Tema 37. cidos nucleicos.

Un nucletido est formado por la unin de un azcar de cinco carbonos, una base estructural
y un grupo fosfato. Cuando la pentosa se encuentra dioxigenada formar parte del ADN.
Generalmente se encuentran unidos a tres fosfatos y se denominan comnmente por el nombre
de dNTP. En el caso de que no estn unidos al grupo fosfato se denomina nuclesido.

Las bases son compuestos nitrogenados aromticos, pudiendo ser purinas o pirimidinas.
Las primeras se unen al azcar en C9; las pirimidinas lo hacen en C1. Tanto la adenina
como la guanina son purinas, compuestas por dos ciclos. La timina, citosina y uracilo son
pirimidinas.

La unin de varios nucletidos se establece mediante enlace fosfodister, entre el grupo

fosfato de un nucletido y el azcar del siguiente.

El ADN est formado por dos hebras antiparalelas que se unen por complementariedad de
bases, por lo tanto encontramos el mismo nmero de timinas que de adeninas y el mismo de
citosinas que de guaninas. El enlace fosfodister le impide rotar, el enlace glicosdico entre el
azcar y la base se establece siempre en la conformacin anti, por la cual la doble cadena es ms
ancha, adems predominan los grupos oxo- (O en lugar de OH) y amino- (NHH en lugar NH) en
las bases.

Las cadenas siempre se establecen en sentido 5 del fosfato hasta el 3 del hidroxilo,
confiriendo polaridad y estabilidad. Adems, aunque existen otras conformaciones, las dobles
cadenas se colocan de manera dextrgira.

Se habla de desnaturalizacin cuando, por cambios en el medio, las hebras del ADN o ARN
se separan, habindose roto los puentes de hidrgeno que unan las cadenas. Sin embargo se sabe
que al restablecer las condiciones iniciales se produce la renaturalizacin y se unen exactamente
igual que al comienzo, gracias a la complementariedad de bases.

El superenrrollamiento que encontramos en las hebras, y le permite situarse tan comprimida,

ocurre gracias a diferentes enzimas tales como las helicasas, las topoisomerasas y las girasas, que
se encargan de inducir cambios estructurales para que la presin ejercida por una de ellas no se
traduzca en una ruptura de la cadena en otro punto de la misma.

El ADN se organiza como cromatina en interfase, sustancia no condensada unida a protenas

tales como las histonas. Existen varios tipos: heterocromatina, que se considera inactiva
transcripcionalmente, que si es del subtipo facultativa s puede haber ocasiones en las que
traduzca algn tipo de seal, al contrario que el subtipo constitutiva; eucromatina, activa
transcripcionalmente y de replicacin ms temprana que la heterocromatina.

En mitosis el ADN se condensa enormemente formando cromosomas, unidos a muchos tipos

de protenas. Est formado por dos cromtidas unidas por el centrmero. La estructura formada
por ADN, un octmero de histonas y otras protenas se denomina nucleosoma.
 Tema 38. cidos nucleicos como soporte del mensaje gentico.

Gracias al experimento de Avery se supo que el ADN era el portador de la informacin

gentica. Observ que con una cepa virulenta inyectada en ratones, estos moran. Con una cepa
no virulenta no pasaba nada, igual que con la virulenta muerta por calor. En cambio cuando
inyectaba cepa virulenta muerta por calor con cepa viva no virulenta el ratn si mora, luego el
material de la cepa muerta era recogido por la viva y se converta en mortal.

A partir de este, y otros experimentos, se comenz a investigar ms acerca del ADN, hasta
determinar que la informacin gentica se encuentra en los genes contenidos en el ADN.

Un gen es una secuencia de ADN que codifica la secuencia primaria de una protena o
un ARN con funcin estructural o cataltica. Al ADN tambin contiene otros segmentos o
secuencias con funcin puramente reguladora. Cada aminocido de una cadena polipeptdica est
codificado por una secuencia de tres nucletidos consecutivos en una de las cadenas de ADN.
Los tripletes codificantes, codones, estn dispuestos en una secuencia que corresponde a la
secuencia de aminocidos del polipptido codificado por el gen.

Las bacterias suelen tener un solo cromosoma por clula y en prcticamente todos los casos el
cromosoma contiene una nica copia de cada gen. Los genes y sus secuencias reguladoras
ocupan gran parte del ADN en los procariontes.

En eucariontes las secuencias son mucho ms complejas. Muchos genes tienen una estructura
caracterstica y sorprendente: sus secuencias de nucletidos contienen uno o ms segmentos
intercalados de ADN que no codifican la secuencia de aminocidos del producto polipeptdico.
Estos segmentos se denominan intrones. Un ejemplo de protena codificada por un gen sin
intrones son las histonas. En total solo el 1,5% del ADN humano es codificante, o exnico, para
productos proteicos o ARN.

Una gran parte del ADN no gnico consiste en secuencias repetidas de diferentes tipos. Lo
ms sorprendente es que alrededor de la mitad del genoma humano consista en secuencias
moderadamente repetitivas procedentes de elementos transponibles segmentos de ADN que
pueden moverse de un lugar a otro del genoma. Estos elementos, transposones, son un tipo de
parsito molecular, que se aloja eficazmente en el genoma husped. Muchos poseen genes que
codifican protenas que catalizan el proceso de transposicin. Algunos transposones del genoma
humano son activos, con baja frecuencia de actuacin, pero la mayora son reliquias inactivas
alteradas por mutacin a lo largo de la evolucin.

Aproximadamente el 3% del genoma humano consiste en secuencias altamente repetitivas

(SSR). Tambin se le denomina satlite que no es codificante, pero que tiene importancia
funcional en el metabolismo celular humano, puesto que en buena parte est asociado a dos
importantes estructuras en los cromosomas: centrmeros y telmeros.
 Tema 39. Replicacin.

Replicacin de ADN.

La replicacin de ADN es semiconservativa. Cada cadena acta como molde para la sntesis
de una nueva cadena. El resultado son dos molculas de ADN nuevas, cada una con una cadena
nueva y otra vieja.

La replicacin empieza en un punto de origen y normalmente avanza de forma bidireccional.

El proceso ocurre de manera simultnea en cada una de las cadenas parentales.

La sntesis de ADN progresa en direccin 5-3 y es semidiscontinua. Esto result

contradictorio con la hiptesis de replicacin bidireccional. Sin embargo diferentes estudios
determinaron que una de las hebras se sintetizaba continuamente y otra a base de fragmentos de
Okazaki ms cortos.

En ocasiones se forman estructuras muy complejas en las que la hebra retardada sufre un lazo
para la sntesis de esta cadena. Para todo ello es necesario un complejo enzimtico.

El ADN es degradado por nucleasas, que pueden clasificarse en dos grandes clases:
exonucleasas, que degrada desde los extremos; y las endonucleasas que degradan desde puntos
internos. El ADN es sintetizado por ADN polimerasas, que tambin se pueden clasificar en
muchos tipos. La ADN polimerasas I cataliza una reaccin fundamental de transferencia de un
grupo fosforilo. Lo que est claro es que todas ellas necesitan de una cadena molde.

Adems es necesario un cebador, un segmento de cadena, complementario del molde, con

un grupo 3-hidroxilo libre al cual pueden aadirse nucletidos. Esto es necesario ya que las
polimerasas actan a partir de cadenas preexistentes. Los cebadores son a menudo
oligonucletidos de ARN.

Durante la polimerizacin, la discriminacin entre nucletidos correctos e incorrectos se basa

no solamente en los puentes de hidrgeno que especifican el apareamiento correcto, sino tambin
la geometra comn de los pares de bases estndar. Adems en las polimerasas existe un
mecanismo intrnseco con actividad exonucleoltica 3-5, que hace posible realizar una
segunda comprobacin de cada nucletido una vez ha sido aadido. Cuando la unin ha sido
errnea se produce la eliminacin del nucletido incorrecto y se produce una pausa en la
sntesis para dar la oportunidad de corregir el error al enzima.

Los pasos de replicacin son: identificacin de los orgenes de replicacin, desenrollado del
dsDNA para proporcionar un molde ssDNA. Formacin de la horquilla de replicacin, iniciacin
de la sntesis de ADN y elongacin. Formacin de las burbujas de replicacin y ligacin de los
segmentos de ADN recin sintetizados. Reconstruccin de la estructura cromatnica.

