N6 medios de cultivo

INTRODUCCION

La primera noticia de la utilizacin de medios de cultivo nos llega del miclogo Brefeld, que
consigui aislar y cultivar esporas de hongos en medios slidos realizados a base de gelatina.
Sin embargo, este sistema no era adecuado para las bacterias (por su menor tamao) y no fue
hasta el ao 1878 cuando Lister populariz un mtodo enfocado al cultivo puro basado en
diluciones seriadas en un medio lquido. Koch realiz sus investigaciones utilizando en un
primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido, pero no tard en recurrir al
caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un
medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las
colonias microbianas. En el ao 1882 tiene lugar uno de los grandes avances de la
microbiologa en relacin con los medios de cultivo: el mdico alemn Walter Hesse introduce
el agar-agar (polisacrido extrado de algas rojas) como solidificante. En 1887 un ayudante de
Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces
placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se
usaban hasta entonces. Beijerinck y Winogradsky, que desde de 1888 realizaron sus
investigaciones sobre lasbacterias quimioauttrofas (utilizacin de nitrgeno y azufre, sobre
todo) tuvieron gran importancia en el desarrollo de los medios selectivos y de
enriquecimiento. Disearon este tipo de medios de tal forma que su especial composicin
qumica favoreca el crecimiento de ciertos tipos de microorganismos que, en funcin de sus
procesos metablicos, eran los nicos capaces de utilizar para su desarrollo ciertos nutrientes
del medio. En 1892 Wrtz impuls el uso de los medios diferenciales, incorporando
indicadores de pH a la composicin de ciertos medios con lo cual se poda observar la
produccin de cidos en la fermentacin en ciertos microorganismos.

OBJETIVOS

Familiarizar al participante con los trminos de medios de cultivo.

Conocer cmo preparar y diferenciar los medios de cultivo.

Conocer las tcnicas de esterilizacin de los medios de cultivo.

MARCO TERICO

Un

medio de cultivo

es una mezcla de diversos nutrientes que en concentracionesadecuadas permite el

crecimiento de microorganismos, bajo determinadas condicionesfsico-qumicas. La
composicin qumica de los medios de cultivo es variada pero, demanera general, todos ellos
contienen una fuente de energa (compuesto orgnico oinorgnico), una fuente carbonada
(algunas veces un mismo compuesto puede servir defuente de energa y fuente carbonada),
sales minerales, vitaminas y agua.

Tipos de medios de cultivo

Medio sinttico:

es un medio que contienen una composicin qumica definida cualitativamente y

cuantitativamente.
Medio mnimo:

es un medio de cultivo que contiene una cantidad mnima de nutrientes capaz de permitir el
desarrollo de microorganismos no tan altamente exigentes, desde el punto de vista nutricional

Medio complejo (completo):

es un medio de cultivo que contiene nutrientes de composicin qumica el cual permite el

crecimiento de diversos microorganismos (Agar soya tripticasa, etc.)

Medio enriquecido:

es un medio que contiene, adems, de los nutrientes bsicos de un medio de cultivo sustancias
altamente nutritivas, como son, suero, sangre, etc.(Agar sangre, etc.)

Medio selectivo:

es un medio que slo permite el crecimiento de un grupo de microorganismos e inhibe el

crecimiento de otros tipos de microorganismos (Agar eosina azul de metileno o EMB), etc.)

Medio diferencial:

es un medio que permite revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos (Agar Mac
Conkey, etc.) La mayora de las bacterias se desarrolla en un medio de cultivo bsico que
contiene agua, extracto de carne y peptona (producto soluble que resulta de la autlisis o de
una hidrlisis enzimtica de protenas de origen animal o vegetal). Este medio se denomina
medio nutritivo, y puede ser lquido (caldo nutritivo ) o slido (agar nutritivo).

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de Microorganismos es observar su

crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los
microorganismos es el Cultivo. Se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgenos
adecuados, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante. La mayora de las bacterias patgenas requieren nutrientes
complejos similares en composicin a los lquidos orgnicos del cuerpo humano. Por eso, la
base de muchos medios de cultivo es una infusin de extractos de carne y Peptona a la que se
aadirn otros ingredientes. El agar es un elemento solidificante muy empleado para la
preparacin de medios de cultivo. Se licua completamente a la temperatura del agua hirviendo
y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el
crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.

