Biosorcin de cinc y

cadmio de soluciones
acuosas
Tesis en opcin al grado de Doctor en Ciencias
Biolgicas

Mara Elena Carballo Valds (Autor); Iris Maldener (Tutor) y Mario Cruz Arias
(Tutor)
 Universidad de La Habana
Facultad de Biologa
Departamento de Microbiologa y
Virologa

Tesis presentada en opcin al Grado Cientfico de Doctor

en Ciencias Biolgicas

Biosorcin de cinc y cadmio de soluciones acuosas por

biomasas microbianas

Aspirante: MSc. Mara Elena Carballo Valds

Tutores: Dr. Mario Cruz Arias

Dra. Iris Maldener
Asesora: Dra. Orqudea Coto Prez

Ciudad de La Habana

2009
 Pgina legal

571.6-Car-B
Biosorcin de cinc y cadmio de soluciones acuosas por biomasas microbianas /
Mara Elena Carballo Valds (Autor) y Iris Maldener (Tutor) y Mario Cruz Arias
(Tutor). -- Tesis en opcin al Grado de Doctor en Ciencias Biolgicas. Ciudad de
La Habana : Editorial Universitaria, 2009. -- ISBN 978-959-16-1119-2. -- 150 pg.

1. Carballo Valds, Mara Elena (Autor)

2. Maldener, Iris (Tutor)
3. Cruz Arias, Mario (Tutor)
4. Ciencias Biolgicas

Digitalizacin: Dr. C. Ral G. Torricella Morales (torri@reduniv.edu.cu)

Instituto de Investigaciones para la Industria Alimenticia - Editorial

Universitaria del Ministerio de Educacin Superior, 2009.

La Editorial Universitaria (Cuba) publica bajo licencia Creative

Commons de tipo Reconocimiento No Comercial Sin Obra Derivada, se
permite su copia y distribucin por cualquier medio siempre que
mantenga el reconocimiento de sus autores, no haga uso comercial de las
obras y no realice ninguna modificacin de ellas.
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AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Mayra Heydrich, a la Dra. Cristina Daz y a la MSc. Ana Isabel Fernndez por las que
di mis primeros pasos en esta investigacin.
A Mandi por que de inicio a fin he podido contar con su apoyo sin el cual no hubiera sido
posible llegar al da de hoy.
A mi Tutor Dr. Mario Cruz Arias por sus conocimientos, apoyo, por siempre confiar en m y por
permitirme establecer con l ms que una relacin profesional una hermandad.
A mi tutora Dra. Iris Maldener, que siempre me transmiti sus experiencias y conocimientos,
por su inters y empeo en el desarrollo de este proyecto, por su cario y admiracin a Cuba, lo
cual permiti formar una familia cubana-alemana.
A la asesora Dra. Orqudea Coto Prez por su colaboracin, sugerencias certeras y empeo en
el xito de la terminacin de este trabajo.
A Irina por su apoyo, colaboracin y por haber ampliado el colectivo con Frank, dispuesto
siempre a contribuir con sus conocimientos de computacin en momentos decisivos.
A mis compaeros de trabajo del Departamento de Microbiologa y Virologa que de diferentes
maneras me apoyaron y contribuyeron a la culminacin de este trabajo. Los jvenes por su
colaboracin en la docencia, los de experiencia acumulada por compartir responsabilidades y
transmitirme sus conocimientos y a la Dra. Suria Valds y Dra. Annia Hernndez por la amistad
ms all del apoyo brindado como jefas del Departamento durante estos aos.
Al Departamento de Biologa Vegetal, que en muchos momentos apoy con sus recursos el
desarrollo de este trabajo y en especial a Maritza.
A la Dra. Victoria Pazos Rivera, Dra. Marcia Rojas Bada y Dr. Jorge Luis Santana por sus
crticas y constructivas oponencias durante el proceso de predefensa. Este agradecimiento es
extensivo a los miembros del Consejo Cientfico de la Facultad de Biologa, Universidad de la
Habana por todo lo que aportaron al mejoramiento del documento y de la defensa.
A la direccin del Consejo Cientfico de la Facultad de Biologa, a la direccin de la Facultad y
a la direccin del Tribunal permanente de Grados Cientficos por la comprensin y apoyo moral,
espiritual y tcnico en momentos muy difciles. Muy especialmente a los Doctores: Marta Prez,
Georgina Espinosa, Fabiola Pazos, Alicia Otazo, Mayra Heydrich y Anselmo Otero.
A los colegas del laboratorio de Fisiologa Vegetal, Universidad de Regensburg, en especial a
Stefan y a Mnica.
A los colegas del Laboratorio de Investigaciones y Servicios de Anlisis Qumico del Instituto
de Materiales y Reactivos. Universidad de la Habana por la disposicin a colaborar siempre
desinteresadamente en los anlisis de las muestras.
A todos mis alumnos de pre y postgrado que han trabajado en el tema.
A Gilda, a Marcia y a Miguel por sus valiosas sugerencias y adecuadas observaciones.
Muy especial a Vita por su amistad y por la dedicacin que ha tenido para transmitirme sus
conocimientos y experiencias.
A la Dra. Dania Prieto por su apoyo, preocupacin y amistad.
A Auro, a Lourdes, a Elsa, a Aleida y dems muchachitas del decanato con las que siempre he
podido contar.
A Karin, Barbara, Edrwar y a los amigos de Regensburg por apoyarme en todo momento.
A Gloria Maria y a Charo por tantas cosa que no es fcil de decir en una o dos lneas pero desde
mi corazn las resumo en MIL GRACIAS POR TODO mis hermanas.
A Ftima, a Nereida, a Aimet y a Elvirita por su disposicin en colaborar, preocupacin y
amistad.
A Tere, Ana y Mario mis hermanos de siempre en la cercana y en la distancia.
A mis vecinos que para nada han estado alejados de este trabajo, en especial a Fifi, Lieti y
Norge por toda la ayuda.
Y por ltimo, no siendo menos importante a toda mi familia, en particular a mima por que
siempre estar conmigo y no es suficiente dedicarle este trabajo para agradecerle su amor y
apoyo incondicional durante mi desarrollo personal y profesional. A Cary por que es una
HERMANA en mayscula y sin ella todo hubiera sido ms difcil. A Ral por los 26 aos que
ha estado siempre a mi lado asumiendo muchas y muchas actividades y responsabilidades para
que pudiera llegar a este momento y por entenderme y a Raulito por ser mi inspiracin y tener
su comprensin por el tiempo que no le he podido dedicar.
A todos los que me apoyaron, desde un apalabra de aliento, una idea, un consejo y con recursos
tcnicos y materiales.

A todos Muchas Gracias.

 A MIMA,
A MI FAMILIA
 INDICE
Pg.
Sntesis. i
Lista de Abreviaturas.. ii
INTRODUCCIN.. 1
CAPTULO I: REVISIN BIBLIOGRFICA.. 8
I.1. Metales.. 8
I.2. Remocin de metales. 9
I.3. Biorremediacin 11
I.3.1. Principales mecanismos del proceso de biosorcin de iones metlicos. 13
I.4. Modelos de evaluacin de la sorcin de metales por biomasa microbiana.. 14
I.5. Remocin de metales por microorganismos. 14
I.5.1. Bacterias.. 15
I.5.2. Hongos. 16
I.5.3. Microalgas... 17
I.5.4. Biorremediacin por consorcios microbianos. 18
I.6. Factores que influyen en la remocin de metales por microorganismos.. 18
I.7. Tcnicas de ingeniera gentica en la remocin de metales. 21
I.7.1. Metalotionenas... 21
I.7.2. Fitoquelatinas.. 23
I.7.3. Expresin de pptidos y protenas sobre la superficie celular. 23
I.8. Ventajas y aplicaciones de los procesos microbianos en la remocin de iones
metlicos... 24
CAPTULO II: MATERIALES Y MTODOS.. 26
II.1. Aislamiento de microorganismos. 26
II.2. Material biolgico 27
II.3. Medios de cultivo. 28
II.4. Determinacin de la capacidad de captura de cinc y cadmio.. 28
II.4.1. Anlisis del metal residual 29
II.5. Efecto de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio de solucin acuosa. 29
 II.5.1.Efecto del estadio fisiolgico del cultivo en la remocin de los metales.. 30
II.5.2. Efecto de la concentracin celular en la remocin de los metales... 30
II.5.3. Efecto del pH en la remocin de los metales... 30
II.5.4. Efecto de la concentracin inicial del metal en el proceso de remocin... 30
II.5.5. Efecto de la competencia nter inica... 31
II.6. Evaluacin del efecto de tratamientos fsicos y qumicos a la biomasa microbiana
sobre la remocin de cinc y cadmio 31
II.7. Determinacin del metal capturado en la superficie celular de las clulas no tratadas... 31
II.8. Evaluacin del efecto de modificaciones genticas en Anabaena sp. PCC 7120
sobre la remocin de cinc y cadmio 32
II.8.1. Amplificacin de los fragmentos por la reaccin en cadena de la polimerasa. 33
II.8.2. Anlisis de restriccin... 34
II.8.3. Electroforesis en gel de agarosa 34
II.8.4. Construccin de vectores.. 35
II.8.5. Transformacin y seleccin de los clones transgnicos 36
II.8.6. Anlisis de los clones 37
II.8.7. Conjugacin y transformacin de cianobacteria... 37
II.8.8. Remocin de los metales por las cepas transgnicas de Anabaena sp. PCC 7120. 38
II.9. Cintica de biosorcin de cinc y cadmio. 38
II.10. Determinacin de la eficiencia de biosorcin de cinc y cadmio 39
II.11. Evaluacin del equilibrio de biosorcin de cinc y cadmio 39
II.11.1. Isotermas de biosorcin de cinc y cadmio.. 39
II.11.2. Aplicacin de los modelos de equilibrio de biosorcin.. 39
II.12. Biosorcin de cadmio por consorcios microbianos... 40
II.13. Anlisis biomtricos.. 41
CAPTULO III: RESULTADOS 42
III.1. Remocin de cinc y cadmio por aislados microbianos del ro Martn Prez y
microorganismos de colecciones.. 42
III.1.1. Remocin de metales por aislados microbianos. 42
III.1.2. Remocin de metales por microorganismos de coleccin.. 44
III.2. Evaluacin de la influencia de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio.. 47
III.3. Remocin de cinc y cadmio por biomasas tratadas por mtodos fsicos y qumicos. 54
 III.4. Efecto de modificaciones genticas a Anabaena sp. PCC 7120 en la remocin de
cinc y cadmio... 56
III.4.1. Construccin de vectores y transformacin en Escherichia coli DH10B.. 56
III.4.2. Conjugacin en Anabaena sp. PCC 7120... 61
III.4.3. Evaluacin de la determinacin de la remocin de cinc y cadmio por los
clones de Anabaena sp. PCC 712. 62
III.5. Determinacin de la cintica de biosorcin de cinc y cadmio... 66
III.6. Evaluacin del efecto de la combinacin de los factores, tratamientos y
modificaciones a las biomasas sobre la eficiencia del proceso de biosorcin de
cinc y cadmio.. 67
III.7. Descripcin e interpretacin del equilibrio de biosorcin de cinc y cadmio 68
III.8. Biosorcin de cadmio por consorcios microbianos 71
CAPTULO IV: DISCUSIN. 75
IV.1. Remocin de cadmio y cinc por microorganismos de coleccin y aislados del ro
Martn Prez 75
IV.2. Efecto de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio. 80
IV.3. Mejoramiento de las capacidades biosortivas de cinc y cadmio en biomasas
microbianas. 85
IV.4. Combinaciones de las mejores condiciones experimentales para la biosorcin de cinc
y cadmio. 90
IV.5. Descripcin del fenmeno de sorcin en cada meta.. 91
IV.6. Remocin de cadmio por consorcios microbianos. 93
CONCLUSIONES... 96
RECOMENDACIONES.. 98
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
ANEXOS
 SNTESIS

La remocin de cinc y cadmio por microorganismos, constituye una temtica de gran

importancia debido a las ventajas de los mtodos biolgicos para reducir o eliminar estos
metales txicos, los que se han detectado como contaminantes en diferentes ecosistemas en el
pas. El tamizaje microbiano que se realiz en el trabajo experimental de la presente Tesis
mostr las potencialidades de las biomasas microbianas en la captura de ambos metales y
permiti la seleccin de microorganismos de colecciones (Pseudomonas mendocina (Ps-1)
Anabaena sp PCC 7120, Saccharomyces cerevisiae (10), Chaetoceros ceratosphorus (1P)) y de
microorganismos autctonos (bacterias A6, CBM4 y microalga CMM6) por las capacidades que
presentaron para capturar estos iones metlicos de soluciones acuosas. Se determin el efecto
de diferentes factores asociados al proceso de remocin de los metales y se definieron las
condiciones que aumentaron la captura de cinc y cadmio por cada microorganismo
seleccionado, demostrndose que la edad fisiolgica del cultivo, el pH y la concentracin inicial
del metal en solucin presentaron la mayor influencia sobre la captura, que dependi del
microorganismo y del metal. La aplicacin de tratamientos fsicos y qumicos a las biomasas
microbianas permiti constatar la efectividad de las clulas inactivadas por calor seco a 60 C
durante 12 h en el incremento de las capacidades de biosorcin de ambos metales. La
modificacin gentica de Anabaena sp. PCC 7120, que logr expresar una metalotionena
procaritica en la superficie celular de esta cianobacteria, duplic la captura y eficiencia de los
iones cadmio y evidenci la factibilidad de remover estos iones por parte de la cepa transgnica.
A partir de los diferentes procedimientos evaluados se combinaron las variantes que ms
favorecieron la remocin de los metales. Los resultados demostraron que en un tiempo de
contacto biomasa-metal de 10h, los monocultivos Pseudomonas mendocina (Ps-1) y
Saccharomyces cerevisiae-10, alcanzaron porcentajes de eficiencia en la biosorcin de cinc del
98 %. Estas dos cepas, la microalga autctona CMM6 y la cepa de cianobacteria transgnica de
Anabaena sp. PCC 7120 (PIM 141-7) lograron obtener porcentajes de eficiencia de biosorcin
de cadmio entre un 68 y 79%. La aplicacin de los modelos de isotermas de biosorcin de
Langmuir y de Freundlich permiti predecir la posibilidad de incrementar la captura de iones
cadmio. Dos consorcios microbianos diseados a partir de los cuatro microorganismos
seleccionados, aumentaron la eficiencia de biosorcin de cadmio a 85,4 y 96,7%. La integracin
de estos resultados permiti establecer una estrategia experimental integral para obtener
biomasas microbianas eficientes en la biosorcin de cinc y/o cadmio de soluciones acuosas.
i
 Lista de Abreviaturas utilizadas en el trabajo
xg Fuerza de gravedad
ADN cido desoxirribonucleico
ATP Trifosfato de adenosina
BLAST Programa para secuencia de nucletidos contra
Base de datos de nucletidos
CIP Fosfatasa alcalina de intestino bovino
E Eficiencia
EAA Espectrofotometra de Absorcin Atmica
EDTA cido etilendiaminotetraactico
Omp Protenas de membrana externa
LMPP Lmites mximos permisibles promedio
MT Metalotionenas
NC Norma cubana
OMS Organizacin Mundial de la Salud
PC Fitoquelatinas
RCP Reaccin en cadena de la polimerasa
SDS Dodecilsulfato de sodio
TBE Tampon de corrida de electroforesis
LB Luria-Bertani

ii
INTRODUCCION

El desarrollo industrial y agrcola, as como la tendencia mundial a la urbanizacin han

contribuido considerablemente a la contaminacin ambiental, la cual constituye un problema
en la actualidad a nivel mundial (Vullo, 2003; Saldivar, 2005). Entre los diversos
contaminantes ambientales, los metales ejercen marcados efectos dainos sobre la composicin
de la biota y el equilibrio de los ecosistemas, debido a su alta toxicidad (Maier, 2003; Lomeli
y Tamayo, 2005).

La extraccin de metales de sus fuentes naturales ha conllevado a la liberacin y redistribucin

de una porcin de stos en la biosfera. Actualmente se calcula que existen un gran nmero de
sitios contaminados por diferentes elementos metlicos, debido fundamentalmente a la
industria minera y petrolera (Torres, 2007; Monge, et al, 2007). Entre estos sitios se encuentran
flujos de aguas naturales y artificiales contaminados con cinc y cadmio en pases tales como
Mxico (Botello et al., 1998), Venezuela (Martnez y Senior, 2001), Argentina (Massaccesi et
al., 2002), Chile (Moroga et al., 2003) y Espaa (Aguilera et al., 2006). Los metales pueden
incorporarse a los sistemas vivos y persistir de manera indefinida en el ambiente, debido a que
no se degradan por va biolgica ni qumica. La movilidad que presentan estos contaminantes
inorgnicos en los ecosistemas acuticos naturales y lo txico que resultan para las formas
superiores de vida, hacen que su eliminacin se considere un asunto de gran prioridad
(Villanueva, 2000; Prez-Rama et al., 2002).

La contaminacin de las aguas por cinc y cadmio constituye un riesgo para la salud pblica. El
ion cadmio, incluso a bajas concentraciones, ejerce efectos perjudiciales muy acentuados, que
pueden resultar irreversibles en actividades biolgicas vitales en los seres vivos, ejemplo de
ello son las lesiones en pulmones, riones y huesos (Sinott, 2001) y los daos que puede
ocasionar en el sistema nervioso central (Navarro et al., 2006). Al cadmio, tambin se le
atribuye accin carcinognica, embriotxica, teratognica y mutagnica (Majumder et al.,
2003). Todos estos efectos, han propiciado la inclusin de este metal dentro de los
contaminantes txicos prioritarios por parte de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) y
en el Registro Internacional de Sustancias Potencialmente Txicas (IRPTC, 1993). En el caso
del ion cinc, entre los efectos nocivos que causa se encuentran afectaciones al sistema
digestivo y respiratorio, as como accin carcinognica, cuando est presente a concentraciones

1
elevadas (>1 000 g) en los organismos vivos (Volesky, 1994; Navarro et al., 2006).

Para solucionar la contaminacin de los cuerpos de agua por metales, se han aplicado
diferentes tecnologas qumicas y fsicas. Estas han presentado limitaciones, debido a los
requerimientos de reactivos costosos que en ocasiones pueden provocar contaminaciones
adicionales (Deepa et al., 2006). Adems, no resultan tiles para reducir los niveles de metales
a los estndares aceptables regulados, en particular, cuando los contaminantes metlicos se
encuentran a concentraciones menores a 100 ppm (Filipipovic et al., 2000).

Los sistemas biolgicos empleados en los tratamientos secundarios para la eliminacin de la

materia orgnica y de microorganismos, no incluyen la etapa especfica para la remocin de
metales de residuos industriales (Pieper y Reineke, 2000). Consecuentemente, con este tipo de
procedimiento aplicado a efluentes con especies metlicas, se produce la formacin de lodos
con una elevada carga de metales que restringe su uso como fertilizante agrcola (Johnson,
2006).

De acuerdo a lo anterior, se hace necesario el desarrollo de nuevos enfoques y tecnologas para

disminuir el impacto ambiental negativo de los metales y preservar las aguas para asegurar la
integridad de los ecosistemas acuticos y recuperar los metales. Los procesos de
biorremediacin ofrecen soluciones ecolgicas, efectivas y econmicas para esta problemtica
ambiental (El-Sayed y El-Morsy, 2004).

La biorremediacin microbiana de ecosistemas acuticos contaminados con metales consiste

en el aprovechamiento de los diferentes mecanismos metablicos y/o caractersticas
estructurales de las bacterias, de las microalgas y de los hongos para modificar o eliminar estos
elementos txicos (Slaba y Dlugonski, 2004). Este proceso, incluye la bioacumulacin
(Hussein et al., 2004) y la biosorcin de metales (Ringot et al., 2006) que en sus aplicaciones,
permitirn disminuir las concentraciones de los contaminantes metlicos a niveles menores a
los lmites establecidos por las Agencias de control del Medio Ambiente y en ocasiones, a
concentraciones no detectables (De Olivera Franco, 2004).

Dadas las capacidades de los microorganismos de funcionar como bioadsorbentes o

bioabsorbentes de metales al retener los cationes que se encuentran en solucin acuosa, la

2
comunidad cientfica se ha interesado en el aislamiento de especies microbianas de fuentes
naturales contaminadas por metales (Kaushik et al., 2008) y de investigar los factores que
intervienen en el proceso de remocin de estos (Kim et al., 2005; Ray et al., 2005). Otras
estrategias estn encaminadas a la aplicacin de diferentes mtodos qumicos y fsicos a las
biomasas microbianas para modificar estructuras, tales como la pared celular y facilitar con
ello la captura de iones metlicos (Goksungur et al., 2005; Deng y Tin, 2007). Con este fin,
tambin se han desarrollado tcnicas de ingeniera gentica que han permitido expresar genes
de protenas que unen metales en las clulas microbianas (Kao et al., 2006; Singh et al., 2008),
aspectos que dan una medida de la actualidad e importancia del tema abordado en el presente
trabajo.

En Cuba, los iones cinc y cadmio, entre otros metales, estn identificados como parte de la
contaminacin de distintos ambientes. Estos metales se han detectado en el litoral norte de La
Habana (Lam et al., 1998), en la Baha de La Habana (Gali et al., 2005) y en diferentes ros de
Ciudad de La Habana, por ejemplo en el ro Martn Prez (Domnguez, 2000; Maqueira, 2005),
en el ro Quib (Henrquez et al., 2005) y en el ro Almendares (Olivares et al., 2005; 2007).
Estas contaminaciones se derivan del vertimiento a los cuerpos de agua de residuos domsticos
e industriales sin tratar, o con tratamientos deficientes (Cazorla et al., 2005; JICA, 2005;
Lpez et al., 2007). Otras investigaciones realizadas en el ro Almendares refieren para
sedimentos, concentraciones de iones cinc y cadmio de 700 g.g-1 y de 33 g.g-1,
respectivamente y en muestras de agua la presencia de cadmio a la concentracin de 0,483
g.L-1 (Rodrguez et al., 2006). Los valores detectados para estos metales, superiores a los
lmites mnimos permitidos en normas internacionales de calidad de los sedimentos y de fase
disuelta informadas por Martn y Whitfield (1983), evidencian la contaminacin del ro
Almendares.

En los vertederos urbanos de Ciudad de La Habana, se han detectado elementos como el cinc y
el cadmio, lo cual hace posible su incorporacin al medio (Olivares et al, 2006).
Anteriormente, se inform de concentraciones de cadmio en el orden del lmite mximo
admisible para el consumo en peces, en la presa Nia Bonita ubicada en los lmites de Ciudad
Habana, lo cual contribuy a la muerte de estos (Campos et al., 1998). En las aguas residuales
de los procesos galvnicos, los niveles de cinc de 40,82 mg.L-1 y para el cadmio de 70 mg.L-1

3
corresponden, a concentraciones muy superiores a los Lmite Mximo Permisible Promedio
(LMPP) de residuales industriales (Delgado et al., 2005) segn lo establecido en La Norma
Cubana de vertimiento de aguas residuales a las aguas terrestres y al alcantarillado (NC27,
1999).

Con el objetivo de aportar a la bsqueda de soluciones a este problema ambiental, en los

ltimos aos, en Cuba, se han desarrollado investigaciones cientficas en el campo de la
remocin de metales por microorganismos, para contribuir al tratamiento de los residuales y a
un desarrollo sostenible, lo cual requiere un mejor aprovechamiento de los recursos naturales y
asegurar el saneamiento y cuidado del entorno, en respuesta adems, a los principales tratados
internacionales de proteccin del ambiente a los cuales esta adscrito el pas (Del Toro et al.,
2001; Delgado et al., 2005). En este sentido se ha abordado la remocin de Ni2+ y Co2+ por
enterobacterias (Gmez et al., 2000), se han utilizado clulas inmovilizadas de Scenedesmus
obliquus en la captura de Cr3+ y Cd2+ (Pelln et al., 2005) y en la biosorcin de Cr3+, Cu2+,
Mn2+ y Zn2+ el empleo de Pseudomonas aeruginosa AT18 (Prez et al., 2008). Entre otros
materiales de origen biolgico investigados con este fin, estn una resina natural de taninos
para la sorcin de Hg2+ (Rodrguez et al., 2005) as como una mezcla de oligogalacturnidos
preparados a partir de la corteza de ctricos, para la adsorcin de Cu2+ (Cartaza et al., 2005).

No obstante, las investigaciones de orden bsico que pudieran sustentar posibles soluciones
prcticas a la contaminacin por metales en Cuba, an son incipientes y requieren profundizar
en los conocimientos de las interacciones entre los microorganismos y los metales, para lograr
un mejor aprovechamiento de los sistemas biolgicos en la remocin de estos elementos
dainos. En relacin a esto se plante como problema cientfico en la presente investigacin,
la carencia de biomasas microbianas para la reduccin o eliminacin eficiente de metales, en
particular iones cinc y cadmio, a partir de soluciones acuosas diluidas. En correspondencia al
planteamiento del problema, se sustenta la pertinencia y relevancia de esta investigacin que
estableci la siguiente hiptesis de trabajo:

La caracterizacin de factores asociados a la remocin de cinc y cadmio combinados con la

aplicacin de tratamientos fsicos, qumicos y modificaciones genticas a microorganismos
permitir obtener biomasas microbianas con capacidades de biosorber eficientemente estos
metales
4
Para demostrar esta hiptesis se traz el siguiente Objetivo General:

Obtener biomasas microbianas eficientes en la biosorcin de iones cinc y cadmio de

soluciones acuosas.

Para el cumplimiento de este objetivo general, se propusieron los siguientes objetivos

especficos:

Seleccionar microorganismos con capacidad de capturar iones cinc y cadmio de soluciones

acuosas a partir de colecciones microbianas y de aislados del ambiente.

Evaluar el incremento de la remocin de iones cinc y cadmio de soluciones acuosas a

travs de la influencia de factores que intervienen en el proceso y del efecto de tratamientos
fsicos y qumicos a los microorganismos seleccionados.

Obtener cepas transgnicas para incrementar la biosorcin de los metales mediante la

expresin de genes que codifican metalotionenas en la superficie celular.

Determinar en monocultivos y consorcios microbianos el incremento de la eficiencia de

biosorcin de cinc o cadmio a escala de laboratorio a travs de la combinacin de factores
biolgicos, fsicos y qumicos.

Esta investigacin tiene las siguientes novedades cientficas.

Por primera vez a nivel mundial:

Se obtuvo una cianobacteria transgnica de Anabaena sp. PCC 7120, la cual expres el
gen smtA que codifica para metalotionenas en el citosol de Synechococcus sp. PCC 7940.
Este gen fusionado a una protena de membrana externa, increment la capacidad
biosortiva de iones cadmio en la cepa transformada.

Se evidenci que los monocultivos de Pseudomonas mendocina (Ps-1) y de Saccharomyces

cerevisiae (10) para la biosorcin de iones cinc y consorcios microbianos constituidos por
una microalga autctona, una cianobacteria transgnica, Pseudomonas mendocina (Ps-1) y
Saccharomyces cerevisiae (10) para la biosorcin de iones cadmio, manifiestan capacidades
de biosorber eficientemente estos metales.
5
Por primera vez en Cuba:

Se demostr a escala de laboratorio la efectividad de la caracterizacin e integracin de

factores biolgicos, fsicos y qumicos que intervienen en la biosorcin de cinc y cadmio
para obtener biomasas microbianas eficientes en el proceso.

Importancia terica:

Se aporta al conocimiento de la expresin de una metalotionena procaritica, protena que

une metales, fusionada en una porina de la pared celular de Anabaena sp. PCC 7120 por
tcnicas de ADN recombinante.

Importancia prctica:

Se dispone de una coleccin microbiana con potencialidad para el saneamiento de

ambientes contaminados con cinc y cadmio. Esta coleccin incluye una cepa autctona de
microalga y una nueva cepa de cianobacteria transgnica.

Se aportan monocultivos de Saccharomyces cerevisiae (10) y de Pseudomonas mendocina

(Ps-1) para la biosorcin de iones cinc y dos consorcios microbianos para la biosorcin de
iones cadmio a partir de soluciones acuosas, con eficiencias en los procesos superiores al
85%.

Se ofrece una estrategia general integrada para evaluar y caracterizar microorganismos en

la remocin de cinc y cadmio, la cual permite desarrollar biosorbentes en monocultivos o
consorcios microbianos eficientes para la biosorcin de estos metales de soluciones
acuosas.

La tesis consta de 98 pginas, organizadas de la siguiente forma: Introduccin, Revisin

Bibliogrfica, Materiales y Mtodos, Resultados, Discusin, Conclusiones, Recomendaciones
y Referencias. Incluye 15 tablas, 25 figuras y 3 anexos.

Los resultados presentados en esta investigacin forman parte de seis publicaciones nacionales
y dos internacionales. Han sido presentados en 10 eventos cientficos nacionales y siete
internacionales. Han formado parte de 6 Tesis de Diploma y tres Tesis de Maestras. Parte de
los resultados han sido reconocidos y premiados en el Concurso Cientfico Tcnico de las BTJ
6
Municipal y Provincial (2006/2007), en el XVI Forum de Ciencia y Tcnica (2008), Facultad
de Biologa y Municipal, en as como en ocho logros cientficos de la Facultad de Biologa.
Universidad de La Habana. Premio Al resultado de investigacin del ao que ms haya
contribuido a la proteccin del medio ambiente en cuba (2008), Facultad de Biologa y
Universidad de La Habana (2009).

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CAPTULO I: REVISIN BIBLIOGRFICA
CAPTULO I: REVISIN BIBLIOGRFICA

I.1. Metales

Entre los problemas globales a que se enfrenta la comunidad internacional en estos momentos
se encuentra el creciente deterioro del ambiente. Este deterioro trae consigo la prdida de la
calidad ambiental que se incrementa a una velocidad vertiginosa con las actividades
antropognicas. Estas contribuyen al vertido de desechos txicos a ecosistemas naturales,
entre los que se destacan los metales. Estos contaminantes inorgnicos constituyen un grupo
cercano a los 40 elementos de la Tabla Peridica y se han identificado como contaminantes
altamente peligrosos (Martn et al., 2003; Wang y Chen, 2006).

Algunos metales, como Na1+, K1+, Mg2+, Ca2+, Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+ y Mo4+,
poseen un desempeo fisiolgico determinado por la esencialidad que presentan para el
desarrollo de funciones vitales en los organismos, ya sean estructurales o catalticas
(Caizares-Villanueva, 2000; Madigan et al., 2003). Este grupo de metales se ubica en dos
categoras: (1)-esenciales y bsicamente no txicos (por ejemplo Na1+, K1+, Mg2+ y Ca2+) y
(2)-esenciales, pero dainos a altas concentraciones como Fe2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Co2+, Ni2+ y
Mo4+. Otros metales al no cumplir una funcin biolgica en las clulas y presentar un mayor
poder contaminante por los efectos txicos que ejercen a los organismos y ecosistemas en
general, son ubicados en una tercera categora, que agrupa a los metales no esenciales y
txicos. Entre estos elementos metlicos se encuentran Cr6+, Cd2+, Hg2+ y el Pb2+ (Valls y De
Lorenzo, 2002).

La toxicidad que causan los metales sobre los organismos vivos va a depender de su
biodisponibilidad, determinada por la especiacin y concentracin de metal libre y lbil
(Krishnamurti y Naidu, 2000; Kim et al., 2002). Entre los efectos txicos que se les han
reconocido en las clulas, estn los relacionados con inactivaciones enzimticas e intercambios
que realizan con cationes fisiolgicamente esenciales para la vida celular, como los
constituyentes de metalo-protenas (Hu et al., 2005). Adems, provocan estrs oxidativo por la
formacin de radicales libres e interactan con el normal funcionamiento de las biomembranas
(Trajanovska et al., 1997; Hall, 2001). Estas afectaciones conducen a deterioros en

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actividades biolgicas vitales que pueden resultar irreversibles en diferentes organismos
(Tietzel y Parsek, 2003; Maier, 2003).
Con relacin a los daos que provocan los metales en los microorganismos se destacan
aquellos que pueden alterar o desnaturalizar protenas y ejercer efectos letales en los mismos
(Brady y Duncan, 1994). En el caso de las plantas, inducen alteraciones en la permeabilidad de
la membrana celular y contribuyen a la inhibicin de la fotosntesis, as como a la disminucin
de la toma de agua y de nutrientes, lo cual da lugar a la muerte celular (Siripornadulsil et al.,
2002; Hall, 2002).