Caractersticas de la replicacin en eucariotas.

En todos los eucariotas, el inicio de la replicacin requiere un complejo proteico de

mltiples subunidades, el complejo de reconocimiento del origen (ORC). Si solo existiera un
punto de origen en eucariotas el proceso tardara ms de 500 horas, al saber que esto no era as se
estudi la posibilidad de que en eucariontes existiera ms de un punto de origen, y as fue.
 Tambin cuentan con diferentes tipos de polimerasas, algunas de ellas sin actividad
exonucleasa, por lo que se sabe que estas enzimas solo se encargan de la sntesis del cebador.

Telmeros. La replicacin necesita de un extremo 3-hidroxilo libre, al final de la cadena

ninguna polimerasa es capaz de introducir el ltimo o los ltimos nucletidos, por lo que el
genoma se acorta en cada divisin. En algunas clulas este proceso es irreversible, sin embargo
otras contienen telomerasas que evitan este acortamiento.

Alarga el extremo 3 de la primasa y la ADN polimerasa sintetiza la cadena complementaria.

Al eliminar el cebador vuelve a quedar una secuencia desapareada como al principio. La enzima
no es capaz de copiar la secuencia que ha aadido la telomerasa, pero s el final del cromosoma
original, por lo tanto no se produce ninguna prdida gnica.

Principales enzimas implicadas en la replicacin.

ADN polimerasas. Polimerizado de desoxinucletidos.

Helicasas. Desenrollado progresivo del ADN.
Topoisomerasas. Libera la tensin de torsin generada por el desenrollado inducido por
las helicasas.
ADN primasa. Inician la sntesis de oligos ARN.
Protenas de unin a ssDNA. Impiden renaturalizacin prematura del ddDNA.
ADN ligasas. Sella mellas en hebras sencillas entre la cadena naciente y los fragmentos
de Okazaki en la hebra retardada.

Replicacin vrica.

Dado que los virus pueden contener como material gentico ARN en lugar de ADN, la
replicacin resulta diferente. Estos organismos presentan enzimas de retrotranscripcin y
replicacin con las cuales pueden pasar de su ADN a ARN, y realizar el proceso contrario.

Tema 40. Reparacin del ADN.

Una clula solo tiene generalmente una o dos copias de las secuencias de ADN genmico. Las
protenas y molculas de ARN daadas pueden ser reemplazadas rpidamente utilizando
informacin codificada en el ADN; en cambio, las propias molculas de ADN son
irreemplazables.

La consecuencia ms importante es un cambio en la secuencia de bases del ADN, que si se

replica y se trasmite a las generaciones futuras se hace permanente. Estos se denominan
mutacin. Dada la gran importancia en los mecanismos de reparacin, los organismos gastan
grandes cantidades de energa en forma de ATP para realizar todos los procesos.
 Reparacin de apareamientos incorrectos.

Se corrigen casi siempre de acuerdo con la informacin contenida en la cadena molde, de

manera que el sistema ha de discriminar de algn modo entre la cadena molde y la recin
sintetizada. La clula consigue este objetivo marcando el ADN molde con grupos metilo para
distinguirlo de las cadenas recin sintetizadas. Despus elimina toda la cadena sintetizada, desde
la secuencia GATC hasta que encuentra el error, quedando un 3-hidroxilo libre; sin embargo
esta distancia puede ser muy grande por lo que se consumiran grandes cantidades de energa.

Reparacin por escisin de bases.

Todas las clulas contienen una clase de enzimas denominadas ADN glucosilasas, que
reconocen lesiones de ADN muy frecuentes y eliminan la base afectada rompiendo en enlace N-
glicosdico. El corte crea sitios absicos. Uno de los errores ms frecuentes son las
desaminaciones de citosina, convirtindola en uracilo o timina. Dado que el ADN no debe
contener uracilo existen en las clulas eucariotas muchas glucosilasas encargadas de reparar este
error. Si existiera uracilo en el ADN no habra manera de distinguir el uracilo bien colocado del
producido fcilmente por la desaminacin de la citosina, situacin poco estable para la vida de
los organismos.

La correccin no se produce por simple sustitucin del nucletido errneo, sino que las AP
endonucleasas rompen el fragmento de ADN donde se encuentra el error para degradarlo, y la
polimerasa I sintetiza el fragmento eliminado sobre la hebra molde.

Reparacin por escisin de nucletido.

Las lesiones que producen grandes distorsiones y abultamiento en la estructura helicoidal del
ADN se reparan mediante el sistema de escisin de nucletido, una va de reparacin esencial
para la supervivencia de todos los organismos de vida libre. Un enzima multinumrico hidroliza
dos enlaces fosfodister, uno a cada lado de la distorsin, pero no seguidamente a ella. El
fragmento que se ha eliminado se restaurar gracias a la polimerasa I.

Reparacin directa.

Varios tipos de lesiones se reparan sin eliminar la base o el nucletido. Un ejemplo es el que
ocurre con los dmeros de pirimidina, que son el producto de una reaccin inducida por la luz
ultravioleta. Las ADN fotoliasas utilizan la energa proveniente de la luz absorbida para invertir
la lesin.

Interaccin de horquillas sobre las lesiones.

En ciertos tipos de lesiones, tales como las roturas de doble cadena, los entrecruzamientos de
doble cadena o lesiones en el ADN de cadena sencilla, la hebra complementaria est ella misma
daada o no disponible. Estas lesiones aparecen cuando una horquilla de replicacin se topa con
una incorreccin no reparada.

A falta de una hebra complementaria para aportar la informacin sobre la reparacin, un

cromosoma homologo puede ser la solucin. El sistema de reparacin es pues dependiente de la
recombinacin gentica homloga.
 En determinadas condiciones se activa una nueva ruta de reparacin, conocida como sntesis
de ADN propensa al error a travs de la lesin; sin embargo resulta un mecanismo de reparacin
mucho menos preciso, por lo que ocurre en momentos en los que el ADN se encuentra muy
daado y ninguna horquilla de replicacin se encuentra activa. A todo este mecanismo se le
denomina respuesta SOS.

Reparacin de la rotura de doble cadena.

Dependiendo de la rotura existen diferentes mecanismos:

Unin de extremos no homlogos. Cuando no encontramos cromosoma homlogo un

complejo proteico se encarga de romper los extremos del hueco que ha producido la
rotura de la cadena originando extremos romos. A partir de estos las ligasas unirn de
nuevo las cadenas obtenindose un cromosoma ms corto, con delecin, pero con altas
probabilidades de no alterar gravemente la estructura del mismo y pudiendo no tener
consecuencias fenotpicas.
Recombinacin homloga. Cuando estn disponibles cromosomas homlogos, un
complejo enzimtico produce la rotura de extremos del cromosoma daado y
posteriormente se produce la inversin de una de las hebras del cromosoma homlogo.
Es a partir de ella cuando la polimerasa reconstruye las cadenas daadas.
Ruptura de Holliday. Cuando la delecin se produce en dos hebras de diferentes
cromosomas homlogos la unin entre estas origina que los dos cromosomas estn
unidos mediante el enlace de Holliday. A partir de esta estructura se produce una
rotacin de las cadenas para evitar tensin en las mismas, a continuacin la separacin
puede provocar diferentes posibilidades de entrecruzamiento, originando reordenacin
allica.

Las mutaciones pueden ser espontaneas o inducidas por algn agente externo, como oxidantes
o alquilantes. Los mutgenos intercalantes son molculas planas que se introducen en el genoma.

Tema 41. Recombinacin del ADN.

El reordenamiento de la informacin gentica dentro y entre las molculas de ADN

comprende diversos procesos conocidos colectivamente como recombinacin gentica. Existen
tres grandes tipos:

Recombinacin gentica homloga.

Consiste en el intercambio gentico entre dos molculas de ADN cualesquiera que comparten
una regin extensa de secuencia casi idntica. La secuencia concreta de bases es irrelevante,
siempre que sea la misma en los dos ADN.

Es bsicamente un proceso de reparacin denominado reparacin del ADN por

recombinacin. Puede ocurrir tambin durante la conjugacin bacteriana, cuando el ADN
cromosmico es transferido de una clula donante a una receptora. En eucariotas ocurre con
mayor frecuencia durante meiosis, proceso tambin denominado como entrecruzamiento. Por
lo tanto la recombinacin homloga proporciona, adems de una mejora de la diversidad y una
opcin de reparacin cromosmica, una unin fsica transitoria entre cromtidas hermanas
necesaria para la segregacin ordenada durante la primera divisin meitica.

La recombinacin requiere una multitud de enzimas y otras protenas. Algunas de ellas con
actividad helicasa y nucleasa. La RecA es un ejemplo de E. coli de protena que realiza un gran
nmero de pasos: apareamiento de los ADN, formacin de intermediario de Holloday y
migracin de la ramificacin.

Recombinacin especfica de sitio.

En la cual los intercambios solo tienen lugar en una secuencia determinada. Estas reacciones
de recombinacin tienen lugar en prcticamente todas las clulas, pero sus funciones estn
especializadas y varan en gran medida de una especie a otra. Se produce gracias a las
recombinasas que rompen una de las cadenas de dos cromosomas en los puntos de
recombinacin y a continuacin une los cromosomas entre s, dando origen a un intermediario
de Holloday. Una nueva ruptura y unin, en puntos diferentes, habr provocado la aparicin de
dos cromosomas nuevos, diferentes a los originales.

Este proceso es el que se lleva a cabo en la clonacin de genes cuando introducimos un

inserto dentro del plsmido de alguna bacteria.

Trasposicin de ADN.

Normalmente interviene un segmento corto de ADN con la notable capacidad de trasladarse

de un lugar a otro del mismo cromosoma, o a otro cromosoma, denominado trasposn. La nueva
localizacin es elegida ms o menos al azar. La insercin de un trasposn en un gen esencial
podra matar la clula, por lo que es muy poco frecuente.

Las bacterias tienen dos tipos de transposones. Las secuencias de insercin contienen
solamente las secuencias requeridas para la transposicin y los genes para las protenas que
promueven el proceso. Los transposones complejos contienen uno o ms genes que pueden, por
ejemplo, conferir resistencia ante antibiticos.

En la transposicin directa o simple el transposn es escindido por cortes en ambos extremos

y se desplaza hasta una nueva localizacin, dejando una rotura en la cadena doble de ADN
dador. En la transposicin replicativa, se replica el transposn completo, dejando atrs una copia
en el sitio que hace de dador.

Los retrotransposones son un tipo de elementos mviles diferentes que surgen a partir de la
retrotranscripcin de ARN en cADN, que se insertar en el nuevo sitio.

Tema 42. Biosntesis de ARN. Transcripcin del ADN en eucariontes.

La expresin de la informacin gentica requiere generalmente la sntesis de una molcula de

ARN, transcrita a partir de un molde de ADN. El ARN es la nica macromolcula conocida que
tiene a la vez funciones en el almacenamiento y la transmisin de la informacin y en la
catlisis.
 Existen tres clases principales de ARN. El ARNm codifica la secuencia de aminocidos de
uno o ms polipptidos especificados por un gen o por un conjunto de genes. El ARNt lee la
informacin codificada en el ARNm y transfiere el aminocido adecuado a la cadena
polipeptidica en crecimiento durante la sntesis proteica. Las molculas de ARNr forman parte
de los ribosomas, complejas maquinarias celulares que sintetizan las protenas.

Mientras que en la replicacin se copia el cromosoma entero, la transcripcin es ms

selectiva. En un momento dado, solo son transcritos genes o grupos de genes determinados y
algunas regiones del genoma nunca son transcritas.

La sntesis de ARN dependiente de ADN o transcripcin es un proceso muy parecido a la

replicacin en su polaridad y en la necesidad de una molcula molde, sin embargo en la
transcripcin no se necesita cebador, y se centra en regiones especficas y no en el genoma
entero, ya que nicamente alrededor del 1% del genoma se transcribe. Para el proceso es
necesaria la presencia de la ARN polimerasa dependiente de ADN, los cuatro ribonuclesidos
5-trifosfato y magnesio.

Esta enzima, que sintetiza en sentido 5-3, es ms activa cuando se encuentra unida a un
ADN bicatenario. El inicio se produce cuando la enzima se une a secuencias especficas
denominadas promotores.

En la fase de elongacin, el extremo en crecimiento de la nueva cadena se aparea

temporalmente con el de ADN molde para formar una doble hlice hbrida de una longitud de
aproximadamente 8 pares de bases. La separacin de la hebra de ADN provoca una sobretensin
en los puntos distantes a la burbuja de transcripcin, es por ello que se hace imprescindible la
presencia de las topoisomerasas que evitan los problemas que puedan derivar de la torsin.

Se denomina como hebra codificante a la que no sirve de molde que tendr la misma
secuencia que la nueva sintetizada de ARN, cambiando timinas por uracilos. La secuencia
codificante de un gen determinado puede estar situada en cualquiera de las dos hebras de un
cromosoma determinado. Las secuencias reguladoras que controlan la transcripcin se designan
convencionalmente por las secuencias de la hebra codificante.

La enzima est compuesta por cinco subunidades ms una variante dentro de una misma
especie, por lo que podemos encontrar diferentes variantes de la holoenzima polimerasa.
Complejo que no tiene actividad exonucleasa contra el control de errores, por lo que la tasa de
error en la transcripcin es bastante alta pero con muchas menos repercusiones para la clula, ya
que existen muchas copias de ARN que adems se degradan rpidamente.

Aunque los promotores en bacterias pueden ser muy diferentes, los nucletidos que se
encuentran con mucha ms frecuencia que otros en cada posicin forman una secuencia
consenso, una de ellos situado a una distancia de -35 TTGACA y el segundo a una distancia de -
10, TATAAT. En eucariotas las secuencias son diferentes, la primera situada a -25 es TATA y la
segunda situada a -75 es CAAT. Otra regin importante es el elemento UP, rico en timinas y
adeninas del ADN, en el cual se unir una de las subunidades de la polimerasa. El cambio de una
de las bases en estas regiones supondr un cambio en la regulacin de la expresin del gen.
 En primer lugar, la polimerasa se une al promotor y forma sucesivamente un complejo
cerrado (en el cual el ADN unido est intacto) y un complejo abierto (en el cual el ADN unido
est intacto pero parcialmente desenrollado). Seguidamente empieza la transcripcin dentro del
complejo, que va acompaada por un cambio de conformacin que transforma el complejo en la
forma propia de elongacin. A partir de este momento la enzima va alejndose de la secuencia
promotor.

La demanda de los diferentes productos gnicos vara segn las condiciones imperantes en la
clula o la fase del desarrollo. La transcripcin de cada gen est regulada cuidadosamente para
suministrar los productos gnicos en las proporciones requeridas, y es la fase de unin a la
polimerasa la que se encuentra mejor regulada. A parte de las secuencias promotor y de la
subunidad variable, existen protenas que pueden activar o inhibir la transcripcin. Un ejemplo
es la protena receptora de cAMP (CRP), que activa el proceso.

El control de la transcripcin en eucariotas se lleva, por tanto, mediante diferentes

mecanismos, un ejemplo es el opern lactosa. Un conjunto de genes que transcribe en tres
enzimas que digieren la lactosa, la -galactosidasa, una permeasa y una transacetilasa, y otras
protenas de regulacin de expresin. Uno de los genes que compone el opern traduce una
protena represora que actuar cuando las concentraciones de lactosa sean latas, y no se necesite
ninguna de las enzimas citadas, unindose a otra secuencia operadora, impidiendo que la ARN
polimerasa se una a l para comenzar la transcripcin.

La terminacin de la sntesis de ARN est indicada por secuencias especficas, hasta ellas el
proceso es procesivo, es decir, las hebras no se separan ya que si lo hicieran la sntesis no
podra continuar a partir de un fragmento de ARN a mitad. Sin embargo, al topar con algunas
secuencias del ADN se produce una pausa en la transcripcin y en alguna de estas secuencias
termina la sntesis de ARN.

En este proceso de terminacin se sabe que en procariotas actan diferentes protenas. Un

ejemplo es la protena ro que utiliza ATP para separar el ARN naciente de la hebra molde y de la
polimerasa, aunque si se produce una situacin de emergencia actuara una protena homloga a
la protena ro.

La maquinaria de la transcripcin en el ncleo de una clula eucariota es mucho ms

compleja que la de las bacterias. Para empezar, tienen tres polimerasas, complejos diferentes
pero con algunas subunidades en comn. Cada una tiene una funcin especfica y se fija a
diferentes secuencias promotoras.

La polimerasa I es responsable nicamente de la sntesis de ARN prerribosmico. La

principal funcin de la polimerasa II es la sntesis de ARNm y de algunos ARN especializados.
Esta enzima es capaz de reconocer miles de promotores, cuyas secuencias difieren ampliamente.
Pero muchos tienen caractersticas comunes como la caja TATA y una secuencia iniciadora
(Inr) cerca del sitio de inicio de la transcripcin. La polimerasa III produce ARNt, ARNr 5S y
algunos otros ARN especializados de pequeo tamao.
 La polimerasa II est considerada como la ms importante, y por ello ha sido la ms
estudiada. Detrs de su alta complejidad con 12 subunidades, se esconde gran homologa
evolutiva con la polimerasa de procariotas. La subunidad ms grande posee un dominio
carboxilo-terminar denominado CTD con muchas e importantes funciones.

La polimerasa II requiere otras numerosas protenas, denominadas factores de transcripcin,

para formar el complejo de transcripcin. El proceso que lleva a cabo la enzima comprende
varias fases unin, inicio, elongacin, terminacin cada una de ellas asociada a protenas
especficas, muchas de ellas que hacen posible que se de cada paso y otras tantas que se encargan
de la regulacin de cada proceso.

Adems existe una regin denominada enhancer que est implicada en la regulacin de
transcripcin, aumentando de manera considerable el proceso. Esta regin no tiene por qu
encontrarse cerca del gen al que regula, ni siquiera en el mismo cromosoma. Por otro lado
cuando la enzima sintetizadora llega hasta un nucleosoma el ADN se separa del octmero
proteico para poder continuar sin problemas, una vez que ha pasado la regin el nucleosoma
vuelve a aparecer para unirse a la cadena de ADN.

La elongacin de las cadenas por la ARN polimerasa es inhibida por actinomicina D. la

porcin plana de esta molcula se intercala en el ADN de doble hlice entre pares de guanina y
citosina, deformando las cadenas. Esto impide el paso de la enzima. Otro inhibidor similar es la
acridina.

En cambio la rifampicina inhibe la sntesis de ARN en las bacterias al inhibir una de las
subunidades de la polimerasa bacteriana. Ocasionalmente se usa como antibitico. Otra molcula
que inhibe este proceso solo en animales es la -amanitina, producida por un hongo para evitar
a los depredadores, de ah su carcter venenoso.

Gran parte de las molculas de ARN en bacterias y en la prctica totalidad en eucariotas son
modificadas en mayor o menor medida despus de su sntesis, y muchos de estos cambios estn
catalizados por otras molculas de ARN denominadas ribozimas.

Una molcula de ARN recin sintetizada recibe el nombre de transcrito primario. En

eucariotas contiene secuencias que corresponden a un gen, aunque las secuencias que codifican
el polipptido puedan no ser contiguas. En un proceso denominado splicing los intrones son
eliminados y los exones son unidos para formar un secuencia continua que especifica un
polipptido funcional.

Los ARNm eucariticos tambin se modifican en ambos extremos. Un residuo modificado,

denominado caperuza, se aade al extremo 5. El extremo 3 se corta y se le aaden unos 80 a
250 residuos de adenina para formar una cola poli-A. Los elaborados complejos proteicos que
llevan a cabo estos tres procesos operan asociados unos con otros y con el CDT de la polimerasa
II.

Los transcritos primarios de loas ARNt tambin se modifican por eliminacin de secuencias
en cada extremo y en algunos casos por eliminacin de intrones. Tambin se modifican muchas
bases y azucares; en el ARNt maduro abundan bases que no se encuentran habitualmente en
otros cidos nucleicos.
 El casquete en 5 se basa en un residuo de 7-metilguanosina unido al residuo 5-terminal del
ARNm a travs de un poco comn enlace 5,5-trifosfato. Este casquete protege el ARNm de las
ribonucleasas. Se une tambin a un complejo proteico especfico de unin al casquete, que
participa en la unin del ARNm al ribosoma para iniciar la traduccin. Se forma a partir de una
condensacin de una molcula de GTP con el trifosfato del extremo 5 del transcrito. La guanina
es metilada posteriormente a partir de S-adenosilmetionina. Estas fases ocurren despus de
aadir los 20 o 30 nucletidos del transcrito.

En la secuencia podemos distinguir cuatro tipos de intrones. Los dos primeros, denominados
intrones del grupo I y del grupo II, difieren en los detalles de sus mecanismos de splicing, pero
no necesitan enzimas para ello. El tercero y ms numeroso del grupo de intrones se encuentra
en los transcritos del ARNm nuclear. Se denomina intrones de espliceosoma, porque su
eliminacin ocurre en el interior por accin de un gran complejo proteico llamado espliceosoma.
Este est formado por complejos de ARN-protenas denominados pequeas ribonucleoprotenas
nucleares, snRNP, en el cual el ARN tambin se denomina de una manera diferente, pequeos
ARN nucleares, snRNA. La cuarta clase de intrones se distingue en que el empalme requiere
ATP y una endonucleasa.

La cola poli-A protege al ARNm de la destruccin enzimtica. En procariotas se han

encontrado molculas de ARN con colas poliadeniladas, sin embargo la funcin en este caso era
precisamente estimular la degradacin de la cadena. El transcrito se extiende ms all del sitio
de adicin y a continuacin es cortado en el lugar donde se aadir. El sitio donde se produce el
corte est indicado por dos secuencias: AAUAAA, altamente conservada, y otra secuencia peor
definida, rica en residuos de guanina y uracilo. Una vez producido el corte la polimadenilato
polimerasa cataliza la reaccin de adicin.

En algunos casos tambin se modifica la regin de ARNm que codifica el polipptido, que
experimenta un proceso de edicin. Esta comprende procesos que aaden o eliminan bases en las
regiones codificantes de los transcritos primarios o que cambiar la secuencia (por ejemplo, la
desaminacin de un residuo de citosina para dar uno de uracilo).

La maduracin diferencial del ARN da lugar a mltiples productos a partir de un gen. Aunque
los posibles beneficios de los intrones no estn claros en la mayor parte de los casos, la
evolucin de las clulas ha aprovechado las rutas de corte y empalme para alterar la expresin de
ciertos genes.

Los ARNr y los ARNt tambin son modificados. Los primeros se forman a partir de ARN
prerribosmico. En coli se han encontrado siete molculas de pre-ARNr. En eucariotas algunos
de ellos se modifican en el nuclolo para dar ARNr, otros pueden ser modificados
ulteriormente postrascripcionalmente para dar ARNt.

El estudio de la maduracin postranscipcin de las molculas de ARN llev a uno de los

descubrimientos ms importantes de la bioqumica: la existencia de enzimas de ARN. Los
ribozimas mejora caracterizados son los intrones de autocorte y empalme del grupo I, la RNasa
P y el Ribozima en cabeza de martillo. La mayora de las actividades de estas molculas se
basan en la transesterificacin y en la hidrlisis del enlace fosfodister. Como sucede con los
enzimas proteicos, la estructura tridimensional de los ribozimas es importante para la funcin. La
actividad se pierde cuando el ARN se calienta por encima de su temperatura de fusin, al aadir
agentes desnaturalizantes o al aadir oligonucletidos complementarios, que destruyen los
patrones normales de apareamiento de bases. Los ribozimas tambin pueden inactivarse
mediante la sustitucin de nucletidos esenciales.

Mecanismos de edicin del ARN. La edicin puede ocurrir a travs de inserciones,

deleciones o por modificacin nucleotdica. Un ejemplo es la desaminacin que sufre la adenina
para convertirse en inosina. Por otro lado, la desaminacin de citosina la transforma en uridina,
menos frecuente en mamferos. Otro mecanismo es la insercin de secuencias de poli uracilo
extensas y deleciones de segmentos usando ARN guas (ARNg).

Estos mecanismos que se dan de manera dependiente al tejido en el que nos encontremos,
permiten que un mismo que pueda provocar la sntesis de diferentes protenas, con propiedades o
tamaos diferentes. Sin embargo esta variabilidad, sumada a la posibilidad de un splicing
alternativo supone un factor de riesgo importante para el cncer.

El procesamiento del ARNt en eucariotas se basa en la eliminacin de un intrn dentro de la

molcula sintetizada por la polimerasa III. Adems el extremo 3 formado por un dinucletido de
uracilo se cambia por la secuencia CCA que ser la que d forma al extremo de la cadena que se
una al aminocido.

El ADN que codifica para ribosomas se basa en secuencias repetidas localizadas en el NOR,
regin que al desempaquetarse el cromosoma despus de la mitosis se encuentra asociada a
nuclolos en formacin. Es la polimerasa I quien cataliza las reacciones de sntesis de los
diferentes ARNr, salvo del 5S cuya sntesis se encuentra regulada por la polimerasa III. Una vez
que se han formado los diferentes pre-ARNr en el nuclolo salen del ncleo donde se ensamblan
ya maduros para sintetizar protenas.

Tema 44. Traduccin del ARNm. Sntesis de polipptidos.

La sntesis de pptidos se realiza en los ribosomas a partir del ARNm, que en eucariotas ha
tenido que salir del ncleo y haber madurado antes de llegar a los ribosomas.

El cdigo gentico est formado por cuatro elementos diferentes, bases nitrogenadas, que se
traducen en veinte aminocidos. Si se combinan 3 a 3 con repeticin daran 64 combinaciones
diferentes, pero sabemos que solo hay 20, esto es porque el cdigo gentico es degenerado y
adems existen codones de parada e inicio.

Los descubrimientos sobre el cdigo gentico se supieron gracias a la enzima polinucletido

fosforilasa, con la cual conseguan sintetizar ARN sin la necesidad de contar con hebras de
ADN. Gracias a ello sintetizaban cadenas de ARNm con diferentes combinaciones repetidas para
averiguar la relacin entre los tripletes y su significado en aminocido.

Existen tres pautas de lectura posibles en una sola cadena, teniendo en cuenta de que la
lectura no es solapante. El lugar de la cadena en el cual comienza la sntesis del pptido
siempre ser AUG, codificando en eucariotas metionina y en procariotas formilmetionina,
aminocido modificado previamente.
 El aminocido llega transportado por el ARNt unido en el extremo 3 ACC. Adems posee
tres regiones importantes: anticodn, triplete complementario al codn del ARNm cuya
secuencia indica de manera inequvoca el aminocido que se unir al ARNt y de l a la cadena
peptdica. Otro extremo ser el de unin al enzima catalizador, y por ltimo el extremo de unin
al ribosoma.

Cuando se unen los dos tipos de ARN la primera y la segunda base del codn se unen
perfectamente mediante puentes de hidrgeno. Pero en con las bases que se encuentran en la
tercera posicin la unin no se realiza completamente y por ello pueden unirse ARNt con una
base diferente a la que muestra el ARNm. A lo largo de la evolucin se ha llegado a la
degeneracin del cdigo gentico para evitar un alto porcentaje errores que provocaran
mutaciones. As pueden darse diferentes uniones no complementarias, las cuales no provocan
cambios en el orden de aminocidos del pptido:

A U C G U A y G
G U y C I U y C y A

Y aunque la mayora de los tripletes solo se diferencian en la ltima base, esto no ocurre as
siempre. Es por ello que la degeneracin del cdigo gentico no se debe exclusivamente a las
propiedades de balanceo que posean los ARNt. Las verdaderas intrpretes del cdigo son las
aminoacil ARNt sintetasas, las cuales leen de manera especfica los diferentes anticodones para
unir determinados aminocidos. Existen dos regiones de unin a la enzima para aumentar la
especificidad de la reaccin que gasta dos molculas de ATP.

Finalmente la unin de ARNm y ARNt se realizar en los ribosomas, macroestructuras que

difieren en procariotas y eucariotas. Las primeras son ms simples de 70S, las eucariotas tienen
una subunidad ms, cuatro en total, con un coeficiente de sedimentacin de 80S.

Dentro de ellos diferenciaremos entre el espacio aminoacil (A), peptidil (P) y de salida (E).
La unin del ARNm con la subunidad menor del ribosoma se lleva a cabo en la regin donde se
encuentra la secuencia de inicio, proceso catalizado por diferentes factores de iniciacin como
IF1 e IF3. Por otro lado la unin del primer aminoacil, que entra en el sitio P se realiza gracias
al factor IF2. A continuacin llega por s misma la subunidad mayor, retirando los factores de
iniciacin gracias al gasto de GTP.

El proceso de elongacin comienza con la entrada de un nuevo aminoacil, correspondiente

con el siguiente triplete, entrando en el sitio A gracias al factor de elongacin EF-tu. Gastando
GTP esta molcula se separa del complejo sinttico. La renovacin de este factor, que se
modifica durante la unin, se consigue gracias a EFs.

La siguiente reaccin se basa en la formacin del enlace peptdico, reaccin catalizada por la
peptidil transferasa, formndose una cadena en el sitio A, y quedando en el sitio P un ARNt sin
aminocido solo. Luego el EFG mueve el ARNt hasta el sitio E, desde donde sale en busca de
un nuevo aminocido.
 Finalmente una secuencia de terminacin indicar que se produzca una ruptura entre la cadena
peptdica formada y los ARNt. La separacin fsica del ribosoma se lleva a cabo gracias a los
factores de terminacin RF1 y RF3.

Todos estos factores imprescindibles en la traduccin de protenas son pertenecientes a las

clulas procariotas. En las clulas eucariotas, generalmente se presentan un nmero ms alto de
ellos. Las diferencias principales se dan en el inicio: en procariotas existe ms de un codn de
inicio, la metionina est modificada, existen solo tres factores de iniciacin en lugar de nueve y
el ARNm no tiene caperuza. En cambio en la terminacin de eucariotas se observa un proceso
ms simple, con solo un factor de terminacin eRF, pero con un gasto de GTP.

Los polisomas son estructuras formadas por diferentes ribosomas unidos a un mismo ARNm,
por lo que se encuentran traduciendo en un intervalo de tiempo muy corto la misma protena. Se
encuentran libres por el citoplasma, al igual que algunos ribosomas que no se unen al RER.

En algunos casos adems se da un procesado postraduccional de las protenas, como en la

insulina: se sintetiza una cadena polipeptidica denominada pre-insulina. Una enzima de
restriccin lo separar en pro-insulina que finalmente se romper en pptido C, inactivo, e
insulina. Realmente en los anlisis de sangre se miden las concentraciones de pptido C, en lugar
de la actividad de insulina.

Otras modificaciones de tipo qumico que pueden sufrir los pptidos recin sintetizados son la
unin de carbohidratos y de lpidos o modificaciones de tipo fosforilacin, hidroxilacin,
acetilacin, etc. La unin de N-acetilglucosamina y N-acetilgalactosamina se produce en el
citoplasma en residuos de serina o treonina. Las glicosilaciones ms complejas se llevan a cabo
en el retculo (N-glicosilacion en asparaguina y O-glicosilacion en serina o treonina) o en Golgi
(O-glicosiolacion en serina o treonina). La unin de lpidos ms tpica es la miristoilacin,
adems de la palmitoilacin y la prenilacin.

Algunos antibiticos se basan en estructuras homlogas a las del ARNt pero inactivas en el
proceso, por lo que las bacterias no pueden replicarse. Dos potentes inhibidores son la toxina
diftrica y la ricina, protenas toxicas presentes en la semilla de ricino. La primera bloquea EF2
y la segunda desestructura los ribosomas.
 Tema 45. Modificaciones post-traduccionales de las protenas.

Las protenas llevan en su secuencia la informacin del lugar diana en el que terminarn.
Adems el lugar de sntesis difiere dependiendo igualmente del destino final: la sntesis de
protenas nucleares y citoslicas se lleva a cabo en los ribosomas libres del citosol; las
protenas que se exportarn de la clula, las destinadas a los lisosomas u otros orgnulos y las
protenas de membrana se sintetizan en el RER.

Esta secuencia seal que indica el destino final suele eliminarse de la cadena peptdica, por
lo que tambin encontramos en la secuencia una seal de corte para realizar este proceso.

Para llevar a cabo la sntesis proteica en el retculo es necesaria la intervencin de un

complejo proteico que regule los diferentes procesos que se llevan a cabo. En la membrana
existe una protena receptora de otra denominada SRP, ser esta quien transporte el ribosoma
libre hacia la membrana, una vez que la sntesis ha comenzado y se encuentra en un estado
muy temprano. Una vez que se ha unido el ribosoma al traslocn, protena canal que se
encargar de facilitar el proceso de sntesis ya sea para protenas de membrana o protenas que
llegarn al lumen, SRP y su receptor se separan del complejo de sntesis y entre ellas gastando
energa en forma de GTP.

En el traslocn suele haber una peptidasa que elimine la secuencia que indic a la protena
SRP que se uniera precisamente a este ribosoma, informando que ya se encuentra con actividad
sinttica. Finalmente la sntesis continuar hasta llegar a un triplete de parada en el ARNm y el
pptido sintetizado quedar en el lumen del retculo.

La sntesis de protenas de membrana es bsicamente igual, salvo que en un momento aparece

una serie de unos 23 aminocidos hidrofbicos, por lo que la cadena se sale del traslocn y la
sntesis contina en la cara citoslica. Existen ejemplos mucho ms complejos en el cual la
protena puede tener ms de un dominio hidrofbico, o un caso en el cual la protena deja su
extremo C-terminal en el lumen y el N-terminal sintetizado en primer lugar en el citosol.

La mayora de las protenas sintetizadas llegarn al aparato de Golgi, en el cual podrn sufrir
diferentes procesos de edicin para finalmente ser transportadas a su destino final. Uno de los
cambios que sufren es la formacin de puentes disulfuro mediante la catlisis de la disulfuro
isomerasa.

Las N-glicosilaciones se llevan a cabo en el retculo. Por un lado se van aadiendo diferentes
azucares a un compuesto de membrana denominado dolicol, isoprenoide de unos 14-24
unidades. Se produce una translocacin que deja la cadena azucarada en el interior del orgnulo
en el cual, por otro lado, se acaba de sintetizar una protena. El siguiente proceso es la unin de
la cadena oligosacrida a la protena y la consiguiente separacin del dolicol que continuar en la
membrana para que se sintetice en ella otra cadena oligosacrida. Las O-glicosilaciones se
realizan en Golgi por adicin serial de unidades de monosacridos.

La tunicamicina es una molcula estructuralmente anloga a la enzima que lleva a cabo el

proceso de N-glicosilacin. Gracias a este antibitico se ha conseguido saber cul es la funcin
de los oligosacridos que se unan a las protenas, ya que la sntesis de estas no quedaba inhibida.

Modificaciones post-traduccionales.

Es el conjunto de procesos que modifican las protenas una vez ha finalizado su sntesis, con
el objetivo de contribuir a su plegamiento, a su activacin o a la regulacin de su activacin o
situacin en el interior celular. Existen muchsimos procesos descritos de los cuales debemos
diferenciar si se basan en una maduracin de la protena o en un cambio regulatorio de la misma.

El plegamiento se puede llevar a cabo mediante protenas libres denominadas Hsp 70-ATP,
sin embargo los plegamientos ms complejos se llevan a cabo en las chaperonas. Cuando es
necesario degradar una protena para disminuir su actividad o por que posee alguna mutacin, la
estructura peptdica se ubiquitina. Esto provoca una unin covalente de este pptido de 76
aminocidos que es reconocido por los proteosomas que las degradarn en pptidos. Existen tres
factores importantes para que se den este proceso: unin, transporte y regulacin.
Tema 46. I. Introduccin a la ingeniera gentica.

Las enzimas ms utilizadas en la biotecnologa son:

Nucleasas. Mellan, cortan o degradan el ADN. Lo consiguen hidrolizando el enlace

fosfodister que une un nucletido con el siguiente. Pueden actuar sobre doble hlices o
sobre la cadena sencilla.
o Exonucleasas. Actan sobre los extremos del ADN, habitualmente de forma
inespecfica.
o Endonucleasa. Actan rompiendo enlaces internos de la molcula de ADN.
Tambin pueden reconocer secuencias de manera especfica, en cuyo caso se
denominan enzimas de restriccin.
Tipo I. Requieren ATP, cortan de manera inespecfica y pueden modificar el
ADN, metilacin.
Tipo II. No requieren ATP, no modifican el ADN, reconocen secuencias
especficas pudiendo dar cortes romos o cohesivos (tipo de corte que
permite unirse de nuevo a las molculas por complementariedad de bases).
Generalmente la secuencia que reconocen es de tipo palindrmica con una
longitud tpica de 6 nucletidos. El mismo enzima puede cortar ms de una
secuencia especfica.
La frecuencia de los cortes depende del nmero de bases que contiene la
secuencia de reconocimiento, siguiendo generalmente una frecuencia de uno
de cada 4n nucletidos, siendo n el nmero de nucletidos de la secuencia
reconocida.
Tipo III. Requieren ATP, cortan de manera especfica y pueden modificar el
ADN, metilacin.
Ligasas. Unen molculas diferentes de ADN. En cualquier clula tiene como funcin
corregir las discontinuidades en la hebra de ADN causadas en el mecanismo de
replicacin de la hebra retardada del ADN, por la reparacin de errores en la replicacin
o bien por agresiones externas al ADN.

Su papel en la biotecnologa es el de catalizar la unin de fragmentos distintos de

ADN, tanto si son romos como si son cohesivos. Favorecen la formacin del enlace
covalente fosfodister entre el extremo 3 y el 5.

Fosfatasa alcalina. Provoca la de-fosforilacin de extremos 5 en molculas de ADN.

Cuando queremos utilizar un vector y pretendemos que no se una a nada por el
momento, a la que se produce la ruptura de las cadenas se utiliza esta enzima que
impedir que el plsmido se vuelva a unir, sean sus extremos del tipo que sean. Luego
gracias a las ligasas s podremos unir el fragmento gentico que queramos, pero no se
habr unido nada por s mismo gracias a esta enzima.
Enzimas modificadoras. Aaden o eliminan grupos, como las quinasas o las
transferasas.
Polimerasas. Sintetizan ARN o ADN, o bien completan la sntesis de molculas
previas.
 o Transferasas en mamferos. ADN polimerasa que cataliza la adicin de
nucletidos al extremo 3 de tipo romo en cadena simple o doble. Facilita los
ensayos de clonacin cuando no hay extremos compatibles. Aade en una de ellas
una repeticin de guaninas y en la que se pretende unir una serie de citosinas.
De esta manera la unin se establece por complementariedad confiriendo alta
resistencia de enlace.
o Retrotranscriptasa. A partir de una cadena de ARNm maduro, con cola poli-A, se
une la polimerasa que comenzar con el oligo dT. A partir de este cebador se
genera una hebra de cADN y posteriormente su hebra complementaria.

Mapas de restriccin.

Son una representacin del genoma de un organismo en el cual se representa grficamente el

lugar exacto por el que una enzima de restriccin determinada corta el ADN. Las aplicaciones
que con ello se han conseguido bsicamente se basan en la identificacin de genes, diagnstico y
clonaje de genes.

Tcnica de anlisis de cidos nucleicos.

Cuando desnaturalizamos el ADN, aumentando la temperatura o disminuyendo la

concentracin de sales, se produce la separacin de las cadenas. Cuando analizamos el resultado
observamos que las hebras sencillas absorben ms luz que la doble cadena, a esta propiedad la
denominamos hipercromicidad.

Esta propiedad podemos utilizarla a la hora de cuantificar cuantas cadenas de ADN han
hibridado con alguna sonda, al realizar el anlisis de la muestra completa. Este proceso en
condiciones experimentales de alta selectividad garantiza la especificidad en la interaccin. Se
puede dar la reaccin entre cadenas de ADN y ARN.

Existen diferentes procesos basados en la hibridacin en filtro: Southern, Northern, Colony

hibridation y dot-blot. Adems de la hibridacin en solucin y la hibridacin in situ.

Southern. Se basa en un proceso que comienza con la digestin del ADN para realizar una
electroforesis. Una vez que se obtiene se utiliza un papel de filtro para que a l se adhieran parte
de cada segmento nucleico que haya quedado en la electroforesis. En este papel se extienden
diferentes sondas marcadas de manera diferente para poder, finalmente localizar los diferentes
genes a partir del marcaje.

Para la interpretacin de estas pruebas se ha de conocer las propiedades de cada sonda y el

mapa de restriccin de la clula. A partir de l podremos distinguir los diferentes alelos gnicos.

PCR.

Este proceso se basa en diferentes reacciones recogidas en tres ciclos diferentes. En cada uno
de ellos se eleva la temperatura para desnaturalizar las cadenas de ADN, principalmente. En el
primero de ello se separan las hebras, con el segundo se consigue la unin con el cebador y en
el tercero comienza la reaccin de la polimerasa. Finalmente con un nmero n de veces
obtendremos un total de 2n copias de cada cromosoma.
 Dado que la enzima tambin se desnaturalizara en cada ciclo al aumentar la temperatura se
pas a utilizar una proveniente de eucariotas que habitaban en las fumarolas de volcanes
subacuticos, y de esta manera solucionaron este posible inconveniente. Existen diferentes tipos
de polimerasa, la ms importante es la TAQ, pero tambin existe la PFU y la VENT.

La primera tiene la mayor tasa de error y la segunda, por el contrario, la menor tasa de error
conocida en este tipo de enzimas. La tercera, aunque tiene una tasa de error intermedia, posee
actividad exonucleotdica al igual que la PFU.

Diseo de oligos. Existe maquinaria automtica que permite fabricar oligonucletidos de

entre 15 y 25 bases. Generalmente tienen una temperatura de fusin entre 50C y 65C y un
contenido de guaninas y citosinas de entre el 40% y el 60%. No tienen posibilidad de
autoapareamiento.

RT-PCR. Es un tipo especial de reaccin en cadena pero a partir de ARN. Se da, por lo tanto,
despus de la retrotranscripcin. Este tipo de pruebas sirve para cuantificar la actividad de
determinados genes en diferentes tejidos o diferentes situaciones dentro de un mismo organismo.

Cuando se presenta ms de una banda en la electroforesis ser porque la misma sonda ha

hibridado con diferentes genes, aunque con secuencias muy parecidas. Estas diferencias de peso
corresponden a splicing alternativo.

Tema 46. Parte II. Vectores de clonacin y construccin de genotecas.

Un experimento de ADN recombinante generalmente presenta el siguiente esquema:

El ADN de un organismo donador se extrae, se corta con endonucleasas de restriccin y se

liga a otro ADN, vector de clonacin, para formar una nueva molcula de ADN recombinado.

Esta construccin se transfiere y mantiene dentro de una clula hospedadora. Proceso

denominado transformacin. Los vectores de clonacin ms comunes son plsmidos, pero
tambin pueden ser bacterifagos, csmidos y YAC (cromosomas artificiales), dependiendo de
las caractersticas que se deseen.

Aquellas clulas que han tomado el vector se identifican y seleccionan, separndolas de

aquellas que no lo contengan.

Si es necesario, la construccin de ADN puede manipularse para asegurarnos que la protena

que es codificada por la secuencia de ADN clonado va a ser producida por la clula hospedadora.

El problema normalmente suele ser precisamente encontrar el injerto. Ya que conociendo el

mapa de restriccin de los vectores, el proceso que contina a la obtencin del injerto suele ser
relativamente sencillo. Para ello comenzamos utilizando en la muestra de ADN de la que
pretendo encontrar el injerto una enzima de restriccin conocida que sea la misma que vayamos
a utilizar con el vector. El plsmido que utilizar ser aquel en el que pueda injertar la secuencia
de ADN en medio de un gen conocido, es decir, que si se produce la unin una protena dejar de
traducirse.
 Una vez que haya unido todos los fragmentos de ADN con los plsmidos, podr diferenciar y
separar aquellas colonias que presenten la protena que no deberan, identificndolas con
aquellas colonias que no hibridaron con nada. El siguiente paso se basa en la unin de un papel
de filtro en el que depositar una pequea muestra de cada colonia, cada una de las cuales s que
tiene algn tipo de injerto.

Con una sonda que hibride con el gen que buscamos podemos saber en qu pocillo se
encuentra la colonia que posee el injerto deseado, y a partir de ah el proceso solo consiste en
aumentar el volumen de la colonia especfica. A partir de este plsmido, en el que conocemos
perfectamente su mapa de restriccin podremos seguir tratando con ellas para obtener finalmente
el injerto nicamente.

Utilizacin de fagos como vectores de clonaje.

Cuando un virus infecta a una bacteria esta puede provocar la replicacin del ADN vrico sin
implantarlo dentro de su genoma. La cantidad de material gentico aumentar de manera drstica
hasta que la bacteria finalmente se rompe. Este proceso se denomina ciclo ltico, para
diferenciarlo del proceso lisognico, que es aquel en el que el ADN vrico y el bacteriano se
unen en un mismo genoma.

El proceso comienza con el cultivo de un csped bacteriano en el cual depositaremos un nico

fago que producir una placa de lisis, es decir, una gota transparente. Generalmente se emplea el
virus lambda, muy conocido, cobre el cual eliminaremos parte no esenciales de un gen de la
replicacin para sustituirla por el gen que pretendemos clonar.

De la misma manera que hacamos con bacterias, utilizaremos un papel de filtro en el que
quedarn impregnados los restos de lisis y con una sonda podremos descubrir la zona de la
colonia bacteriana que posee nuestro gen. Una vez que obtenemos grandes cantidades de ADN
utilizaremos la misma enzima de restriccin utilizada en un principio con lambda para obtener el
injerto nicamente.

En ocasiones se le une al gen una serie de histidinas, para que si se encuentra en el genoma
de la bacteria podamos provocar nosotros la lisis celular y posteriormente pasar toda la muestra
por una columna de afinidad de histidina, gracias a la cual obtendremos muestras ricas en el
gen determinado.

Csmidos.

Son vectores de clonacin, que han sido ampliamente usados en la elaboracin de genotecas
de ADN genmico de gran tamao, ya que permiten la introduccin de inserto de ADN de hasta
45 kb, el doble que los vectores derivados de la parte del genoma del fago lambda. Un csmido
contiene un plsmido, el oriC y un gen de resistencia a antibiticos.

Tema 48. Bases moleculares de la respuesta inmune.

Mecanismos de defensa naturales.

Barreras. Las barreras son primera lnea de defensa que poseen los organismos. Son de tipo
inespecfica y se basan en la piel y epitelios y en las secreciones.
 Inmunidad innata. Es una barrera secundaria que se basa en la defensa de fagoctica como
los macrfagos y los neutrfilos, de la actividad de natural killers y del sistema complemento.

Inmunidad adaptativa o adquirida. Es el primer tipo de barrera especfica. La respuesta

inmune se divide en respuesta celular, marcada por los linfocitos T, y por la respuesta humoral,
marcada por los linfocitos B. La primera se basa en el ataque contra clulas infectadas por virus,
hongos, parsitos y tejidos extraos. La respuesta humoral en cambio se basa en un marcaje
contra bacterias, fases extracelulares de la infeccin vrica y algunos parsitos.

Respuesta inmune.

Comienza con la digestin de los cuerpos extraos para el organismo por parte de
macrfagos y clulas dendrticas. Estas poseen un complejo proteico de histocompatibilidad,
de tipo I o tipo II, en la cara externa de su membrana en el cual alojarn un fragmento del cuerpo
digerido. Estas son, por tanto, las clulas presentadoras del antgeno.

Los linfocitos Tc (CD8) poseen en sus membranas receptores para diferentes antgenos,
TCR, y mediante estos complejos se producir la unin entre la CPA y el linfocito Tc. Esta
unin provocar la secrecin de interleucinas que activar al linfocito para que se produzca la
eliminacin citotxica. A partir de esta primera unin el linfocito ser capaz de reconocer la
secuencia aminoacdica en diferentes cuerpos celulares para provocar la misma respuesta.

Los linfocitos B no poseen receptores en la cara externa de la membrana sino anticuerpos, es

decir, inmunoglobulinas igualmente muy especficas para cada antgeno. Esta interaccin
provocar la eliminacin a partir del sistema complemento.

Los linfocitos Th (CD4) son un tipo de clulas que provocan, al unirse con los antgenos, una
respuesta secretora que provocar un aumento en la replicacin de linfocitos Tc y B, adems de
la sntesis de gran cantidad de anticuerpos en el plasma sanguneo. Son a este tipo de clulas a
las que ataca directamente el VIH provocando la respuesta autoinmune.