La Gelatina es otro agente solidificante, pero se emplea mucho menos ya que bastantes
bacterias provocan su licuacin. En los diferentes medios de cultivo se encuentran numerosos
materiales de enriquecimiento como hidratos de carbono, suero, sangre completa, bilis, etc.
Los hidratos de Carbono se adicionan por dos motivos fundamentales: para incrementar el
valor nutritivo del medio y para detectar reacciones de fermentacin de los microorganismos
que ayuden a identificarlos. El suero y la sangre completa se aaden para promover el
crecimiento de los microorganismos menos resistentes. Tambin se aaden colorantes que
actan como indicadores para detectar, por ejemplo, la formacin de cido o como inhibidores
del crecimiento de unas bacterias y no de otras (el Rojo Fenol se usa como indicador ya que es
rojo en pH bsico y amarillo en pH cido. La Violeta de Genciana se usa como inhibidor ya que
impide el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram-positivas).

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una

serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al
propio medio.

1- disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como

mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern
necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de
estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones
para las reacciones qumicas que tengan lugar. Todas estas sustancias se suministraban
originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin
embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los medios de cultivo
provocaba la prdida delos factores nutritivos lbiles. Actualmente, la forma ms extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los microorganismos, que no
suelen utilizar directamente las protenas naturales, tienen capacidad de atacar los
aminocidos y otros compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona. Ciertas
bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios
sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos
carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y
sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica.

Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien comoindicadores de

ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos
de ciertos microorganismos.

2- consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como

albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los
medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de
fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los
medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran
cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.

3- presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases

Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal.
Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los
microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera
sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen
mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy
reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a
cualquiera de las citadas condiciones. Los gases principales que afectan al desarrollo
microbiano son el oxgeno y el dixido de carbono. Las bacterias presentan una respuesta
amplia y variable al oxgeno libre clasificndose en cuatro grupos:

i.-Aerobias: bacterias que se desarrollan en presencia de oxgeno libre.

ii.-Anaerobias: bacterias que se desarrollan en ausencia de oxgeno libre.

iii.-Anaerobias facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como en ausencia

de oxgeno libre.

iv.-Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequeas cantidades de oxgeno libre.

Para desarrollar bacterias aerobias se incuban los medios de cultivo en agitacin constante o
introduciendo aire estril en el medio. Los anaerobios estrictos son muy sensibles al O2 por lo
que se debe evitar la exposicin de estos microorganismos al O2. Se puede obtener un
ambiente de anaerobiosis por los siguientes mtodos:

A.- Agregando al medio de cultivo un compuesto reductor, como es el tioglicolatosdico, para

disminuir el contenido de O2.B.- Quitando el O2 por procedimientos mecnicos y
reemplazndolo por N2 o CO2.C.- Mediante reacciones qumicas dentro del recipiente que
contiene el medio de cultivo inoculado para combinar el oxgeno libre con otro compuesto. Por
ejemplo: al encender una vela se transforma el oxgeno en dixido de carbono.

4- condiciones adecuadas de humedad

Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para

un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el
crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental

La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de

luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.

6- pH

La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los

microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro,
aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia
de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin
embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales.

7- Temperatura

Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y43C. Otros
como los psicrfilos crecen a 0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de
temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y los saproftos tienen rangos ms
amplios.

8- Esterilidad del medio

Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de
formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especmenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para
esterilizar los medios de cultivo es la autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como
agente esterilizante)

Clasificacin de los medios de cultivo

SIMPLES: estn formados solamente por compuestos qumicos simples de frmula qumica
bien conocida.

COMPLEJOS: estn formados por lquidos animales, jugos vegetales, extractos de carne, etc.
Tambin podemos clasificarlos en: electivos, selectivos, diferenciales y enriquecidos.

Medios electivos

En algunos casos, especialmente en el aislamiento de organismos del suelo, un medio que

satisfaga los requerimientos nutricionales mnimos de los organismos que interesan, pueden
ser ms tiles. Por ejemplo, se pueden obtener cultivos de enriquecimiento conteniendo un
gran nmero de bacterias del gnero Azotobacter, usando un medio libre de nitrgeno y que
contenga una fuente orgnica de carbono e incubando aerbicamente.

Medios selectivos

Otro importante mtodo de separacin de cultivos mixtos, es por medio del uso de un medio
selectivo. Este es un medio que ha sido modificado para incluir uno o ms agentes inhibitorios.
La eleccin de un medio selectivo debe ser apropiada para el aislamiento del organismo que
interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser colorantes, antibiticos, sales biliares y
sustancias que afecten el metabolismo enzimtico de algunas especies. Los medios selectivos
para especies Gram-, pueden incluir cristal violeta el cual inhibe el crecimiento de muchas
bacterias Gram+. La penicilina con una concentracin de 5,50 unidades/ml inhibe la mayora
de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram-

Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azidasdica, etc. que
inhiben el crecimiento de bacterias Gram-.