En los humanos, por ejemplo, el Cd2+ tiene una vida media de 10-30 aos y produce graves
daos en los pulmones, en el estmago, en los riones y en los huesos (Sinott, 2001), as como
en el sistema nervioso, incluso a bajas concentraciones (Navarro et al., 2006). Otros trabajos
han indicado que este metal presenta efectos carcinognico, embriotxico, teratognico y
mutagnico (Terry y Stone, 2002; Majumder et al., 2003).

El Zn2+ es un elemento esencial en la activacin de enzimas en los humanos pero presenta

efectos txicos a niveles entre 100-500 miligramos ingeridos por da (Volesky, 1994). En ellos
produce lcera en el sistema digestivo, irritacin de la piel, anemia y alteraciones en el sistema
respiratorio. La acumulacin de este metal, puede incluso presentar accin carcinognica. El
consumo de este metal en grandes cantidades, ha provocado efectos adversos en la morfologa
de algunas especies de peces (Navarro et al., 2006).

I.2. Remocin de metales

La contaminacin de las aguas y suelos por metales es uno de los principales problemas
medioambientales en los pases industrializados y en vas de desarrollo. Las fuentes
fundamentales de esta contaminacin se originan a partir de los eventos naturales y de la
actividad domstica e industrial (Langstn et al., 1999). Entre las principales industrias que
contribuyen a estas condiciones adversas al ambiente estn: la industria electrnica, de
produccin de plstico, la dedicada a la fabricacin de pinturas y agentes colorantes, la
industria alimentaria, la petroqumica y la de plaguicidas, as como la productora de metales y
de energa nuclear (Lomeli y Tamayo, 2005; Southichak et al., 2006).

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Los metales vertidos al ambiente son bioamplificados a travs de la cadena alimentaria y
acumulados en los tejidos de los organismos receptores, donde pueden persistir
indefinidamente, debido a que son no biodegradables (Hursthouse, 2001; Feris et al., 2004;
Hussien et al., 2004; Rattan et al., 2005).

El inters por la contaminacin por metales est dado fundamentalmente por dos razones, la
toxicidad, como un aspecto medioambiental, y por el valor del metal recobrado, en
consideracin al agotamiento de las reservas de estos elementos qumicos. Estos dos aspectos
determinan la seleccin de la especie metlica para su eliminacin y no implica que ambos
estn necesariamente separados (Volesky, 2000). Anteriormente, fue planteado que los metales
Cd2+, Pb2+, Hg2+, Co2+, Cu2+ y Fe2+, por la combinacin de los factores ambientales y
tecnolgicos son prioritarios para ser tratados por un proceso de biorremediacin. En relacin
al Zn2+ se ha planteado que representa un menor riesgo ambiental, por constituir un elemento
esencial en los organismos. Este metal es de uso extensivo en la industria y las aplicaciones de
las tecnologas establecidas han causado contaminacin de flujos de aguas y su incorporacin a
los sedimentos, lo cual puede aumentar su biodisponibilidad y de esta manera incidir en los
efectos carcinognicos que puede ocasionar en los humanos. Esto unido al agotamiento de sus
reservas ha conllevado a que se clasifique tambin como un metal prioritario para el
tratamiento por biorremediacin (Volesky, 1999; Navarro et al., 2006).

Diversos mtodos fsicos y qumicos han sido aplicados con el objetivo de remover estos
contaminantes metlicos presentes en fluidos acuosos. Entre los mtodos fsicos referidos se
encuentran la separacin a travs de membranas y la filtracin. Los mtodos qumicos han
abordado el intercambio inico, la quelacin, la adsorcin, el tratamiento electroqumico, la
precipitacin, la extraccin con solventes y la oxidacin-reduccin (Mallick, 2003; Johnson,
2006). Estos mtodos se caracterizan por tener costos excesivamente altos, debido a los
reactivos requeridos y a la no recuperacin del agente activo, lo cual impide su reutilizacin en
ciclos sucesivos de tratamiento. Adems, resultan ineficientes especialmente cuando los iones
metlicos estn presentes en soluciones en un rango de concentracin de 1-100 mg.L-1 y en
ocasiones provocan contaminaciones secundarias (Kapoor y Viraraghavan, 1998; Filipipovic et
al., 2000).

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En diversas industrias, los sistemas de tratamientos biolgicos aplicados a los desechos no
incluyen una etapa de tratamiento especfico para la remocin de metales, lo cual conducen a la
formacin de lodos con elevada concentracin de metales. Estos lodos son tratados por
incineracin, lo cual provoca la contaminacin del aire por las cenizas o del suelo por su
deposicin. Esto conlleva costos elevados para su descontaminacin de forma segura de la
zona contaminada por los productos de incineracin (Tien y Huang, 1991). Lodos con
caractersticas similares pueden ser producidos tambin, por la aplicacin de algunos mtodos
fsicos y qumicos (Deepa et al., 2006).

Como alternativa a estas tecnologas convencionales, la utilizacin de los microorganismos en

procesos de biorremediacin, ofrece una opcin rentable y beneficiosa, especialmente para el
tratamiento de grandes volmenes de soluciones acuosas contaminadas con bajas
concentraciones de estos elementos (Pethkar et al., 2001; Slaba y Dlugonski, 2004).

I.3. Biorremediacin

Diferentes definiciones se le ha atribuido al trmino biorremediacin en dependencia de la

sustancia contaminante, del ecosistema a biorremediar y del agente que acomete la
remediacin. Todas tienen en comn la utilizacin de sistemas biolgicos cuyos procesos
metablicos y caractersticas estructurales permiten la eliminacin de contaminantes qumicos
(Gupta et al., 2000; Pelln et al., 2003; De Olivera Franco, 2004). Los resultados obtenidos
cuando se logra remediar un problema de contaminacin, permite utilizar otros trminos
como: biorrestauracin, biorrecuperacin, biorrehabilitacin, biorregeneracin, biocorreccin,
biorreversin, saneamiento y limpieza.

La biorremediacin de ecosistemas contaminados con metales pesados, a travs del uso de

microorganismos y plantas como biosorbentes, favorece la movilizacin e inmovilizacin de
estos contaminantes. Estos procesos resultan ms econmicos y de una aplicacin ms simple,
en comparacin con los mtodos fsicos y qumicos referidos anteriormente. Estas ventajas,
que ofrecen los sistemas biolgicos, estn dadas porque constituyen tecnologas limpias y
sostenibles. La inmovilizacin del metal, es decir, el paso de un estado soluble inicial en fase
acuosa a uno insoluble final en fase slida constituye una alternativa adecuada para la

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biorremediacin debido a que disminuye la biodisponibilidad de los metales (Kiran et al.,
2007).

Entre los procesos microbianos que incluye la biorremediacin de metales e inmovilizacin de

estos contaminantes se encuentran:
Biotransformacin: involucra transformaciones qumicas sobre el metal pesado catalizadas
por enzimas microbianas, que pueden contemplar oxidaciones, reducciones y metilaciones, que
dan como resultado compuestos poco solubles en agua o bien compuestos voltiles, por lo que
es un proceso que en ocasiones puede inmovilizar o movilizar el metal (Srinath et al., 2002;
Banuelos et al., 2005).

Fitorremediacin: se refiere a la utilizacin de plantas y microorganismos asociados a su

rizosfera para la remediacin in situ y ex situ de suelos, lodos, sedimentos y aguas
contaminados con metales, a travs de la inmovilizacin intracelular o extracelular, as como la
biotransformacin de estos elementos (Prasad y Freitas, 2003, Banuelos, 2006). Es una
tecnologa econmica, posee un impacto regenerativo en los lugares donde se aplica y la
capacidad extractiva se mantiene debido al crecimiento vegetal (Lombi et al., 2001).

Bioacumulacin: proceso activo, mediado metablicamente en organismos vivos por la accin

de protenas transportadoras, que inmovilizan en el interior celular al ion metlico (Anhalya et
al., 2004; Hussein et al., 2004). Estos iones se unen a ligandos de alta afinidad en el citosol,
tales como las fitoquelatinas y metalotionenas, as como a aminocidos y cidos orgnicos
(malato, glutamato y citrato) presentes en el citosol (Clemens, 2001; Avils et al., 2003, 2005).
Adems, los iones metlicos pueden ser compartimentalizados dentro de organelos
citoplasmticos (Surez y Reyes, 2002; Eide, 2003). La energa requerida en este mecanismo,
es generada a travs del sistema H+-ATPasa, lo cual indica la dependencia de la captura del
metal de la actividad fisiolgica celular y de la tolerancia especfica del microorganismo a la
toxicidad de los metales en el interior de la clula (Gadd, 2004).

Biosorcin: consiste en la captacin pasiva, rpida y reversible, de iones metlicos presentes

en soluciones acuosas, por interacciones fisicoqumicas con materiales biolgicos vivos o
muertos. Estas interacciones dan lugar a diferentes mecanismos que unen selectivamente los
iones a la pared celular (Parker et al., 1998; Lpez et al., 2000). Es el proceso ms

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ampliamente estudiado, por la efectividad que puede ofrecer para su prctica y uso en la
biorremediacin de metales (Srinath et al., 2002; Liu et al., 2003).

Los componentes de la superficie celular que intervienen en este proceso son polmeros
estructurales y extracelulares, con un alto contenido de polianiones como los carboxilos,
aminas, amidas, hidroxilo, fosfato y sulfhidrilo, los cuales constituyen grupos funcionales que
interactan con los metales, atrapndolos dentro de su estructura (Kogej y Pavko, 2001).

I.3.1. Principales mecanismos del proceso de biosorcin de iones metlicos

El enlace de metales por el proceso de biosorcin, ha sido atribuido a un nmero de diferentes

mecanismos secuestradores tales como: precipitacin, complejacin, bioadsorcin e
intercambio inico. Es reconocido que una combinacin de diferentes mecanismos, cada uno
funcionando independiente y de manera simultnea, pueden contribuir a la captura general del
metal (Volesky, 1990; Vianna et al., 2000; Gadd, 2004).

La precipitacin es un mecanismo que consiste en la deposicin de material elctricamente

neutro (metal o sales del metal) en la superficie de la biomasa y no necesariamente involucra
un enlace entre la biomasa y las capas depositadas. Este mecanismo puede ser facilitado por el
enlace inicial de los iones metlicos a los sitios reactivos de la biomasa, los cuales servirn
como sitios de nucleacin para posteriores precipitaciones (Mayers y Beverdge, 1989;
Anhalya et al., 2004).

La formacin de complejos, es otro mecanismo que ocurre por la interaccin de los grupos
activos de la superficie celular con los metales, lo que permite la quelacin de los iones
metlicos, al quedar estos ligados o enlazados a estos grupos. A estos complejos tributan
exopolmeros microbianos, compuestos principalmente por polisacridos que interactan con
los iones metlicos como consecuencia directa de la presencia de grupos funcionales cargados
negativamente en su estructura (Surez y Reyes, 2002). Esta formacin de complejos facilita la
precipitacin extracelular de los metales (Caizares Villanueva, 2000).

La bioadsorcin se refiere a la unin pasiva de un soluto (metal) a los sitios libres que no estn
ocupados inicialmente por otros cationes, mediante una interaccin fsico-qumica entre el
metal y la pared celular (Kotrba, et al., 1999; Kogej y Pavco, 2001).

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El intercambio inico es el mecanismo que se produce cuando los cationes que pueden estar
unidos a los sitios de enlaces de la biomasa, son desplazados por el metal presente en solucin
(Navarro et al., 2006; Chen y Wang, 2007).

I.4. Modelos de evaluacin de la sorcin de metales por biomasa microbiana

En la biosorcin la cantidad de metal enlazado por masa del sorbente es llamado metal
enlazado o capturado (q), que alcanza su mximo cuando se establece un equilibrio entre el
metal disuelto y el metal enlazado al slido, al incrementar la concentracin del metal en
solucin. Este equilibrio, alcanzado a una temperatura constante, es representado en una curva
llamada isoterma que relaciona la cantidad de metal unido a la clula con la concentracin
final del metal en solucin (Volesky, 1999; Caizares-Villanueva, 2000). La construccin de
las isotermas mediante los modelos de Freundlich y Langmuir ha sido usada en la evaluacin
de la capacidad biosortiva de las biomasas (Benguella y Benaissa, 2002; Parvathi et al., 2007).

La isoterma de Freundlich es originalmente de naturaleza emprica, pero posteriormente ha

sido interpretada como la sorcin de metales a sitios con una distribucin de afinidad por los
iones metlicos. Esta isoterma asume que los sitios de fuertes enlaces son ocupados
primeramente y que la fuerza de enlace disminuye con el incremento del grado de ocupacin
de los sitios (Freundlich, 1906).

La isoterma de Langmuir es el modelo matemtico ms usado en el proceso de biosorcin y se

basa en considerar la sorcin de metales como un fenmeno qumico. Esta isoterma asume que
este fenmeno est restringido a una monocapa, que todos los sitios de unin del metal son
uniformes (ej. constante temperatura, igual energa de sorcin y no afectacin de la unin del
metal en sitios vecinos) y que una molcula del sorbato reacciona con un sitio activo y no hay
interacciones entre especies de sorbato (Langmuir, 1916).

I.5. Remocin de metales por microorganismos

Los microorganismos estn expuestos a la presencia de diversos tipos de metales en el

ambiente, condicin que favorece la interaccin microorganismo-metal. Dichas interacciones
entre los microorganismos y los metales garantizan los requerimientos de estos elementos para
diversas funciones intracelulares y adems, son muy importantes para la aplicacin de estos
14
agentes biolgicos en la biotecnologa ambiental, con el objetivo de implementar mtodos de
remocin, recuperacin o destoxificacin de metales (Valls y De Lorenzo, 2002).

En la literatura se ha informado extensamente la potencialidad de diferentes especies de

microorganismos, correspondientes a bacterias, hongos, levaduras y microalgas en la captura
de metales, as como la tendencia a disponer de biosorbentes microbianos de bajo costo y con
carcter renovable (Zouboulis et al., 1999; Gupta et al., 2000; Slaba y Dlugonski, 2004; Wang
y Chen, 2006).

I.5.1. Bacterias

Las bacterias constituyen un grupo microbiano estudiado ampliamente en la remocin de un

gran nmero de metales, por ejemplo, especies de los gneros Bacillus (Kim et al., 2007; Pan
et al., 2007), Pseudomonas (Chen et al., 2006), Acinetobacter (Srivastava y Thakur, 2006),
Escherichia (Kao et al., 2008), Enterobacter, Serratia (Gmez et al., 2000; Marrero et al.,
2007), Micrococcus y Acetobacter (Bonaventura y Johnson, 1997). Investigaciones realizadas
con especies de Arthrobacter demostraron su capacidad de enlazar cobre, magnesio, nquel y
plomo a valores de pH neutro (Veglio et al., 1997). Posteriormente, se confirm que
Pseudomonas fluorescens, transporta iones de plomo al interior celular a bajos pH (Rivas et
al., 2004).

Las caractersticas estructurales y la composicin qumica de las bacterias Gram positivas, han
motivado la evaluacin de diferentes especies del gnero Bacillus en la captura de metales. Las
especies Bacillus sphaericus, Bacillus cereus y Bacillus subtilis enfrentadas a los iones Cd2+,
Zn2+, Cu2+ y Pb2+ presentaron distintas capacidades de captura y los mayores valores se
obtuvieron con Bacillus subtilis y Bacillus cereus (Da Costa y Pereira, 2001). Otros autores
han sealado la eficiente adsorcin de Pb2+ por biomasa de Bacillus cereus y demostraron que
la captura de este metal es un proceso dependiente que logra incrementos en su captura con el
aumento del pH. Este mtodo de acumulacin de plomo puede resultar muy prometedor al
compararlo con los procesos convencionales (Ray et al., 2005).

Las cianobacterias, constituyen un grupo de bacterias fototrofas con capacidad de remover

metales. Este grupo de bacterias producen exopolisacridos con potencialidades de aplicacin
en la captura de estos contaminantes inorgnicos (Shah et al., 2000). La especie Microcystis
15
aeruginosa, en estado libre e inmovilizada, posee la capacidad de capturar extracelularmente
nquel, cadmio y cobre por un proceso independiente del metabolismo celular (Parker et al,
1998). Posteriormente se demostr que Nostoc linckiia acumula Zn2+ y Cd2+ por la unin de
estos iones a protenas intracelulares (El-Enany e Issa, 2000). Investigaciones ms recientes
indicaron que Synechocystis aquatilis NPBS-3, incorpora iones metlicos al interior
citoplasmtico, localizados en grnulos de polifosfatos (Andrade et al., 2004).

I.5.2. Hongos

Los hongos filamentosos y las levaduras han demostrado una alta afinidad por los iones
metlicos y pueden capturarlos del ambiente por medio de mecanismos fisicoqumicos y
biolgicos (Cabuk et al., 2004; Preetha y Viruthagiri, 2005). La acumulacin de metales en
los hongos se da como resultado tanto del transporte activo dependiente del metabolismo
(Acosta et al., 2007) como del transporte pasivo y la retencin de especies qumicas por los
constituyentes de la pared celular (Goksungur et al., 2005).

La pared celular de la clula eucariota (hongos) compuesta por polisacridos tales como
glucano, quitosano y quitina, posee numerosos grupos funcionales cargados negativamente
como aminos, hidroxilos, carboxilos, sulfhidrilos y fosfatos. Estos estn implicados en el
enlace de metales por mecanismos de adsorcin (Gupta et al., 2000; Slaba y Dlugonski, 2004).
Otras biomolculas involucradas en la captura de metales por este grupo microbiano son los
pigmentos y los polisacridos extracelulares (Gadd, 2004).

Investigaciones realizadas por Tsezos y Volesky (1981) mostraron que Rhizopus arrhizus es un
agente ideal para remover Fe2+, Pb2+ y Cd2+ de desechos industriales, debido a que el nitrgeno
de la quitina forma complejos con los metales. Muchas especies de los gneros Penicillium,
Aspergillus, Mucor, Trichoderma y Saccharomyces han resultado ser microorganismos
excelentes para la remocin de metales (Zhou, 1999; Sintuprapa et al., 2000). Esta capacidad
puede estar relacionada con la alta tolerancia que presentan los hongos a los metales txicos, lo
cual les permite ser eficientes en la captura de una variedad de metales, por ejemplo, Ni2+,
Zn2+, Cu2+, Cd2+ y Pb2+ (Slaba y Dlugonski, 2004).

Una gran atencin ha estado enfocada, principalmente, al uso de Saccharomyces cerevisiae

como material biosorbente (Brady et al., 1994; Chen y Wang, 2007). Otros informes han
16
sealado que esta levadura remueve Zn2+ y Ni2+ (Zouboulis et al., 2001), Cu2+ (Jianlong, 2002)
Cr6+, Fe3+ (Goyal et al., 2003) Cd2+ (Kim et al., 2005) y Pb2+ a partir de soluciones acuosas
(Parvathi et al., 2007).
Especies del gnero Candida mostraron capacidad para secuestrar metales como Ni2+, Cu2+,
Zn2+ y Ag2+, a travs del enlace de estos iones metlicos a los grupos funcionales de la pared
celular (Kambe, 1997). Recientemente se demostr en las especies Candida tropicalis y
Candida lipolytica la capacidad de biosorber Cr6+ y Ni2+. Estos procesos resultaron
dependientes del pH y de la concentracin del metal en solucin (Hua et al., 2008).

I.5.3. Microalgas

En investigaciones realizadas con diversos gneros de microalgas se ha demostrado que estos

organismos eucariontes presentan afinidad por los metales pesados, lo cual les puede permitir
remover estos contaminantes de efluentes acuosos. Experimentos realizados con Chlorella
vulgaris y Scenedesmus acutus, demostraron las capacidades de estas microalgas
inmovilizadas en la remocin de Cd2+, Zn2+ y Cr6+ (Travieso et al., 1999). Posteriormente se
inform de la acumulacin de Cu2+ y Ni2+ por Chlorella vulgaris a partir de soluciones
monometlicas y bimetlicas (Mallick, 2003). La captura de Cd2+ por Tetraselmis suesica fue
proporcional a la concentracin del metal en solucin (Prez-Rama et al., 2002). Otras
investigaciones han referido la acumulacin de Cu2+ y Zn2+ por Nannochloropsis gaditana
inmovilizado en alginato de calcio (Moreno et al., 1998). Adems, se inform la eliminacin
de cromo presente en aguas residuales de galvanizados, mediante el empleo de un cultivo de
Scenedesmus obliquus, con una eficiencia de eliminacin de Cr6+ del 12% y del 27% para el
Cr3+ y en condiciones de inmovilizacin, el alga alcanz el 95% de eliminacin de Cr3+
(Pelln et al., 2003).

Estos microorganismos acumulan intracelularmente metales esenciales, requeridos para su

nutricin, por un transporte biolgicamente activo y pueden secuestrar iones metlicos que les
resultan txicos por diferentes mecanismos, como la adsorcin a grupos activos de la superficie
celular y la quelacin intracelular por protenas, lo cual responde a un proceso de
destoxificacin (Pokrovsky et al., 2008). Las protenas intracelulares involucradas en la unin
de los metales, identificadas como metalotionenas, unen iones metlicos a los grupos

17
sulfhidrilos (Prez-Rama et al., 2002) y las fitoquelatinas forman complejos estables con estas
especies qumicas (Cobbett, 2000).

I.5.4. Biorremediacin por consorcios microbianos

En los procesos de biorremediacin, un gran nmero de microorganismos son capaces de

eliminar compuestos contaminantes del ambiente (Abalos et al., 2004), sin embargo no
siempre un simple microorganismo posee toda la capacidad metablica, fisiolgica, y
estructural necesaria para disminuir la carga contaminante. Una estrategia que ofrece
soluciones adecuadas la constituye el empleo de poblaciones mixtas o consorcios microbianos.
Estos sistemas microbianos son ms competentes para accionar sobre una amplia variedad de
sustancias contaminantes (Vias et al., 2001; Mallick, 2003) y aportan ventajas selectivas en
un ambiente determinado, dado las diferentes capacidades estructurales, metablicas y
genticas que pueden presentar (Daz, 2004).

Diversos grupos de autores han investigado la aplicacin de consorcios microbianos en la

recuperacin de ecosistemas contaminados con hidrocarburos y mezclas complejas de
xenobiticos (Araujo et al., 2004; Nez et al., 2004; Npoles, 2005; Vias, 2005). Sin
embargo, para la eliminacin de metales los monocultivos microbianos han constituido el tipo
de biosorbente ms investigado. Algunos trabajos han referido el uso potencial de lodos
activados como biosorbentes de metales (Atkinson et al., 1998) que constituiran consorcios
microbianos naturales. La utilizacin de consorcios microbianos, o sistemas mixtos formados
por microorganismos o microorganismos y macromolculas (polmeros) sorbentes, que
incrementen los rendimientos en la captacin de mezclas de metales (Lebeau et al., 2000;
Yakup et al., 2001; Brant et al., 2002; Vullo et al., 2003), es un rea de trabajo de creciente
inters entre los investigadores para contribuir al saneamiento ambiental.

I.6. Factores que influyen en la remocin de metales por microorganismos

El proceso de remocin de metales por microorganismos est determinado por la influencia de

diversos factores, que determinan la mxima capacidad de captura de estos elementos por los
microorganismos. Entre estos factores se encuentran: el tipo de microorganismo, las
condiciones para la obtencin de la biomasa, las caractersticas fisiolgicas y bioqumicas, el
18
estado de la biomasa, la concentracin celular, la composicin qumica y la dotacin gentica
(Unz y Shuttleworth, 1996; Wang y Chen, 2006). Entre otros que pueden ejercer determinados
efectos sobre el proceso de remocin de metales estn el pH, la temperatura, la presencia de
varios iones en la solucin y la concentracin inicial del metal (Volesky, 2000; Radway et al.,
2001; Mallick, 2003).

Tipo de microorganismo: Diversos grupos microbianos han mostrado capacidad para la

remocin de metales. La diferencia entre estos est dada fundamentalmente por la composicin
celular, as como por sus caractersticas fisiolgicas y genticas (Bakkaloglu et al., 1998).

Obtencin de la biomasa microbiana: la presencia o ausencia de determinadas sustancias

orgnicas y agentes quelantes en el medio de cultivo pueden influir positiva o negativamente
en la capacidad biosortiva, por sus efectos sobre la morfologa celular y la composicin de la
pared celular (Al-Asheh y Duvnjak, 1995). Investigaciones realizados sobre el efecto de las
condiciones del cultivo celular de Phormidium laminosum y su capacidad biosortiva,
demostraron que la biosorcin de Cu2+ por esta cianobacteria, disminuy inicialmente en
condiciones de limitacin de nitrgeno y subsecuentemente se increment hasta alcanzar el
valor de nitrgeno suficiente para la clula (Sampedro et al., 1995). Posteriormente, se detect
incremento en la remocin de cromo por un cultivo de ocho horas de crecimiento de
Anabaena variabilitis ATCC 29413, en un medio de cultivo suplementado con nitrato (Khattar
et al., 2002).

Edad fisiolgica del microorganismo: Los diferentes estadios fisiolgicos de los cultivo
microbianos pueden alterar los grupos funcionales (hidroxilos, carboxilos, aminos, sulfatos y
fosfatos) presentes en la pared celular, los cuales estn fuertemente involucrados en la unin
del metal a la biomasa (Pan-Jin et al., 2000; Sudha y Abraham, 2002; Mehta et al., 2002) de
ah que la edad fisiolgica del cultivo microbiano pueda influir de manera positiva o
negativa en la captura de los metales pesados.

Concentracin celular: un incremento en la concentracin celular lleva a una interferencia

entre los sitios de unin del metal y la biomasa, lo cual puede provocar una disminucin en el
atrapamiento del metal (Kim et al., 2005).

19
Estado de la biomasa: la biomasa celular tanto viva como muerta tiene la capacidad de
secuestrar metales. Es importante considerar que emplear las clulas en un estado metablico
determinado, estar en dependencia de la informacin gentica que tenga la especie microbiana
para manifestar un tipo u otro de mecanismo de captura (Gupta et al., 2000; Radway et al.,
2001). La biomasa microbiana sometida a tratamientos fsicos y qumicos puede adaptar sus
propiedades de enlazar metales a requerimientos especficos (Kappoor y Viraraghavan, 1998;
Goksungur et al., 2003).

Los tratamientos fsicos incluyen calentamiento/ebullicin, congelacin/descongelacin,

secado y liofilizacin. Los diferentes tratamientos qumicos incluyen el lavado de la biomasa
con detergentes, entrecruzamiento con solventes orgnicos y tratamientos cidos o alcalinos
(Jianlong, 2002; Kalyuzhnyi y Gladchenko, 2005; Yu et al., 2007).

Segn el estado biolgico de la biomasa, activa o inactivada, la biosorcin presenta

determinadas ventajas y desventajas. La biomasa viva, permite regenerar nuevas clulas con
sitios disponibles para el enlace del metal y puede manipularse genticamente. Los aspectos
negativos estn dados por la necesidad de nutrientes y los efectos txicos a que estn expuestas
las clulas a determinadas concentraciones de los metales. La biomasa muerta, ofrece como
ventajas una biosorcin rpida, eficiente e independiente del crecimiento y elimina problemas
con la toxicidad de los metales. Tambin, ofrece como ventaja la posibilidad de recuperar los
metales y la biomasa microbiana, lo cual reduce los costos del proceso. Sus limitaciones estn
relacionadas con una rpida saturacin del sistema, dependencia del pH del medio y las
posibilidades del mejoramiento del material biolgico est restringido (Hussein et al., 2004).

Temperatura: un incremento en la temperatura del proceso de remocin de metales, aumenta

la energa del sistema y facilita el enlace del metal a la superficie del microorganismo. Por
encima de la temperatura ptima disminuye el enlace, lo cual puede estar dado por la distorsin
de algunos sitios de la superficie celular disponibles para la unin del ion metlico o por un
proceso de desorcin del metal que puede ocurrir al aumentar la temperatura (Volesky, 2000).

pH: El pH de las soluciones de metales es un factor importante en el proceso de biosorcin.

Este parmetro determina la disponibilidad del metal en una forma soluble para la adsorcin, e
influye en la carga superficial del microorganismo. La biosorcin depende de la protonacin o
20
la desprotonacin de los grupos funcionales sobre la pared celular (Kogej y Pavko, 2001; De
Oliveira Franco, 2004). Con el aumento del pH de la solucin del metal los sitios activos sobre
la pared celular se desprotonan y aumenta la carga negativa con un consecuente incremento del
enlace de los metales a los grupos funcionales de las biomasas microbianas, producto de una
intensificacin de las fuerzas electrostticas involucradas en el proceso de adsorcin
(Filipipovic et al., 2000; Ray et al., 2005).

Concentracin inicial del metal: la cantidad de metal capturado por las biomasas microbianas
incrementa con la concentracin inicial del metal en la solucin, seguido frecuentemente por la
saturacin de los sitios de enlace del biosorbente (Kogej y Pavko, 2001). Investigaciones
relacionadas con la eliminacin de cromo por Scenedesmus obliquus han corroborado que la
eficiencia del proceso por la microalga, es dependiente de la concentracin inicial del metal en
la solucin (Pelln et al., 2003).

Presencia de otros iones en solucin: la biosorcin en algunos casos es selectiva y la

presencia de varios metales en una misma solucin, puede propiciar competencia inter inica y
por lo tanto la remocin de un metal puede estar influenciada por la presencia de otros iones
metlicos (Tsekova et al., 2007).

I.7. Tcnicas de ingeniera gentica en la remocin de metales

Tcnicas de ingeniera gentica han sido usadas para expresar pptidos o protenas con
afinidad por metales en los microorganismos. En el desarrollo de cepas transgnicas con estas
propiedades, han estado involucradas las metalotionenas (MT) y fitoquelatinas (PC). Estas
protenas ricas en cistenas aparecen naturalmente e intervienen en el enlace de metales, como
un mecanismo de destoxificacin celular (Pazirandeh et al., 1998; Sayle y Ripp, 2000;
MendozaCozatl y Moreno-Snchez, 2006; Chaurasia et al., 2008).

I.7.1. Metalotionenas

Las metalotionenas (MT) se caracterizan por constituir una familia de protenas intracelulares
con peso molecular relativamente bajo (6-7 kDa) y alto contenido de metales, entre los que
predominan el Zn2+, Cu2+ o Cd2+. Presentan numerosos residuos de cistena conservados
(Palmiter, 1998; Davis y Cousins, 2000) y generalmente no tienen aminocidos aromticos o

21
histidina. Se encuentran en organismos eucariontes y procariontes, por lo que son
ampliamente distribuidas en la naturaleza (Coyle et al., 2002). Estas protenas fueron descritas
por primera vez a finales de la dcada de 1950 a partir de su aislamiento de riones de caballo
(Margoshes
y Valle, 1957), como complejos MT-Zn+2, MT-Cd+2 y MT-Cu+2 (Dabrio et al., 2002).

Las funciones biolgicas de las metalotionenas estn relacionadas con mltiples procesos
biolgicos, entre los que se encuentran la homeostasis de metales esenciales como el cinc, ya
que regulan el abastecimiento de este metal a enzimas cruciales y a factores de transcripcin
que se encuentran involucrados en la divisin celular (Cheria y Apostolova, 2000; Ogra y
Suzuky, 2000). En la destoxificacin de metales txicos muestran funcin protectora contra
hepatoxicidad, nefrotoxicidad, hematoxicidad, inmunotoxicidad y daos en los huesos (Saber y
Pi Kin, 2003). Otros ejemplos pudieran ser su accin contra daos oxidativos, causados por
radicales libres, como neuroprotector de radiaciones ionizantes y modulador de la apoptosis
celular (Dabrio et al., 2002).

La caracterstica de todas las metalotionenas es la presencia en su estructura de secuencias de

tripptidos con residuos de cistenas, que forman las secuencias Cys-X-Cys, Cys-X-Y-Cys y
X- Cys-Cys- X, donde (X) y (Y) son aminocidos diferentes a la cistena. No presentan grupos
tiol libres y los metales divalentes son enlazados por los tomos de azufre en forma de grupos
tiolatos (Naz et al., 2005). Las cistenas estn organizadas en subunidades o dominios,
denominados y en las de origen eucaritico (Matthew et al., 2004). Tienen la capacidad de
enlazar siete tomos de metales divalentes o 12 monovalentes por molcula (Coyle et al.,
2002).

Las propiedades de estas protenas, propiciaron su inclusin en los ensayos de ingeniera

gentica aplicados a especies microbianas con la finalidad de capturar metales. Como primera
estrategia se abord el clonaje de metalotionenas eucariticas para la expresin intracelular en
bacterias (Mejre y Bulow, 2001; Valls y De Lorenzo, 2002). Con este objetivo, genes que
codifican estas protenas procedentes de ratn, pescado y mamferos, han sido expresados en
Escherichia coli y la protena sintetizada fue capaz de asociarse con iones metlicos
(Samuelson et al., 2000; Kao et al., 2006). Otros trabajos han abordado esta estrategia gentica

22
en Niesseria gonorroheae y en Ralstonia eutropha; en estos microorganismos los genes de la
metalotionena de ratn fueron fusionados al gen de una proteasa, lo cual facilit el transporte
de la protena a la membrana externa (Lovley y Lloyd, 2000).

Las investigaciones de las metalotionenas de origen procaritico han estado ms limitados.

Estas protenas se han detectado en las cianobacterias Synechocystis sp. PCC 6803 (Lui y
Douthwatte, 2002), Synechococcus sp. PCC 7940 (Robinson et al., 2002), Oscillatoria brevis
(Liu et al., 2003) y tambin, en el gnero bacteriano Pseudomonas (Higham et al., 1984). Su
papel fisiolgico incluye el almacenamiento de metales (particularmente Cd2+ y Zn2+) y la
destoxificacin de estos (Saber y Pi-Kin, 2003). En este grupo de metalotionenas las cistenas
estn organizadas en dominios, denominados smtA y smtB, y enlazan la misma proporcin de
iones metlicos que las de origen eucarionte (Sambit et al., 2001). Estos dos genes que median
la resistencia a metales se encuentran en el locus smt, operon que codifica para una
metalotionena en Synechoccoccus sp. (Naz et al., 2005).

I.7.2. Fitoquelatinas

Las fitoquelatinas (PC) se han identificado en una amplia variedad de especies de plantas y en
algunos microorganismos (Zenk, 1996; Goldsbrough, 2000; Chaurasia et al., 2008). Tienen
una estructura de pptidos cortos compuestos de tres aminocidos, Glu, Cys y Gly, con
residuos de Glu y Cys acoplados a travs de enlaces -carboxilamida. La estructura de tales
pptidos puede ser representada por ( -Glu-Cys)n -Gly, donde (n) es un rango de 2 a 11
(Sriprang et al., 2003; Wu et al., 2006). Aunque la evidencia de la importancia de las
fitoquelatinas en la destoxificacin es fuerte, especialmente para el cadmio, participan en la
homeostasis de metales esenciales, en el metabolismo del sulfuro y se le ha atribuido accin
antioxidante (Dietz et al., 1999; Cobbett, 2000).

I.7.3. Expresin de pptidos y protenas sobre la superficie celular

El aumento de la capacidad de retencin de metales en las clulas microbianas ha sido

investigado mediante el empleo de cepas que expresen pptidos o protenas con afinidad por
los iones metlicos como las metalotionenas y fitoquelatinas (Sriprang et al., 2003; Bae y
Chen, 2004; Moreno-Snchez et al., 2005; Mendoza-Cozalt y Moreno-Schez, 2006).

23
La expresin de metalotionenas y fitoquelatinas ha involucrado diferentes protenas de
membrana externa, por ejemplo las denominadas LamB y OmpC, que facilitan la fusin de los
genes correspondientes a las molculas que unen metales (Valls et al., 1998).

La protena LamB se caracteriza por una elevada flexibilidad y presencia en la superficie en un

nmero de copias de aproximadamente 1x 104 (Charbit et al., 1998). Constituye el puerto de
entrada para la maltosa y es receptor para el fago lambda (Hamer, 1986). La protena de
membrana externa, OmpC, permite la difusin pasiva de pequeas molculas hidroflicas a la
clula (Nikaido, 1996) adems, es estructuralmente importante para estabilizar la membrana
externa, al conectar esta estructura celular con la capa de peptidoglicano (Hansel et al., 1998)
y est presente en numerosas copias (2x 105) por clula. Estas particularidades sugieren que
puedan ser excelentes candidatos para la expresin de pptidos y protenas en superficies
celulares (Cruz et al., 2000).

I.8. Ventajas y aplicaciones de los procesos microbianos en la remocin de iones

metlicos

La biorremediacin de metales txicos por biosorcin o bioacumulacin es especialmente

conveniente como un paso de limpieza en sistemas acuticos, debido a que posibilita obtener
agua con la calidad requerida para su consumo. Estos procesos biotecnolgicos logran
efectividad en el tratamiento de grandes volmenes de aguas residuales contaminadas con
metales a concentraciones en el orden de 1-100 mg.L-1 (Wang y Chen, 2006) y no generan
residuos que impacten negativamente al ambiente (Torres, 2007). Adems, constituyen
tecnologas con aplicaciones promisorias para la eliminacin de metales presentes en suelos y
as disminuir la contaminacin de este ecosistema y del manto fretico (Bonaventura y
Johnson, 1997, Barkay y Schaefer, 2001).

A diferencia de las tecnologas convencionales, la biorremediacin se puede llevar a cabo en el

sitio contaminado y es ms econmica. Por ejemplo, la aplicacin de la biosorcin presenta un
menor costo ($8,4-$197 en tres das) en comparacin con la incineracin que requiere de un
costo entre $300 a $1000 para igual tiempo de tratamiento (Atlas y Unterman, 1999). A las
ventajas econmicas que presentan estos procesos biotecnolgicos, tributa el hecho de que las
biomasas microbianas pueden resultar de fcil acceso, a partir de desechos de plantas de
fermentacin o por crecimiento de los microorganismos en sustratos baratos (Kiran et al.,
24
2007). La biosorcin permite la recuperacin del material biolgico de manera sencilla sin
grandes tecnologas, ya que estos pueden ser regenerados por la desorcin del metal con cidos
o soluciones de sales. La solucin resultante, altamente concentrada de metales, puede ser
procesada por otras tcnicas como la precipitacin para remover el metal concentrado.
Recobrado estos recursos naturales pudieran ser utilizados en otros procesos industriales
(Acosta et al, 2007). En la bioacumulacin, la biomasa microbiana cargada de metal posee un
volumen pequeo comparado con el efluente, por lo que es efectiva para reducir el volumen
del desecho. Este proceso limita la recuperacin del biosorbente, pero tambin facilita la
recuperacin de los iones metlicos (Caizares- Villanueva, 2000).

En adicin a lo anterior, la aplicacin de los procesos microbianos para la eliminacin de

metales pesados, poseen una elevada eficiencia a bajas concentraciones de metales y
radioactivos, operan en un amplio rango de pH, de temperatura y los iones de las sales de
calcio y magnesio no compiten con los sitios activos de las superficies celulares, como sucede
en las resinas de intercambio inico (Kiran et al., 2007).

Todas estas particularidades de los procesos de remocin de metales como resultado de las
interacciones entre los microorganismos e iones metlicos han permitido desarrollar con fines
comerciales, biosorbentes para secuestrar metales txicos en el tratamiento de aguas
residuales, como el AlgaSORB a partir de Chlorella vulgaris (Darnall et al., 1986); Tsezos,
compuesto por Rhizopus arrhizus, lodo activado y Penicillium chrysogenum (Tsezos et al.,
1987); B. V. Sorbex Inc. que incluye biomasa de Sargassum natans, Ascophylum nodosum,
Halimeda opuntia, Palmyra pamata, Chondrus crispus y Chlorella vulgaris (Volesky, 1990);
Bio-fix conformado por cianobacteria (Spirulina), levadura, alga y las plantas Lemna sp. y
Shagnum sp. (Bennett et al., 1991) y posteriormente se desarroll el biosorbente AMT-
Bioclaim, que consiste en biomasa granulada de Bacillus subtilis (Granham et al., 1992).

25
CAPTULO II: MATERIALES Y MTODOS
CAPTULO II: MATERIALES Y MTODOS

II.1. Aislamiento de microorganismos

En la bsqueda de microorganismos con capacidad para capturar cinc y/o cadmio se realiz un
aislamiento microbiano a partir de muestras de agua del ro Martn Prez. Esta corriente
fluvial, con una extensin de 6,4 km. y una cuenca pluvial de 13,1 km2, nace en el Reparto
Diezmero, Municipio San Miguel del Padrn y desemboca en la Baha de La Habana, Cuba.
Este ro es receptor de contaminantes metlicos que proceden fundamentalmente de las aguas
residuales domsticas e industriales (Domnguez, 2000).

La colecta de las aguas del ro Martn Prez se llev a cabo en el perodo seco, Noviembre
2004 a Abril de 2005, en dos puntos de muestreos seleccionados por la cercana a estos de
posibles fuentes de contaminacin por metales.

Punto 1: Ro Martn Prez y Puente del Ferrocarril, Va Blanca y Calzada Vieja de

Guanabacoa. En sus cercanas se encuentran el establecimiento Botellera Habana y el taller
Emilio Prez Olivera.

Punto 2: Ro Martn Prez entre calle 6ta y 7ma. Se ubica en sus alrededores la empresa de
semirremolques Ramn Pea y el establecimiento Mrtires de Panam.

Las muestras de agua se colectaron aproximadamente a un metro de la orilla y a 15 cm. de

profundidad. Para la colecta se emplearon frascos de polietileno de 1,5 L de capacidad,
tratados con HNO3 al 10% durante 24 h y sometidos a enjuagues con abundante agua
bidestilada estril. Las muestras se filtraron por papel de filtro cualitativo para eliminar los
slidos en suspensin. Se prepararon diluciones seriadas en solucin fisiolgica (8,5g NaCl. L-
1
) desde 10-1 a 10-4; posteriormente de cada dilucin se inocul 100 L y se disemin con
esptula de Drigalsky en medio de cultivo Agar Nutriente (Atlas, 2000) y en medio de cultivo
Allen y Arnon (Allen y Arnon, 1955) para el aislamiento de bacterias y microorganismos
fototrofos. Cada una de las siembras se realiz por triplicado. Los medios inoculados para el
aislamiento de bacterias se incubaron a 30 2 C por 24 horas y para los fototrofos a 5000
Lux, 25 2 C durante 10 das. Transcurrido el tiempo de incubacin, a las colonias distintivas
que crecieron en los medios selectivos, se les comprob la pureza y se caracterizaron de

26
acuerdo a sus caractersticas morfolgicas y tintoriales, a travs de tincin de Gram (bacterias)
y preparacin en fresco (microorganismos fototrofos) con las posteriores observaciones al
microscopio ptico con aumento de 400 y 1000 x.

II.2. Material biolgico

La captura de cinc y/o cadmio se determin en los aislados microbianos, as como en

microorganismos procedentes de diferentes colecciones nacionales e internacionales (Tabla 1).

Tabla 1-Microorganismos de colecciones para la evaluacin de sus capacidades de capturar los

metales.

Coleccin de cultivos microbianos Coleccin de cultivos microbianos

Departamento de Microbiologa
Facultad de Biologa
Universidad de La Habana
Bacillus thurigiensis (Cp-3)
Bacillus cereus (B63)
Bacillus megaterium (M-II)
Micrococcus luteus (Ml-2)
Pseudomonas mendocina (Ps-1)
Serratia marcescens ATCC-14056
Escherichia coli ATCC-8739
Enterobacter sp (Dl-7)
Acetobacter diazotrophicus (caa-1)
Saccharomyces cerevisiae (3)
Saccharomyces cerevisiae (5)
Saccharomyces cerevisiae (7)
Saccharomyces cerevisiae (8)
Saccharomyces cerevisiae (10)
Saccharomyces cerevisiae (12)
Rhodotorula sp. (Rh-a)
Schizosacharomyces sp. (Sz)
Coleccin de cultivos microbianos
Instituto Pasteur
Anabaena sp. PCC 7120
Synechococcus sp. PCC 7942
Centro de Investigaciones Pesqueras, Cuba
Phormidium sp. (M3-p)
Chaetoceros ceratosphorus (1P)
Chaetoceros muelleri (2P)
Talassiosira fluviatilis (3P)
Nanocloropsis gaditana (13P)
Tetraselmis suesica (7P)
Tetraselmis tetrtele (6P)
Tetraselmis chui (8P)
Nanocloropsis oculata (12P)
Coleccin de cultivos microbianos
Laboratorio de Fisiologa Vegetal,
Universidad de Regensburg, Alemania
Anabaena variabilis ATCC 29413
Nodularia sphaerocarpa (4A)
Tolypothrix tenuis (5A )
Chloroglocopsis fritschii (9A)
Nostoc muscorum (11A)
Nostoc sp. (15AE)
Calothrix sp. (12A)
Scytonema bohneri (14A)

Se utilizaron otros microorganismos donados por la coleccin de cultivos microbianos,

Laboratorio de Fisiologa Vegetal, Universidad de Regensburg, Alemania: Escherichia coli

27
 DH10B, Escherichia coli HB101 y Escherichia coli J-53, para el desarrollo de las
modificaciones genticas.

II.3. Medios de cultivo

Para la conservacin y propagacin de los microorganismos, se emplearon los siguientes

medios de cultivo (Tabla 2). La composicin de los medios se muestra en el Anexo I.

Tabla 2.- Medios de cultivo correspondientes a cada grupo microbiano.

Grupo microbiano Medios de Cultivo

Propagacin Conservacin
Bacterias Caldo Nutriente (BIOCEN) Agar Nutriente (BIOCEN)
(Atlas, 2000) (Atlas, 2000)
SYP LGI Modificado
Acetobacter diazotrophicus (Caballero y Martnez, 1994) (Reis et al., 1992)

Escherichia coli DH10B

Escherichia coli HB101
Escherichia coli J-53
Cianobacterias y
aislados fototrofos
Levaduras
Microalgas de coleccin
Luria-Bertani (LB) Glicerina -70 C
(Sambrook et al., 1989) (Sambrook, et al., 1989)
Allen y Arnon Allen y Arnon
(Allen y Arnon,1955) (Allen y Arnon,1955)
Extracto de Levadura glucosa Extracto de Levadura glucosa-agar
(Atlas, 2000) (Atlas, 2000)
Guillard H/2 Guillard H/2
(Guillard, 1975) (Guillard, 1975)

II.4. Determinacin de la capacidad de captura de cinc y cadmio

A partir del crecimiento microbiano en los medios de conservacin se obtuvo un preinculo en

las siguientes condiciones: bacterias y levaduras a 30 r 2 C durante 24 h, microorganismos
fototrofos bajo condiciones de constante iluminacin de 5 000 Lux a 28 2 C durante siete
das. Todos los cultivos se mantuvieron en agitacin a 100 r.min-1, en zaranda orbital.
Posteriormente, las biomasas se propagaron en Erlenmeyers con un volumen efectivo de medio
de 200 mL, inoculado con 10 mL del preinculo (absorbancia de 0,01 a 640 nm para las
bacterias y 0,08 mg. L-1 de clorofila total para los microorganismos fototrofos). Los cultivos se
incubaron a las condiciones apropiadas para cada uno de los microorganismos, referidas
anteriormente en la obtencin del preinculo. Posteriormente se precipitaron las clulas por
centrifugacin a 3 500 xg durante 20 min, en una centrfuga MLW T24D. Los respectivos
precipitados celulares se reprecipitaron con agua bidestilada en una centrfuga Eppendorf
(Drehichtung) a 3 200 xg durante 10 min., para su puesta en contacto con los metales.
28
Soluciones patrones de Zn2+ y Cd2+ de 100 mM.L-1 se prepararon en agua bidestilada estril a
partir de ZnSO4.7H2O y CdCl2.4H2O de alta pureza. Para los experimentos de captura de los
metales se pusieron en contacto las biomasas microbianas con las soluciones de iones cinc y
cadmio, en una proporcin biomasa hmeda-metal de 2 g.L-1:1 mM.L-1 (cinc 65,4 mg.L-1y
cadmio-112,4 mg.L-1) segn la metodologa descrita por Lo y colaboradores (2001). La
suspensin microorganismo-metal se agit en zaranda a 100 r.min-1 a 28 2 C, se ajust y
control el pH a 6,0 con HCl 0.1M o NaOH 0.1M, segn se requiri durante 24 h.
Posteriormente, se colect el sobrenadante que contiene el metal residual, por centrifugacin a
3 500 xg durante 20 min., en centrfuga MLW T24D y se conserv a 4 C hasta su anlisis.
Estas condiciones se mantuvieron en el resto del trabajo y las diferencias estn sealadas en los
diferentes experimentos. Se realizaron tres repeticiones en todos los casos.

II.4.1. Anlisis del metal residual

Todas las muestras, sobrenadante obtenido despus de poner en contacto las biomasas
microbianas con las soluciones de los metales, se analizaron por espectrofotometra de
absorcin atmica (EAA, equipo Phillips 9100) con llama de aire-acetileno, segn el
procedimiento descrito por American Water Association (1998). La corriente de lmpara
utilizada para el Zn2+ fue de 10 mA y para el Cd2+ de 8 mA. Se emplearon longitudes de onda
de 230,9 nm y de 228,8 nm para el Zn2+ y el Cd2+, respectivamente. Se prepar una curva de
calibracin para cada metal, que permiti calcular el coeficiente de correlacin lineal (R2), la
ecuacin de la recta y el metal residual, a travs del programa de computacin Barnett
(Microsoft Excel).

La cantidad de metal capturado por las biomasas microbianas, para todos los experimentos
realizados en el trabajo, se calcul a travs de la siguiente ecuacin:
q = (Co Cf) * V / m (Vieira y Volesky, 2003)
donde: q: mg de metal enlazado por gramo de biomasa (mg.g-1)
Co y Cf: concentracin inicial y residual del metal (mg.L-1)
V: volumen de la solucin (L) m: masa del biosorbente (g).

II.5. Efecto de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio de solucin acuosa

Para estos experimentos se seleccionaron los microorganismos que presentaron los mayores
valores de cinc y cadmio capturados (q), superior a 15 mg.g-1, entre los evaluados en cuanto a

29
sus capacidades de capturar ambos metales.

II.5.1. Efecto del estadio fisiolgico del cultivo en la remocin de los metales

Para determinar la curva de crecimiento de bacterias y levaduras se determin por

turbidimetra a 640 nm hasta 24 de incubacin. El crecimiento en los microorganismos
fototrofos se determin por la cuantificacin de clorotofila total (Harmutk, 1987). Este mtodo
consisti en la extraccin etanlica de la clorofila y la determinacin de la absorbancia a 649
nm y 664 nm a diferentes intervalos de tiempo hasta 12 das de incubacin. Las
determinaciones de absorbancia se realizaron en espectofotocolormetro (Spekol 11). Las
biomasas microbianas se muestrearon en tres estadios fisiolgicos diferentes, para llevar a cabo
los experimentos de captacin de los metales. Como control de este experimento, se utiliz la
muestra de biomasa de bacterias y levaduras crecidas durante 24 h y de los microorganismos
fototrofos durante siete das.

II.5.2. Efecto de la concentracin celular en la remocin de los metales

Para la determinacin del efecto de la concentracin celular en la remocin de cinc y cadmio se

pusieron en contacto tres concentraciones de biomasa microbiana hmeda: 2, 3 y 4 g.L-1 con
los metales. Como control de este experimento se utiliz la concentracin celular
correspondiente a 2 g.L-1.

II.5.3. Efecto del pH en la remocin de los metales

Para determinar el efecto del pH, las diferentes biomasas microbianas se pusieron en contacto
con las soluciones de los metales a los valores de pH correspondientes a 5.0, 6.0, 7.0. El ajuste
y mantenimiento de cada valor de pH fijado a la suspensin biomasa-metal se realiz a travs
de las mediciones de esta variable a diferentes intervalos de tiempo desde 0 a 24 h y por la
adicin de HCl 0.1M o NaOH 0.1M, segn se requiri. Como control de este experimento se
utiliz el valor de pH 6.0 en la suspensin biomasa-metal.

II.5.4. Efecto de la concentracin inicial del metal en el proceso de remocin

Para evaluar el efecto de este factor sobre la remocin de cinc y cadmio, los microorganismos
se pusieron en contacto con las soluciones de los metales preparadas por dilucin de las
soluciones patrones entre 25 y 160 mg.L-1 para el Zn2+, como control se emple la
30
concentracin de 65,4 mg.L-1. Para el Cd2+ se emplearon concentraciones entre 25 y 250
mg.L1. En este caso se utiliz la concentracin de 112,4 mg.L-1 como control del experimento.

II.5.5. Efecto de la competencia nter inica

A una solucin con CdCl2.4H2O y ZnSO4.7H2O mezclados, se adicion la biomasa microbiana

en la proporcin de 2g.L-1: 1mM.L-1 de cada metal. El resto de las condiciones del experimento
de captacin de los metales se indic en el epgrafe II.4. Como control se utilizaron las
soluciones monometlicas de Zn2+ y Cd2+ en iguales condiciones experimentales.

II.6. Evaluacin del efecto de tratamientos fsicos y qumicos a la biomasa microbiana

sobre la remocin de cinc y cadmio

Los microorganismos se cultivaron como se indic en el epgrafe II.4 y se sometieron a las

siguientes variantes de tratamientos:

Variantes de tratamientos:
A-Esterilizacin (autoclave durante veinte minutos a 121 C).
B- Entrecruzamiento (formaldehdo 15 % durante 15 min).
C- Alcalino (Hidrxido de sodio 0.5 M a 100 C durante 15 min).
D- Secado (secado a 60 C en horno durante 12 h).
E- Control (biomasa no tratada)

Despus de la aplicacin de los tratamientos por esterilizacin, entrecruzamiento y alcalino, las

clulas se precipitaron con agua bidestilada por centrifugacin a 3 500 xg durante 20 min., en
una centrfuga MLW T24D. Para comprobar la accin de cada tratamiento sobre la viabilidad
celular, el control y las biomasas tratadas se sembraron en placas con medios de cultivos
selectivos para cada grupo microbiano, se incubaron en las condiciones referidas en el epgrafe
II.4. La biomasa que se obtuvo del tratamiento por secado, las biomasas hmedas de las clulas
sometidas al resto de los tratamientos y los respectivos controles se pusieron en contacto con
las soluciones de cinc y cadmio.

II.7. Determinacin del metal capturado en la superficie celular de las clulas no tratadas

El metal enlazado a la superficie celular, definido como metal adsorbido (qad) se determin en
los microorganismos no tratados, obtenidas despus del experimento de sorcin de los metales,
31
al resuspender 0,5 g de biomasa en 10 mL de una solucin que contena 2 mM.L-1 de cido
etilendiaminotetraactico (EDTA) durante 20 min. Seguidamente, esta suspensin se
centrifug a 3 200 xg durante 10 min, en centrfuga Eppendorf (Drehichtung) para determinar
por EAA el contenido de metal extrado con EDTA. El metal adsorbido, expresado en
porcentaje se calcul a travs de la siguiente ecuacin:
q ad = (qt qi) 100 (Prez- Rama et al., 2002)

donde: qt: se calcul a travs de la siguiente ecuacin q=(Co-Cf) * V/m (Vieira y Volesky, 2003)
qi : metal intracelular, cantidad de metal no extrado con EDTA.

II.8. Evaluacin del efecto de modificaciones genticas en Anabaena sp. PCC 7120 sobre
la remocin de cinc y cadmio

Los microorganismos utilizados para las transformaciones genticas y las caractersticas de

cada uno de estos se indican en la Tabla 3. Las secuencias de bases del gen smtA, que codifica
la protena metalotionena y del gen alr0834 que codifica la porina, se muestran en el Anexo
II.
Los plsmidos utilizados fueron:

pDrive (QIAGEN Gmbh, Hilden) de 3 850 pb, con gen de resistencia a ampicillina.
pGEM-T (Promega) de 3 000 pb, con gen de resistencia a ampicillina.
pRL277 de 6 798 pb (Promega) con gen de resistencia a estreptomicina y
espectomicina.

El mapa de cada vector empleado en el trabajo se muestra en el Anexo III.

Extraccin del ADN genmico: La biomasa de Synechococcus sp. PCC 7942 y Anabaena sp.
PCC 7120, se colect y se lav con buffer TE (Tris HCl 10mM y EDTA 1M, pH 7.5) por
centrifugacin a 8 000 xg durante 5 min. A la biomasa resuspendida en este buffer, se le
adicion polvo de vidrio, SDS al 10% y se extrajo con fenol/cloroformo en una relacin (1:1)
En las distintas extracciones se separ la fase acuosa por centrifugacin. Finalmente se
precipit el ADN con NaAc 3M (10% del volumen) y 2,5 volmenes de etanol. El precipitado
obtenido se separ por centrifugacin, se lav con etanol y posteriormente se resuspendi en
buffer TE a pH 8.0 (Cai y Wolk, 1990). Las muestras se conservaron a -20 C para su uso
posterior.

32
Extraccin del ADN plasmdico: se realiz por micro centrifugacin segn las instrucciones
del protocolo del estuche QIApre Spin Miniprep (QIAGEN Gmbh, Hilden).

En ambos casos el ADN se cuantific por espectrofotometra (Kontron Uvicon 860) a una
=260 nm.

Tabla 3- Caractersticas de las cepas empleadas en las transformaciones genticas.

Cepa Caractersticas Referencia

Donante del gen smtA que codifica
Synechococcus sp. PCC 7942 metalotionena intracelular. Shi et al., 1992
Donante del gen alr0834 que codifica la
protena de membrana externa Omp (porina)
Anabaena sp. PCC 7120 y receptora del gen smtA fusionado en la Moslavac et al.,
porina para la transformacin final 2005
Alta eficiencia de recombinacin. Receptora
Escherichia coli DH10B de los genes smtA y alr08334 Hanahan et al.,1991
Aporta ADN metilasa y una enzima nicking
para el inicio de la conjugacin (genes tra) en
Escherichia coli HB101 el plsmido auxiliar pRL258. Receptora del Elhai y Wolk , 1988
fragmento porina+smtA+porina.
Aporta mediante su plsmido PR-4 la
Escherichia coli J-53 maquinaria requerida para la conjugacin Elhai y Wolk , 1988
excepto las enzimas nicking

II.8.1. Amplificacin de los fragmentos por la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP)

La reaccin en cadena de la polimerasa se utiliz para la amplificacin de los fragmentos de

genes a partir del ADN genmico de las cepas Synechococcus sp. PCC 7942 y de Anabaena
sp. PCC 7120, as como del ADN plasmdico de los clones obtenidos en las transformaciones.
Para la amplificacin de los diferentes fragmentos, los oligonucletidos utilizados como
cebadores, se seleccionaron segn las secuencias de bases de los genes de inters (Tabla 4).

La reaccin en cadena de la polimerasa se realiz en un volumen final de 50 L, que contena

50 ng.L-1 de la muestra de ADN y una concentracin de los cebadores de 100 pmoles. Se
adicion 2U de Taq ADN polimerasa y 12,5 L de la solucin tampn de esta enzima. A cada
muestra se le adicion parafina lquida. El programa utilizado para la amplificacin de los
fragmentos, consisti en los siguientes pasos: inicialmente, 10 min. a 95 C, posteriormente 30
ciclos de 30 seg. a 95 C (desnaturalizacin), 30 seg. a 54 C (alineacin) y 2 min a 72 C

33
(extensin). Un paso final de extensin a 72 C por 10 min., para garantizar la completa
elongacin de los fragmentos amplificados. Esta reaccin se realiz en un termociclador
Biometra (T1 Thermocyler).

Tabla 4- Cebadores utilizados en las amplificaciones por la RCP.

Cdigo Fragmento que amplifica Secuencia de los cebadores1

Talla del fragmento
2
289 F 5'-GGA TCC GCT AGC ATG ACC TCA ACA ACG TTG -3'
3 smtA (170) pb 5'-GCT AGC GCC GTG GCA GTT ACA GCC-3'
313 R
291 F 5'-ATG CTA TTT TCT GGC GCT GC -3'
292 R Porina alr0834 ( 1 540 pb) 5'-CTA AAT GTG GTT CTC AAC GCA CC-3'
291 F 5'porina+ smtA + porina 3' 5'-ATG CTA TTT TCT GGC GCT GC -3'
315 R (1 700 pb) 5'-CTCCAG TTA GAA ACT AAA TGT GGT TCT C-3
291 F 5' porina + smtA 3' 5'-ATG CTA TTT TCT GGC GCT GC -3'
313 R (866 pb) 5'- GCT AGC GCC GTG GCA GTT ACA GCC -3'
324 F pRL277+ 5'porina + smtA 3' 5'-GCT CTC GGG TAA CAT CAA GGC -3
313 R (1 100 pb) 5'-GCT AGC GCC GTG GCA GTT ACA GCC-3'

1
-Cebadores diseados en el Laboratorio de Fisiologa Vegetal, Universidad de Regensburg, Alemania
2
-F: cebador que amplifica a partir del extremo 5' del fragmento a amplificar
3
-R: cebador que amplifica a partir del extremo 3' del fragmento a amplificar

II.8.2. Anlisis de restriccin

Al considerar los sitios de corte de los fragmentos y plsmidos, se utilizaron las siguientes
endonucleasas de restriccin: NheI (G/CTAGC) para el plsmido pDrive y el centro de la
porina (arl0834) en el plsmido pGEM-T. SphI (GCATG/C) y PstI (CTGCA/G) para el
plsmido pGEM-T; EagI (C/GGCCG) con dos sitios de corte en el plsmido pRL277. Todas
las digestiones se realizaron en un volumen de 25 L con los tampones recomendados por el
fabricante New England Biolabs, Fermentas, con una concentracin de las enzimas de 1U.g-1
de ADN e incubada una hora a 37 C.

II.8.3. Electroforesis en gel de agarosa

Los productos de la RCP y de las digestiones se analizaron por electroforesis en gel de agarosa
al 0.8% en tampn de corrida TBE (Tris-Borato 0.045 M, EDTA 0.1 M, pH 8) con adicin de
bromuro de etidio, a una concentracin final de 0.5 g.mL-1. Las muestras se mezclaron con
bromofenol azul, al 0.25 % en una relacin 1:6 (v/v) (Sambrook et al., 1989).

34
Se emplearon los siguientes patrones de peso molecular: de 26 282 pb-421 pb (MBI,
Fermentas) y de 3 000 pb -100 pb (GeneRulerTM). Las electroforesis se llevaron a cabo a un
voltaje de 90 V y con un tiempo de corrida de una hora y cincuenta minutos. La separacin de
las bandas se visualiz por transiluminacin con luz ultravioleta.

Una vez comprobada la talla de las bandas correspondientes a los fragmentos de inters, por
electroforesis en gel de agarosa, se realiz la extraccin y purificacin de los productos de la
RCP y de las digestiones, segn el protocolo descrito para la extraccin de fragmentos a partir
de gel de agarosa QIAquick (QIAGEN Gmbh, Hilden).

II.8.4. Construccin de vectores

Vectores recombinados con los fragmentos smtA y alr0834: Los insertos utilizados en la
recombinacin de los plsmidos se obtuvieron del ADN aislado de Synechococcus sp. PCC
7942 y Anabaena sp. PCC 7120, mediante la purificacin de stos a partir de los productos de
la RCP. El plsmido pDrive digerido con la enzima NheI se utiliz para el clonaje del
fragmento smtA, segn el protocolo de ligazn (QIAGEN Gmbh, Hilden) para clonar
productos obtenidos por la RCP. La insercin de la protena de membrana externa (alr0834) en
el plsmido pGEM-T se realiz mediante la siguiente reaccin: 1 L de una relacin 4:1
inserto/vector, 1.5 L 10x buffer de ligazn, 0.75 L 10nM ATP, 10.75 L del producto de la
RCP (537 ng.L-1) y 1 L de ADN ligasa, a una concentracin de 1 U en un volumen final de
la reaccin de 15 L.

Vector integrador: El fragmento smtA del plsmido pDrive y el plsmido pGEM-T se

digirieron con la endonucleasa de restriccin NheI. El producto de la digestin correspondiente
al plsmido pGEM-T se incub una hora a 37 C. Una segunda incubacin similar a las
condiciones anteriores se realiz con 1 L (1U) de fosfatasa alcalina de intestino bovino (CIP)
con el objetivo de disminuir el fondo del vector. A partir de las bandas obtenidas por
electroforesis se aislaron el inserto y el plsmido. Posteriormente se realiz la insercin del
fragmento smtA en el plsmido pGEM-T/ arl0834, mediante la siguiente reaccin: 11 L de
una relacin 9:1 inserto/vector, 1.5 L buffer de ligazn, 1.5 L de 10 nM de ATP y 1 L
ADN ligasa, a una concentracin de 1U en un volumen final de la reaccin de 15 L.

35
Vector movilizable en cianobacterias: El fragmento porina-smtA-porina, contenido en el
plsmido pGEM-T, aislado a partir de un clon y el plsmido pRL277 se digirieron con la
endonucleasa de restriccin EagI. Posteriormente el fragmento se lig al plsmido pRL277. La
reaccin de ligazn fue la siguiente: 3 L de una relacin 13:1 inserto/vector, 1,5 L buffer de
ligazn, 1,5 L de 10nM de ATP y 1 L ADN ligasa, a una concentracin de 1U L-1 en un
volumen final de la reaccin de 15 L.