Caractersticas de la respuesta inmune. Es muy especfica y proporciona respuesta a una

gran diversidad de antgenos. Posee la propiedad de memoria lograda por la produccin de
inmunoglobulinas G que permitirn una respuesta con mayor celeridad en un segundo ataque.

Conceptos importantes.

Antgeno. Molcula capaz de provocar la respuesta inmune.

Eptopo. Cada uno de los fragmentos de la secuencia de aminocidos reconocida por los
anticuerpos.

Hapteno. Molcula pequea contra la que hay respuesta inmune, aunque no suele haber para
molculas de pequeo tamao. Por lo tanto se unen a una protena para que el organismo s sea
capaz de producir anticuerpos contra esta molcula.

Adjuvante. Sustancia que provoca que la molcula en cuestin sea ms antignica, esto en un
principio se basa en las diferencias con protenas del propio organismo.
 Complejo de histocompatibilidad. Glicoprotenas que se unen a fragmentos peptdicos, con
el fin de presentarlas a las clulas T. Es importante su estudio para evitar rechazo en trasplantes.
Existen muchos genes que codifican antgenos de histocompatibilidad.

Las de tipo I se basan en una nica cadena, que en algunos casos se encuentra unida a otras
protenas. Estos complejos sacan pptidos del interior celular, luego no suelen provocar
respuesta inmune, a no ser que la protena traducida proceda de ADN vrico, por lo que s se
eliminara esta clula entera. Las de tipo II son dos pptidos capaces adems de presentar
pptidos de mayor tamao. Estos complejos sacan pptidos digeridos a partir de clulas
procedentes del exterior.

En estos genes existe una gran variedad de polimorfismos con funcin protectora. Cada uno
hace que la unin de un fragmento antignico determinado presente una afinidad caracterstica.

Anticuerpos, tipos y caractersticas.

Existen diferentes tipos de Ig. En todos ellos se presentan dos cadenas pesadas y dos ligeras
unidas entre s por puentes disulfuro. Siempre localizan a los antgenos por la parte variable del
anticuerpo, especfica de cada uno. Las cadenas pesadas tienen tambin una cadena constante
dentro del mismo grupo que lo define. Las ligeras por su parte pueden ser de tipo lambda o
kappa. Las ms abundantes en el organismo son las Ig A, en sangre las Ig G.

Las Ig M son fijadoras del complemento y tambin opsonizadoras, se basan en la respuesta

primaria. Las Ig A se secretan en la leche y son resistentes a ambientes cidos, presentes en
mucosas. Las Ig G se fijan al complemento y ayudan a las natural killer, adems pueden
atravesar la placenta y proteger al feto. Las Ig E provocan la reaccin inflamatoria, causando las
alergias. Las Ig D estn en los linfocitos B, intervienen en la maduracin a linfocitos.

La produccin de estos anticuerpos podr suponer diferentes tipos de respuestas. Pueden

neutralizar el antgeno al unirse a l, pueden provocar la opsonizacin del mismo para su
posterior digestin. Adems pueden, unidos a clulas citotxicas, atrapar el parsito para impedir
que cause dao, esto provocar la inflamacin.

Reaccin antgeno-anticuerpo.

Existen eptopos reconocidos que se encuentran, linealmente, separados por lo que el

anticuerpo no es capaz de reconocerlo si la protena se encuentra desnaturalizada. Esto se
denomina determinante conformacional. El determinante lineal es aquel que en el que la relacin
de los dos cuerpos se da, independientemente del estado de la protena. Por ltimo, el
determinante neo-antignico, es aquel en el que la relacin se da cuando la protena sufre una
protelisis.

La unin entre diferentes subunidades de las cadenas largas de las inmunoglobulinas permite
cierta flexibilidad, de esta manera un mismo anticuerpo puede unirse a dos eptopos, uno en cada
extremo, pudiendo estos encontrarse a distancias diferentes entre s.
 Segn un anticuerpo pueda unirse a uno, dos o varios eptopos determinaremos que es
monovalente, bivalente o polivalente, consiguiendo progresivamente un mayor nivel de avidez.
Por lo tanto esta propiedad es mayor en la Ig M que en la de tipo G.

El sistema complemento.

Es un conjunto de unas 25 protenas plasmticas que complementan la funcin de los

anticuerpos y respuesta inmune activando procesos como fijacin para provocar la lisis celular,
opsonizacin con la protena C3b y activacin de la respuesta inflamatoria, en la que intervienen
las protenas C5a, C4a y C3a.

Se basa en una progresin en cascada. Luego la respuesta aumenta exponencialmente. Existen

dos vas diferentes que confluyen ambas en un mismo punto para finalmente digerir la clula
afectada. Otra tercera va activada es activada por lectina.

Va clsica. Se produce la unin de anticuerpos a antgenos multivalente, y a los anticuerpos

se une la protena C1, formada por seis subunidades: C1q de unin a la siguiente protena, y C1r
y C1s son zimgenos activos al producirse la unin del complejo con el anticuerpo.

Se produce a continuacin la unin con C4 en C1q y las otras dos subunidades provocan la
ruptura de parte de C4, activndola: C4b, que se une covalentemente con la superficie antignica
y a anticuerpos separndose de C1q.

Se une C2 a C4, escisin de C2 para formar el complejo C4bC2a, convertasa de C3. Este
provoca la ruptura de molculas de C3 libres y una vez activadas se unen como C3b a la
superficie antignica y al complejo C4bC2a para formar la convertasa de C5.

La escisin de C5 inicia las etapas finales de la activacin del complemento al comenzar la

formacin del MAC, complejo de ataque de membrana. La C5a se unir a C6, C7, C8 y C9 para
formar un poro en la membrana celular. La creacin de un nmero elevado de estos provocar
una variacin drstica del potencial electroqumico que causar la muerte de la clula.

Va alternativa. Comienza por la escisin espontnea de C3 a C3b. Normalmente se suelen

degradar, pero a veces se une directamente a la superficie microbiana unindose a la protena B,
formando todo ello el complejo de la convertasa C3 alternativa. Este complejo puede provocar la
activacin a C5b quien contina con las fases ya descritas.

Va activada por lectina. Intervienen diferentes protenas como las MBL y las MASP. Las
primeras son protenas que se unen a manosas de patgenos. La segunda por su parte es una
protena plasmtica que se une a la anterior, con actividad convertasa.

El proceso comienza por la unin de MBL al patgeno, y la consiguiente adaptacin a ellas de

MASP. Este complejo se comporta como la convertasa de C3, activndola a C3b que continuar
de la manera ya descrita anteriormente. La protena C3b tambin puede actuar como
opsonizadora, en lugar de continuar el ciclo para formar el poro.
 Variabilidad de anticuerpos.

Se debe a la recombinacin en clulas somticas, un proceso muy variable. De los diferentes

fragmentos del gen que codifica la cadena ligera, encontramos muchas secuencias variables (V)
y otras tantas de unin (J). Para formar la inmunoglobulina solo se traducir una secuencia de
cada una de ellas, por lo tanto si en cada gen se encuentran un nmero elevado de cada una las
posibilidades finales son amplsimas.

Para las cadenas pesadas ocurre algo parecido, sin embargo en estos genes aparece adems un
tipo de alelo (D). Aproximadamente la cantidad de regiones V es de 100, de regiones J es de 6 y
de regiones D es de 4. Las posibles selecciones se llevan a cabo gracias a una enzima que escoge
aleatoriamente, pudindose regular sin embargo, llamada RAG. Luego la Tdt se encargar en
ocasiones de introducir nucletidos entre las secuencias VJ, para aumentar la variabilidad aun
ms.

Obtencin de los anticuerpos monoclonales.

Los anticuerpos se generan de manera muy especfica e individualmente. Para obtener

grandes cantidades de un anticuerpo en animales hay que seguir un proceso bsico:

Se introduce el antgeno dentro del animal, ratn en nuestro caso. Se le extirpa el bazo y de l
sacamos los linfocitos. Por otro lado cultivamos clulas tumorales de ratn incapaces de
sintetizar purinas, luego el medio deba contener grandes cantidades de ellas.

Fusionamos las dos colonias celulares con PEG y las introducimos en un medio sin purinas,
por lo que solo las clulas que se hayan fusionado correctamente podrn continuar viviendo y
replicndose. Conociendo la cepa correcta podemos empezar la clonacin in vitro o in vivo.