Medios diferenciales

Es aquel que tiene adicionado un reactivo que luego de la inoculacin e incubacin nos

permite observar diferencias entre los distintos tipos de microorganismos que se han
desarrollado.Ej.: que tenga agregado un indicador de pH que haga variar el color del medio
cuando se encuentre frente a un microorganismo.

Medios enriquecidos

Cuando se agrega una sustancia para enriquecerlo, aportando algn factor decrecimiento
necesario para el microorganismo que el medio no lo posea .Ej.: agar sangre.

Procedimiento de enriquecimiento

Cuando se necesita obtener un

cultivo
de un organismo determinado es necesaria una tcnica de enriquecimiento adecuada para esa
especie. Los mtodos se basan en cualquier caracterstica fisiolgica del organismo deseado,
por ejemplo, pH o temperatura ptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos
inhibidores. En algunos casos se puede hacer un tratamiento trmico de suspensiones de suelo
para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguidos
por un plaqueo en medio slido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de
incubacin, de manera que el organismo deseado aumente su nmero en relacin con el de
los otros organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio lquido es
inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de aislamiento, comprende la
obtencin de colonias separadas en medio slido.

COMPOSICIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Peptonas

Las caractersticas de una peptona dependen de la pureza y calidad del material proteico
empleado y del mtodo de hidrlisis. La hidrlisis cida y alcalina tienden a destruir el
contenido de vitaminas de la protena, y parte del contenido de aminocidos tambin pueden
perderse. La hidrlisis enzimtica tiende a preservar las vitaminas y a mantener intacto el
contenido de aminocidos. Por Ej., la casena pura no contiene hidratos de carbono y tiene
gran contenido de triptofano y vitaminas. Una peptona de casena preparada por hidrlisis
cida no tiene triptofano ni carbohidratos y puede usarse como ingrediente en

medios

para analizar el contenido vitamnico de sueros o de preparaciones farmacuticas. Casi todos

los extractos de levadura microbiolgicos son en realidad peptona de levadura, debindose la
digestin de las clulas de levaduras a sus propias enzimas autolticas.

Infusiones y extractos

Las infusiones y los extractos de carne y otros tejidos se usaron antes de conocrselas
peptonas, hoy se los sigue usando en menor medida.

Examen de peptonas, infusiones y extractos por su contenido microbiano

La excesiva contaminacin microbiana de peptona, infusiones y extractos u otros ingredientes

los hace poco seguros para propsitos cientficos, aunque generalmente favorecen el
crecimiento de otros microorganismos. Si se preparan estos materiales en un laboratorio
siempre deben hacerse las pruebas de contaminacin antes de usarlos. Esto se hace de la
siguiente manera:

Disolver 1gr. del material a examinar en 10,0 ml de agua purificada. Extender 0,01 ml sobre un
rea de 1 cm2 de una lmina portaobjetos de vidrio, secada al aire, y colorear por el mtodo
de Gram. Examinar 10 campos con una lente de inmersin en aceite. No debe haber ms de
50microorganismos o grupos visibles en 10 campos. Los medios pueden ser: lquidos o
agarizados.

Agentes solidificantes

El agar es un polmero de la galactosa que es esterificado con cido sulfrico y se extrae de

ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae , debe estar limpio y libre de desechos. Se
agrega a la solucin acuosa del 1,5 al 2%.El medio agarizado comienza a fundir a los 100C, si
bien se mantiene lquido hastalos 45C, en donde se comienza a solidificar.

Ventajas

Prcticamente no es atacado o asimilado por los microorganismos, hay pocosorganismos que

lo digieren.

Desventajas

No es til en medios cidos

La gelatina es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra parte numerosos
microorganismos lo digieren, se usa principalmente en microbiologa de suelos. La agarosa es
un polisacrido neutro que junto con la agaro pectina es un producto de disociacin del agar.
Se usa en pruebas de difusin inmunoelectrofortica, donde la claridad es especialmente
importante.

