Alat HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) Sebagai Alat Modern
Dalam Kromatografi
Hal yang menarik pada alat HPLC
adalah kecepatan, ketelitian dan
kemampuannya memisah-misahkan suatu
campuran yang kompleks. Campuran yang
dapat dipisah-pisahkan, meliputi molekul-
molekul, senyawa-senyawa ionik,
senyawa-senyawa yang tak stabil (yang
jika diuapkan akan mengalami peruraian)
dan juga senyawa-senyawa dengan massa
rumus besar. Termasuk contoh dari
senyawa-senyawa tersebut antara lain
asam-asam amino, asam nukleat,
hidrokarbon, karbohidrat, pestisida,
steroid, antibiotik danjuga senyaqa-
senyawa anorganik.
Pada rangkaian alat HPLC, bagian
alat yang memegang peran yang sangat
penting adalah kolom. Setalah sampel
terpisah-pisah dan kelaur dari kolom,
maka komponen sampel akan masuk ke
dalam suatu detektor. Detektor akan
mengukur kadar masing-masing
komponen yang responnya akan diolah
oleh prosesor dan ditampilkan oleh
rekorder berupa suatu kromatogram.
HPLC Merk Shimadzu seri LC-6A
merupakan HPLC yang memiliki
komponen-komponen yang lengkap,
dioperasikan dengan suatu sistem kontrol
yang mengendalikan semua komponen,
pompa, oven kolom, sistem injeksi,
detektor, prosessor dan printer. HPLC ini
mempunyai injektor yang dapat bekerja
secara otomatis, dapat menginjeksikan
sampel sampai 100 sampel secara
otomatis. Jika semua parameter sudah di
set, solvent (phase gerak) sudah disiapkan
cukup, alat ini dapat melakukan analisis
sendiri, hasilnya akan muncul dalam
kromatogram termasuk perhitung luas
masing-masing puncak kromatogram.
Prinsip Kerja
Prinsip kerja HPLC sebenarnya
tidak berbeda dengan prinsip-prinsip
kromatografi yang lain, yaitu pemisahan
komponen-komponen sampel dengan cara
melewatkan sampel pada suatu kolom,
yang selanjutnya dilakukan pengukuran
kadar masing-masing komponen-
komponen tersebut dengan suatu
detektor. Kerja detektor bermacam-
macam, tetapi pada dasarnya
membandingkan respon dari komponen
sampel dengan respon dari larutan
standar. Dengan kata lain, penentuan
kadar pada dasarnya adalah
membandingkan respon sampel dengan
respom standar. Untuk analisis dengan
HPLC diperlukan standar yang betul-betul
murni, biasanya disebut HPLC grade.
Untuk mendapatkan hasil analisis yang
tepat juga diperlukan phase gerak dengan
kemurnian tinggi.
Bagian-Bagian Alat HPLC
Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari
tandon (reservoir) cairan fase gerak,
pompa, injector, kolom, detektor dan
rekorder.
1. Tandon (Reservoir)
Reservoir terbuat dari gelas atau
stainless steel. Jumlahnya bisa satu, dua
atau lebih. Reservoir yang baik disertai
degessing system yang berfungsi untuk
mengusir gas-gas terlarut dalam solvent.
Gas terlarut tersebut antara lain oksigen.
Degassing dilakukan dengan mengalirkan
gas inert dengan kelarutan yang sangat
kecil, misalnya helium. Sistem yang lebih
lengkap disertai penyaring debu. Debu dan
partikulat yang terbawa oleh solvent dapat
menyumbat kolom. Degassing dapat juga
dibuat sendiri dengan erlermeyer yang
dilengkapi dengan pengaduk magnet,
pemanas dan pompa vacum. Untuk
memperoleh pemisahan yang optimum
dianjurkan menggunakan solvent yang
masih baru.
2. Pompa
Fungsi pompa adalah untuk
memompa fase gerak (solvent) ke dalam
kolom dengan aliran yang konstan dan
reproducible. Pompa harus memenuhi
persyaratan:
a) Dapat memberi tekanan sampai 6000
psi (360 atm)
b) Tekanan yang dihasilkan bebas pulsa.
c) Dapat mengalirkan fase gerak dengan
kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit.
d) Dapat mengalirkan fase gerak dengan
reprodusibilitas yang tinggi.
e) Tahan terhadap korosi (biasanya
terbuat dari baja atau teflon).