Las mezclas de reaccin de ligamiento para la obtencin de los diferentes vectores se

incubaron a 16 C durante 1,5 h, posteriormente la enzima ADN ligasa se inactiv a 70 C por
15 min.

II.8.5. Transformacin y seleccin de los clones transgnicos

Preparacin de clulas competentes: las cepas Escherichia coli DH10B y Escherichia coli
HB101 se utilizaron para la preparacin de las clulas competentes. A partir de un crecimiento
celular con una absorbancia de 0,6 a 600 nm (KONTRON UVIKON 860) correspondiente a la
fase de crecimiento exponencial de cada una de estas cepas, se centrifug 1,5 mL del cultivo a
1000 xg y a 4 C por 5 min. Posteriormente el precipitado celular de cada cepa se lav con
una solucin de CaCL2 (100 mM.L-1), se centrifug y seguidamente las biomasas se
resuspendieron en 1 mL de esta solucin. Las alcuotas de 100 L de la suspensin final se
conservaron a -70 C (Sambrook et al., 1989).

Transformacin: A 40 L de clulas competentes se le aadi 1L del producto de cada

ligazn y se incubaron en hielo por 1 h. La transformacin fue realizada por electroporacin
con un pulso (choque trmico a 42 C por 2 min.) a 2,5 kV, 25 F y 200 . Despus de la
pulsacin, las clulas se colocaron por 2 min en hielo y posteriormente se le aadi medio LB
y se incubaron a 37 C durante 1h. Transcurrido este tiempo, los cultivos se sembraron por
diseminacin con esptula de Drigalsky en placas con medio LB, que contenan 1,5% de agar y
los antibiticos correspondientes a cada vector: ampicillina (50 g.mL-1) vectores
recombinantes pDrive y pGEM-T, estreptomicina (2,5 g.mL-1) y espectomicina (2,5 g.mL-
1
) para el vector pRL277. En todos los casos las placas inoculadas se incubaron a 37 C
durante 16 h.
Seleccin: Las clulas transformadas de Escherichia coli DH10B, con los vectores pDrive y

36
pGEM-T portadores de los fragmentos insertados; as como las clulas transformadas de
Escherichia coli DH101 con el vector pRL277 portador de la construccin final, se
seleccionaron a partir de la expresin del nuevo fenotipo, que consisti en la resistencia a los
antibiticos correspondientes. Se seleccionaron varias de las colonias crecidas para comprobar
la transformacin. Estas se inocularon sobre medio LB ms antibitico y se incubaron en
agitacin a 150 r.min-1 a 37 C durante 16 horas.

II.8.6. Anlisis de los clones

Los clones de Escherichia coli DH10B y de Escherichia coli HB101 se analizaron a partir de
la extraccin y purificacin del ADN por microcentrifugacin, segn el protocolo del estuche
QIApre Spin Miniprep (QIAGEN Gmbh, Hilden). Posteriormente se realizaron digestiones con
las endonucleasas adecuadas a cada fragmento y plsmido, as como amplificaciones por la
RCP y finalmente las muestras se aplicaron en gel de agarosa al 0.8 %.

II.8.7. Conjugacin y transformacin de cianobacteria

La cepa Escherichia coli HB101 que contiene el plsmido auxiliar pRL-528 y el fragmento
porina-smtA-porina en el plsmido pRL277 con genes de resistencia a ampicillina y
estreptomicina y la cepa Escherichia coli J-53 que contiene el plsmido PR-4 con genes de
resistencia a kanamicina, tetraciclina y ampicillina se cultivaron hasta la fase log en el medio
de cultivo LB, suplementado con los antibiticos correspondientes. El cultivo celular de
Anabaena sp. PCC 7120, hasta la mitad de la fase log, fue obtenido en el medio de cultivo
Allen y Arnon (Allen y Arnon, 1955). Las biomasas se lavaron con los respectivos medios sin
antibiticos y se colectaron por centrifugacin a 5 000 xg.

Los precipitados celulares de cada microorganismo se emplearon para la conjugacin

triparental con Anabaena sp. PCC 7120. El procedimiento realizado fue el siguiente: Las
clulas de ambas cepas de Escherichia coli se mezclaron en 1 mL del medio de cultivo LB y
se incubaron a 30 C por una hora, para transferir el plsmido RP-4 de Escherichia coli J-53 a
las clulas de Escherichia coli HB101. Posteriormente se adicion la cianobacteria a la mezcla
de Escherichia coli. En estas condiciones, Escherichia coli HB101, proporciona los plsmidos
movilizables pRL277 con la construccin final y el plsmido RP-4 a las clulas de Anabaena
sp. PCC 7120. De esta mezcla microbiana se adicionaron diferentes diluciones a filtros

37
miliporo HATF y se incubaron en placas de medio LB agarizado sin antibitico y se incubaron
a 5 000 lux por dos das. A continuacin los filtros miliporo se transfirieron al mismo medio de
cultivo, suplementado con estreptomicina (2,5 g.mL-1) y espectomicina (2,5 g.mL-1).
Despus de dos semanas, las colonias aisladas se inocularon en estas condiciones para
chequear la correcta insercin de la construccin por la RCP.

La representacin esquemtica de la metodologa empleada para la modificacin gentica de

Anabaena sp. PCC 7120 se muestra en la Figura 1.

Control de la orientacin del fragmento smtA clonado en el plsmido pRL277 y

recombinado en Anabaena sp. PCC 7120: La orientacin del gen se verific a travs de la
electroforesis de los productos de la RCP, amplificados con los cebadores para los fragmentos
[alr0834- smtA- alr0834] y [alr0834-smtA], a partir del ADN de cada clon, obtenido de la
transformacin en Escherichia coli HB101 y de los fragmentos digeridos. Los clones
seleccionados se conservaron en glicerina a -70 C, hasta su utilizacin.

II.8.8. Remocin de los metales por las cepas transgnicas de Anabaena sp. PCC 7120

Los clones de Anabaena sp. PCC 7120 y los controles negativos (Anabaena sp. PCC 7120 no
transformada y Anabaena sp. PCC 7120 que contena el plsmido pRL 271 sin los insertos) se
cultivaron en el medio Allen y Arnon (Allen y Arnon, 1955) con adicin de estreptomicina
(2,5 g.mL-1) y espectomicina (2,5 g.mL-1), segn se requiri. Las condiciones de incubacin
y de los experimentos de captura de los metales se describieron en el epgrafe II.4.

Con la cepa transgnica que mostr mayores valores de metal capturado se determin el efecto
de los diferentes factores y de los tratamientos a la biomasa sobre la captura del metal. La
metodologa experimental empleada se refiri en los epgrafes II.5.1, II.5.2, II.5.3, II.5.4 y II.6.

II.9. Cintica de biosorcin de cinc y cadmio

Las biomasas microbianas se pusieron en contacto con los metales en las condiciones
experimentales determinadas en la evaluacin de los diferentes factores y de los tratamientos
fsicos y qumicos que contribuyeron a obtener los mayores valores de captura de iones cinc y
cadmio, como se indican en los resultados de este trabajo. Estas condiciones se mantuvieron en
los siguientes experimentos y las variaciones se sealan en cada caso.
38
 Anabaena sp PCC 7120 Synechoccocus sp PCC 7120
ADN genmico ADN genmico

PCR (291+292) PCR (289+313)

alr0834 (1 540 pb) smtA (170 pb)

Ligazn
pGEM-T p-Drive Ligazn
3 000 pb 3 850 pb

PIM 110
NheI PIM 112

PIM110
PIM110 Ligazn

PIM114
EagI

alr0834 + smtA

pRL277
6 798 pb
Transformaciones realizadas en clulas
EagI competentes de Escherichia coli DH10B
PIM 141

Transformacin en Escherichia coli HB101

Obtencin de mutantes de Anabaena sp PCC 7120

Conjugacin Triparental

Transferencia del plsmido RP-4 de Escherichia coli J-35 a las clulas de Escherichis coli HB101
con la construccin plasmdica final pRL277

Transferencia del plsmido mobilizable pRL277 y el plsmido RP-4 de Escherichia coli HB101 a las
clulas de Anabaena sp PCC 7120

Figura 1- Representacin esquemtica de la metodologa empleada para la modificacin

gentica de Anabaena sp. PCC 7120
Para determinar la cintica de biosorcin de los iones de cinc y cadmio, se tomaron 2 mL de
muestra a diferentes intervalos de tiempo de contacto entre la biomasa microbiana y los iones
metlicos de 0 a 1 440 min., a 28 C en agitacin a 100 r.min-1. La cuantificacin del metal
capturado (q) se realiz como se indic en el epgrafe II.4.1.1.

II.10. Determinacin de la eficiencia de biosorcin de cinc y cadmio

A las 10 h de contacto entre las biomasas y los iones metlicos se determin la eficiencia de la
remocin de estos metales segn lo indicado en el epgrafe II.4.1.1. Se evalo la eficiencia del
proceso de captura de cinc y cadmio por los microorganismos, aun tiempo de contacto entre
las biomasas y los iones metlicos de 10 h, mediante la siguiente ecuacin:

Ci-Ceq (Barros et al., 2003)

E= x 100
Ci

donde: E: eficiencia de la remocin del metal (%).

Co: concentracin inicial del metal (mg.L-1).
Ceq: concentracin del metal en equilibrio, calculada de la siguiente manera:
Ceq= Co- q (m v-1) (Vieira y Volesky, 2003)

II.11. Evaluacin del equilibrio de biosorcin de cinc y cadmio

El equilibrio de biosorcin de cinc y cadmio se evalo e interpret en microorganismos que

presentaron valores de eficiencia de captura de los metales superiores al 65%.

II.11.1. Isotermas de biosorcin de cinc y cadmio

Las curvas de isotermas de biosorcin de los metales se realizaron a concentraciones iniciales

de cinc de 20 a 130 mg.L-1 y para el cadmio en el rango de 35 a 225 mg.L-1. La suspensin
biomasa seca-metal se mantuvo agitada en zaranda a 100 r.min-1 y a pH 6.0 por 10 h. Al
graficar la capacidad de captura del metal (q=mg.g-1) contra la concentracin de equilibrio del
metal remanente en la solucin (Ceq=mg.L-1) se obtuvieron las isotermas de biosorcin.

II.11.2. Aplicacin de los modelos de equilibrio de biosorcin

El equilibrio de biosorcin de los metales se interpret al aplicar dos modelos matemticos de

isoterma, el modelo de isoterma de Langmuir (1916) y el modelo de isoterma de Freundlich
(1906).
39
Para el ajuste de los datos experimentales a los modelos de equilibrio de biosorcin y la
determinacin de las constantes de adsorcin, los datos experimentales de las isotermas de
biosorcin, se compararon con las ecuaciones correspondientes a cada modelo de biosorcin
(Parvathi et al., 2007).
Modelo de Langmuir q = qmx b Cf / 1 + bCf
Ecuacin linealizada: 1/q= 1/qmx (1/b Cf +1)

donde:
q: mg de metal acumulado por g de biomasa microbiana (mg.g-1).
Cf: concentracin de metal residual en solucin (mg.L-1).
q mx: mxima captura del metal bajo las condiciones dadas (mg.g-1).
b: constante relacionada a la afinidad entre el sorbente/sorbato (L.mg-1).

Modelo de Freundlich q = Kf Cf 1/n

Ecuacin linealizada: Log q = Log k +1/n Log Cf

donde:
q: mg de metal acumulado por g de material biosorbente (mg.g-1).
Kf: constante que brinda informacin de la capacidad de adsorcin del biosorbente (L.g-1).
Cf: concentracin de metal residual en solucin (mg.L-1).
n: constante emprica que provee indicacin de la intensidad de adsorcin

Estas ecuaciones linealizadas permitieron transformar los datos experimentales y graficar las
(y) en funcin de (x). Al graficar los datos transformados, 1/q como una funcin de 1/Cf,
modelo de Langmuir y log q como una funcin de log Ce, modelo de Freundlich, se
obtuvieron los grficos y se determin el coeficiente de regresin (R2). A partir de la
correlacin de los datos experimentales se calcularon las constantes de adsorcin de los
modelos, (qmx) y (b) en el modelo de Langmuir y (Kf) y (n) en el modelo de Freundlich.

II.12. Biosorcin de cadmio por consorcios microbianos

A partir de la evaluacin del equilibrio de biosorcin de los iones cadmio se disearon tres
consorcios microbianos denominados ISMEC/08, AMECA/08 y MECIIMA/08. Estos se
pusieron en contacto con la solucin de iones cadmio en una relacin de 1,3 mM.L-1 del metal
con 2 g.L-1 de biomasa seca de cada microorganismo que conforman los consorcios. El proceso
de biosorcin transcurri a pH 6.0, 28 2 C durante un tiempo de 10 horas.

40
II.13. Anlisis Biomtricos

Como punto de partida para la realizacin de los Anlisis de Varianza (ANOVA) a los datos
bsicos obtenidos en los diferentes experimentos se les comprob la normalidad y
homogeneidad de varianza mediante las pruebas de Kolmogorov-Smirnov y Bartlett,
respectivamente. En los casos en que no fueron cumplidas estas premisas se realizaron
transformaciones logartmicas y posteriormente se aplicaron mtodos estadsticos paramtricos
para realizar los anlisis correspondientes. Las variables analizadas fueron: metal capturado
por gramo de biomasa (q mg.g-1), porcentaje de metal adsorbido (qad) y porcentaje de
eficiencia del proceso de captura de los metales (E). En los anlisis de la evaluacin de las
capacidades de remocin de cinc y cadmio por los microorganismos (tamizaje), caracterizacin
de los factores asociados al proceso de remocin de ambos metales, tratamientos fsicos y
qumicos a las biomasas microbianas, combinacin de las mejores condiciones experimentales
para la biosorcin de los metales y biosorcin por consorcios microbianos se aplicaron los
anlisis estadsticos paramtricos, Prueba de t-Student para la comparacin de dos muestras a
un nivel de significacin de 0.001 o el anlisis de varianza de clasificacin simple cuando se
compararon ms de dos muestras. Cuando en ste ltimo anlisis se obtuvieron resultados
estadsticamente significativo se aplic la prueba de Tukey a posteriori para la comparacin de
las medias a un nivel de significacin de 0.05. Para el procesamiento estadstico de los datos se
emple el paquete estadstico Statistica versin 6.1 para Windows.

41
CAPTULO III: RESULTADOS
CAPTULO III: RESULTADOS

III.1. Remocin de cinc y cadmio por aislados microbianos del ro Martn Prez y
microorganismos de colecciones

III.1.1. Remocin de metales por aislados microbianos

Del aislamiento microbiano a partir de aguas del ro Martn Prez se obtuvieron 24 aislados
microbianos; su caracterizacin preeliminar en cuanto a: caractersticas culturales,
morfolgicas y estructurales, permiti constatar el aislamiento de seis microalgas y 18
bacterias (Tabla 5).

Tabla 5. Aislados microbianos del ro Martn Prez.

Estaciones Aislados bacterianos

de muestreo Clave Morfologa Respuesta al Gram
A1 Bacilar Gram negativo
A5 Coco Gram negativo
A6 Cocobacilo Gram negativo
A7 Bacilar Gram negativo
A2F Bacilar Gram positivo
CBM1 Bacilar Gram negativo
CBM2 Cocobacilo Gram negativo
CBM4 Cocobacilo Gram negativo
CBM6 Bacilar Gram positivo
Punto 1 CBM7 Bacilar Gram positivo
CBM10 Bacilar Gram positivo
CBM11 Coco Gram positivo
Aislados de microalgas
Clave Morfologa
CMM Ovoide
CMM1 Ovoide
CMM3 Ovoide
CMM5 Ovoide
CMM6 Ovoide
CMMV Ovoide
Aislados bacterianos
Clave Morfologa Respuesta al Gram
A2 Bacilar Gram negativo
A3 Bacilar Gram negativo
Punto 2 A4 Coco Gram negativo
A2M Coco Gram positivo
A2N Coco Gram positivo
AN Cocobacilo Gram negativo

Leyenda: Punto 1.Ro Martn Prez y Puente del Ferrocarril Punto 2.Ro Martn Prez y calle 6ta y7ma

42
La respuesta a la tincin de Gram de los aislados bacterianos permiti diferenciar los
siguientes grupos: bacilos Gram positivos (22%), bacilos Gram negativos (28%), cocobacilos
Gram negativos (22%), cocos Gram negativos (11%) y cocos Gram positivos (17%).

En los resultados obtenidos en la remocin de cinc y cadmio por las bacterias y microalgas
aisladas (Figuras 2 y 3) se pudo detectar que el 87,5% de estos aislados capturaron ambos
iones metlicos de la solucin acuosa. Los valores de captura de cinc y cadmio difieren
significativamente entre los aislados, como es mostrado en las figuras.

a (I) 25 (II)
20 a

(mg.g- )
1
b 20 a,b
(mg.g )
-1

15 b b
b 15 b,c c
a d

2+
10 c c d,e e
q Cd
c,d 10
2+

g d d,e e,f e,f f

g,h f,g f f
q Zn

5 f
0 i
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
g g
5 g
h h
i i 0 h
13 14 15 16 17 18 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 15 17 18

Cepas Cepas

Leyenda
Punto de muestreo 1 Punto de muestreo 2
1-A1 7-CBM2 13-A2
2-A5 8-CBM4 14-A3
3-A6 9-CBM6 15-A4
4-A7 10-CBM7 16-AN
5-A2F 11-CBM10 17-A2M
6-CBM1 12-CBM11 18-A2N

Figura 2-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por bacterias aisladas del ro
Martn Prez.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismo. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

Entre las bacterias, el aislado A6, con un enlace de los iones cinc de 17,98 1,5 mg.g-1 (Figura
2-I) y el aislado CBM4, con valores de 21,68 0,2 mg.g-1 de retencin de iones cadmio
(Figura 2-II) resultaron ser las biomasas microbianas con mayores capacidades para la captura

43
de estos iones. Los anlisis estadsticos aplicados a los valores de (q) obtenidos en el grupo
bacteriano, confirmaron los resultados significativos de estas dos bacterias Gram negativas.
Otro resultado que se destac entre estos aislados, lo constituy el hecho que las bacterias A1,
A3 y A2N no capturaran cinc ni cadmio de las soluciones.

La microalga CMM3 present el valor de captura del metal ms elevado (6,33 0,26 mg.g-1)
entre este grupo microbiano (Figura 3-I), resultados corroborados estadsticamente. En relacin
a la remocin del cadmio (Figura 3-II) los aislados CMM3, CMM6 y CMV se distinguieron al
presentar valores de captura de este ion entre 18,2 2,8 y 21,07 2,06 mg.g-1, sin diferencias
significativas entre si.

7 (I) a 30 (I)
(II)
a,b a
25

(mg.g )
6 b a

-1
(mg.g )

a
-1

5 c c 20
4 d 15
2+
b b
3 b
2+

10
q Cd
q Zn

2
5
1
0 0
CM-M CM- CM- CM- CM- CM-V CM- CM- CM- CM- CM- CM-V
M1 M3 M5 M6 M M1 M3 M5 M6

Cepas Cepas

Figura 3-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por aislados de microalgas.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismos. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

III.1.2. Remocin de metales por microorganismos de coleccin

Al evaluar la captura de cinc y cadmio de 36 microorganismos de coleccin se evidenciaron

niveles de los metales enlazados a las biomasas los cuales, difieren significativamente entre los
microorganismos de cada grupo microbiano (Figuras 4, 5, 6 y 7). Entre las bacterias,
Pseudomonas mendocina (Ps-1) se destac por la capacidad que present para capturar los dos

44
metales. Esta bacteria Gram negativa captur 25,36 1,78 mg.g-1 de iones cinc (Figura 4-I) y
22,56 0,25 mg.g-1 de cadmio (Figura 4-II) valores con diferencias significativas de los
obtenidos por las restantes bacterias ensayadas, comprobado mediante un ANOVA de
clasificacin simple y procedimiento Tukey a posteriori.

30 (I) a 25 (II) a
25 20 b

(mg.g )
b
(mg.g )

-1
-1

20
15
15 b b b c,d
c

2+
2+

10 c,d d
q Zn

q Cd
10 c c c
c,d e
5 d 5
e
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Cepas Cepas

Leyenda
1-Bacillus cereus (B-63) 6-Serratia marcescens ATCC-14056
2-Bacillus thuringiensis (Cp-3) 7-Escherichia coli ATCC-8739
3-Bacillus megaterium (M-11) 8-Enterobacter sp. (Dl-7)
4- Micrococcus luteus (M-2) 9- Acetobacter diazotrophicus (caa-1)
5-Pseudomonas mendocina (Ps-1)

Figura 4-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por bacterias de coleccin.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin- 1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismos. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

En el grupo de las cianobacterias la especie Anabaena variabilis ATCC 29413 alcanz el

mayor valor de captura de cinc con una (q) de 13,16 1,59 mg.g-1 (Figura 5-I). Los mejores
resultados en la captura de los iones cadmio se observan para las especies Anabaena sp. PCC
7120 y Chloroglocopsis fritschii (9A) con valores de 16,01 1,19 y 15,58 0,99 mg.g-1 de
metal capturado, respectivamente (Figura 5-II). Los anlisis estadsticos confirmaron los
resultados obtenidos entre las bacterias fototrofas.

Los niveles de remocin de los metales por las microalgas de coleccin, revelaron que
Tetraselmis suesica (7P) alcanz la mayor captura de cinc (13,52 0,62 mg.g-1) valor que
difiere con significacin estadstica de los obtenidos por el resto de las microalgas (Figura 6-I).
45
Por otro lado, se observ que las especies Chaetoceros ceratosphorus (1P) y Nanocloropsis
gaditana (13-P), inmovilizaron la mayor cantidad de cadmio en solucin, con niveles de 16,86
0,53 mg.g-1 y 14,39 2,28 mg.g-1 del metal capturado, respectivamente, resultados avalados
por los anlisis estadsticos como se puede observar en la Figura 6 (II).

16 a (I) (II)
20
14 a a

(mg.g )
q Zn (mg.g )

12

-1
-1

b 15
10 b
b
8 c c,d c c 10 b,c b
2+

2+
6 c,d c c,d d
d

q Cd
d
4 5 e e
2 e e
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Cepas Cepas

Leyenda
1- Anabaena sp. PCC 7120 2- Anabaena variabilis ATCC 29413
3- Synechococcus sp. PCC 7942 4- Nodularia sphaerocarpa (4A)
5- Tolypothrix tenuis (5A) 6- Chloroglocopsis fritschii (9A)
7- Nostoc muscorum (11A) 8- Calothrix sp. (12A)
9- Scytonema bohneri (14A) 10- Nostoc sp. (15AE)
11- Phormidium sp. (M3-p)

Figura 5-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por cianobacterias de coleccin.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismos. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

El comportamiento de las levaduras en su interaccin con los metales, evidenci que estos
microorganismos presentaron mayor capacidad de unir iones de cinc con respecto a los iones
de cadmio (Figura 7-I y Figura 7-II) respectivamente, este comportamiento contrasta con los
otros grupos microbianos ensayados en la remocin de ambos metales. Las cepas (10) y (12)
de Saccharomyces cerevisiae, con valores en la remocin de los iones de cinc de 27,06 0,92
y 24,84 0,62 mg.g-1, respectivamente y para el cadmio Saccharomyces cerevisiae (10), con
un valor de (q) de 34,26 1,27 mg.g-1 constituyeron las levaduras con mayores capacidades de
captura detectadas. Estos resultados fueron sustentados estadsticamente (Figura 7-I y 7-II).

46
 15 (I) a a,b 20 (II)
a
a,b,c b,c a

(mg.g )

(mg.g )
-1
15

-1
10 c,d
d d,e 10 b b
2+

2+
5 e c
q Zn

q Cd
5 d
d
0 e
0
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Cepas Cepas
Leyenda
1- Chaetoceros ceratosphorus (1P) 2- Chaetoceros muelleri (2P)
3- Talassiosira fluviatilis (3P) 4- Nanocloropsis gaditana (13P)
5- Tetraselmis suesica (7P) 6- Tetraselmis tetrtele (6P)
7- Nanocloropsis oculata (12P) 8- Tetraselmis chui (8P)

Figura 6-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por microalgas de coleccin.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismos. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

(I) 40 (II) a
30 a
a 35
b
(mg.g )

25 30
b,c b,c b
-1
(mg.g )
-1

c b,c
20 25
20 b b
15 b
2+

c
2+

15
q Cd

10
q Zn

10 d
5 5 e e
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8
Cepas Cepas

Leyenda
1-Saccharomyces cerevisiae (3)
3-Saccharomyces cerevisiae (7)
5-Saccharomyces cerevisiae (10)
7-Rhodotorula sp. (Rh-a)
2-Saccharomyces cerevisiae (5)
4-Saccharomyces cerevisiae (8)
6-Saccharomyces cerevisiae (12)
8-Schizosacharomyces sp. (Sz)

Figura 7-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por levaduras de coleccin.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por microorganismos. Se
aplic ANOVA para los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.
Los resultados obtenidos en la evaluacin de la remocin de los iones cinc y cadmio por los
aislados del ro Martn Prez y microorganismos de coleccin permitieron seleccionar, a partir
de cada grupo microbiano analizado, los microorganismos que en contacto con los metales
alcanzaron un nivel de captura absoluto mximo superior a 15 mg.g-1, entre los que mostraron
diferencias significativamente mayores en el grupo analizado. Este criterio de seleccin se
sustenta en lo referido en la literatura acerca de que para competir con tecnologas fsicas y
qumicas existentes en la eliminacin de metales, el agente activo (microorganismo) debe tener
una capacidad de captura de los iones metlicos superior a 15 mg.g-1 (Brierley et al., 1986;
Caizares-Villanueva, 2000).

Los microorganismos seleccionados representan el 12% del total (60) de los evaluados. El
71% de los siete seleccionados captur iones cadmio preferentemente a los iones cinc; el 43 %
corresponden a cepas autctonas aisladas de las aguas del ro Martn Prez y entre las bacterias
seleccionadas predominaron las Gram negativas (Tabla 6).

Tabla 6-Microorganismos con mayores valores de captura de cinc y cadmio seleccionados del
tamizaje.
Microorganismos Fuente Zn2+ Cd2+
(q mg.g-1) (q mg.g-1)
Bacteria A6 I 18 1,5 -
Bacteria CBM4 I - 21,8 0,2
Pseudomonas mendocina (Ps-1) II 25,4 1,78 22,6 0,25
Anabaena sp. PCC 7120 II - 16 1,19
Microalga CMM6 I - 21,1 3,9
Chaetoceros ceratosphorus (1P) II - 16,86 0,53
Saccharomyces cerevisiae (10) II 27,06 0,92 34,26 1, 27

Leyenda: I- microorganismos que provienen del aislamiento, II- microorganismos de colecciones microbianas,
q= mg de metal capturado por gramo de biomasa. () representan desviacin estndar de tres rplicas por
microorganismo.

III.2. Evaluacin de la influencia de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio

Los resultados hallados en la evaluacin de la influencia de los factores analizados sobre la

captura de cinc y cadmio por las biomasas microbianas seleccionadas (Tabla 6) resultaron de
vital importancia para determinar los parmetros de cada variable que ms favorecieron la
captura de los metales. Adems, permiti confirmar que la accin de estas depende del
microorganismo. Estos resultados se muestran a continuacin.
47
Edad fisiolgica del cultivo. A partir del crecimiento microbiano se seleccion para los
experimentos de sorcin de los metales, la biomasa celular crecida hasta los siguientes estadios
fisiolgicos: (1ra) primera mitad exponencial, (2da) exponencial avanzada y (3ra) estacionaria
/inicio declinacin o muerte celular. Los resultados presentados en las Figuras 8 y 9 indicaron
el efecto de los diferentes estadios fisiolgicos de los microorganismos sobre la remocin de
los metales. La captura de los iones cinc por el aislado bacteriano A6, Pseudomonas
mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10) en cada uno de estos estadios fisiolgicos
se muestra en la Figura 8. La respuesta de los aislados CBM4 y CMM6, Pseudomonas
mendocina (Ps-1), Anabaena sp. PCC 7120, Chaetoceros ceratosphorus (1P), Saccharomyces
cerevisiae (10) en contacto con los iones cadmio en las fases de crecimiento analizadas se
presenta en la Figura 9.

25 bacteria A6 1.2 Pseudomonas

Pseudomonas mendocina
mendocina (Ps-1)
a 40 22
q Zn2+ ( mg.g -1)

a 35
1
aa
mg.g-1 )) b
Absorbancia

20
-1

b 30 b
(640 nm)

Absorbancia
Absorbancia
0.8 30 1.5
1.5
Zn2+((mg.g

nm)
15 25

(640nm)
0.6 b b
10 20
20 11
0.4 15

(640
2+

5 0.2 10
10 0.5
0.5
qqZn

0 0 5
00 00
0 4 8 10 14 17 20 24 0 0 4 4 88 10
10 14 16 18
14 16 18 20
20 24
24
Tiempo (horas) Tiempo (horas)
Tiempo (horas)
2+ -1 2+
2+ -1 -1
Absorbancia ( 640 nm) q Zn (mg.g ) Absorbancia
Absorbancia( 640 nm)
( 640 nm) q Zn
q Zn (mg.g
(mg.g ))
Saccharomyces cerevisiae (10)
25 a 2.5
b
( mg.g )
-1

Absorbancia

20 c 2
(640 nm)

15 1.5
10 1
2+
q Zn

5 0.5
0 0
0 4 8 10 14 18 20 24
Tiempo (horas)
2+ -1
Absorbancia ( 640 nm) q Zn (mg.g )

Figura 8-Influencia de la edad fisiolgica del cultivo en la remocin de Zn2+ de solucin

acuosa.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por estadio fisiolgico. Se
aplic ANOVA de clasificacin simple para cada microorganismo analizado. Letras diferentes sobre las barras
indican diferencias significativas entre los valores de (q) en los diferentes estadios fisiolgicos para p<0.05,
segn la prueba estadstica Tukey a posteriori.

48
 25 bacteria CMM4
2 50 Pseudomonas mendocina
Pseudomonas mendocina (Ps-1)
(Ps-1)
2 2
aa

(mg.g )
a a

(mg.g-1-1))
-1
40

Absorbancia
20 40

Absorbancia
Absorbancia
1.5 1.51.5

(640 nm)
(640 nm)
b

(mg.g

(640 nm)
15 30
30
1 bb bb1 1
2+

10 20
20

2+
Cd2+
q Cd

0.5 0.50.5

qqCd
5 10
10
0 0 0 0 0
0 4 8 10 14 18 20 24 00 44 88 10
1014141616181820202424
Tiempo (horas) Tiempo
Tiempo(horas)
(horas)
2+ -1 2+
2+ -1 -1
Absorbancia ( 640 nm) q Cd (mg.g ) Absorbancia ( 640 nm) qq Cd
Cd (mg.g ) )
(mg.g
)
35 microalga CMM6 20
30 Anabaena sp. PCC 7120 5 a
( mg.g )
-1

30

(mg.g )
a

-1
25

Clorofila Total
Clorofila total
b 4 25 b 15
b

(mg.L )
(mg.L )
20 c

-1
-1
3 20
15 10
2+

2+
2 15
q Cd

q Cd
10
10 5
5 1
5
0 0
0 0
0 2 3 4 7 10 12
0 2 4 6 7 10 11 12
Tiempo (das)
Tiempo (das)
-1-1 2+ -1 -1
-1 2+ -1
Clorofila
Clorofila total
total (mg.L ) )
( mg.L q Cd (mg.g ) Clorofilatotal
Clorofila total( mg.L
(mg.L )) q Cd (mg.g )

Chaetoceros ceratosphorus (1P) Saccharomyces cerevisiae (10)

( mg.g )

20 4 50 a 2.5
-1

a
(mg.g )

a a
-1

Clorofila total

40 2

Absorbancia
15 3

(640 nm)
(mg.L )
-1

b 30 1.5
10 2
2+
2+

20 1
q Cd

5 1
q Cd

c 10 0.5
0 0 0 0
0 2 3 7 8 10 12 0 4 8 10 14 18 20 24
Tiempo (das)
Tiempo (horas)
-1-1 2+ -1 2+ -1
Clorofila
Clorofila total
total (mg.L ) )
( mg.L q Cd (mg.g ) Absorbancia ( 640 nm) q Cd (mg.g )

Figura 9-Influencia de la edad fisiolgica del cultivo en la remocin de Cd2+ de solucin

acuosa.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por estadio fisiolgico. Se
aplic ANOVA de clasificacin simple para cada microorganismo analizado. Letras diferentes sobre las barras
indican diferencias significativas entre los valores de (q) de los diferentes estadios fisiolgicos para p<0.05,
segn la prueba estadstica Tukey a posteriori.

En los grficos de pudo observar que el aislado bacteriano A6 y Pseudomonas mendocina (Ps-
1) alcanzaron en un menor tiempo de crecimiento, correspondiente a los estadios primera mitad
exponencial y exponencial avanzada, valores de iones cinc capturado estadsticamente iguales
o superiores a los obtenidos por los respectivos controles en fase estacionaria/inicio de

49
declinacin o muerte celular (Figura 8). Resultados similares se obtuvieron para la captura de
iones cadmio por la bacteria aislada CBM4 y Pseudomonas mendocina (Ps-1) tal y como lo
confirmaron los anlisis estadsticos (Figura 9). Para el caso de Anabaena sp. PCC 7120 y del
aislado CMM6 se evidenci que en la fase estacionaria/inicio de declinacin o muerte celular
los incrementos en la captura de cadmio fueron significativamente superiores a los obtenidos
por los controles (fase exponencial avanzada). Para este metal, otro resultado que se destac
fue el obtenido por Saccharomyces cerevisiae (10) que present valores de captura que no
difieren significativamente entre los tres estadios fisiolgicos.

Concentracin celular. Las cantidades de metal capturado (mg) por gramo de biomasa a las
diferentes concentraciones celulares analizadas se exponen en la Figura 10 (I) para el cinc y en
la Figura 10 (II) para el cadmio.

40
50 (I) a (II)
a 35 a
(mg.g )
-1

40
(mg.g )

b
-1

b 30
30
a a a
b 25
a
2+

a c
+2

20 a
q Cd

c 20 a a a
q Zn

a a a a
10 a 15
a a a
0 10
2 g.L-1 3 g.L-1 4 g.L-1 2 g.L-1 3 g.L-1 4 g.L-1
Concentracin celular Concentracin celular

Pseudom onas m endocina (Ps-1)

bacteria A 6 Anab aena sp. PCC 7120
Saccharom yces cerevisiae (10)
Pseudom onas m endocina (Ps-1) bacteria CBM4
m icroalga CMM 6
Saccharom yces cerevisiae (10) Chaetoceros ceratosphorus (1P)

Figura 10-Efecto de la concentracin celular sobre la capacidad de captura de Zn2+ (I) y Cd2+
(II).
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda, agitacin a 100
r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por concentracin celular. Se
aplic ANOVA de clasificacin simple para cada microorganismo analizado. Letras diferentes sobre las barras
indican diferencias significativas entre los valores de (q) de las diferentes concentraciones celulares para
p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a posteriori.

Los datos obtenidos de captura de los iones cinc (Figura 10-I) mostraron que el aumento de la
poblacin celular influy negativamente en la captura de este metal por Pseudomonas
mendocina (Ps-1). Por el contrario un incremento de la concentracin celular a 3g.L-1 en
Saccharomyces cerevisiae (10), aument significativamente la cantidad de los iones cinc
50
capturados tal y como se confirm estadsticamente. En relacin a la captura de cadmio para
las diferentes concentraciones celulares ensayadas en cada microorganismo (Figura 10-II) no
se detectaron incrementos en los valores del metal capturado, con respecto al control (2g.L-1).
Las diferentes respuestas de Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10)
en sus interacciones con los dos metales evidenciaron que la influencia de este factor depende
del comportamiento biolgico de cada tipo de microorganismo en relacin con el metal en s,
al menos en las condiciones experimentales ensayadas.

pH. El anlisis de la variacin de pH en el proceso de remocin de los metales permiti

conocer la accin de este factor sobre la captura de cinc y cadmio por las biomasas
microbianas. En la Figura 11 se presentan estos resultados.

(I) a
35 (II) b
a 40

(mg.g )
30
-1
a a
(mg.g )

30
-1

25 a
a b b
20 b 20 a
b b
2+

b a c
a
q Cd

15
2+

c c
10 b b
q Zn

10 c
c c
5 0 c
c
c
0 5 5.5 6 6.5 7
5 5.5 6 6.5 7 pH
pH Pseudomonas mendocina (Ps-1)
Anabaena sp. PCC 7120
Saccharomyces cerevisiae (10)
bacteria A 6 bacteria CBM4
Pseudomonas mendocina (Ps-1) microalga CMM6
Saccharomyces cerevisiae (10) Chaetoceros ceratosphorus (1P)

Figura 11-Efecto del pH en la remocin Zn2+ (I) y Cd2+ (II) por biomasas microbianas.
Condiciones experimentales: 28 2 C, metal en solucin- 1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a 100
r.min-1, 24 h. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por pH. Se aplic ANOVA de
clasificacin simple para cada microorganismo analizado. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de los diferentes pH para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a
posteriori.

Los datos obtenidos para la captura de los metales a pH 5.0 permitieron detectar que en estas
condiciones experimentales la microalga Chaetoceros ceratosphorus (1P) present el mayor
nivel de captura de cadmio (19,22 0,88 mg.g-1), que difiere con significacin estadstica del
valor de captura alcanzado a pH 6.0 y 7.0 (Figura 11-II). Para el resto de los microorganismos,
a pH 5.0, ocurrieron reducciones entre el 16 y 92% en la captura del cinc (Figura 11-I) y en el
orden de un 30 al 80 % en los valores de cadmio secuestrado (Figura 11-II) con respecto a los
51
resultados obtenidos a pH 6 (control). En adicin a lo anterior, la tendencia de las curvas
evidenci que el valor de pH 7.0 caus incrementos significativos en la captura de cinc por la
bacteria A6 (Figura 11-I). Resultados similares son observados en el secuestro de los iones de
cadmio por la levadura, la cianobacteria y la microalga CMM6 (Figura 11-II). Los dems
procesos de remocin ensayados fueron ms efectivos a pH 6.0, resultados verificados por los
anlisis estadsticos.

Concentracin del metal. Los resultados de la remocin de cinc y cadmio por los
microorganismos, a diferentes concentraciones iniciales de estos metales en la solucin
aparecen en la Tabla 7.

Tabla 7-Efecto de la concentracin inicial de cadmio y cinc sobre la capacidad de captura por
biomasas microbianas.
Concentracin Biomasas microbianas
inicial Bacteria Pseudomonas Anabaena Microalga Chaetoceros Saccharomyces
(mg.L-1) CBM4 mendocina sp. PCC CMM6 ceratophorus cerevisiae (10)
2+
(Ps-1) 7120 (1P)
Cd
0 e e e e d e
0 0 0 0 0 0
25 d d d d c d
8,5 1,4 5,15 0,24 11,5 1,7 5,8 1,2 4,75 1,4 11,5 2,3
50 c c c d b c
13,5 1,9 13,6 0,99 15 1,5 9,0 0,9 11,22 2,4 23,78 3,7
100 b b b c a b
22,5 2,0 27,6 2,63 20 2,1 23 2,2 17,4 1,5 36,41 1,5
150 a b a a a a
26 2,8 34,2 2,32 23,4 3,3 40 3,0 18,85 2,2 51,22 2,5
200 a a a a a a
26,5 0,7 36,7 1,17 22,3 1 39,6 1,3 20,05 1,8 47,91 3,1
250 a a a a a a
26,891,0 37,66 2,6 23 1,3 40,8 1,8 21,3 1,0 46,5 3,4
Biomasas microbianas
2+
Zn Pseudomonas mendocina Bacteria A6 Saccharomyces cerevisiae (10)
(Ps-1)
0 d d d
0 0 0
25 c c c
8,04 1,2 8,6 1,0 12,5 1,3
60 b b b
23,7 2,7 15,4 2,2 25.6 2,6
100 a a a
30,3 1,1 21,5 1,1 37,7 0,5
160 b a a
25,6 1,6 24,17 1,9 37,6 0,8

Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a 100 r.min-1, 24 h. ()

representan desviacin estndar de tres repeticiones por concentracin de metal. Se aplic ANOVA de
clasificacin simple para cada microorganismo analizado. Letras diferentes en la tabla indican diferencias
significativas entre los valores de (q) de las diferentes concentraciones de metales para p<0.05, segn la prueba
estadstica Tukey a posteriori.

52
Como se observa en la Tabla 7, con el aumento de la concentracin inicial de cinc y cadmio en
la solucin se increment la captura de estos metales por cada biomasa. Este incremento
alcanz un mximo por encima de 100 mg.L-1 de la concentracin inicial de cada metal, a
partir del cual los valores de captura se mantuvieron o disminuyeron. Este comportamiento de
los microorganismos se confirm por los anlisis estadsticos, que adems avalaron que los
valores de captura de ambos metales mostraron diferencias significativas entre las
concentraciones ensayadas de los iones metlicos, para cada biomasa.

Competencia nter-inica: Los resultados de los experimentos de captura de cinc y cadmio a

partir de una solucin bimetlica por Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces
cerevisiae (10), microorganismos seleccionados para este estudio por las capacidades que
presentaron de capturar ambos metales se muestran en la Tabla 8. En el anlisis de estos
resultados se pudo constatar en el sistema bimetlico una disminucin significativa de la
captura de los iones cinc y cadmio con respecto a la captura alcanzada en las soluciones
monometlicas por los microorganismos ensayados. El grado de afectacin en la remocin de
los iones vari en dependencia de los microorganismos. Para Pseudomonas mendocina (Ps-1)
las afectaciones en la remocin de los iones cinc, en presencia de cadmio en solucin, fue
superior (70%). Reducciones similares se detectaron en la captura de cadmio frente a los iones
cinc por Saccharomyces cerevisiae (10).

Tabla 8- Remocin de cinc y cadmio de solucin bimetlica.

Solucin del Pseudomonas mendocina (Ps-1) Saccharomyces cerevisiae (10)

metal
q (mg.g-1) q (mg.g-1)

Zn2+ Cd2+ Zn2+ Cd2+

Bimetlica 7,4 1,9b 15,4 2,3b 11,4 2,1b 9,8 . 1,5b

Monometlica 24,7 1,7a 23,4 0, 38a 26,8 0,7a 34,3 1,3a

Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a

100 r.min-1, 24 h. (q)- metal capturado por la biomasa () representan desviacin estndar de tres repeticiones en
cada caso. Se aplic la prueba t de Student para comparar en cada microorganismo el valor de (q) de cada metal
de las soluciones mono y bimetlicas. Letras diferentes en la tabla indican diferencias significativas para
p<0.001

53
III.3. Remocin de cinc y cadmio por biomasas tratadas por mtodos fsicos y qumicos

Una de las estrategias empleadas para lograr incrementos en la capacidad de captura de los
iones cinc y cadmio por los microorganismos consisti en aplicar diferentes tratamientos
fsicos y qumicos a las biomasas microbianas, resultados que se muestran en la Figura 12.

(I)
bacteria A6 Pseudomonas mendocina (Ps-1) Saccharomyces cerevisiae (10)
35 a 50

(mg.g )
a 40
(mg.g )

(mg.g )

-1
-1

-1
30
40 a b a
25 b
b

30 b
20 b b b 30 b
c c
b b

2+
2+
2+

20
b

q Zn
c c c

q Zn
q Zn

15 b b
20
d
b b b

10 10
10 b b
b

5 b

0 0 0
A B C D E A B C D E A B C D E

Tratamientos Tratamientos Tratamientos

(II)

bacteria CBM4 a 60 Pseudomonas mendocina (Ps-1) Anabaena sp. PCC 7120

40
(mg.g )
-1

a a

(mg.g )
50 b

-1
30
(mg.g )
-1

30 b 40
b c 20 b
2+

20 30 c
2+
q Cd

b b
2+

q Cd
20
q Cd

10 c d d 10 c
10
0 0 0
A B C D E A B C D E A B C D E
Tratamientos Tratamientos Tratamientos
microalga CMM6 Chaetoceros ceratosphorus (1P) Saccharomyces cerevisiae (10)
a 30 60
a a
(mg.g )
-1

40
a
(mg.g )

25
(mg.g )

50
-1

-1

30 b 20 40
b b b
b,c c
2+

20 15 b 30
c
q Cd

2+

2+

b
d
q Cd

20
q Cd

10
10 e
5 c 10 b

0 0 0
A B C D E A B C D E A B C D E
Tratamientos Tratamientos Tratamientos

Tratamientos
A-Esterilizacin B-Entrecruzamiento C-Alcalino D-Secado E-Clulas no tratadas (control)
Figura 12-Remocin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin acuosa por biomasas microbianas
sometidas a diferentes tratamientos.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH 6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa 2 g.L-1 (biomasa hmeda-
tratamientos A, B, C y controles, biomasa seca -tratamiento D) agitacin a 100 r.min-1, 24 h. Barras de error
representan desviacin estndar de tres repeticiones por tratamiento. Se aplic ANOVA de clasificacin simple
para cada microorganismo analizado. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias significativas entre
los valores de (q) de los diferentes tratamientos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a posteriori
54
Estos tratamientos produjeron la muerte celular que se corrobor por la ausencia del
crecimiento microbiano al inocular las biomasas tratadas, en los medios de cultivo
correspondientes a estas. Cada tratamiento ejerci un efecto diferente sobre la captura de los
iones cinc (Figura 12-I) y cadmio (Figura 12- II) que dependi del microorganismo empleado.
Las diferencias significativas en la cantidad de metal enlazado a cada biomasa tratada se
comprobaron mediante un ANOVA de clasificacin simple y procedimiento Tukey a
posteriori.

Los resultados obtenidos en la remocin de cadmio por Pseudomonas mendocina (Ps-1),

Chaetoceros ceratosphorus (1P) y la bacteria aislada CBM4 indicaron que estas biomasas
tratadas por esterilizacin, capturaron mayor concentracin del metal con respecto a los
controles. Resultado similares se detectaron por los aislados bacterianos A6 y CBM4
sometidas al tratamiento alcalino en la captura de cinc y cadmio, respectivamente. El
tratamiento por secado proporcion los mayores incrementos en el secuestro de los iones cinc y
cadmio para todos los microorganismos tratados. Este notorio efecto producido por el calor
seco, con respecto al control se confirm por los anlisis estadsticos. Para el resto de las
variantes de biomasas tratadas por esterilizacin, entrecruzamiento e hidrxido de sodio, los
valores de los metales capturados fueron similares o inferiores a los controles (biomasa no
tratada), resultados que se pueden observar en las Figuras 12 (I) y (II).

El incremento de la biosorcin de los iones cinc y cadmio en dos veces ms, por las biomasas
celulares de los aislados A6, CBM4 y CMM6, as como por Pseudomonas mendocina (Ps-1) y
Saccharomyces cerevisiae (10) tratadas por secado con respecto a las clulas no tratadas,
revelaron que las biomasas muertas mediante este tratamiento pueden ser potencialmente tiles
para disminuir estos metales de soluciones acuosas a escala de laboratorio.

Teniendo en cuenta que en las biomasas inactivadas el 100% de los metales capturado es por
un mecanismo de biosorcin, los porcentajes de cinc y cadmio capturado extracelularmente
(qad= metal adsorbido) por las biomasas no tratadas indicaron que los porcentajes de ambos
metales enlazado a la superficie celular de las clulas vivas fue inferior al alcanzado por las
clulas inactivadas mediante el tratamiento por secado (Tabla 9).

55
Tabla 9-Porcentajes de los metales capturados en la superficie celular por las biomasas
microbianas no tratadas.
Porcentaje de Zn2+ (%)
Pseudomonas mendocina (Ps-1) Bacteria A 6 Saccharomyces cerevisiae (10)

57,8 0,94 31,65 4,98 46,8 0,44

Porcentaje de Cd2+ (%)
Pseudomonas Anabaena sp. Bacteria Chaetoceros Microalga Saccharomyces
mendocina PCC 7120 CBM4 ceratosphorus CMM6 cerevisiae
(Ps-1) (1P) (10)

33,5 4,4 9,4 2,9 17,42,6 14,6 3,01 34,0 1,6 12,1 2,2

() representan desviacin estndar de tres repeticiones en cada microorganismo.

De los resultados mostrados en la Tabla 9 es vlido destacar que el tratamiento por calor seco
increment la captura extracelular de cinc entre 1,7 y 4,4 veces ms con respecto a las clulas
vivas. Los incrementos de cadmio secuestrado a la superficie celular por las clulas muertas se
encontraron en el orden entre 3 y 8,3 veces ms en relacin a las clulas no tratadas.

III.4. Efecto de modificaciones genticas a Anabaena sp. PCC 7120 en la remocin de

cinc y cadmio

La transformacin gentica, constituy otra alternativa para evaluar si modificaciones en la

superficie celular favorecen la remocin de cinc y cadmio. En la seleccin de Anabaena sp.
PCC 7120 para estas investigaciones se tuvo en cuenta que bacterias fototrofas constituyen
blancos para la expresin de genes que codifican protenas que unen metales (Koebnik et al.,
2000; Hildegard et al., 2001; Valls y De Lorenzo, 2002). En adicin, a este criterio de
seleccin se valor que el gen de la protena heterloga a insertar, procede de otra
cianobacteria, lo cual pudiera resultar ms compatible para el proceso de transformacin. Los
resultados de la expresin de una metalotionena (MT) protena heterloga que une metales en
la superficie celular de Anabaena sp. PCC 7120 se muestran a continuacin.

III.4.1. Construccin de vectores y transformacin en Escherichia coli DH10B

A partir del aislamiento del ADN genmico de Anabaena sp. PCC 7120 y de Synecchococcus
sp. PCC 7942 se obtuvieron los fragmentos correspondientes a los genes alr0834 y smtA,

56
respectivamente. La amplificacin de estos fragmentos por la reaccin en cadena de la
polimerasa se comprob mediante la corrida electrofortica (Figura 13).

(a) (b)
1 2 1 2
Anabaena sp.
PCC 7120 Synechoccocus sp.
PCC 7942

smtA
1 500 pb
170 pb
alr0834
1 540 pb

200 pb

100 pb

Figura 13-Perfil electrofortico de los fragmentos alr0834 y smtA amplificados por la

Reaccin en Cadena de la Polimerasa.
Figura13-a: lnea 2-fragmento de genes, alr0834, amplificado de la protena de membrana externa de Anabaena
sp. PCC 7120 (cebadores 291+292). Figura13-b: lnea 2-fragmento de smtA de Synechococcus sp. PCC 7942
(cebadores 289+313). Lnea 1, en las dos corridas electrofortica, patrn de ADN (3 000 pb- 100 pb).

Se observa en la Figura 13 (a) una banda que migr de forma aproximadamente similar al
marcador molecular de 1500 pb, correspondiente al gen alr0834. Este gen codifica para una
protena de membrana externa (porina) que permite expresar protenas fusionadas. En la Figura
13 (b) se visualiza la corrida de una banda, ligeramente por debajo del marcador de 200 pb,
que se correspondi con la talla del fragmento smtA. Este gen codifica para la metalotionena,
protena con afinidad por metales pesados.

Los fragmentos insertados en los vectores, alr0834 en plsmido pGEM-T y smtA en el

plsmido pDrive se clonaron en la cepa Escherichia coli DH10B. Del resultado de cada
transformacin se seleccionaron 12 clones, que mostraron resistencia a ampicillina, para

57
comprobar estas transformaciones. El anlisis de restriccin del ADN plasmdico en cada clon
posibilit seleccionar dos clones positivos a las transformaciones (Figura 14).

alr0834 1 2 3

SphI PstI
smtA

NheI NheI

PIM-110
1 540 pb 1 500 pb

170 pb
PIM- 112

200 pb
100 pb

Figura 14-Electroforesis de los productos de la digestin de los clones seleccionados de las

transformaciones con los vectores recombinados pGEM-T y pDrive.
Lnea 1-PIM 110 (SphI y PstI) lnea 2- PIM 112 (NheI) y lnea 3- patrn de ADN (3000 pb-100 pb).

Posteriormente, se construy el vector integrador pGEM-T+ [porina-smtA-porina] clonado en

las clulas competentes de Escherichia coli DH10B. La corrida electrofortica del ADN de los
productos de la digestin con SphI y PstI y amplificados con los cebadores 291+315 de cada
clon seleccionado se muestra en la Figura 15. Estos resultados permitieron deducir que la
banda observada en el clon 2 corresponde al fragmento porina-smtA-porina (1 700 pb), talla
ligeramente inferior al marcador molecular del patrn correspondiente a 1 882 pb, por tanto se
seleccion este clon y se denomin PIM 114.

El fragmento porina-smtA-porina se aisl a partir del ADN plasmdico del PIM 114, por
digestin con la enzima de restriccin EagI y extraccin a partir de la banda correspondiente al
fragmento del gel de agarosa. Con este fragmento se recombin el plsmido movilizable,
vector pRL277, previamente digerido con la misma enzima. Este plsmido clonado en
Escherichia coli DH10B, por electroporacin proporcion el crecimiento de tres clones en el
58
medio de cultivo LB, suplementado con estreptomicina (2,5 g.mL-1) y espectomicina (2,5
g.mL-1). La comprobacin del xito de esta transformacin se muestra en la Figura 16.

1 2 3
NheI

smtA

PIM-110
1 882 pb

1 700 pb

porina-smtA-porina
PIM-114

Figura 15-Electroforesis de los productos de la digestin (SphI y PstI) y amplificacin por la

RCP con los cebadores 291+315 de los clones transformados con el plsmido integrador
pGEM-T.

Lnea 1- patrn de ADN (26282 pb-421 pb), lnea 2- clon 1, lnea 3- clon 2

La digestin con la enzima EagI del ADN aislado de cada clon y la amplificacin con los
cebadores 291+315, permiti detectar los valores correspondientes a los pesos moleculares de
las bandas de inters (Figura 16). Estos resultados se justificaron por la aparicin de una banda
que coincide con la masa molecular informada para el plsmido pRL277 de 6 798 pb,
detectada aproximadamente entre las bandas de 7 743 y 6 223 pb del patrn de ADN (26 282
pb-421 pb). La otra banda se correspondi con el fragmento porina-smtA-porina de un tamao
molecular aproximado de 1 700 pb en comparacin a la banda de 1 882 pb del patrn de ADN
(26 282 pb-421 pb). Las bandas detectadas en los tres clones analizados ratificaron la
construccin del vector movilizable pRL277+ [porina-smtA-porina].

59
 1 2 3 4

EagI
EagI

7 743 pb 6 798 pb
6 223 pb PIM-114
Vector pRL277

1 882 pb

1 700 pb

Porina-smtA-porina
PIM-141

Figura 16-Perfil electrofortico de los productos de la digestin con la enzima EagI y

amplificados con los cebadores 291+315 del ADN de los clones obtenidos en la
transformacin con el vector pRL277 clonado con el fragmento porina-smtA- porina.

Lnea 1- patrn de ADN (26 282 pb-421 pb), lnea 2- clon 1, lnea 3- clon 2 y lnea 4- clon 3.

Para verificar la orientacin de la insercin del gen smtA en el plsmido pRL277, vector de
transformacin de los clones obtenidos anteriormente, el ADN plasmdico y los productos de la
digestin con la enzima EagI para cada clon, se amplificaron por la RCP (Figura 17). El
anlisis de la corrida electrofortica muestra una banda entre los marcadores de peso molecular
de 2 000 a 1 500 pb, en las muestras amplificadas con los cebadores 291+315, lo cual indic la
presencia del fragmento 5'porina-smtA-porina3' (1 700 pb). Por otro lado, la amplificacin del
ADN plasmdico y de los productos de la digestin con los cebadores 291+313, constat la
adecuada orientacin del gen que codifica para la metalotionena al detectar una banda al nivel
de los 900 pb que se corresponde con el tamao molecular del fragmento 5'porina-smtA3' (860
pb). A partir de estos resultados se seleccion el clon 1 para la conjugacin y transformacin
de Anabaena sp. PCC 7120 y se nombr PIM 141.

60
 1 2 3 5 6 7 8 9 10 11 12 13

2 000 pb
1 700 pb

1 500 pb
860 pb
900 pb

Figura 17-Anlisis de la corrida electrofortica de los productos de la digestin y amplificacin

de los clones obtenidos por transformacin con el vector integrador.

Lnea 1- patrn de ADN (3000 pb-100 pb), lneas 2, 3, 4 clones 1, 2 y 3 amplificados con los cebadores
291+313, lneas 5, 6 y 7 producto de la digestin de los clones con la enzima EagI y amplificados con los
cebadores 291+313, lneas 8, 9 y 10 clones 1, 2 y 3 amplificados con los cebadores 291+ 315 y lneas 11, 12 y
13 producto de la digestin de los clones con la enzima EagI y amplificados con los cebadores 291+315.

III.4.2. Conjugacin en Anabaena sp. PCC 7120

El anlisis del intercambio e insercin de la protena fusionada (porina-smtA) dentro del

genoma de Anabaena sp. PCC 7120, permiti corroborar los resultados positivos de la
conjugacin triparental. Los fragmentos 5'porina-smtA3, pRL277-5'porina-smtA3' y 5'porina-
smtA-porina3', aislados de cada clon, amplificados por RCP y visualizados por electroforesis
en gel de agarosa, se indican en la Figura 18. En la Figura 18 (a) se observa el inserto del gen
de la metalotionena al obtener una banda que se corresponde a este gen (866 pb) entre los
marcadores de 900 y 800 pb. Este resultado se confirm por la banda que present un
incremento en la talla (~1 100 pb), fragmento que incluye una porcin del plsmido pRL277-
porina-smtA (Figura 18 b) al utilizar los cebadores 324+313. No se detect banda con la cepa
salvaje Anabaena sp. PCC 7120 (control). En las dos colonias analizadas en esta
transformacin se comprob la presencia del fragmento porina-smtA-porina de 1 700 pb al
comparar la ubicacin de la banda correspondiente a dicho fragmento, amplificada con los
oligonucletidos 291+315, con el marcador de 1 500 pb (Figura 18-c). De esta forma se
confirm la presencia en estos dos clones del gen de la metalotionena fusionada en la protena

61
de membrana externa (alr0834) de Anabaena sp. PCC 7120 y fueron identificados como PIM
141-6A y PIM 141-7.

(a) (b) (c)

1 2 3 2 33 4
1 21 1 2 3

1 100 pb
2 000 pb

900 pb 1 031 pb
866 pb 1 700 pb
800 pb 1 500 pb

Figura 18-Comprobacin de la insercin de la protena fusionada (porina-smtA-porina) en los

clones de Anabaena sp. PCC 7120 por la RCP.
(a): amplificacin del fragmento [5' porina+smtA 3] con los cebadores 291+313, lnea 1-PIM 141-6A, lnea 2-
PIM 141-7, lnea 3-patrn molecular. (b)- amplificacin del fragmento [pRL277+ 5' porina-smtA 3] con los
cebadores 324+ 313, lnea1-Anabaena sp. PCC 7120 no transformada, lnea 2-PIM 141-6A, lnea 3-PIM 141-7,
lnea 4- patrn molecular. (c)- amplificacin del fragmento [5' porina-smtA-porina3] con los cebadores
291+315, lnea 1-patrn molecular, lnea 2-PIM 141-6A, lnea 3-PIM 141-7. Patrn molecular -ADN (3000 pb-
100 pb).

III.4.3. Evaluacin de la determinacin de la remocin de cinc y cadmio por los clones de

Anabaena sp. PCC 712

Los resultados de la remocin de los iones cinc y cadmio por las cepas transformadas de
Anabaena sp. PCC 7120 (Figura 19-I) reflejan que la capacidad de remocin de los iones cinc
de las cepas transformadas no difiere estadsticamente en relacin a la cepa salvaje. Un
comportamiento diferente se observa en la captura de cadmio. Para este metal los clones PIM
141-6A y PIM 141-7 mostraron incrementos en la remocin con respecto a la cepa salvaje
(Figura 19-II). Estos resultados confirmados estadsticamente, revelaron que el clon PIM 141-7
duplic la captura de cadmio con respecto a la cepa salvaje. A partir de estos resultados se
seleccion el clon PIM 141-7 para continuar la investigacin con el metal cadmio.
62
Se observa en la Figura 19 (III) que los valores de cadmio capturado por la cepa que contena
el plsmido pRL 277 sin los insertos correspondientes al fragmento de genes de la porina
alr0834 y smtA (control b) no mostr diferencias significativas con la cantidad de metal
capturado por la cepa salvaje (control a).

14 a (I) 40 (II) a
12
(mg.g )

(mg.g )
-1

-1
10
a a 30
b
8 c
6 20
2+

2+
4
q Zn

q Cd
10
2
0 0
Control PIM 141- 6A PIM 141-7 Control PIM 141- 6A PIM 141-7
(a)
Cepas (a)
Cepas

20 a (III) a
(mg.g )
-1

15

10
2+
q Cd

0
Control (a) Control (b)
Cepas

Figura 19-Remocin de los metales Zn2+ (I), Cd2+ (II) y (III) de solucin acuosa por los clones
de Anabaena sp. PCC 7120 y los controles.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH-6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 h. control(a)- cepa salvaje de Anabaena sp. PCC 7120, control (b)- cepa salvaje de Anabaena sp.
PCC 7120 con el plsmido pRL 277 sin inserto. Barras de error representan desviacin estndar de tres
repeticiones por microorganismos .Figura 19 (I) y Figura 19 (II) se aplic ANOVA de clasificacin simple para
los microorganismos analizados. Letras diferentes sobre las barras indican diferencias significativas entre los
valores de (q) de los microorganismos para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a posteriori. Figura 19
(III)- se aplic la prueba t de Student para comparar el valor de (q) del control (a) y control (b). Letras diferentes
indican diferencias significativas para p<0.001.

Al aplicar EDTA a la biomasa de la cepa transgnica PIM 141-7, despus de la remocin de

los iones cadmio se detect que del total del metal capturado el 56,3 % fue adsorbido a la
superficie celular. Este porcentaje del metal enlazado extracelularmente difiere con
significacin estadstica del obtenido con la cepa salvaje (Figura 20).

Teniendo en cuanta los resultados de la remocin de cadmio por el clon PIM 141-7 se procedi
a evaluar el efecto de diferentes factores y tratamientos a la biomasa sobre la capacidad de
63
capturar los iones cadmio (Figura 21).

70
a

adsorbido (%)
60
50
40
30 b
2+ 20
Cd
10
0
clon PIM 141-7 Anabaena sp. PCC 7120

Figura 20- Porcentaje de adsorcin de cadmio (%) por el clon de Anabaena sp. PCC 7120
PIM141-7 y la cepa salvaje.
Condiciones experimentales: 28 2 C, pH-6.0, metal en solucin-1mM.L-1, biomasa hmeda 2 g.L-1, agitacin a
100 r.min-1, 24 horas. Barras de error representan desviacin estndar de tres repeticiones por cepa microbiana.
Se aplic la prueba t de Student para comparar el porcentaje de metal adsorbido de la cepa transformada y no
transformada genticamente. Letras diferentes indican diferencias significativas para p<0.001.

La captura del metal en diferentes edades fisiolgica (Figura 21-I) indic que a los siete das
de crecimiento celular, tiempo de cultivo que se correspondi con el final de la fase
exponencial, los niveles de captura del metal resultaron estadsticamente significativos a los
obtenidos en los restantes estadios analizados. El incremento de la concentracin de la biomasa
afect negativamente la remocin de cadmio, resultados que se constataron estadsticamente
(Figura 21-II).

A pH 6.0 se obtuvieron los mayores valores de captura de los iones cadmio con diferencias
significativas a los obtenidos a pH 5.0 y pH 7.0 (Figura 21-III). En la captura de cadmio a
partir de diferentes concentraciones iniciales de este metal (Figura 21-IV) se detect que la
cepa transgnica alcanz la mayor captura a partir de la concentracin inicial del metal en
solucin de la 200 mg.L-1, resultado corroborado por los anlisis estadsticos mostrados en la
figura.

La determinacin del efecto de los tratamientos fsicos y qumicos a la biomasa del clon PIM
141-7, sobre la captura del metal (Figura 21-V) mostr que con excepcin del tratamiento por
secado, que no mostr diferencias con el control, el resto de los tratamientos afectaron
significativamente la captura de los iones cadmio.
64
 35 (I)a (I) 2 .5 (II)
35 3 4400

)
) )
a

-1
30

-1 -1
a

(mg.g ))
b 2 2 .5

-1
total (mg.L
30

Clorofila total

-1
(mg.g
25
b 3300 b

Cd (mg.g
)
25

-1
1 .5 c
q Cd(mg.g
20 2

Clorofila(mg.L
2
10 20
2+ 2+ 5 1 1 .5

2+
20

2+
1
150 c

qqCd
c 1 10
q Cd
105 0 .5
10
5
0 0 0 .5 0
0 0 2 3 4 7 8 9 10 12 0 0 2 3 4
0 2 Tie
3m4
p o (d
7 a 8
s) 9 10 p H -5 .0 p H -6 .0
p H-1-7-1
.0
Concentracin celular (mg.L
(g.L ) )
Tie m p o (d a-1
s) 2+ -1
Clorofila total (mg.L ) q Cd (mg.g )

(III) 50 (IV)
(IV) a a
40

(mg.g ) )
50

-1
b a
(mg.g )

-1
-1

40 c b

Cd (mg.g
30 40 c
b 30 d
30
20 d

2+ 2+
20 c
2+

20 f e

qq Cd
q Cd

10 f
10 10
0
0
0 0 50 100 150 200 250
0 50 1 02+
0 1 5 0-1 2 0 0 250
pH-5.0 pH-6.0 pH-7.0 Ci Cd2 + (mg.L -1)
Ci Cd (m g .L )

50
(V) a
40
(mg.g )

a
-1

30 b
b
2+

20
q Cd

c
10

0
A B C D E
Tra tam ien tos

A- Esterilizacin B- Entrecruzamiento C- Alcalino

D- Secado E- Biomasa no tratada

Figura 21- Efecto de diferentes factores y de los tratamientos fsicos y qumicos a la biomasa
del clon PIM 141-7 sobre la captura de los iones cadmio.

(I)-Edad fisiolgica del cultivo, (II)-Concentracin celular, (III)-pH, (IV)-Concentracin inicial del metal, (V)-
tratamientos fsicos y qumicos. 28 2 C, agitacin a 100 r.min-1, 24h. Barras de error representan desviacin
estndar de tres repeticiones en cada caso. Se aplic ANOVA de clasificacin simple para cada factor analizado
y para los tratamientos. Letras diferentes indican diferencias significativas entre los valores de (q) de los
diferentes parmetros de cada factor analizado y de los diferentes tratamientos para p<0.05, segn la prueba
estadstica Tukey a posteriori.

En la Tabla 10 se compararon los mayores valores de captura de cadmio entre el clon PIM
141-7 (Figura 21) y la cepa salvaje (Figuras 9, 10-I, 11-I, 12-I y Tabla 7). En todos los casos la

65
remocin de cadmio por la cepa transgnica result superior a la cepa no transformada,
resultados confirmados mediante la prueba estadstica t-Student.

Tabla 10- Anlisis comparativo de los mayores valores de cadmio capturado entre el clon PIM
141-7 y la cepa salvaje (control)
2+ -1
q Cd (mg.g )
Cepas
Edad Concentracin pH Concentracin Tratamiento a la
fisiolgica del celular inicial del metal biomasa
cultivo
a a a a a
Clon 29,4 1,3 32,6 1,7 32,6 1,7 42,29 1,87 41,12 0,59
PIM141-7
b b b b b
control 24,86 1,9 16,1 1,19 29,4 2,06 22,97 3,21 26,5 3,46

Control: cepa salvaje. () representan desviacin estndar de tres repeticiones por cada factor y tratamiento. Se
aplic la prueba t de Student para comparar en cada factor y tratamiento el valor de metal capturado (q) de la
cepa transformada (PIM 141-7) y cepa salvaje (control). Letras diferentes en la tabla indican diferencias
significativas para p<0.001.

III.5. Determinacin de la cintica de biosorcin de cinc y cadmio

La caracterizacin de los diferentes factores asociados a la remocin de cinc y cadmio, de los

tratamientos fsicos y qumicos a los microorganismos, as como de la modificacin gentica a
Anabaena sp. PCC 7120 permiti establecer las condiciones experimentales ms favorables
para el proceso, en cada microorganismo (Tabla 11). Estas condiciones se seleccionaron para
continuar los siguientes experimentos y muestra que las mayores variaciones de los factores,
con respecto a los controles, estn dadas en la edad fisiolgica del cultivo, la concentracin
inicial del metal en la solucin acuosa y el pH. De los tratamientos a las biomasas, el secado
predomin para todos los microorganismos.

Los valores de remocin de cinc y cadmio por las biomasas microbianas, en funcin del
tiempo, se exponen en la Figura 22 (I) y Figura 22 (II), respectivamente. Las curvas
representadas en los grficos muestran una regin lineal aproximadamente hasta los primeros
40 minutos de contacto de la suspensin biomasa-metal. La relacin que se estableci entre la
captura del metal y el tiempo (Figura 22-I y 22-II) indic la rapidez con que ocurri la
biosorcin de los metales a la superficie celular. En los grficos se observa que posterior a los
40 minutos, disminuy la velocidad de adsorcin por los microorganismos. Esta lleg a ser
casi constante hasta el tiempo final de contacto (1 440 minutos). A partir de estos resultados se
66
Tabla 11-Variables experimentales que proporcionaron los mayores niveles de captura de los
metales.
Edad Concentracin
Fisiolgica
pH Tratamiento
Microorganismos (fases de Celular metal
crecimiento)
-1
Cinc (mg.g )
ra -1 -1
Control 3 2 g.L 65.4 mg.L 6.0 No aplicado
da -1 -1
Aislado bacteriano A6 2 2 g.L 100 mg.L 7.0 Secado
ra -1 -1
Pseudomonas mendocina (Ps-1) 1 2 g.L 100 mg.L 6.0 Secado
ra -1 -1
Saccharomyces cerevisiae (10) 3 3 g.L 100 mg.L 6.0 Secado
-1
Cadmio (mg.g )
ra -1 -1
Control 3 2 g.L 112.4 mg.L 6.0 No aplicado
ra -1 -1
Aislado bacteriano CBM4 3 2 g.L 150 mg.L 6.0 Secado
ra -1 -1
Pseudomonas mendocina (Ps-1) 1 2 g.L 200 mg.L 6.0 Secado
ra -1 -1
Anabaena sp. PCC 7120 3 2 g.L 150 mg.L 7.0 Secado
da -1 -1
clon PIM 141-7 2 2 g.L 200 mg.L 6.0 Secado
ra -1 -1
aislado de microalga CMM6 3 2 g.L 150 mg.L 7.0 Secado
da -1 -1
Chaetoceros ceratosphorus (1P) 2 2 g.L 150 mg.L 5.0 Secado
a -1 -1
Saccharomyces cerevisiae (10) 3r 2 g.L 150 mg.L 7.0 Secado
ra da ra
Fases de crecimiento: 1 exponencial temprana, 2 -exponencial avanzada, 3 estacionaria/inicio de
declinacin o muerte celular.

(I) 80
80 (II)
50 (II)
70
70
-1 )
(mg.g )
-1
(mg.g )
-1

60
Cd (mg.g

40 60
50
50
30
2+
2+
2+

40
40
qq Cd
q Zn

20 30
30
20
20
10 10
10
0 00
00

55

10

40

60

120

240

4800

9600

440
10

40

60

1 440
120

240
0
5
10
40
60
120
240
480
960
1440

48

Tiempo(minutos)
Tiempo (minutos)
Tiempo (minutos) Pseudomonas mendocina(Ps-1)
(Ps-1)
Pseudomonas mendocina
clon
clon PIM
PIM 141-7
141-7
Saccharomyces cerevisiae(10)
Saccharomyces cerevisiae (10)
Pseudomonas mendocina (Ps-1) microalga CMM6
microalga CMM6
bacteria CBM4
bacteria CBM4
Saccharomyces cerevisiae (10) Chaetoceros ceratosphorus(1P)(1P)
bacteria A6 Chaetoceros ceratosphorus
Anabaena sp.PCC
Anabaena sp. PCC7120
7120

Figura 22-Cintica de biosorcin de Zn2+ (I) y Cd2+ (II) de solucin por biomasas microbianas
inactivadas.
Condiciones experimentales: referidas en la Tabla 11. 28 2 C, agitacin a 100 r.min-1, 24 h. Barras de error
representan desviacin estndar de tres repeticiones por tiempo para cada microorganismo
estableci un tiempo de 600 minutos para llevar a cabo los siguientes experimentos de captura
de los metales por los microorganismos.

III.6. Evaluacin del efecto de la combinacin de los factores, tratamientos y

modificaciones a las biomasas sobre la eficiencia del proceso de biosorcin de cinc y
cadmio

Los resultados de la combinacin de los parmetros caracterizados en la captura de los metales,

expresados en porcentaje de eficiencia se muestran en la Tabla 12. Las condiciones
experimentales seleccionadas para cada microorganismo (Tabla 11) con un tiempo de contacto
biomasametal de 10 horas (Figura 22) incrementaron significativamente la eficiencia de la
biosorcin de los iones por los microorganismos en relacin a los respectivos controles.
Excepciones en estos resultados se constataron por el aislado bacteriano A6 en la captura de
cinc y de cadmio por el aislado bacteriano CBM4 y la microalga Chaetoceros ceratosphorus
(1P) (Tabla 12).

Tabla 12-Eficiencia de la biosorcin de Zn2+ y Cd2+ por biomasas microbianas.

E (%) Microorganismos
Aislado bacteriano Pseudomonas Saccharomyces cerevisiae
A6 mendocina (Ps-1) (10)
2+ a a a
Zn 55,0 4,2 97,9 1,5 98,4 1,7
Control a b b
49,1 3,4 69,4 4,8 83,5 0,04
Aislado Ps Anabaena clon Aislado de Chaetoceros S.
bacteriano mendocina sp. PIM microalga ceratosphorus cerevisiae
CBM4 (Ps-1) PCC7120 141-7 CMM6 (1P) (10)
a a a a a a a
2+ 39,3 0,2 76,2 3,1 44,8 2,4 68,8 1,6 72,4 2,5 30,2 3,5 79,13 1,9
Cd
a b b b b a b
Control 35,0 2,2 40,6 0.4 28,5 2,1 53,4 2,4 38,4 4,1 29,5 0,9 61,6 3,1

Condiciones experimentales: referidas en la Tabla 11. 28 2 C, agitacin a 100 r.min-1, 10 h. (control -24h)
E (%)- porcentaje de eficiencia.. () representan desviacin estndar de tres repeticiones en cada caso. Se aplic
la prueba t de Student para comparar en cada microorganismo el porcentaje de eficiencia alcanzados por estos y
los respectivos controles. Letras diferentes en la tabla indican diferencias significativas entre las dos medias
comparadas para p<0.001.

Los datos hallados para el cinc revelaron porcentajes de eficiencia en la biosorcin de este
metal por Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10) superior al 97%.
Los mayores incrementos en la eficiencia de captura de cadmio correspondieron a: clon PIM
141-7, microalga CMM6, Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10),

67
con porcentajes de eficiencias entre el 68 y 79% (Tabla 12). El ajuste de las condiciones
experimentales para la cepa transformada permiti incrementar el porcentaje de eficiencia en
2,4 veces ms con respecto a la cepa salvaje. Estos microorganismos se seleccionaron para
continuar la presente investigacin. La seleccin estuvo apoyada en los resultados estadsticos,
como se observa en la Tabla 12 y en criterios informados en la literatura que refieren
biosorbentes muy eficientes cuando estos alcanzan porcentajes de eficiencias en la captura de
los metales superiores al 60% (Pethkar et al., 2001).

III.7. Descripcin e interpretacin del equilibrio de biosorcin de cinc y cadmio

En la Figura 23 se muestran las isotermas de biosorcin del cinc (Figura 23-I) y del cadmio
(Figura 23-II), por los microorganismos seleccionados segn los porcentajes de eficiencia
alcanzados en la remocin de los metales.

60 70
(I) (II)
50 60
(mg.g )
(mg.g )

-1
-1

40 50

40
30
2+

2+
q Zn

30
q Cd

20
20
10
10
0
0
0 10 20 30 50 70 90
0 25 50 80 1 10 14 0 19 0
2+ -1 2+ -1
Zn (C e q m g.L ) Cd (C eq m g .L )

Pseu do m o na s m en do cina (Ps-1 )

Pseu do m o na s m e nd ocin a (Ps-1) clon PIM 1 41 -7
Sa cch a ro m yces ce revisia e (10 )
Sa ccha ro m yce s cere visiae (1 0) m icroa lga C MM6

Figura 23-Isotermas de biosorcin de Zn2+ (I) y de Cd2+ (II) por biomasas microbianas.
Condiciones experimentales comunes: 28 2 C, pH 6, agitacin a 100 r.min-1,10 h. Especificaciones de la edad
fisiolgica y concentracin celular para cada microorganismo se indican en la Tabla 11. Barras de error
representan desviacin estndar de tres repeticiones por concentracin del metal en equilibrio para cada
microorganismo.

En cada uno de estos grficos (Figura 23) se observ una isoterma de biosorcin, con un
incremento en el patrn de captura de los iones cinc y cadmio al aumentar la concentracin del
metal en equilibrio (Ceq). Posteriormente, no ocurrieron incrementos en el secuestro de los
metales, lo cual proporcion la aparicin de una fase de meseta en las curvas que se analizan.
68
A los resultados de las isotermas de biosorcin, Figura 23 (I y II) se les aplicaron los modelos
de isotermas de equilibrio de Langmuir y Freundlich. El ajuste de estos datos, derivados de la
ecuacin matemtica linealizada de ambos modelos se representa en la Figura 24.

0.16 2 (II)
(I) y = 0,7169x -0,0245
y = 3.3159x + 0.0034 R 2 = 0,9554
R 2 = 0.9533 1.6 y = 0.7675x - 0.0015
mg.g )
-1

(mg.g )
0.12

-1
y = 2.6166x + 0.0008 R 2 = 0.9727

R 2 = 0.9639
1.2 y = 0.76x + 0.0498
2+

0.08 y = 1.7947x + 0.0056 R 2 = 0.9621

2+
1/q (Cd

R 2 = 0.9258 y = 0.809x + 0.0532

log q Cd
0.8
y = 1,4191x + 0,0046 R 2 = 0.9736
0.04 R 2 = 0,9484
0.4

0 0
0 0.01 0.02 0.03 0.04 0 0.5 1 1.5 2 2.5
1/Cf (Cd
2+
mg.L )
-1 2+ -1
log Cf Cd (mg.L )
Dartos experimentales (Pseudomonas mendocina Ps-1) Datos experimentales (Pseudomonas mendocina Ps-1)
Datos experimentales (PIM 141-7) Datos experimentales (PIM 141-7)
Datos experimentales (Saccharomyces cerevisiae-10) Datos experimentales (Saccharomyces cerevisiae -10)
Datos experimentales (Aislado de microalga CMM6) Datos experimentales (Aislado de microalga CMM6)

0.25 (III) 2 (IV)

y = 0.9249x + 0.0062 y = 0.8761x + 0.0619
R 2 = 0.9762 R 2 = 0.97
(mg.g )

0.2 1.6
-1
(mg.g )
-1

y = 0.8689x - 0.0082
0.15 1.2 R 2 = 0.9382
2+
2+

log q Zn

y = 2.1002x - 0.0108
1/q Zn

0.1 0.8
R 2 = 0.926

0.05 0.4

0 0
0 0.05 0.1 0.15 0 0.5 1 1.5 2 2.5
2+ -1
1/C f C d (m g.L ) 2+ -1
log Cf (Zn m g.L )

Datos ex perimentales (Ps eudomonas mendoc ina Ps -1) Datos experimentales (Pseudomonas mendocina Ps-1)
Datos ex perimentales (Sac c haromyc es c erevis iae-10) Datos experimentales (Saccharomyces cerevisiae-10)

Figura 24- Aplicacin de modelos de biosorcin a los datos experimentales, (I) Cd2+ y (III)
Zn2+ Modelo de Langmuir, (II) Cd2+ y (IV) Zn2+ Modelo de Freundlich.

En los grficos (Figura 24) se puede observar como los datos experimentales se ajustaron a una
lnea recta al representar los valores de 1/q contra 1/Cf, de acuerdo con la ecuacin lineal del
modelo de Langmuir, aplicado a los equilibrios de biosorcin del cinc y del cadmio para cada
una de las biomasas microbianas. Un comportamiento similar se observ con el modelo de

69
Freundlich, al plotear el log q contra el log Cf. Como se indica en la Figura 24, la
determinacin de los coeficientes de regresin (R2) de ambos modelos fue superior a 0,92.

Los parmetros determinados de las ecuaciones de Langmuir (qmx y b) y de Freundlich (Kf y

n) a partir del ajuste de los datos experimentales, de la isoterma de biosorcin de cada metal,
por los respectivos microorganismos, se muestran en la Tabla 13.

Tabla 13-Parmetros de las ecuaciones de Langmuir y Freundlich estimados del ajuste de los
puntos experimentales de la biosorcin de cinc y cadmio.

Microorganismos Cinc (mg.g-1)

Modelo de Langmuir Modelo de Freundlich
q mx = 181,81 Kf = 1,13
Pseudomonas mendocina (Ps-1) b = 0,006 n = 1,12
2
R = 0,9837 R2 = 0,9782
q mx = 85,47 Kf = 1,04
Saccharomyces cerevisiae (10) b = 0,0055 n = 1,13
2
R = 0,9299 R2 = 0,9481
-1
Cadmio (mg.g )
Microorganismos Modelo de Langmuir Modelo de Freundlich
q mx = 1250 Kf = 1,00
Pseudomonas mendocina (Ps-1) b = 3,05 n = 1,3
R2 = 0,9639 R2 = 0,974
q mx = 185,18 Kf = 1,01
Clon PIM 141-7 b = 0,003 n = 1,31
2
R = 0,9315 R2 = 0,9677
q mx = 344,82 Kf = 1,06
Aislado de microalga CMM6 b = 8,75 n = 1,4
2
R = 0,9575 R2 = 0,9572
q mx = 217,39 Kf = 1,13
Saccharomyces cerevisiae (10) b = 0,0032 n = 1,23
2
R = 0.9484 R2 = 0,9736
Leyeda: qmx: mxima captura del metal bajo las condiciones dadas (mg.g-1).
b: constante relacionada a la afinidad entre el sorbente/sorbato (L.mg-1).
Kf: constante emprica que brinda informacin de la capacidad de adsorcin del
biosorbente (L.g-1).
n: constante emprica que provee indicacin de la intensidad de adsorcin

En el proceso de biosorcin de cinc, los parmetros calculados mediante este modelo indicaron

70
que la bacteria Gram negativa Pseudomonas mendocina (Ps-1), posee mayor capacidad de
captura (qmax) y afinidad (b) por este metal, de acuerdo con los resultados mostrados en la
tabla. La ecuacin linealizada del modelo de bioadsorcin de Langmuir permiti estimar
valores de mxima captura (qmx) de iones cadmio, elevados para todos los microorganismos y
entre estos se destacaron Pseudomonas mendocina (Ps-1) y el aislado de microalga CMM6 con
potencialidades para la remocin de este metal en valores de hasta 1 250 y 344,82 mg.g-1,
respectivamente. En consecuencia con este resultado, a estos dos microorganismos le
correspondieron los mayores valores obtenidos de la constante (b), relacionada con la afinidad
entre el sorbente y el sorbato (Tabla 13).

Por otro lado, los valores de (Kf) y (n) obtenidos de la ecuacin lineal del modelo de isoterma
de Freundlich y referidos en la Tabla 13, indicaron que los microorganismos analizados
presentaron un comportamiento similar en cuanto a la separacin de los iones cinc y cadmio de
la solucin acuosa, dado por el parmetro (n), as como en la capacidad de adsorcin de la
biomasa, determinada por Kf.

En general, los resultados obtenidos con la aplicacin de los modelos de isoterma de Langmuir
y Freundlich, revelaron que ambos modelos se ajustan razonablemente bien a lo datos
experimentales y que los microorganismos analizados presentan un alto potencial de
biosorcin. Estos resultados avalaron los porcentajes de eficiencia superiores al 97% (Tabla
12) en la biosorcin de cinc por los monocultivos Pseudomonas mendocina (Ps-1) y
Saccharomyces cerevisiae (10) y permiten sugerir la posibilidad de incrementar la captura y
eficiencia de la biosorcin de iones cadmio por las biomasas ensayadas.

III.8. Biosorcin de cadmio por consorcios microbianos

Con la finalidad de incrementar la captura de los iones cadmio y la eficiencia del proceso con
respecto a las obtenidas por los monocultivos de Pseudomonas mendocina (Ps-1),
Saccharomyces cerevisiae (10), el aislado de microalga CMM6 y el clon PIM 141-7 (Tabla 12)
se disearon tres consorcios microbianos. Estos consorcios son los siguientes: MECIIMA/08
(conformado por los cuatro microorganismos); ISMEC/08 (Pseudomonas mendocina (Ps-1),
aislado CMM6) y el consorcio AMECA/08 (Pseudomonas mendocina (Ps-1), Saccharomyces
cerevisiae-10).

71
Las capacidades de biosorcin de iones cadmio por los consorcios microbianos (Tabla 14)
demuestran la eficacia de estos para obtener capacidades de captura de los iones cadmio que
superan los 124 mg.g-1. Valores que muestran el incremento en la biosorcin de este metal si
tenemos en cuenta los niveles de la captura de los monocultivos que los conforman
determinada en al tamizaje (Tabla 6). Se observa en la tabla que al consorcio MECIIMA/08 le
corresponde el mayor valor de captura de este metal (197,1 3,09) con significacin
estadstica con respecto al resto de los consorcios evaluados.

Tabla 14- Biosorcin de cadmio por diferentes consorcios microbianos

2+
Consorcios Cd q (mg.g-1)
Microbianos
a
MECIIMA/ 08 197,1 3,09
b
ISMEC / 08 145,4 2,8
c
AMECA/ 08 124,3 2,9

Condiciones experimentales: pH 6.0, biomasa seca 2 g.L-1, metal en solucin 1,3 mM.L-1, 28 2 C, agitacin a
100 r.min-1, 10 h. () representan desviacin estndar de tres repeticiones en cada consorcio. Se aplic ANOVA
de clasificacin simple para los consorcios. En la tabla, letras diferentes indican diferencias significativas entre
los valores de (q) de los consorcios para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a posteriori.

La eficiencia en la remocin de cadmio por los consorcios (Tabla 15) evidenci incrementos
superiores al 82 % y que el consorcio ISMEC/08 alcanz el mayor porcentaje de eficiencia.
Esto se confirm mediante los anlisis estadsticos aplicados a los resultados obtenidos por los
consorcios. Adems, en la tabla se observa que los consorcios MECIIMA/08 e ISMEC/08
superaron los porcentajes de eficiencias logrados por cada monocultivo en las condiciones
establecidas para el tamizaje (control I) y para el control II cuando se combinaron las mejores
condiciones experimentales para cada monocultivo. Otro resultado importante a tener en
cuenta es que el consorcio AMECA/08 no present diferencias significativas con uno de los
microorganismos que lo conforman, en iguales condiciones experimentales al control II. Estos
resultados se confirmaron mediante un ANOVA de clasificacin simple y procedimiento de
Tukey a posteriori aplicado para cada consorcio y su respectivo control.

72
Tabla 15- Eficiencia de remocin de cadmio por consorcios microbianos

Consorcios Microbianos E (%) Cd2+

I II
a a' B
MECIIMA/ 08 85,4 1,3
Control- monocultivos
microalga CMM6 37,7 4,0d 72,4 2,5
c'

Pseudomonas mendocina (Ps-1) 40,1 0,4d 76,2 3,1

b',c'
cln PIM 141-7 c c'
53,43 2,4 68,8 1,64
Saccharomyces cerevisiae (10) b b'
60,9 3,1 79,13 1,78
aa' A
ISMEC / 08 96,9 1,9
Control- monocultivos
Pseudomonas mendocina (Ps-1) 40,1 0,4b 76,2 3,1
b'

microalga CMM6 37,7 4,0b 72,4 2,5

b'

aa' B
AMECA/ 08 82,9 4,2
Control- monocultivos
Pseudomonas mendocina (Ps-1) 40,1 0,4c 76,2 3,1
b'

Saccharomyces cerevisiae (10) 60,9 3,1b 79,13 1,78

a'

I-Eficiencia obtenida por los controles en las condiciones experimentales establecidas para el tamizaje. II-
Eficiencia obtenida por los controles en la combinacin de los parmetros experimentales (Tabla 11). E (%)-
Porcentaje de Eficiencia. () representan desviacin estndar de tres repeticiones en cada caso. Se aplic
ANOVA de clasificacin simple para los consorcios. En la tabla, letras diferentes maysculas indican diferencias
significativas entre los porcentajes de (E) de los consorcios. Letras diferentes minsculas (a) indican diferencias
significativas entre los porcentajes de (E) de cada consorcio y el control (I) y letras diferentes minsculas con
apstrofe (a') indican diferencias significativas entre los porcentajes de (E) de cada consorcio y el control (II)
para p<0.05, segn la prueba estadstica Tukey a posteriori.

Como resultado fundamental del diseo y evaluacin de los consorcios microbianos se verific
la factibilidad de disear combinaciones microbianas que incluyan microorganismos
autctonos, transformados genticamente y de colecciones para incrementar la capacidad de
biosorcin de iones cadmio. Por otro lado, en dos de estas combinaciones (consorcios
MECIIMA/08 e ISMEC/08) se lograron incrementos significativos en la eficiencia de
biosorcin. Estos dos sistemas microbianos pueden resultar potencialmente tiles para el
desarrollo de investigaciones con residuales lquidos contaminados con cadmio y posteriores
escalados con fines de aplicacin en aguas residuales contaminadas con este metal.

En la Figura 25 se propone una estrategia de trabajo que integra los diferentes procedimientos
empleados en el estudio de la remocin microbiana de cinc y cadmio, la cual posibilit

73
incrementar en las biomasas microbianas la capacidad de biosorcin de estos iones y la
eficiencia del proceso.

Tamizaje microbiano

Aislamiento de fuentes Microorganismos de

naturales colecciones

Seleccin de microorganismos (q) >15 mg.g-1

Caracterizacin de factores Biomasa microbiana

asociados a la remocin de los Tratamientos (fsicos y qumicos)
metales Modificaciones genticas

Combinacin de factores, tratamientos y modificaciones

Monocultivos

Evaluacin del equilibrio de biosorcin

Diseo de consorcios microbianos

Seleccin del sistema microbiano

(E) > 85%

2+ incrementada en la biosorcin de
Biomasas microbianas con capacidad y eficiencia
2+ 2+
Zn y Cd

Figura 25- Estrategia general integrada para la obtencin de biomasas microbianas con
capacidades y eficiencia incrementadas en la biosorcin de Zn2+y Cd2+

74
CAPTULO IV: DISCUSIN
CAPTULO IV: DISCUSIN

IV.1. Remocin de cinc y cadmio por microorganismos de coleccin y aislados del ro

Martn Prez

El aislamiento microbiano del ro Martn Prez mostr un mayor nmero de aislados

bacterianos Gram negativos. Estos resultados pueden estar relacionados con la carga de aguas
albaales que recibe esta corriente fluvial, receptora de residuales domsticos, en adicin a los
residuales industriales. En otras investigaciones relacionadas con la evaluacin de la carga
microbiana en las agua del ro Almendares, en ciudad de La Habana se han informado
resultados similares al detectar la presencia de bacterias coliformes totales y coliformes fecales
en todos los puntos muestreados en este ro (Rojas et al., 2005).

La seleccin de tres de los aislados del ro Martn Prez (bacterias A6, CBM4 y microalga
CMM6) y de cuatro microorganismos de coleccin, con valores considerables de captura de
cinc y cadmio, evidencian la diversidad de respuestas fisiolgicas y genticas que presentan los
microorganismos, las cuales les permitira activar mecanismos constitutivos que se
desencadenan rpidamente en la clula (Nies y Silver, 1995). Apoyado en estas caractersticas
celulares es posible inferir que independiente a la fuente de aislamiento, los microorganismos
pudieran presentar capacidad de secuestrar cinc y cadmio. Estos resultados, coinciden con los
obtenidos por otros autores que refieren capacidades similares para capturar iones de cobre en
especies del gnero Pseudomonas, procedentes de colecciones microbianas y de aislamientos
de ecosistemas contaminados con metales pesados (Savvaidis et al., 2003).

Sin embargo, es de considerar que el 43% de los microorganismos seleccionados en este

trabajo, por los niveles de captura de cinc y cadmio, correspondieron a aislados microbianos
del ro Martn Prez. En las aguas muestreadas de este ro se pudieron constatar
concentraciones de cadmio de 10 g.L-1, valores que representan un problema de
contaminacin ambiental, lo cual no ocurre para el cinc (6.0 g.L-1) si tenemos en cuenta que
los valores de referencias informados para fase disuelta de ros en el caso del cadmio es de 0,02
g.L-1 y para el cinc de 30 g.L-1 (Martn y Whitfield, 1983). La presencia de cinc y cadmio
en el ecosistema pudo haber inducido la expresin de mecanismos de adaptacin y de
supervivencia para contrarrestar el dao causado por los efectos txicos de estos elementos
75
debido a la accin acumulativa de los metales que no son biodegradables. Otros autores han
referido este comportamiento en aislados microbianos de ecosistemas contaminados con otros
metales (Silver y Phung, 2005; Marrero, 2008). Los mecanismos que generan tolerancia o
resistencia celular est la incorporacin de los iones metlicos a la clula (Marrero et al.,
2007). Estos mecanismos celulares tambin podran justificar los resultados del aislamiento, el
cual adems corrobora que ecosistemas receptores de metales pesados, fundamentalmente por
accin antropognica, constituyen hbitats apropiados para aislar microorganismos con
capacidades promisorias para remover iones metlicos (Massaccesi et al., 2002; De et al.,
2006; Ansari y Malik, 2007; Kaushik et al., 2008).

Al analizar las posibles interacciones que se pueden establecer entre los microorganismos y los
metales, es importante considerar determinadas propiedades inherentes a los microorganismos,
tanto de los aislados como los depositados en colecciones, las cuales pudieran propiciar que las
clulas procariotas y eucariotas al estar en contacto con los metales presenten la capacidad de
enlazar estos elementos, en particular cinc y cadmio. En estas propiedades estn la
composicin qumica de las estructuras de las clulas microbianas, sus caractersticas
metablicas y genticas que facilitan la adsorcin y absorcin de metales disueltos en solucin
acuosa. En otros trabajos tambin se ha fundamentado la captura de metales en biomasas
microbianas por las variadas interacciones entre las propiedades biolgicas de los
microorganismos y los metales (Breierov et al., 2002; Vullo, 2003; Mashitah et al., 2007).

En esta investigacin se encontr que entre los mejores microorganismos en el secuestro de

cinc y de cadmio estn Pseudomonas mendocina (Ps-1) y los aislados CBM4 y A6 que son
bacterias Gram negativas. Las estructuras celulares en estas bacterias se caracterizan por la
presencia de la membrana externa compuesta por lipopolisacridos y fosfolpidos, los cuales
pueden ofrecer abundantes grupos funcionales para la unin de estos metales. La composicin
qumica del peptidoglicano puede tambin tributar con centros activos, como grupos
carboxilos, hidroxilos y aminos para el secuestro o intercambio con los iones cinc y cadmio.
Esta interaccin entre la superficie celular de las bacterias Gram negativas y una amplia
diversidad de metales se han comprobado e informado por otros grupos de investigadores
(Gupta et al., 2000; Surez y Reyes, 2002; Lin et al., 2005).

76
Investigaciones anteriores sustentan que las bacterias Gram positivas poseen mayores
capacidades para capturar metales por la presencia de cidos asociados a la capa de
peptidoglicano de la pared celular, fundamentalmente los cidos teicoicos, los que son una
fuente de grupos fosfatos y carboxilos que actan principalmente en la captura de los metales
(Da Costa y Pereira, 2001; Surez y Reyes, 2002). De acuerdo a estas caractersticas de las
estructuras celulares que poseen las bacterias Gram negativas y Gram positivas, se deduce que
ambos grupos presentan propiedades estructurales apropiadas para establecer interacciones
extracelulares con los iones cinc y cadmio, lo cual puede avalar el comportamiento de las
bacterias en contacto con estos metales, demostrado en el presente trabajo.

De igual manera, en la interpretacin de los resultados obtenidos con las cianobacterias

ensayadas, es importante considerar en estos procariontes fotosintticos, el aporte significativo
que puede tener la pared celular en el secuestro de los metales. Esta estructura, en este grupo
de microorganismos, tiene caractersticas similares a las bacterias Gram negativas, donde los
metales se pueden ubicar en la regin polar de la membrana o dentro de la capa de
peptidoglicano (Madigan et al., 2003). Un criterio que lo apoya es la naturaleza polianinica de
la pared celular, la cual acta como un intercambiador catinico, dado por los diferentes grupos
funcionales que posee y que facilitan la biosorcin de los metales (Aran y Pissopa, 2002).

En los microorganismos procariontes evaluados, la captura de los iones cinc y cadmio tambin
pudiera ocurrir la acumulacin intracelular de estos por sistemas de protenas transportadoras
que pueden incorporar al citosol los metales (Legatzki et al., 2003; Nies et al., 2006; Marrero
et al., 2007). A partir de la presencia de los iones metlicos en el interior celular, estos pueden
ser atrapados por protenas enlazadoras de metales como las metalotionenas (Garca et al.,
1999; Surez y Reyes, 2002) o ser secuestrados en grnulos citoplasmticos, los cuales
presentan una elevada capacidad de enlazar diferentes metales, debido a su inespecificidad
(Andrade et al., 2004).

En las microalgas, aisladas del ro Martn Prez y de coleccin, la remocin de cinc y cadmio
podra explicarse por variados mecanismos que pueden desarrollar, por ejemplo, la capacidad
que poseen para capturar iones metlicos a travs de la precipitacin de estos sobre la pared
celular o de la adsorcin a los diferentes grupos qumicos funcionales que presentan en esta
estructura (Tomko et al., 2006). Adems, pueden unir metales intracelularmente a protenas de
77
repetidas secuencias de pares de gamma-cido glutmico-cistena, que proporcionan grupos
tiol, como son las fitoquelatinas (Morelli y Scarano, 2001) y acumular metales en estructuras
citoplasmticas como las vacuolas y mitocondrias (Pellon et al., 2005).

Las levaduras empleadas en esta investigacin mostraron tambin la capacidad de secuestrar

cinc y cadmio. Esto puede deberse a la composicin qumica de los polisacridos que
conforman la estructura microfibrilar y multilaminar de la pared celular, que al facilitar la
interaccin con los cationes favorece el enlace de estos. Estas interacciones se han verificado
en otras investigaciones realizadas en Saccharomyces cerevisiae, que han detectado la
retencin de especies metlicas en los constituyentes de la pared celular (Goksubgur et al.,
2005). La posible incorporacin de cinc y cadmio a vacuolas de polifosfatos, como resultado
de un sistema de transporte consumidor de energa que se genera a travs del sistema H+-
ATPasa, as como el enlace de estos iones a protenas o polipptidos intracelulares que aportan
grupos tiolatos como las fitoquelatinas y metalotionenas pueden constituir vas de
acumulacin intracelular en estos hongos no filamentosos. Trabajos realizados previamente, lo
han demostrado para otros metales (Lovley, 2000; Vullo, 2003).

Los mecanismos de captura de metales comentados con anterioridad, pudieran estar

funcionando de manera individual o combinados para los diferentes microorganismos en
cuestin, ya que estos no son excluyentes, en coincidencia con lo que han planteado otros
autores (Torres, 2007). Todo esto hace que en la bsqueda de soluciones al problema de la
contaminacin de ecosistemas por metales, las biomasas microbianas representan una
alternativa promisoria para la proteccin ambiental, dado por los mecanismos celulares de
bioacumulacin y biosorcin que inmovilizan a los iones metlicos con beneficios para el
ambiente, lo cual est apoyado en la literatura especializada (Park et al., 2005; Ahmad et al.,
2006; Srivastava y Thakur, 2006).

El tamizaje y la inclusin de aislamientos de fuentes naturales constituyen el punto de partida

para seleccionar y disponer de microorganismos que pudieran resultar promisorios en la
reduccin de concentraciones de cinc y cadmio de soluciones acuosas, al mostrar capacidades
iniciales de captura de los metales superiores a 15 mg.g-1 (Tabla 6). Criterios similares se han
informado por otros investigadores (Brierley et al., 1986; Caizares-Villanueva, 2000).

78
Las potencialidades de los microorganismos seleccionados para posibles aplicaciones en el
campo de la biorremediacin de ambientes contaminados con cinc y cadmio, sustentan la
importancia prctica de disponer de esta coleccin microbiana, la cual est adems, avalada
por las particularidades de cada grupo. En las bacterias no fototrficas su rpido crecimiento, la
gran diversidad metablica y su elevada relacin superficie-volumen, les proporcionan
ventajas al reaccionar con los metales en solucin (Valls y De Lorenzo, 2002; Rivas et al.,
2004). Adems, las cianobacterias y microalgas pueden reproducirse con un mnimo de
condiciones y diversas especies producen oxgeno, lo cual favorece al ambiente (Mallick,
2002). Las levaduras pueden obtenerse como un residuo de procesos industriales (Marques et
al., 2000; Wang y Chen, 2006). Todos estos aspectos pueden contribuir de manera directa a la
disminucin de los costos del proceso de la biorremediacin microbiana.

Es importante sealar que en este trabajo se obtuvieron biomasas microbianas que no

mostraron capacidades para enlazar los dos metales estudiados. En este sentido, se conoce de
microorganismos que utilizan transportadores de la membrana que expulsan al ambiente los
iones metlicos, as como de otros que se valen de modificaciones enzimticas para cambiar el
estado redox de estos elementos qumicos (Cervantes et al., 2006) en respuesta a los efectos
txicos de los metales. Es posible la presencia de cualquiera de estos mecanismos en los
microorganismos que mostraron dicho comportamiento lo cual pudiera explicar estos
resultados.

Un aspecto a valorar en los resultados obtenidos, lo constituye el hecho de que a pesar de que
los metales cinc y cadmio seleccionados para la investigacin pertenecen al mismo grupo de la
tabla peridica, se encontraron diferencias en los niveles de captura para el cadmio con
respecto al cinc. Estas diferencias se pueden explicar para cationes isovalentes en base al peso
atmico, el ion de mayor peso atmico (Cd2+ 48) es mejor y ms eficientemente adsorbido en
comparacin al Zn2+ (30) debido a su acidez, lo cual favorece su interaccin con el adsorbente.
Esta superioridad del ion cadmio frente al ion cinc como adsorbato se ha demostrado y
comprobado en investigaciones anteriores (Mohapatra y Gupta, 2005; Navarro et al., 2006).
Otro aspecto que influye en la mayor captura de cadmio es el radio inico del metal, para el
cadmio es de 0.97 oA y para el cinc de 0.74 oA. En relacin a esto, se ha constatado que la
fuerza de enlace de los metales por los ligandos incrementa linealmente con el aumento del
79
radio inico (Holan y Volesky, 1994). Adems, el cadmio se caracteriza por formar ms
enlaces covalentes con los ligandos, a diferencia del cinc que establece mayormente enlace
inicos los cuales resultan menos estables (Volesky, 1999). En adicin a las caractersticas
inherente a los iones, la respuesta de los microorganismos a la elevada toxicidad del cadmio
con respecto al cinc, puede contribuir a un mayor enlace y captura de los iones cadmio como
una va de destoxificacin de este metal para garantizar la supervivencia de las clulas.

IV.2. Efecto de diferentes factores en la remocin de cinc y cadmio

La respuesta fisiolgica de los microorganismos en un ambiente dado se encuentra

influenciada por diferentes factores. En la captura de metales es importante considerar factores
tales como, el estadio fisiolgico del microorganismo, la concentracin de la biomasa, la
concentracin del metal, el valor del pH al que se desarrolla el proceso y la competencia
nter-inica.

En este trabajo, se demostr que la mayor captura de cadmio por los microorganismos CBM4,
Anabaena sp. PCC 7120, CMM6 y en Chaetoceros ceratosphorus (1P) ocurri a partir de la
etapas de crecimiento exponencial avanzada. Un comportamiento similar se observ en el
aislado A6 y en Saccharomyces cerevisiae (10) para el cinc. Estos resultados, ponen en
evidencia que el trnsito de las clulas por las diferentes fases de crecimiento ejerce una
influencia significativa en la captura de los metales. Esta influencia puede estar dada por los
diversos cambios que ocurren en la composicin qumica de las estructuras celulares, en los
procesos metablicos y en las respuestas fisiolgicas de las clulas.

En adicin a lo anterior, es de considerar que en estos estadios fisiolgicos, se puede producir

disminucin en el tamao de la clula microbiana y aumento de la porosidad de la superficie de
la clula en respuesta a un proceso de regulacin, lo cual se ha sugerido por otros
investigadores (Abn y Fernndez, 1996; Caldwell, 1999; Pan-Jin et al., 2000). Se infiere de
estos planteamientos que es posible que ocurra un aumento en la relacin superficie-volumen
y consecuentemente, un incremento de la capacidad de retener los iones metlicos. Adems, el
aumento de porosidad en la superficie celular puede favorecer la interaccin de las biomasas
microbianas con los metales. Resultados similares a los que aqu se presentan se han informado
en otras investigaciones relacionadas con la captura de cobre y cromo por diferentes especies

80
microbianas (Sudhan y Abraham, 2002; Mehta et al., 2002) lo cual, demuestra la importancia
de evaluar la influencia de este factor bitico.

En contraste a este comportamiento de los microorganismos, los resultados obtenidos con

Pseudomonas mendocina (Ps-1) frente a los dos metales y con Saccharomyces cerevisiae (10)
en la remocin del cadmio, corroboran la manifestacin de respuestas diferentes en las clulas
microbianas, en similares condiciones ambientales. La capacidad de alcanzar los mximos
niveles de remocin de cinc y cadmio, a las 8 horas de cultivo (fase exponencial temprana) en
Pseudomonas mendocina (Ps-1) puede estar relacionado con mecanismos de defensa frente a
las concentraciones de los metales empleadas, para evitar los efectos txicos de estos. Los
resultados anteriores, se corresponden con los obtenidos con especies del gnero Pseudomonas
spp. y por el hongo filamentoso Verticillium marquandii en la captura de cinc (Saba y
Dugosnski, 2004).

A partir del anlisis del efecto de la edad fisiolgica en la remocin de los iones cadmio y cinc,
se constat que si bien la edad del cultivo presenta un determinado impacto en la remocin de
los metales, dado por la respuesta fisiolgica de la poblacin celular en la expresin de
determinadas caractersticas que permiten modificar la naturaleza del ambiente contaminado,
este proceso va a depender del microorganismo en s. Estos resultados adems, permiten inferir
que en los microorganismos analizados pudieran participar de manera conjunta mecanismos de
acumulacin intracelular y extracelular de los metales. Esto se justifica por la capacidad de las
biomasas de capturar los iones cinc y cadmio durante todo el ciclo de crecimiento.

Los resultados relacionados con el efecto de la concentracin celular mostraron que para todos
los microorganismos ensayados la concentracin de 2g.L-1 es suficiente para alcanzar los
mayores valores de captura de cinc y cadmio, con excepcin de Saccharomyces cerevisiae (10)
frente al cinc. Este comportamiento en la mayora de los microorganismos, concuerda con los
resultados obtenidos por otros autores cuando estudiaron la captura de plomo por Streptomyces
rimosus (Selatnia et al., 2004) y Bacillus cereus (Ray et al., 2005), as como en la biosorcin
de cobre y cadmio por Saccharomyces cerevisiae (Kim et al., 2005), al producirse una
disminucin en la captura de los metales con el incremento de la concentracin celular en la
solucin.

81
Es importante destacar, que la concentracin celular es un aspecto controvertido entre
investigadores que abordan el anlisis de este factor bitico. Gadd y De Rome (1988),
afirmaron que un incremento en la concentracin de la biomasa disminuye el atrapamiento de
los metales por interferencias entre los sitios de unin al metal. Esta hiptesis fue invalidada al
atribuir la responsabilidad de la disminucin de la captura a la baja concentracin de metales
en solucin (Fourest y Roux, 1992). Con relacin a estos puntos de vista es pertinente sealar
que ambos podran ser complementarios a la hora de explicar la disminucin de la remocin de
los metales con el incremento celular en la solucin. La elevada concentracin celular frente a
los metales puede impedir el contacto de los iones con los sitios activos de unin en la clula y
por otro lado, mayor concentracin de biomasa proporciona un exceso de sitios libres
disponibles para el enlace, los cuales no llegan a ocuparse si no es suficiente cantidad de iones
metlicos en la solucin.

El pH influye en la especiacin del metal y en la activacin de los grupos funcionales de la

superficie celular que une los iones metlicos (Navarro et al., 2006; Deng y Ting, 2007). Esto
conlleva a que la interaccin de los cationes metlicos con los grupos de unin de la biomasa
sea un proceso sensible y dependiente de los valores del pH (Filipipovic et al., 2000).

El incremento de la captura de los iones cinc y cadmio, a pH entre 6 y 7, podra explicarse por
el bajo nivel de protonacin de los grupos activos de enlace a los metales por parte de los
microorganismos. Varios trabajos previos han confirmado que la presencia de menor cantidad
de protones H+ libres en la solucin disminuye la competencia entre estos y los iones
metlicos, lo cual facilita el enlace de los metales a los sitios activos. Adems, la carga
negativa de los ligandos en la superficie de la biomasa permite que la reaccin con los cationes
sea mayor, de esta manera se intensifican las fuerzas electrostticas involucradas en el proceso
de adsorcin, lo cual incrementa la cantidad de iones enlazados a la biomasa (Savvaidis et al.,
2003; Ray et al., 2005). A valores de pH 5, existe un predominio de cargas positivas en la
superficie de la clula microbiana, lo que evita la unin de los cationes metlicos cargados
positivamente. A pH bajo, la concentracin de iones hidronio (H3O+) aumenta y la alta
movilidad inica que estos presentan favorece la competencia entre estos y el catin metlico
por los grupos funcionales de unin al metal en la biomasa microbiana, lo cual puede explicar
los bajos valores de captura por los microorganismos a pH 5.0. Comportamientos similares se

82
han registrado en la remocin de metales por diferentes biomasas microbianas (Say et al.,
2001; Esposito et al., 2002; Vijayaraghavan et al., 2004; Kim et al., 2005).

Estudios de especiacin qumica han indicado que el ion cadmio se encuentra en su forma
Cd+2 como especie dominante a valores de pH inferiores a 5.5 (Navarro et al., 2006). A partir
de este valor de pH, este metal aparece en la forma de hidroxocomplejos Cd (OH)+ como
catin primordial (WHO, 1992). De acuerdo con los resultados obtenidos con Chaetoceros
ceratosphorus (1P), es posible sugerir la preferencia de esta microalga por iones de mayor
carga, como el Cd+2 en relacin al Cd (OH)+. Resultados similares fueron obtenidos por otros
investigadores, cuando enfrentaron el alga Ascophyllum nodosum y el hongo Lentinus edades a
este ion (Navarro et al., 2006).

De esta investigacin es posible concluir que a valores de pH neutro o cercanos a este, la

captura de cinc y cadmio result favorecida, lo que se encuentra en correspondencia con
resultados obtenidos con diferentes especies de bacterias, levaduras, hongos filamentosos y
algas (Kogej y Pavko, 2001; Savvaidis et al., 2003; De Oliveira Franco, 2004). Por otro lado,
los resultados en su conjunto pueden indicar cmo la variacin en las unidades de pH, provoca
diferenciaciones en la capacidad de retencin de los iones por las biomasas. Otros autores han
determinado que la disminucin del pH en dos unidades puede, en algunos casos, resultar en
una reduccin del metal enlazado de aproximadamente el 90% (Aldor et al., 1995).

Las variaciones en los mayores valores de captura de cinc y cadmio, con el aumento de la
concentracin inicial de estos metales, depende del microorganismo y del punto de saturacin
que presenten. En relacin a esto, para la acumulacin extracelular o en el citosol, de los iones,
el contacto entre la clula y el metal estar mediado por la pared celular. Esta estructura bajo
determinadas concentraciones de los metales pudiera no disponer de sitios libres para el enlace
de los iones (Fein, 1996; Gupta et al., 2000), lo que puede conllevar a que no incremente la
retencin del metal por la clula.

Diferentes discrepancias son encontradas en la literatura en relacin a este factor, algunos

autores sostienen que la cantidad de metal eliminado de soluciones acuosas por las biomasas
microbianas aumenta en proporcin directa con el incremento de la concentracin del ion
metlico en solucin (Say et al., 2003; Kim et al., 2005). Posteriormente se inform que la

83
bioadsorcin de cadmio en solucin acuosa por biomasa fngica mostr una disminucin en la
captura de los iones a partir de la concentracin inicial en la cual alcanz la mayor capacidad
de bioadsorcin del metal (Acosta et al., 2007).

Otro aspecto considerado en esta investigacin, est relacionado con la presencia en los
sistemas naturales de una variedad de metales contaminantes. Esto puede ser originado por
accin antropognica o por la fuente natural de estos elementos qumicos, que vinculan ms de
un metal, tal es el caso del cinc y del cadmio (Navarro et al., 2006). En correspondencia a la
necesidad de contar con biomasas microbianas funcionales en mezclas de metales, se
constataron las particularidades de la captura de estos metales a partir de una solucin
bimetlica por Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10).

La afectacin de la captura de un metal en presencia de otro y viceversa puede estar

relacionada con las caractersticas propias de cada metal. La competencia nter inica que se
establece entre los dos metales puede causar adsorcin y desorcin sobre la superficie celular
simultneamente, procesos paralelos que ocurren relacionados con el radio de los iones
metlicos. Por otro lado, se conoce que los iones de cadmio tienen mayor afinidad por los
ligandos que los iones de cinc, por lo que pudiera predecirse que el cadmio desplace al cinc de
otros sitios de enlace, como una reaccin de intercambio metal-metal (Saber y Pi-kin, 2003).
Usualmente son suficientes cantidades estequiomtricas de cadmio para desplazar todo el cinc
de los ligandos (Blindauer et al., 2001).

En adicin a lo anterior, la competencia entre los iones tiene un importante efecto de

antagonismo y sinergismo en la biosorcin de los metales individuales (Stillman, 1995; Nieto
y Rodrguez, 1999; Hussein et al., 2004), quizs por la existencia de un gradiente que modula
el proceso. Existen adems, resultados que muestran que la cantidad total de metal biosorbido
en un sistema multimetal es menor que en un sistema simple (Figueira et al., 1997; Utigikar et
al., 2000).

En general, los resultados relacionados con la determinacin del efecto de diferentes factores
en la remocin de cinc y cadmio en solucin acuosa revisten gran importancia debido a que
permitieron caracterizar el proceso de captura de estos iones por este grupo de
microorganismos. Adems, posibilitaron constatar que el conocimiento de las condiciones en
84
que ocurren las interacciones entre los microorganismos y los iones cinc y cadmio facilit el
ajuste y control de parmetros qumicos y biolgicos requeridos para que las biomasas
microbianas manifestaran mayores incrementos en las capacidades de secuestro de estos
metales.

IV.3. Mejoramiento de las capacidades biosortivas de cinc y cadmio en biomasas

microbianas

La capacidad biosortiva de los microorganismos, pudiera ser mejorada por tratamientos fsicos,
qumicos y combinaciones de estos a las biomasas. Estos tratamientos pueden inactivar las
funciones vitales de la clula e incrementar la cantidad del metal secuestrado en la superficie
celular (Goksungur et al., 2003; Park et al., 2005; Parvathi et al., 2007). A estas modalidades
de mejoramiento de la captura de metales por biomasas microbianas se suman con frecuencia
las modificaciones genticas (Lee et al., 2003; Kao et al., 2006; Chaurasia et al., 2008; Singh
et al., 2008). Basado en estos antecedentes se evalu en esta investigacin, los efectos de
diferentes tratamientos y de transformaciones genticas en microorganismos sobre la captura
de cinc y cadmio. Los resultados alcanzados en la presente investigacin, se valoraron como
novedosos y de importancia terica y prctica.

En los experimentos de captura de cinc y cadmio por las biomasas tratadas, las reducciones en
la biosorcin de estos metales por los tratamientos por esterilizacin, entrecruzamiento y
alcalino pueden ser debidas a las alteraciones en los componentes de la pared celular que
limitan los grupos funcionales de unin a metales en esta estructura, dada la accin de dichos
tratamientos. En adicin a lo anterior, la prdida de la captura intracelular de estos metales,
como resultado de la afectacin en los sistemas de transporte por la inactivacin celular,
explicara la disminucin de la capacidad de capturar los iones cinc y cadmio. Esto puede
resultar una consecuencia de la participacin conjunta de los mecanismos de bioacumulacin y
biosorcin en estos microorganismos, lo cual podra sustentar los resultados obtenidos. Esta
sugerencia de mecanismos combinados, es adems apoyada por los resultados obtenidos en la
determinacin de la influencia de la edad fisiolgica del cultivo en la captura de los metales.

Coincidiendo con los resultados del presente trabajo, en otras investigaciones se han
encontrado reducciones en la capacidad de la captura de nquel por las especies Aspergillus
niger y Rhizopus nigricans, cuando fueron sometidas a tratamientos con formaldehdo y con
85
hidrxido de sodio. Estos efectos negativos se han atribuido, a disminuciones significativas en
el rea superficial de la biomasa, a la hidrlisis de las protenas y a la ruptura de cadenas de
polmeros (Kapoor y Viraraghavan, 1997; Sudha y Abraham, 2002). Estos aspectos pudieran
haber incidido tambin en la respuesta de algunas biomasas microbianas tratadas por los
mtodos de esterilizacin, entrecruzamiento e hidrxido de sodio.

En contraste con los resultados anteriores, la literatura recopila informacin sobre la

efectividad de estos tratamientos. En relacin a esto, Microcystis aeruginosa tratada con
formaldehdo increment significativamente la captura de nquel, cadmio y cobre (Parker et
al., 1998). El tratamiento de las cianobacterias Tolypothrix tenuis, Anabaena variabilis y
Microcystis aeruginosa, con hidrxido de sodio mejor la remocin selectiva de iones cadmio
(Nagase et al., 2005). Posteriormente se conoci que la biomasa de Saccharomyces cerevisiae
modificada por entrecruzamiento mediante glutaraldehdo con adicin de cistena, increment
la adsorcin de Cd2+ y Pb2+ (Yu et al., 2007).

En correspondencia con la eficacia que pueden brindar los tratamientos de las biomasas
microbianas, el tratamiento por secado increment la captura de cinc y cadmio por los
microorganismos, en la presente investigacin. Este efecto pudiera estar dado por la
desnaturalizacin de las protenas solubles en la pared celular, provocada por el calor seco, lo
cual facilita la fijacin de estas biomolculas a la superficie de la clula microbiana. Como
resultado de esta accin, hay autores que plantean la efectividad de este tratamiento debido a
la formacin de complejos entre protenas y metales, con el consecuente incremento en la
capacidad de captura, en comparacin con las clulas vivas (no tratadas). Por otro lado, ha
sido reconocido que este tratamiento puede proporcionar mayor estabilidad operacional de la
biomasa microbiana, eliminar posibles impurezas en esta y exponer en la superficie celular
sitios de unin a metales, que pudieran estar embebidos en las estructuras externas de los
microorganismos (Huang et al., 1990; Anhalya et al., 2004). Estos efectos favorables del
tratamiento por secado pudieran contrarrestar la perdida de la capacidad de acumulacin
intracelular por la falta de los sistemas de transporte en estas clulas metablicamente
inactivadas.

El tratamiento de las biomasas vivas con EDTA, evidenci que los metales capturados se
localizan fundamentalmente en el interior celular por lo que resulta un proceso
86
fundamentalmente dependiente del metabolismo celular. Estos resultados demostraron el
mejoramiento el mejoramiento de las capacidades de biosorcin de cinc y cadmio en las
clulas tratadas con calor seco y adems, proporciona las ventajas del uso de clulas
inactivadas en la remocin de estos metales. Las biomasas microbianas en estado inactivo
pueden ser usadas y conservadas a temperatura ambiente por largos perodos de tiempo, no
dependen de la toxicidad de los metales, no requieren del suministro de nutrientes (Gupta et
al., 2000; Mheta et al., 2002) y constituyen un menor riesgo para el ambiente.

En la aplicacin de tcnicas de ingeniera gentica que pudieran contribuir al incremento de las

capacidades de biosorcin de metales en los microorganismos se ha abordado la expresin de
pptidos y protenas con capacidades de unir iones metlicos, entre las que se encuentran las
metalotionenas (Sriprang et al., 2003; Qin et al., 2006; Kao et al., 2008).

La fusin del gen smtA, que codifica para la protena metalotionena en Synechococcus sp.
PCC 7942 (Blindauer et al., 2001), en la porina alr0834 de Anabaena sp. PCC 7120 realizada
en este trabajo, constituye una va para proporcionar mayor interaccin a nivel de pared celular
entre los grupos sulfhidrilos de la metalotionena y los iones cinc y cadmio. Bajo condiciones
normales las porinas tienen una participacin importante en el transporte de nutrientes
(Caldwell, 1999) y en la organizacin de las envolturas celulares, al funcionar como anclaje
entre el peptidoglicano y la membrana externa (Valls et al., 1998).

La comparacin de las secuencias nucleotdicas de la porina somA de Synechococcus sp. PCC

6301 con la porina alr0834 de Anabaena sp. PCC 7120 por el programa BLAST, permiti
seleccionar el sitio de insercin de la metalotionena en el lazo externo de la porina que se
encuentra en contacto con el medio ambiente. Esta tctica de clonaje presenta menos
limitaciones en la captura del metal y disminuye la toxicidad asociada a la interferencia con el
estado redox del citosol, producto de la acumulacin intracelular de estos compuestos. Estas
desventajas se han encontrado en otras investigaciones relacionadas con el clonaje de
metalotionenas eucariticas expresadas en el citoplasma celular (Chen y Wilson, 1997; Kotrba
et al., 1999; Valls y De Lorenzo 2002).

La expresin de metalotionenas en compartimentos de la membrana externa celular obtenida

en este trabajo, result una alternativa para duplicar la capacidad de biosorcin de los iones
87
cadmio (Figura 19-II) y la eficiencia del proceso (Tabla 12). Adems, permiti confirmar que
protenas embebidas o enlazadas a la membrana externa constituyen plataformas para fusionar
protenas heterlogas sobre superficies celulares, lo cual corrobora lo informado por otros
grupos de investigadores (Koebnik et al., 2000; Hildegard et al., 2001; Valls y De Lorenzo,
2002)

Como alternativa a la caracterstica que presenta el vector pRL277 de ser movilizable y no

conjugativo, la conjugacin triparental informada por Elhai y Wolf, (1988) result favorable
para lograr cepas transgnicas con la insercin de dominios que unen metales en protenas de
superficie. A estos resultados contribuyeron el plsmido conjugativo PR-4 de la cepa de
Escherichia coli J-35, que al coexistir con el vector clonado pRL277 en el mismo clon, facilit
la transferencia de este plsmido. Adems, el plsmido auxiliar pRL 258, aportado por
Escherichia coli HB101 proporcion la endonucleasa para el inicio del proceso de
conjugacin. La eficacia de este mecanismo en la transferencia de genes entre bacterias ha sido
resaltada por otros investigadores (Redondo y Alonso, 2007).

La expresin de la protena metalotionena fue comprobada por la cantidad de cadmio enlazado

a los clones de Anabaena sp. PCC 7120 y confirmada por los niveles significativamente
menores de cadmio capturado por la cepa salvaje y la cepa de Anabaena sp. PCC 7120 con el
plsmido insertado sin los genes de inters. En el aumento de la cantidad de metal capturado,
un importante papel tienen las cistenas que conforman la estructura de las metalotionenas y
los residuos de histidina de esta protena, los cuales estn tambin implicados en la
coordinacin de los metales (Daniels et al., 1998; Blindauer et al., 2001).

Los porcentajes de cadmio adsorbido por el clon PIM 141-7, con respecto a la cepa salvaje
tambin infieren la expresin de la metalotionena dado por una mayor localizacin del metal
en la superficie celular, lo que adems, se sustenta por el incremento en el secuestro del metal a
un menor tiempo de crecimiento (siete das) en la cepa transformada, que puede estar asociado
con la mayor produccin de la protena con respecto a la cepa salvaje (10 das). La mayor
captura de cadmio a la concentracin inicial del metal en solucin de 200 mg-L-1, indica que la
expresin de la metalotionena en el clon PIM 141-7 proporciona un punto de saturacin a la
biomasa mayor que el obtenido en la cepa no transformada al proporcionar posiblemente
mayores grupos de enlace como los sulfhidrilos cuya fuente son estas protenas. Es de destacar
88
que no ocurri afectacin en el tratamiento por secado lo cual, pudo deberse a que el calor no
afect la estabilidad de la metalotionena. Este efecto se ha corroborado en otros estudios (Erk
et al., 2002). A estos resultados se les atribuye la importancia que ofrece la expresin de la
metalotionena fuera del citosol para el uso de clulas no viables en la captura del metal.

Los mayores valores de cadmio capturado por la nueva cepa de cianobacteria transgnica con
respecto a la salvaje, en todos los parmetros evaluados (Tabla 10) confirman que la
metalotionena expresada facilita una mayor capacidad metaloadsortiva de iones cadmio.

Resultados previos han referido el incremento en la captura de metales por la expresin de

metalotionenas de origen eucarionte en bacterias. Estas investigaciones se han dirigido
fundamentalmente a la bacteria Gram negativa Escherichia coli (Samuelson et al., 2000;
Kostal et al., 2004). Otros microorganismos estudiados en la expresin de protenas
heterlogas (MT), con inherente capacidad para enlazar metales, han sido Pseudomonas putida
(Valls et al., 2000) y Ralstonia eutropha (Lovley y Lloyd, 2000; Wernrus et al., 2001).

Los clones de Anabaena sp. PCC 7120 presentaron un comportamiento diferente frente a los
iones de cinc con respecto al cadmio. Este resultado coincide con lo encontrado por otros
autores que han referido que las cistenas de las metalotionenas, enlazan ms fuertemente el
cadmio que el cinc (Blindauer et al., 2001). La menor capacidad que mostraron las cepas
transgnicas de enlazar los iones cinc es posible tambin, de explicar por las propias
caractersticas de los metales en estudio, discutidas anteriormente (epgrafe V).

Estos hallazgos son de un gran valor para comprobar que las modificaciones genticas llevadas
a cabo, constituyen una alternativa para crear quelantes biolgicos con incremento de las
capacidades y selectividad de capturar metales. Adems, constituye una novedad cientfica a
nivel internacional ya que por primera vez se informa de la expresin de metalotionena
procaritica fusionada a una protena de membrana externa en Anabaena sp. PCC 7120, que
duplica la cantidad de cadmio capturado por las clulas y la eficiencia del proceso de remocin
de este in. Adems, esta cianobacteria transgnica forma parte de la coleccin de
microorganismos seleccionada en esta investigacin con promisorias aplicaciones prcticas. En
adicin a lo anterior, la metodologa empleada para obtener estos resultados contribuye al

89
conocimiento del manejo de tcnicas de ADN recombinante para la expresin en la superficie
celular de pptidos enlazadores de metales, tales como las metalotionenas.

IV.4. Combinaciones de las mejores condiciones experimentales para la biosorcin de

cinc y cadmio

La cintica de biosorcin de cinc y cadmio ocurre en una primera fase que se caracteriza por
que un proceso de biosorcin muy rpido, en el cual la capacidad de saturacin se alcanza en
un tiempo de contacto de 40 minutos. Seguidamente, se manifiesta una segunda fase en la cual
la biosorcin es mucho ms lenta. Estos datos permitieron establecer un tiempo de contacto
entre la biomasa y el metal de diez horas, tiempo suficiente para que se alcance el equilibrio en
el proceso de biosorcin de los dos metales. El valor de estos resultados se justifica por la
disminucin de 14 horas en el secuestro de los metales, lo cual reviste gran importancia para la
posible utilizacin de los microorganismos con fines prcticos.

Se demuestra con estos resultados que las interacciones dinmicas, que se establecen entre los
microorganismos y los metales, aumentan la velocidad de captura de los iones metlicos y
estos estn en coincidencia con otros resultados informados en la literatura que demuestran las
dos fases cinticas en la acumulacin de los metales (Hussein et al., 2004; Yu et al., 2007).
Adems, se ha considerado que el primer estado de este proceso se corresponde con una rpida
adsorcin fsica o intercambio inico sobre la superficie celular, que finaliza con la fase de
equilibrio de biosorcin (Parvathi et al., 2007).

Los incrementos en la eficiencia de biosorcin de cinc y de cadmio, cuando se combinaron las

mejores condiciones experimentales durante 10 h de contacto biomasas-metal, puede ser el
resultado de las capacidades de los microorganismos de adaptarse a diferentes variables, como
una funcin de la diversidad gentica que presentan, reflejada fisiolgicamente, tal como se
detect en Pseudomonas mendocina (Ps-1), Saccharomyces cerevisiae (10), en la microalga
CMM6 y el clon PIM 141-7. En los incrementos de la eficiencia de remocin se distingui la
cepa transformada que alcanz porcentajes de eficiencia en el orden de 2,4 veces superior a la
alcanzada por la cepa salvaje en las condiciones ensayadas en el tamizaje.

Por otro lado, esta caracterizacin fisiolgica integrada de la biosorcin de los metales permiti
evaluar, en las condiciones ensayadas, el comportamiento de los microorganismos en contacto
90
con el cinc y el cadmio como la respuesta fisiolgica de la poblacin microbiana, adaptada a
factores controlados en el mismo medio. Adems, posibilit verificar que para un
funcionamiento efectivo de los procesos de biosorcin de cinc y cadmio la integracin de
varios factores caracterizados, puede constituir un aporte importante.

En la literatura consultada no se refieren antecedentes de la integracin de los factores antes

mencionados, debido a que estos se investigan cada uno por separado (Metha et al., 2002;
Mallick, 2003; Kim et al., 2005; Navarro et al., 2006; Yu et al., 2007). Por consiguiente resulta
novedoso demostrar a escala de laboratorio la efectividad de la combinacin de factores,
tratamientos y modificaciones a las biomasas, previamente establecidos y ajustados, para
facilitar la obtencin de biomasas microbianas con incrementos en las capacidades de captura
de cinc y cadmio, as como en la eficiencia de biosorcin de estos metales, al considerar que en
la naturaleza, a diferencia de los ensayos de laboratorio, los microorganismos deben responder,
simultneamente, a una variedad de factores ambientales. En estas condiciones expresan los
limites de sus habilidades fisiolgicas en respuesta a los mecanismos de control (Caldwell,
1999).

Por otro lado, estos resultados permiten informar por primera vez para Cuba de los
monocultivos de Pseudomonas mendocina (Ps-1) y de Saccharomyces cerevisiae (10) con
porcentajes de eficiencia en la captura de iones cinc, superiores al 97%, lo cual hace de estos
dos microorganismos, biosorbentes prometedores para futuras aplicaciones en la reduccin de
concentraciones de cinc de residuos lquidos contaminados. La relevancia de estos resultados
est apoyada en las eficiencias informadas para biosorbentes comerciales y otras tecnologas,
aplicadas en la remocin de diferentes metales. Estos mtodos han alcanzado despus de un
proceso de optimizacin porcentajes de eficiencias entre el 95 y 99 % (Gamez, et al., 2007).

IV.5. Descripcin del fenmeno de sorcin en cada metal

La evaluacin de la capacidad de biosorcin indic que las isotermas de biosorcin de cinc y

cadmio, estn representadas satisfactoriamente a travs del modelo de Langmuir, para todas
las concentraciones en equilibrio de los iones metlicos examinadas. Cada una de las isotermas
mostr un comportamiento tpico de curva hiperblica, representativa del comportamiento
favorable de la biosorcin, dado por un incremento en la captura de los metales mientras que
los sitios de enlace no llegan a saturarse y posteriormente ocurre la disminucin del secuestro
91
de los iones, con la saturacin de la biomasa. Estos resultados coinciden con los obtenidos en
la biosorcin de plomo y nquel por Sargassum sp. (Vianna et al., 2000), con la captura de
cadmio, cobre y cinc por Aspergillus oryzae, Bacillus lentus y Saccharomyces cerevisiae,
respectivamente (Sudhan y Abrahan, 2002) y adems, en el secuestro de plomo por
Saccharomyces cerevisiae (Parvathi et al., 2007).

Las isotermas de biosorcin de cinc y cadmio obtenidas para los microorganismos estudiados,
indican que los iones cinc y cadmio (sorbatos) son atrados hacia el sorbente
(microorganismos) donde pueden ser enlazados por diferentes mecanismos como por ejemplo
la adsorcin, hasta que se establece un equilibrio entre el sorbato disuelto y el sorbato enlazado
al sorbente. La afinidad entre el sorbente por el sorbato determina su distribucin entre la fase
slida y lquida, en respuesta al total de sitios de unin que estn disponibles en la biomasa
microbiana para biosorber (Volesky, 1999).

Los coeficientes de regresin muestran que las ecuaciones lineales de los modelos de
Langmuir y Freundlich, representan adecuadamente los datos experimentales obtenidos. Los
resultados alcanzados estn en concordancia con lo planteado por otros investigadores, al
precisar que coeficientes de regresin superiores a 0,9 proporcionan una buena correlacin
entre los modelos y los datos experimentales (Hussein et al., 2004; Deng y Ting, 2007). Los
modelos aplicados se caracterizan por las siguientes suposiciones: Langmuir, refiere la
adsorcin en monocapa y la energa de adsorcin constante (Savvaidis et al., 2003) y la
ecuacin de Freundlich trata con superficies de adsorcin heterogneas (Jianlong et al., 2001).

Los coeficientes de regresin obtenidos con la ecuacin de Freundlich, sugieren que pudiera
predominar la adsorcin de los metales en multicapas. Con relacin a esto, resulta importante
resaltar que este modelo no predice la saturacin de la biomasa. Sin embargo, resultados
anteriores de esta investigacin han evidenciado la saturacin de los microorganismos durante
la captura de los metales. En correspondencia con esto, sugerimos que la mejor descripcin de
los datos se logra con la ecuacin del modelo de Langmuir. Esto es consistente adems, si se
tiene en cuenta que este modelo asume que diversos grupos activos de la superficie celular,
constituyen sitios de enlace de metales y estos estn presentes en la estructura compleja de la
superficie celular (Parvathi et al., 2007).

92
Los cuatro microorganismos presentan valores elevados para la biosorcin de iones cadmio.
Esta afirmacin se sustenta en el clculo del lmite mximo de biosorcin (qmax) relacionado
con la capacidad del biosorbente para retener iones metlicos en soluciones concentradas, as
como por la constante (b) determinada para cada biosorbente que muestra la afinidad de las
biomasas por el sorbato (Holan y Volesky, 1993). En cuanto a las constantes de Freundlich,
tanto la (Kf) como la (n) mostraron valores que confirman la capacidad de adsorcin de los
biosorbente (Sudhan y Abraham, 2002).

IV.6. Remocin de cadmio por consorcios microbianos

Las relaciones de cooperacin establecidas entre las biomasas microbianas que conforman los
consorcios permiten mejorar las capacidades biosortivas de los metales. El incremento de la
captura de iones cadmio que presentaron los tres consorcios basado en el aumento del nmero
de centros activos de unin del metal sobre la superficie celular, excede al menos cuatro veces
los valores de metal enlazados a las clulas con respecto a la captura de los controles obtenida
en el tamizaje (Tabla 6). El incremento significativo en 6,6 veces ms, que present el
consorcio MECIIMA/08 puede ser el resultado de un efecto sinrgico ms acentuado a partir
de la presencia de la cepa de cianobacteria transgnica, que mediante la sntesis de
metalotionenas fusionadas en la protena de membrana externa aporta un mayor nmero de
grupos sulfhidrilos de unin al metal. Adems, la microalga autctona CMM6 pudiera
contribuir a una mayor afinidad de este consorcio por el metal cadmio. Los mayores valores
de la constante (b) determinada para esta microalga, por el modelo de Langmuir permiten
realizar estas inferencias. Esto tambin, se sustenta por los resultados del consorcio ISMEC/08
en el cual est presente la microalga autctona.

La seleccin adecuada del tipo de microorganismos y la manipulacin de las condiciones de las

biomasas por mtodos fsicos, qumicos y genticos, hacen de estos consorcios biotecnologas
especficas que pueden constituir una herramienta para el mejoramiento del tratamiento de
efluentes contaminados con iones cadmio. En este sentido, orientar la captura de los iones
cadmio a la biosorcin es una alternativa para eliminar ciertas limitaciones del proceso,
originadas por el empleo de clulas vivas, los cuales necesitan ser controladas para una
remediacin efectiva. El estado activo de las biomasas conlleva a requerimientos energticos

93
para la biosntesis celular, crecimiento y reproduccin que garanticen la generacin de las
biomasas microbiana.

Los valores de eficiencias alcanzados en la remocin de cadmio por el consorcios

MECIIMA/08 (85,4 %) y ms an por ISMEC/08 (96,9%) constituyen un hallazgo de
inestimable valor ya que posibilitaron informar por primera vez de dos consorcios microbianos
diseados a partir de una bacteria Gram negativa y una levadura, procedentes de una coleccin
microbiana nacional, de una cepa autctona de microalga y una nueva cepa de cianobacteria
transgnica eficientes en la biosorcin de cadmio. Esta novedad se refuerza por la poca
informacin que refiere la literatura especializada sobre la biosorcin de metales por
consorcios microbianos. Adems, permite aportar estos dos sistemas microbianos con
potencialidades en la aplicacin de residuales contaminados por cinc y cadmio.

Los resultados del presente trabajo responden a los intereses de disponer de biomasas
microbianas prometedoras desde el punto de vista econmico, ambiental y de sus capacidades
para contribuir a la solucin del problema de la contaminacin por metales pesados, en
particular por cinc y cadmio. En este sentido, microorganismos en monocultivos o en sistemas
microbianos como la utilizacin de consorcios microbianos, o sistemas mixtos formados por
microorganismos y macromolculas (polmeros) sorbentes, se encuentra en constante bsqueda
para incrementar los rendimientos en la captacin de metales (Lebeau et al., 2000; Yakup et
al., 2001; Brant et al., 2002; Vullo et al., 2003).

A partir de los resultados obtenidos en esta investigacin se pudo inferir que la utilizacin de
varias estrategias y la combinacin de estas, pueden constituir una metodologa de
investigacin eficaz para obtener biomasas microbianas con incrementos en las capacidades de
remocin de cinc y cadmio, as como en la eficiencia del proceso a escala de laboratorio. Este
procedimiento general integra mtodos convencionales de trabajo en microbiologa con
herramientas de microbiologa molecular, modelos matemticos para evaluar el
comportamiento de los microorganismos y adems, tiene en cuenta criterios de seleccin de los
microorganismos, informados en la literatura especializada. Esta estrategia permitira evaluar y
caracterizar microorganismos en la remocin de cinc y cadmio para desarrollar biosorbentes en
monocultivos o consorcios microbianos eficientes para la disminucin de estos metales de
soluciones acuosas.
94
Dada la necesidad que existe en la actualidad, de encontrar soluciones a los graves problemas
de contaminacin ambiental que generan diversas industrias y la actividad humana, el valor de
la ejecucin de esta estrategia integrada, est dado en que posibilita conocer el sistema que se
evala y explorar las posibilidades del material biolgico empleado desde diferentes puntos de
vista, para desarrollar y caracterizar microorganismos con potencialidades de ser empleados en
la biorremocin de ambientes contaminados con cinc y cadmio.

La puesta en prctica de esta estrategia contribuy a que en este trabajo se profundizara en el

conocimiento de microorganismos involucrados en los procesos de biosorcin de cinc y
cadmio de solucin acuosa y mostr adems las posibilidades que ofrece la biodiversidad
microbiana, para proyectar este tipo de investigacin. Se verificaron diferentes vas para lograr
incrementos en las capacidades de biosorcin y eficiencia del proceso para estos metales y se
pusieron en prctica consorcios microbianos que en su diseo incluyeron microorganismos
autctonos, de colecciones y modificados genticamente, de lo cual no exista antecedentes. Se
brind una estrategia de trabajo factible para continuar este tipo de investigacin en el campo
de la biorremediacin de metales y en particular de cinc y cadmio.

95
CONCLUSIONES

1-Las cepas de colecciones microbianas Pseudomonas mendocina (Ps-1), Anabaena sp. PCC
7120, Chaetoceros ceratosphorus (1P), Saccharomyces cerevisiae (10) y los
microorganismos autctonos A6, CBM4 y CMM6, alcanzaron niveles de captura de los
metales entre 16 y 34 mg.g-1. Esto significa que pueden competir con tecnologas existentes
aplicables en la remocin de metales, lo cual permiti seleccionarlos como punto de partida
para desarrollar bioadsorbentes eficientes.

2-Los valores de pH entre 6 y 7, el cultivo microbiano a partir de la fase exponencial avanzada

de crecimiento y las concentraciones iniciales de los metales en solucin iguales o superiores
a 100 mg.L-1, las cuales son concentraciones saturantes para las biomasas, constituyen los
parmetros que propiciaron los mayores incrementos en la remocin de cinc y cadmio para la
generalidad de los microorganismos estudiados.

3-El tratamiento por calor seco increment la capacidad biosortiva de los iones cinc y cadmio
por las biomasas microbianas inactivadas, lo que sustenta la aplicacin de este tratamiento
fsico en la biosorcin de estos metales.

4-La cepa transgnica de Anabaena sp. PCC 7120, clon PIM 141-7 duplic los valores de
captura de cadmio y los porcentajes de eficiencias del proceso con respecto a los valores
originales de la cepa salvaje a partir de la expresin de la metaloprotena a nivel de pared
celular.

5-La biosorcin de iones cinc fue un proceso eficiente en porcentajes superiores al 97% por los
monocultivos de Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces cerevisiae (10), por lo
que resulta promisorio la utilizacin de estas cepas en residuales lquidos impactados con
cinc.

6-El consorcios microbiano MECIIMA/08 compuesto por Pseudomonas mendocina (Ps-1),

Saccharomyces cerevisiae (10), el clon PIM 141-7 y la microalga autctona CMM6 y el
consorcio ISME/08 integrado por Pseudomonas mendocina (Ps-1) y Saccharomyces

96
 cerevisiae presentaron eficiencias en la biosorcin de iones cadmio de 85,4 y 96,7 %,
respectivamente, lo que los hace candidatos para ensayos con efluentes naturales
contaminados con iones cadmio.

7-La estrategia experimental integrada puesta en prctica para incrementar la capacidad

biosortiva de las biomasas microbianas es factible para obtener una eficiente remocin de
cinc y cadmio y aplicable a otras investigaciones con estos metales.

97
RECOMENDACIONES

1-Evaluar la efectividad de los monocultivos Pseudomonas mendocina (Ps-1) y

Saccharomyces cerevisiae (10) y de los consorcios microbianos MECIIMA/08 e ISMEC/08
con efluentes naturales contaminados con cinc y cadmio a escala de laboratorio.

2-Extender el uso de la estrategia empleada a otros microorganismos para obtener una mayor
disponibilidad de biomasas microbianas eficientes en la remocin de cinc y/o cadmio, as
como determinar su factibilidad en la remocin microbiana de otros metales.

3-Realizar la identificacin del aislado de microalga CMM6

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"Microalgas con potencialidad de capturar cadmio y cinc". M. E. Carballo Valds;
A. Martnez Sardias, A. Lafforte; M. Cruz Arias; M. lvarez Prieto; S. Alleyne
Veita; O. L. Collazo Prez; M. Alfonso Zayas; I. Salgado Bernal; T. Romero
Lpez; R. Nodar Prez. Revista Contribucin a la Educacin y la Proteccin
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"Aislamiento de microalgas del Ro Martn Prez de la Ciudad de La Habana". I.
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"Remocin de metales pesados txicos de soluciones acuosas por biosorbentes
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Microbiologa y Parasitologa R. R. N 0494-UNT, (2006)
Remocin microbiana de metales pesados. 2da Convencin Cubana de Ciencias de
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Armando Martnez Sardias, Mario Cruz Arias, Irina Salgado, Marjory Prez, Iris
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Microorganismos usados en la remocin de metales pesados de soluciones acuosas:
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Alleyne Odalys Collazo. SCINDO Vol. 11 N 1, (2008).
Estudio de aislados bacterianos en la remocin de zinc y cadmio Irina Salgado,
Mara E. Carballo, Armando Martnez, Sherlan Avril, Mario Cruz, Manuel lvarez,
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 Educacin y la Proteccin Ambiental, VIII: 351-360, ISBN 978-959-7136-56-9,
(2008).
Evaluacin de la potencialidad de una cepa bacteriana para la eliminacin de zinc y
cadmio de solucin acuosas. Irina Salgado, Armando Martnez, Mara E. Carballo,
Mario Cruz, Aurelio Boza, Manuel lvarez, Odalys Collazo. C.D Quinto
minisimposium internacional sobre remocin de contaminantes de aguas, atmsfera y
suelo, AG-106, (2008).
Evaluacin de la capacidad de biorremocin de cadmio y cinc en bacterias,
microalgas y levaduras. Carballo Valds M. E; Martnez Sardias A.; Salgado
Bernal I.; Maldener I.; lvarez Prieto M.; Boza, A Collazo Prez O. L; Romero T;
Prez Rodrguez M.; Cruz Arias M. En prensa. Revista Biologa, (2008)
TRABAJOS PRESENTADOS EN EVENTOS

"Estudio bibliogrfico sobre la Biorremediacin. Una alternativa para el saneamiento

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Gonzlez, M. Cruz. Pster Taller Visin Universitaria del Medio Ambiente. Centro
de Estudio del Medio Ambiente. Universidad de La Habana, Cuba, (2003).
"Las Microalgas, un potencial para la Biorremediacin de aguas residuales
contaminadas con metales pesados. Estudio bibliogrfico". M. E. Carballo; A.
Martnez; K. Paneque; R. Rodrguez; M. Cruz Pster. Taller Visin Universitaria del
Medio Ambiente. Centro de estudio del Medio Ambiente. Universidad de La Habana,
Cuba, (2003).
"Tamizaje de cepas bacterianas para la remocin de metales pesados (cobre y
cadmio). M. E. Carballo, A. Pin, A. Martnez, J. Martnez, C. Daz y R. Jimnez.
IX Taller de la Ctedra de Medio Ambiente. Instituto Superior de Ciencia y
Tecnologa Nucleares. Ciudad Habana, Cuba, (2003).
"Biosorcin de cadmio por bacterias y levaduras". Martnez A., M. E. Carballo, A.
Pin, M. Alfonso, J. Gutirrez, M. Cruz, C. Daz y B. Luna. X Taller de la Ctedra
de Medio Ambiente. Instituto Superior de Ciencia y Tecnologa Nucleares. Ciudad
Habana, Cuba, (2004).
"Microalgas con potencialidad de capturar cadmio y cinc". M. E. Carballo Valds;
A. Martnez Sardias, A. Lafforte; M. Cruz Arias; M. lvarez Prieto; S. Alleyne
 Veita; O. L. Collazo Prez; M. Alfonso Zayas; I. Salgado Bernal; T. Romero
Lpez; R. Nodar Prez. IIX Taller de la Ctedra de Medio Ambiente. (ISCTN).
Cuba, (2005).
"Remocin de cadmio mediante microorganismos". Alfonso Zayas Mabel., Gutirrez
Prez Jorge., Carballo Valds Maria Elena., Martnez, Sardias Armando., Cruz
Arias Mario., Salgado Bernal Irina. Primer Evento Nacional de Tcnicos de la
Ciencia, (2005).
"Biosorcin de cadmio por biomasa desnaturalizada de Rhizopus nigricans". I.
Fernndez, M. E. Carballo Valds; B. Volesky; T. Davis; A. Martnez Sardias.
Congreso Cientfico Internacional CNIC 2005. Cuba, (2005).
"Efecto del tratamiento a la biomasa desnaturalizada de Rhizopus nigricans en la
biosorcin de cadmio". M. E. Carballo Valds; I. Fernndez; B. Volesky; T. Davis;
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"Aislamiento de microalgas del ro Martn Prez de la ciudad de La Habana". Irina
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"Microalgas con potencialidad de capturar cadmio y zinc". M.E. Carballo Valds, A.
Martnez Sardias, A. Lafforte, M. Cruz Arias, M. lvarez Prieto, S. Alleyne Veita,
O. L. Collazo Prez, M. Alfonso Zayas, I. Salgado Bernal, T. Romero Lpez, R.
Nodar Prez. XI Taller de la Ctedra del Medio Ambiente del Instituto Superior de
Tecnologas y Ciencias Aplicadas, (2005).
"Remocin de metales por microorganismos y efecto de factores biticos y abiticos
en el mecanismo de captura". A. Martnez, M. E. Carballo; I. Salgado, M. Cruz
Arias O. Collazo, M. lvarez. XII Exposicin Forjadores del Futuro Municipal y
Provincial, (2005 y 2006).
"Remocin de metales pesados txicos de soluciones acuosas por biosorbentes
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Marjory Prez; Mabel Alfonso; Manuel lvarez; Odalys Collazo. II Congreso
Peruano de Estudiantes de Microbiologa y Parasitologa. Universidad Nacional de
Trujillo, Per, (2006).
 "Remocin microbiana de metales pesados, alternativa para el saneamiento
ambiental". Armando Martnez; Ma. Elena Carballo; Mario Cruz; Irina Salgado,
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Remocin microbiana de metales pesados. Mara Elena Carballo Valds,
Armando Martnez Sardias, Mario Cruz Arias, Irina Salgado Marjory Prez, Iris
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de Ciencias de la Tierra. II Congreso Cubano de Minera, (2007).
"Estudio de aislados bacterianos en la remocin de zinc y cadmio". Irina Salgado,
Mara E. Carballo, Armando Martnez, Sherlan Avril, Mario Cruz, Manuel lvarez,
Aurelio Boza, Odalys Collazo, Mara Liva, Joivier Vichi. XIII Workshop oof
EEnvironmental Chair. Havana Verde, (2008).
"Cepa bacteriana con potencialidad en la remocin de zinc y cadmio: herramienta
para el saneamiento de aguas residuales y ecosistemas acuticos". Irina Salgado,
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LOGROS CIENTFICOS

Logro para la ciencia y Premio al mejor resultado en la direccin de medio ambiente.

Balance de Investigaciones, Facultad de Biologa. Universidad de La Habana.
"Seleccin de cepas atrapadoras de metales pesados". M. E. Carballo, A. Pin, J.
Martnez, A. Martnez, (2000).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La
Habana. "Estrategia para la remocin de metales pesados por biosorbentes no vivos".
M. E. Carballo; T. A. Davis; M. Husen y B. Volesky, (2001).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La Habana.
"Empleo de microalgas para el tratamiento de aguas contaminadas con cadmio". M. E.
 Carballo; M. Cruz Arias; A. Martnez; Teresita Romero Lpez; Iris Maldener y Lzaro Lima
Cazorla, (2003).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa "Determinacin de
parmetros fisiolgicos en dos especies de microalgas con capacidad de remover
metales pesados". M. E. Carballo Valds, M. Cruz Arias, Armando Martnez
Sardias, Mabel Alfonso Zayas, Manuel lvarez Prieto, Sheyla Alleyne Veita,
(2004).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa "Remocin de
cadmio y cinc por diferentes especies microbianas". M. E. Carballo; M. Cruz Arias;
A. Martnez Sardias; I. Salgado Bernal; M. Prez Rodrguez; M. Alfonso Zayas; M.
lvarez Prieto; Alleyne Veitia y O. L. Collazo Garca, (2005).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La
Habana. "Tratamiento de aguas contaminadas con metales pesados mediante
microalgas". Balance de Investigacin. M. E. Carballo; M. Cruz Arias; A. Martines
Sardias; I. Salgado Bernal; M. Prez Rodrguez; M. Alfonso Zayas; M. lvarez
Prieto; Alleyne Veitia y O. L. Collazo Garca, (2006).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La
Habana. "Aislamiento de una cepa bacteriana con capacidad de remocin de Zinc y
Cadmio y caracterizacin del proceso de biosorcin". I. Salgado, A. Martnez, M. E.
Carballo, S. Avril, M. Cruz, M. lvarez, A. Boza, O. Collazo, M. Liva, J. Vichi,
(2007).
"Obtencin de una cianobacteria transgnica con capacidad aumentada en la captura
de cadmio" Maria Elena Carballo Valds, Iris Maldener, Mario Cruz Arias, Armando
Martnez, Irina Salgado Bernal, (2008).
Logro Cientfico, Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La
Habana. "Remocin de cadmio por consorcios microbianos" Maria Elena Carballo
Valds, Armando Martnez, Mario Cruz Arias, Irina Salgado Bernal, (2008).
Premio Balance de Investigacin. Facultad de Biologa. Universidad de La Habana Al
resultado de investigacin del ao que ms haya contribuido a la proteccin del
medio ambiente en cuba Los microorganismos en la conservacin del medio
ambiente. Beneficios para la agricultura y la biorremediacin de ecosistemas
 impactados. Gilda Guerra, Mayra Heydrich, Orqudea Coto, Mario Cruz, Annia
Hernndez, Marcia Rojas, Maria Elena Carballo, Jeannette Marrero, Ana Margarita
Manzano, Miguel Ramos, Yanelis Acebo, Osmel Domnguez, Maria I. Snchez, Irina
Salgado, Juan Arguelles, Armando Martnez Narovis Rives, A. N. Hernndez, M. El
Jaziri, B. Diallo, Lila Castellanos; L J. Lpez M. Ayala, Georg Auling, Cornelia
Grosse, (2008).

APOYO FINANCIERO

Proyecto ALMA MATER "Desarrollo de un proceso analtico para la determinacin de

metales en agua y animales" (1998-2000).

Proyecto BMBF "Tratamiento de aguas residuales contaminadas con metales pesados

mediante microalgas" (2002-2006).
ANEXO I- Composicin de medios de cultivo
Extracto de Levadura- Glucosa (Atlas, 2000)
Extracto de levadura..5 g
Glucosa10 g
Agua destilada. 1L
pH............................7.0

LGI-P Modificado (Reis et al., 1994)

Azcar cristal......................................100 g
K2HPO4 (10%)...................................................2 mL
KH2PO4 (10%)...................................................6 mL
MgSO4 7 H2O (10 %).......................................2 mL
CaCl2 2 H2O (1%)............................................2 mL
Na2 MoO4 2 H2O (1%)......................................2 mL
Azl de bromotimol (0,5% en KOH 0,2N)........5mL
FeCl3 6H2O (1%)...............................................1mL
Vitaminas.............................................................1mL
Guarapo lquido...................................................5 mL
Agua destilada..1L
pH........................................................................5,5

SYP (Caballero y Martnez, 1994) Luria-Bertani (Sambrook et al.,

1989)
Sacarosa..10g Triptona..10 g
Extracto de levadura3g NaCl........5 g
K2HPO4.......................................................1g Extracto de levadura.5g
KH2PO4.......................................................3g Agua destilada..1L
Agua destilada..1L
pH...7.0
pH.6.2

Allen y Arnon (Allen y Arnon, 1955)

Solucin de micro elementos
MnCl2 4 H2O..360 mg
MoO3 .......................................36 mg
ZnSO4 7 H2O.......44 mg
CuSO4 5H2O...15.8 mg
H3BO4 ...572 mg
NH4VO3.4,6 mg
CoCl2 6 H2O.....8 mg
Solucin de de hierro Fe EDTA160 mL
Agua destilada........................ 1L
Solucin de hierro Fe EDTA
KOH..5,2 g + Na2EDTA 2H2O.....20,4 g 186 mL
FeSO4 7 H2O13,7g.L-1..................................364 mL
Mezclar las dos soluciones
ANEXO I- Composicin de medios de cultivo (continuacin)
Solucin A
MgSO4 7 H2O (4%) . 500 mL
CaCl2 2 H2O (1,2%) . ... 500 mL
NaCl (3,8%)... 500 mL
Solucin de micro elementos500 mL
Solucin B
K2HPO4. 28 g
Agua destilada 500 mL

Elaboracin del medio de cultivo

Solucin A25 mL
Solucin B..6,5 mL
KNO3..0,253 g
NaNO3...................................0,212 g
Agua destilada.969 mL
pH...7.5

Medio Guillard H/2 (Guillard, 1975)

Solucin de sales
NaNO3................................. 300 g
KH2PO4............................... 30 g
NH4Cl.................................. 20 g
Agua destilada.......................1L
Solucin de vitaminas
B12- cianocobalamina......... 100 g
B1-tiamina........................... 10 g
H-biotina............................. .100 g
Agua destilada...1L
Solucin de micro elementos
ZnSO4 H2O.......................... 30 g
CuSO4 5H2O.........................25 g
MnSO4 H2O......................... 20 g
FeCl3 6H2O.......................... 50 g
NaMoO4 2H2O......................25 g
Na2-EDTA.............................50 g
Agua destilada... 1L
Elaboracin del medio de cultivo
Solucin de sales.1 mL
Solucin de vitaminas 1 mL
Solucin de microelementos1 mL
Agua de Mar.1 L
pH.6.0
La preparacin de cada uno de los medios en estado slido se realiz por la adicin de
Agar- agar al 1,5% en 100 mL de medio.
ANEXO II-Secuencia de bases de la protena de superficie alr0834 y de los genes
smtA

Secuencia de bases de la porina alr0834

>Anabaena (Chr) 959601-961136 (http://bacteria.kazusa.or.jp/cyanobase/)

(291 F) ATGCTATTTTCTGGCGCTGCTGCCTTTGCAGGAGAAACCCCTGCCATAACA
GAAACAAATGAAACCTCAAAAATAGCTAATGCAGACCTAGCTACTCAACAAGAGGT
AATGTCACTACCTCAGTTTCTCAGTTTTCTGACGTACAACCCACAGACTGGGCTTTCC
AAGCATTGCAATCACTGGTAGAGCGTTATGGTTGTATTGCAGGATATCCCAATGGGA
CATACCGTGGTAATCGCGCCCTCACAAGATATGAATTTGCCGCAGGCTTGAACGCTT
GTCTGGATCGAGTCAACGAATTGATCGCTACTGCCACGGCGGAGTTAGTCACAAAAG
AAGACTTAGCTACACTACAAAGGCTACAAGAAGAGTTTTCTGCGGAACTAGCAACAT
TAAGAGGTCGAGTTGATGCTTTAGAAGCACGTACCTCGGAATTAGAGCCAATCAATT
CTCAACCACAACAAAGCTGCAAGGACAAGTAGTATCAGTTATCAGCGATGTCTTATC
AGGCGATCGCGTCAATAATGCAGATATCGTCGATACAAATACTACTCTGGGAGTACG
GGCGCGATTAGAACTTGTCTCCAGCTTTACTGGGCGAGATACCTTGTTCACCAGAATT
GAAGCTAACAACATTACTAGCCCCGACATTAATACTCCAGAAGGTAACCTGTTCTTC
GCTAGCGTTGAACCCAGTACTAACGCTGCTATTGGTACTTTGTGGTATGGGTTCCCC
GTGGGCAAAAATACACAAGCCAAGCTAATTGCCGTTGGAGGTGCAGCAGACGACCT
CACCAGCACCGTAAACATATTTGATGGAGATGGTGCTTTTGGTGCTTTAACTACCTTT
GGTACACGTAACCCGATTTATGGGCAGATAGGTGGTACTGGTTTGGGTGTCACTCAC
CAGTTTAGTGATAAATTAGCCTTAAGCTTGGGTTATTTGAGTGGTACAGCAAATGAC
CCATCACCCCAGAATGGTTTATTTGACGGCGCTTACGGTGCATTAGCACAACTGACA
GTTAGACCAAGCGATCGCGTCAGTGTTGGCCTAACATATATCAATTCTTACCGGCAA
CCCCTAGCCACTGGTAGTAACGCTGCAACCACCTTCCAAGGTTTAGGCGAAAGATTT
TCCAGCAATTCCTACGGTCTCCAAGCTTCTATCGGTCTGAGTGAAAAATTAGTCTTGG
GTGGATGGGCTGGTTACACTAATAGCCGCATCTTGACAGGCGATCGTGGAGACGTTG
ATATCTGGAACTATGCGGTTACTCTTGGTTTCCCCGACCTTGGGAAAAAAGGTAACTT
AGCCGGTATCATTGCTGGGATGGAACCAAAAGTCACAAGTTCTAGCATCGCTGGACT
AAATAGAGATAGAGATACTTCCTATCATGTGGAAGCATTTTATCAATACAAAGTCAG
TGATAATATCACCATCACACCAGGCATTATCTGGCTAACATCACCAGACCACAATGA
CAATAATGATGATGTTGTTATTGGTGCGTTGAGAACCACATTTAGTTTCTAA (315 R)
(292 R)

Leyenda GCTAGC -sitio de corte para la NheI donde se inserta la metalotionena (smtA)

Secuencia de bases y aminoacdica de smtA (Gen Bank acceso X64585.1)

Met Thr Ser Thr Thr Leu Val Lys Cys Ala Cys Glu Pro Cys Leu Cys
(289 F) ATG ACC TCA ACA ACG TTG GTC AAA TGC GTC TGT GAG CCC TGT CTC TGC

Asn Val Asp Pro Ser Lys Ala Ile Asp Arg Asn Gly Leu Tyr Tyr Cys
AAC GTC GAC CCC AGC AAA GCG ATC GAT CGC AAC GGT CTG TAC TAC TGC

Ser Glu Ala Cys Ala Asp Gly His Thr Gly Gly Ser Lys Gly Cys Gly
AGC GAA GCC TGT GCC GAT GGC CAC ACC GGT GGT AGC AAA GGC TGC GGC

His Thr Gly Cys Asn Cys His Gly

CAC ACC GGC TGT AAC TGC CAC GGC TAA (313 R)
ANEXO III- Mapa circular de los vectores

EagI
ANEXO III- Mapa circular de los vectores (continuacin)