Otros componentes Indicadores colorimtricos

Los indicadores pueden incluirse entre los medios

. Los indicadores de pH ms usados son rojo fenol, azul bromotimol, prpura de bromocresol y
rojo neutro. Estos indicadores se usan para demostrar la produccin de cido por un hidrato
de carbono contenido en el medio. El azul de metileno y la resazurina son los indicadores de Eh
(carga inica) ms usados actualmente. Algunos lotes de pH y Eh pueden ser txicos para
algunos microorganismos y deben probarse antes de usarlos.

Agentes selectivos

Agentes selectivos que permiten el crecimiento de algunos microorganismos e inhibenel de

otros pueden incorporarse a los medios. Son muy tiles para los trabajos de identificacin. Se
han ensayados muchos agentes selectivos y algunos son muy valiosos y usados. Los colorantes
fueron probablemente los primeros agentes selectivos que se emplearon. Son ejemplos el
cristal violeta y el verde brillante, que se usan para inhibir microorganismos Gram- .

El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe el crecimiento de casi todas las bacterias,
pero es bien tolerado por los estafilococos. La azida de sodio, el citrato y el telurito de sodio, el
laurisulfato y elselenito de sodio, el iodo y el feniletanol se usan para dar selectividad. Un
medio puede hacerse selectivo ajustando la reaccin a un pH muy alto o muy bajo para
permitir el crecimiento de algunos microorganismos e inhibir el de otros. Un ejemplo bien
conocido es el uso de un pH 5,6 en medio de Sabouraud para el crecimiento de levaduras y
mohos.

Agentes reductores

Agentes reductores puede agregarse para promover la anaerobiosis. Uno o ms compuestos

como los siguientes pueden usarse: cido ascrbico, tiogilcolato de sodio,formaldehdo
sulfoxilato de sodio, cido tiomlico, hidrosulfito de sodio y cistena. Muchos medios que no
contienen agentes reductores y se usan normalmente para cultivar aerobios pueden
emplearse para cultivar microorganismos de requerimientos especiales incubndolos en
propano, hidrgeno, metano u otros gases.

Preparacin
La preparacin de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse de
acuerdo a las instrucciones. Slo debe usarse equipos y cristalera qumica limpios. El agua
debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicacin en contra. La pesada exacta de
los materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en bao
de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitacin. El calentamiento excesivo
debe evitarse. La homogeneidad tambin es esencial, especialmente para medios que
contienen agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin
espuma ni burbujas. La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o
filtracin. Casi todos los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos para volmenes de
hasta500 ml. Para volmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ms minutos
segn sea necesario. Para verificar la esterilizacin placas y tubos con el medio se deben
incubar a 20-25C 30-35C durante varios das o semanas. Los medios deben guardarse en un
refrigerador.

CUESTIONARIO

1. QUE ES UN AGAR DE DONDE SE EXTRAE

es un polmero de subunidades de galactosa; en realidad es una mezcla heterognea
de dos clases de polisacridos: agaropectina y agarosa.1 Aunque ambas clases de
polisacridos comparten el mismo esqueleto de galactosa, la agaropectina est
modificada con grupos cidos, tales como sulfato y piruvato. Los polisacridos de agar
sirven como la estructura primaria de la pared celular de las algas. Disuelto en agua
caliente y enfriado se vuelve gelatinoso. Su uso principal es como medio de cultivo en
microbiologa; tambin se usa como laxante, espesante para sopas, gelatinas
vegetales, helados y algunos postres y como agente aclarador de la cerveza.
2. QUE ES GELATINA DE DONDE SE EXTRAE
La gelatina es una mezcla de protenas fabricadas de colgeno en el tejido
conectivo animal. Cuando se mezcla con agua y se calienta, forma
un gel viscoso que sirve como un buen medio de crecimiento para las
bacterias. Aislar un tipo particular de bacterias de esta forma es difcil, sin
embargo, en parte porque las bacterias estn en todos lados y diferentes
especies pueden contaminar fcilmente el cultivo.
3. Porque se usa agua destilada en la preparacin de medios de cultivo?
La ventaja es que el agua destilada es 100% pura, y es apta para el crecimiento de las
bacterias en ella, a una temperatura adecuada, el agua destilada es la indicada para
los medios de cultivo por estas razones. para limpiar materiales de laboratorio, es la
mejor, ya que esta purificada y libre de partculas contaminantes.

BIBLIOGRAFA

https://es.scribd.com/doc/17102236/4%C2%BA-LABORATORIO-DE-MICROBIOLOGIA-I

http://microbiologia3bequipo5.blogspot.pe/2014/09/tipos-y-funciones-de-los-medios-
de.html

http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf