100 ml con 90 ml de agua peptonada esteril
5 Tubos de ensaye con tapn de baquelita de 16 x 150 con agua peptonada estriles
1 Matraz Erlenmeyer de 250 ml con tap de baquelita con 180 ml de agar KF
2 Tubos con Caldo BHI con NaCl al 6.5 %
2 Tubos de Caldo BHI
2 Tubos de Agar Bilis Esculina
METODOLOGA
1 Sesin
1. Pesar 10g de muestra en una bolsa para stomacher
2. Agregar 90 ml de agua peptonada y colocar en el homogeneizador peristltico
durante 1 minuto a velocidad media.
3. Realizar diluciones decimales hasta 10-4
4. Inocular 1 ml de cada dilucin en una caja Petri
5. Vaciar 20 a 25 ml de medio KF estreptoccico adicionado con TTC al 1% fundido y
enfriado a 45C
6. Realizar por duplicado cada una de las diluciones y adicionar una placa testigo
7. Homogeneizar, dejar solidificar
8. Incubar las placas por 483 h a 352C
2. Sesin
1. Contar las colonias que presenten coloracin rosa intenso a rojo
2. Seleccionar 5 a 10 colonias caractersticas y transferir a caldo BHI
3. Incubar a 352C de 18 a 24 h
3. Sesin
Pruebas confirmatorias
1. Preparar frotis para realizar tincin de Gram. Cocos gram positivos
2. Prueba de Catalasa. Reaccin negativa
20
3. Sembrar en agar Bilis Esculina. Incubar a 352C de 24 h

4. Sembrar en caldo BHI con NaCl al 6.5%. Incubar a 352C durante 723 h
5. Sembrar en caldo BHI. Incubar a 45C durante 242 h
4. Sesin
1. Revisar resultados de pruebas confirmatorias
RESULTADOS
Incluir fotografas
CUADRO DE RESULTADOS
Muestra
UFC/g
Morfologa Colonial
Morfologa Microscpica
Catalasa
Agar Bilis Esculina
BHI 6.5%
BHI 45C
21
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
22
PRACTICA No. 4
IDENTIFICACIN DE Salmonella EN ALIMENTOS
OBJETIVO
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de alimentos mediante la tcnica de la
NOM-115-SSA1-1994 Identificacin de Salmonella en alimentos
MARCO TERICO
Salmonella es una bacteria gramnegativa, anaerbica facultativa. Todas las Salmonellas se
consideran patgenas para el hombre causando salmonelosis, o gatroenteritis por
Salmnonella. Todas las especies de Samonella son fcilmente destruidas a la temperatura
de pasteurizacin de la leche, y son bastante sensibles a la radiacin ionizante.
El principal hbitat de las especies de Salmonella es el tracto es el tracto intestinal de
animales como reptiles, aves, animales de granja y personas. Como formas intestinales,
son excretadas en heces y son diseminados en el ambiente, pudindose encontrar en agua,
especialmente en agua contaminada.
Los huevos y ovoproductos, la carne de pollo y pavo, la carne de vaca, la carne de cerdo,
la leche y los helados, son los alimentos que con mayor frecuencia se ven asociados en
brotes de salmonelosis humana. La contaminacin secundaria es tambin origen
importante de casos de Salmonella, a travs de los manipuladores y del contacto directo
entre alimentos contaminados y no contaminados, S. typhimurium es la serovariedad de
origen alimentario que se encuentra con mayor frecuencia en todo el mundo, aunque han
comenzado a incrementarse los casos de S. enteritidis de forma considerable,
especialmente en casos asociados a huevos y carne de ave.
Por grupo
Alcohol al 70%
20 ml KOH 10%
23
20 ml Reactivo de Kovacs o Erlich

1 Incubadora
1 Stomacher
3 Pipetas de 10 ml
1 Autoclave
Por equipo
1 Matraz Erlenmeyer con tapn de rosca de 250 ml con 125 ml de caldo lactosado
1 Tubo con tapn de rosca de 16 x 150 con 10 ml de caldo tetrationato
1 Tubo con tapn de rosca de 16 x 150 con 10 ml de caldo selenito
2 Placas Petri con 25 ml de agar Entrico de Hektoen
2 Placas Petri con 25 ml de agar Verde Brillante
2 Placas Petri con 25 ml de agar Sulfito de bismuto
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar TSI
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar LIA
2 Tubos con tapn de rosca con 5ml de agar Citrato de Simmnons
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar SIM
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar MIO
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de caldo urea
2 Tubos con
2 Tubos con caldo RM-VP
1 Placa multipruebas API 20E
1 Probeta
3 Pipetas de 10 ml
1 Parrilla Elctrica
4 Mecheros
1 Balanza granatara
1 Gradilla
METODOLOGA
24
1. Sesin
1. Pesar aspticamente 25 g de la muestra en una bolsa estril
2. Adicionar 225 ml del medio de preenriquecimiento estril (caldo lactosado), colocar
la bolsa en el homogeneizador peristltico (stomacher), homogeneizar por un
periodo de 1 a 2 minutos a una velocidad media
3. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un matraz Erlenmeyer estril
de boca ancha con tapn de rosca
4. Incubar a 35C durante 24 hrs.
2. Sesin
1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de
preenriquecimiento y agitar suavemente, transferir respectivamente 1 ml de la
mezcla a un tubo que contenga 10 ml de caldo tetrationato y a otro con 10 ml de
caldo selenito cistina.
2. Incubar de 18 a 24 h a 35C, para alimentos fuertemente contaminados a 42C por
el mismo periodo.
3. Sesin
1. Mezclar el tubo con caldo selenito cistina y estriar en agar xilosa lisina desoxicolato
(XLD), agar verde brillante (VB) y una tercera caja con cualquiera de los medios
selectivos adicionales (agar entrico Hektoen, agar Sulfito de Bismuto o Agar SS).
2. Efectuar el mismo procedimiento para el caldo tetrationato.
3. Incubar las placas 242 h a 35C.
4 Sesin
1. Examinar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella,
de acuerdo con las siguientes caractersticas:
a) Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin
centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer
completamente negras
25
b) .Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por
medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias
amarillas.
c) Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro.
En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.
d) Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs,
grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante
(halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen
colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran
colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.
e) Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias
dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.
Identificacin bioqumica
1. Seleccionar al menos dos colonias tpicas de cada medio selectivo, que se
encuentren bien aisladas.
2. Tocar levemente el centro de cada colonia que se sospecha son de Salmonella e
inocular dos tubos, uno con agar triple azcar hierro (TSI) y otro con agar hierro
lisina (LIA), por estra en la superficie inclinada y por puncin en el fondo.
3. Incubar por 242 h a 35C.
4. Almacenar en refrigeracin de 5C las placas con medios selectivos por si es
necesario retomar ms colonias.
5. Sesin y 6 Sesin
1. Observar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para
Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones:
a) Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la
fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color
rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la
lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin
negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico.
26
b) Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la
descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que
produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las
cepas de Salmonella producen cido sulfihdrico en este medio con
ennegrecimiento a lo largo de la puncin.
c) Prueba de ureasa. Con un asa estril, tomar crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de
caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las
reacciones positivas con el color del medio original.
2. Incubar por 24 h, a 35C
d) Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo
presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de
caldo urea (rpida). Incubar 2 h a 370.5C en bao de agua. Descartar
todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la
prueba negativa (sin cambio de color del medio).
3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de
Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales
4. Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones
en LIA tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos
casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella
que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren
reacciones atpicas en ambos medios.
Identificacin serolgica
Ensayo de los antgenos somticos de Salmonella (Antisuero polivalente O)
1. Colocar con un asa dos gotas separadas de solucin salina estril sobre un
portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. Suspender en
cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI.
2. Agregar a una de ellas una gota del antisuero polivalente somtico (O) y mezclar
con el canto del asa o empleando aplicadores de madera.
3. Agitar inclinando la lmina hacia atrs y hacia adelante durante aproximadamente
un min. Observar bajo buena iluminacin sobre un fondo oscuro.
27
4. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. La prueba positiva

resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no
aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina.
5. Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe
continuar con las pruebas bioqumicas complementarias.
6. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse
el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C,
D y E, suelen ser los ms frecuentes).
7. Si la aglutinacin con el antisuero O es negativa, utilizar antisuero Vi y efectuar la
prueba. Si hay aglutinacin con Vi calentar el cultivo a ebullicin y repetir la
aglutinacin con el antisuero polivalente O.
Ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H).

1. Inocular el crecimiento del tubo de TSI en agar infusin de cerebro corazn e
incubar de 4 a 6 h a 35C hasta que se observe crecimiento (para ensayo en el
mismo da), o bien, en caldo soya tripticaseina e incubar por 242 h a 35C (para
ensayo al da siguiente).
2. Adicionar 2,5 ml de solucin salina formalizada a 5 ml del cultivo en caldo o al
cultivo en agar cerebro corazn (BHI).
3. Colocar 0,5 ml del antisuero polivalente flagelar (H) preparado en un tubo para
serologa (13 x 100 mm aproximadamente).
4. Adicionar 0,5 ml del cultivo formalizado. Preparar un control de solucin salina
mezclando 0,5 ml de solucin salina formalizada con 0,5 ml del antgeno
formalizado.
5. Incubar las mezclas en bao de agua a 48-50C. Observar a intervalos de 15 min
por espacio de 1 h. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la
mezcla de prueba pero no en el control. Debe interpretarse como negativa una
prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. Cuando ambas
mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica.
Pruebas Bioqumicas complementarias
28
Cuando las pruebas serolgicas o bioqumicas iniciales, dan resultados atpicos o no

concluyentes, realizar las pruebas que se describen a continuacin:
Inocular los cultivos positivos provenientes de TSI y LIA en: medio SIM, agar citrato de
Simmons, caldo manitol y caldo RM-VP. Usar caldo malonato para confirmar la presencia
de la especie S. arizonae.
a) Agar citrato Simmons. Inocular por estra el tubo. Incubar 962 h a 35
2C.
Prueba positiva: crecimiento acompaado de un cambio de color de verde
a azul.
Prueba negativa: ausencia de crecimiento y sin cambio de color.
b) Medio SIM. Inocular por puncin. Incubar 24 h a 352C.
Movilidad.
Prueba positiva: crecimiento a lo largo de la puncin y en el seno del medio de
cultivo.
Prueba negativa: crecimiento a lo largo de la puncin exclusivamente.
Produccin de cido sulfihdrico.
Prueba positiva: desarrollo de un color negro a lo largo de la puncin que
puede extenderse a todo el medio.
Prueba negativa: ausencia de color negro.
Produccin de indol
Adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento, de 0,2 a 0,3 ml de
reactivo de Kovac.
Prueba positiva: desarrollo de un anillo de color rojo.
Prueba negativa: sin cambio de color.
c) Caldo RM-VP. Inocular un tubo con el medio. Incubar 482 h a 352C
para la prueba de VP y 96 h para la prueba RM.
Prueba de Voges-Proskauer (VP). Transferir a un tubo un ml del
cultivo de 48 h. Adicionar 0,6 ml de solucin de alfa naftol. Adicionar
0,2 ml de solucin de hidrxido de potasio 40%. Adicionar algunos
cristales de creatinina (opcional). Interpretar los resultados despus
de incubar 2 h a 352C o 4 h a temperatura ambiente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo ladrillo.
29

Reincubar el resto del medio RM-VP 48 h ms a 352C.
Prueba de rojo de metilo (RM). Adicionar al medio de cultivo de 96 h
de incubacin de dos a tres gotas de solucin de rojo de metilo.
Interpretar los resultados inmediatamente.
Prueba positiva: desarrollo de color rojo.
Prueba negativa: desarrollo de color amarillo.
d) Caldo malonato. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 402 h a
352C.
Prueba positiva: desarrollo de color azul.
e) Caldo manitol. Inocular un tubo conteniendo el medio. Incubar 242 h a
352C.
Prueba positiva: desarrollo de color amarillo.
Nota: los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden ser usados como
alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales.
RESULTADOS
Incluir fotografas
Prueba o sustrato Salmonella

Urea -
Lisina descarboxilasa +
Malonato -
Indol -
Lactosa -
Movilidad +
H2S en TSI +
VP -
Citrato de Simmons +
30
Manitol +
Glucosa +
Muestra
Colonias sospechosas provenientes de

Caldo selenito-cistina Caldo tetrationato
Colonia seleccionadas del agar selectivo

Colonia 1: Colonia 2:
Morfologa colonial
LIA LIA
TSI TSI
Citrato de Citrato de
Simmnons
Simmons
Urea Urea
Malonato Malonato
H2S H2S
31
Indol Indol
Movilidad Movilidad
V-P V-P
RM RM
Serologa Serologa
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO
PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.
32
PRACTICA No. 5
RECUENTO DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS
OBJETIVO
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de alimentos mediante la tcnica de la
NOM-114-SSA1-1994 Recuento de Staphylococcus aureus en alimentos
Determinar el riesgo potencial de los alimentos analizados en relacin a su
contenido de Staphylococcus aureus
MARCO TERICO
El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse
de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa
intoxicaciones alimentarias.
Entre las razones para determinar el Staphylococcus aureus en alimentos estn:
Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de una enfermedad de
origen alimentario.
Determinar si un alimento o ingrediente es fuente potencial de este microorganismo
enterotoxignico.
Demostrar la contaminacin postproceso la cual es usualmente debida a contacto humano
o con superficies inadecuadamente sanitizadas.
Los alimentos sujetos a contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de
Staphylococcus aureus representan un riesgo por la ausencia de flora competitiva que
normalmente restringe el crecimiento del Staphylococcus aureus y la produccin de
enterotoxinas.
Este tipo de alimentos se vuelven ms peligrosos, si adems son sujetos a un inadecuado

manejo o son mantenidos a temperaturas de conservacin inapropiadas.
Los alimentos perecederos tales como: carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos
de pastelera y productos de leche, son los ms comnmente asociados con intoxicacin
estafilocccica.
33
Por grupo
Alcohol al 70%
1 Incubadora
1 Stomacher
1 Autoclave
Por equipo
6 Tubo con tapn de rosca de 16 x 150 con 10 ml de caldo tetrationato
1 Frasco para toma de muestra con 90 ml de agua peptonada estril
3 Tubo con tapn de rosca de 16 x 150 con 9 ml de agua peptonada estril
2 Placas Petri con 25 ml de agar Entrico de Hektoen
2 Placas Petri con 25 ml de agar Verde Brillante
2 Placas Petri con 25 ml de agar Sulfito de bismuto
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar TSI
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar LIA
2 Tubos con tapn de rosca con 5ml de agar Citrato de Simmnons
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar SIM
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de agar MIO
2 Tubos con tapn de rosca con 5 ml de caldo urea
2 Tubos con
2 Tubos con caldo RM-VP
1 Placa multipruebas API 20E
1 Probeta
3 Pipetas de 10 ml
1 Parrilla Elctrica
4 Mecheros
1 Balanza granatara
1 Gradilla
34
METODOLOGA
1. Sesin
2. Distribuir sobre la mesa las placas ya marcadas con la dilucin correspondiente con
Agar Baird Parker
3. Empleando pipeta automtica de 0.1ml, depositar el inoculo sobre la superficie del
agar
4. Distribuir el inoculo sobre la superficie del agar con varillas de vidrio estriles
dobladas en ngulo recto, empleando una varilla para cada placa
5. Mantener las placas en su posicin hasta que el inoculo sea absorbido totalmente
por el agar
6. Invertir las placar e incubar de 24 a 28 hrs a 352C
2. Sesin
1. Transcurrido el tiempo de incubacin, seleccionar las placas que tengan entre 20 a
200 colonias aisladas, contar y marcar las colonias negras, brillantes con o sin
ligeros bordes blancos y rodeadas por una zona clara en el fondo del medio opaco.
2. Incubar las placas 24hrs ms e incluir en el conteo las nuevas colonias que tengan
las caractersticas mencionadas.
3. Sesin
1. Elegir la placa que contenga entre 50-150 colonias tpicas, sembrar cada una de
acuerdo al siguiente cuadro
No. de colonias sospechosas Colonias por probar
Menos de 50 3
51-100 5
101-150 7
2. Transferir cada colonia por duplicado en tubos con caldo BHI

3. Incubar a 352C durante 18-24hrs
35
4. A las colonias seleccionadas realizar un frotis, y teirlo con la tcnica de Gram
4 Sesin
Prueba de coagulasa
1. A cada tubo con 0.2ml de caldo BHI y con crecimiento de cada
5. Sesin y 6 Sesin
RESULTADOS
Incluir fotografas
Muestra
Colonias sospechosas provenientes de

Caldo selenito-cistina Caldo tetrationato
Colonia seleccionadas del agar selectivo
LIA LIA
TSI TSI
Citrato de Citrato de
Simmnons
Simmons
Urea Urea
Serologa Serologa
CONCLUSIONES
REFERENCIAS
36
NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO

PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.
37

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