Ada beberapa jenis pompa, antara lain :
a. Reciprocating pump:
Terdiri dari ruang kecil, dimana solvent
dipompa dengan piston yang bergerak
maju mundur. Tekanan yang dihasilkan
dapat mencapai 10.000 psi.
b. Displacement Pump:
Terdiri dari semacam alat suntik (syring)
yang besar dengan kapasitas biasanya 250
ml. Solvent dialirkan dengan
menggerakkan piston.
c. Pneumatic Pump:
Terdiri dari container yang berisi solvent
yang dapat ditekan dengan suatu gas.
Tekanan yang dihasilkan kurang dari 2000
psi. Sistim pemompaan ini dapat diatur
secara manual atau dengan menggunakan
kontrol sistem komputer. Berkenaan
dengan aliran fase gerak, jika komposisi
solvent dibuat tetap maka disebut
isocratic elution. Hal ini dapat dilakukan
dengan mencampur lebih dulu dua atau
lebih solvent. Kemudian langkah
selanjutnya adalah menaruhnya dalam
satu reservoir atau dapat juga dengan
menaruh masing-masing solvent pada
reservoir yang berbeda dengan pompa
masing-masing. Jika komposisi solvent
dibuat berubah-ubah dari waktu ke waktu,
maka cara ini disebut gradient elution,
yang pelaksanannya dapat diatur dengan
control system.
Pompa perlu dirawat dengan baik, antara
lain:
a. Menggunakan solvent yang bebas debu/
partikulat.
b. Pompa jangan dibiarkan kering,
sehingga tidak terjadi geseran yang bisa
mengakibatkan kebocoran pompa.
c. Bila dalam solvent terdapat garam-
garam, maka setelah selesai menggunakan
alat ini, pompa harus dialiri air (aquadest)
sampai bersih kemudian dibilas dengan
methanol agar tidak terjadi pengendapan
garam dalam dinding pompa.
d. Jangan menjalankan pompa dalam
keadaan kering.
3. Katup Injector:
Bagian ini merupakan tempat dimana
sampel diinjeksikan untuk selanjutnya
dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
Ada beberapa sistem injeksi:
a. Syringe Injection;
Injeksi menggunakan syringe yang dapat
memompakan sampel dengan tekanan
sampai 1500 psi.
b. Stop Flow Injection:
Termasuk jenis syringe injection, hanya
injeksinya dengan cara memasukkan
sampel ke dalam ruang injeksi (atau
disebut mixing chamber, sementara itu
aliran fase gerak dihentikan. Setelah
sampel masuk lalu fase gerak dialirkan
kembali dan sampel akan terbawa.
c. Auto sampler (disebut juga Auto
Injector)
Terdiri dari suatu sistem yang dikendalikan
oleh control system. Sampel ditaruh dalam
wadah seperti tabung kecil bertutup.
Tutup dapat ditembus oleh jarum
pengisap. Sampel disedot secara otomatis
dengan sistem pompa yang untuk
selanjutnya dimasukkan ke dalam aliran
fase gerak. Pada auto sampler ini dapat
dipasang 100 sampel sekaligus. Dengan
sistem HPLC akan bekerja sendiri
melakukan analisis, termasuk mencuci
sendiri sistem injeksinya setelah
melakukan injeksi.
4. Kolom (Column):
a. Bahan kolom, ukuran kolom dan ukuran
partikel isi kolom.
Kolom merupakan jantung dari HPLC,
sebab kunci keberhasilan analisis sangat
tergantung pada efisiensi kolom sebagai
alat untuk memisah-misahkan senyawa
dalam campuran yang kompleks. Kolom
terbuat dari stainless steel yang dibor
halus atau dari gelas. Untuk yang dibuat
dari gelas pada umumnya kurang terhadap
tekanan, hanya dipakai di bawah 600 psi
dan di pasaran tersedia bermacam-macam
jenis kolom dari berbagai pabrik. Ukuran
kolom antara 10 sampai 30 cm, berbentuk
lurus, diameter dalam 4 sampai 10 mm
dan ukuran partikel dalam kolom 5 sampai
10 um. Ada juga kolom dengan ukuran
yang lebih kecil, panjang 3 sampai 7,5 cm;
diameter dalam 1 sampai 4,6 mm, ukuran
partikel 3 sampai 5 um.
Dalam pemakaian yang berhati-hati,
digunakan kolom pengaman (grand
column) yang dipasang sebelum kolom
analitik. Kolom ini berisi packing yang
sama dengan kolom analitik, ukurannya
kolom lebih pendek dengan partikel yang
ukurannya lebih besar. Kolom ini akan
menahan debu partikulat yang ikut
terelusi sehingga umur kolom analitik lebih
panjang.
Contoh perbandingan waktu dan hasil
kolom panjang dan pendek untuk
campuran theobromine, theophyline,
BHET, caffein yang menunjukkan bahwa
kolom, pendek dapat memisahkan sampel
hanya dalam waktu 120 detik (2 menit),
sedang kolom panjang perlu waktu 6
menit. Kolom analitik ada pula yang dapat
diatur suhunya. Sebenarnya yang diatur
bukan kolomnya tetapi ruang dimana
kolom ditempatkan. Ruang ini disebut
column oven dan kolomnya disebut
thermostat column. Dengan cara seperti
ini dapat diatur suhu kolom 1000 sampai
1500.
b. Jenis Column Packing (Isi Kolom)
Ada dua jenis packing kolom yang telah
digunakan dalam kromatografi cair. yaitu
berupa partikel porous dan partikel
pelliculer.
Isi kolom yang berbentuk pellicular terdiri
dari partikel berbentuk bola, non porous
terbuat dari gelas atau polimer. Partikel ini
dilapis dengan suatu lapisan tipis yang
porous dari silika, alumina atau penukar
ion. Pelapisan dapat dilakukan dengan
penambahan phase diam yang akan
ditahan oleh partikel secara absorbsi atau
dengan jalan mereaksikan bagian
permukaan partikel tersebut dengan
bahan organik tertentu.
Dari reaksi ini dihasilkan suatu lapisan
permukaan yang mempunyai sifat
tertentu. Lapisan yang terbentuk
selanjutnya disebut phase terikat (bonded
phase). Packing kolom yang berupa silika,
permukaannya terdiri dari silika yang
dihidrolisis, baik dengan pemanas atau
perendaman dalam HCL sehingga gugus
silanol bersifat polar.
Untuk mendapatkan permukaan dengan
gugus yang sifatnya non polar dapat
diikatkan siloxane. Ini diperoleh dengan
menghidrolisis permukaan silika dengan
organochlorosilan.
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka
komponen-komponennya akan terpisah-
pisah dan keluar dari kolom dengan waktu
yang berbeda-beda. Komponen yang
sudah terpisah ini secara berturut-turut
akan melewati suatu detektor dan akan
dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan
harus sesuai dengan jenis zat yang
dianalisis.
a. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah
spektrophotometri abssorbsi. Sampel yang
dianalisis harus menyerap sinar UV.
Setelah sampel melewati kolom lalu
dilewatkan Flow-cell.
Intensitas sinar keluar akan lebih kecil
daripada sinar masuk karena ada yang
diabsorbsi oleh sampel. Besarnya absorbsi
yang dinyatakan dengan ukuran absorban
sebanding dengan kadar zat yang
dianalisis. Detektor ini sifatnya spesifik,
artinya hanya dapat digunakan untuk zat-
zat yang menyerap sinar UV. Panjang
gelombang sinar UV yang biasa digunakan
adalah 254 nm.
b. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah
spektrophotometri. Sampel dikenai sinar
UV yang sesuai, maka zat ini akan
berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya
ditangkap dengan phototube. Intensitas
sinar Fluoresensi ini akan sebanding
dengan kadar sampel yang diamati.
Detektor ini lebih sensitif daripada
detektor UV.
Pemakaian sumber sinar laser akan
memberikan sensitivitas yang sangat
tinggi. Untuk zat yang tidak berfluoresensi
dapat dilakukan derivitisasi yang
menghasilkan zat yang dapat
berfluoresensi. Derivatisasi sering
dilakukan terhadap asam amino.
c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index
Detector = RID)
Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan
indeks refraksi sampel dengan solvent.
Semua larutan suatu zat mempunyai
indeks bias yang spesifik, oleh karena itu
detektor ini dapat digunakan untuk hampir
semua zat.
6. Recorder
Hasil pembacaan detektor kemudian
diolah oleh suatu processor kemudian
dikirim ke recorder. Recorder akan
membuat suatu tampilan. Dalam
kromatografi tampilan ini disebut
chromathogram. Untuk HPLC dilengkapi
seperangkat software yang dapat
menghitung luas kromatogram dan
bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
Kelebihan dari alat HPLC adalah :
Mampu memisahkan molekul-molekul
dari suatu campuran.
Mudah melahsanakannya.
Kecepatan analisis dan kepekaan yang
tinggi.
Dapat dihindari terjadinya dekomposisi /
kerusakan bahan analisis
Resolusi yang baik.
Dapat digunakan bermacan-macam
detektor.
Kolom dapat digunakan kembali.
Mudah melakukan sample recovery.