Biotecnologa

Inmovilizacin

Biotransformaciones

Cmo obtener una molcula orgnica de inters industrial?

1
Biotransformacin

Proceso biolgico en el cual una molcula

(natural o sinttica) es transformada en un
producto recuperable, por medio de
reacciones qumicas definidas, llevadas a
cabo por clulas o enzimas aisladas.

Biotransformacin
Cultivo de Clulas

Sntesis de Metabolito

de novo Biotransformacin
medio bsico: C,N, elementos minerales. medio bsico: C,N, elementos minerales.

Metabolismo PRECURSOR
Primario y Secundario (natural o sinttico)

Metabolito 1 paso: 1 enzima

Multipaso: > 2 Enzimas

Metabolito
nuevo o
existente

2
 Caractersticas atractivas

Alta selectividad (qumica , regio-, estereo-)

Requiere condiciones de reaccin suaves

Funciona en condiciones acuosas y mixtas (solvente-

agua)

No es necesario, en general, proteger otros grupos

funcionales

Biocatlisis e Industria

Qumica Desarrollo de rutas de produccin con

del
futuro
Menor nmero de pasos
Mayor rendimiento en cada paso
Preservacin de energa
Reduccin de los costos
Menor generacin de desechos

Biocatlisis ofrece una opcin y solucin tecnolgica

Qumica
verde

3
Procesos de biotransformacin que se han
desarrollado a escala industrial

Clases de compuestos producidos en

biotransformaciones industriales

4
Industrias en las que se emplean las
biotransformaciones

Cuales son las posibles desventajas??

Los costos para el desarrollo de

un proceso de biotransformacin
suelen ser altos
I-D Tiempo de reaccin

Concentraciones sustrato/producto bajas

Estabilidad limitada de biocatalizadores

5
 Biotransformaciones

Parmetros principales a tener en cuenta:

Productividad: g de producto l-1 h-1

Concentracin mxima de P: g de producto/l

Rendimiento: g producto/g sustrato consumido

Consumo de biocatalizador

Eficiencias de distintos procesos biocatalticos

The production of fine chemicals by biotransformations Straathof, Panke and Schmid Current Opinion in Biotechnology 2002, 13:548556

6
 Biotransformaciones en la Industria Farmacutica

The production of fine chemicals by biotransformations Straathof, Panke and Schmid Current Opinion in Biotechnology 2002, 13:548556

Biotransformaciones en la Industria Farmacutica

The production of fine chemicals by biotransformations Straathof, Panke and Schmid Current Opinion in Biotechnology 2002, 13:548556

7
Agentes de Biotransformacin
Con que se puede hacer una biotransformacin?

Clulas activas
Clulas en reposo
Microorganismos
Esporas
Clulas muertas

Suspensiones
Callos
Clulas Vegetales
Clulas inmovilizadas
Protoplastos

Enzimas aisladas
Clulas Animales

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 Agentes de Biotransformacin
Tipos de biocatalizadores usados en biotransformaciones industriales

Consideraciones para una

biotransformacin exitosa
Clulas o Enzimas ?
Clulas Enzimas
Varios pasos enzimticos Especificidad.
Cofactores Fcil Purificacin del producto.
Costos
Ausencia de contaminantes.
Simplicidad
Desventajas: Posibilidad de Reutilizacin.
formacin de otros productos Desventajas:
no deseados etapa de extraccin y
pasaje de sustrato y producto purificacin de la enzima: mayor
por membranas puede estar costo y posibilidad de
dificultado inactivacin

9
 Clulas o enzimas
Qu criterio aplicar?

1) Clulas enteras Simplicidad y menor costo

Siempre que:

-No haya limitaciones de difusin Clulas permeabilizadas

- No haya reacciones secundarias no

deseadas

Mayor especificidad
2) Enzimas
Necesidad de cofactores
Mayor costo

Reciclado de cofactores

K. Nakamura et al. / Tetrahedron: Asymmetry 14 (2003) 26592681

10
K. Nakamura et al. / Tetrahedron: Asymmetry 14 (2003) 26592681

Biotransformacin con clulas

vegetales
Clulas Vegetales:
Catalizan importantes reacciones (esterificacin,
epoxidacin, hidroxilacin, glicosilacin, hidrlisis,
metilacin, isomerizacin, oxidacin, etc).
Desventajas:
Crecen lentamenteen cultivo
Generalmente presentan bajos rendimientos.
Productos de inters farmacutico y cosmtico
principalmente.

11
Biotransformacin con clulas
vegetales
BIOCATALIZADOR PRECURSOR PRODUCTO

Capsicum frutescens Acido protocateico y Acido Vainillina y Capsaicina (aditivos

(clulas inmovilizadas) cafeico alimenticios)
Catharantus roseus Vinblastina Vincristina (antineoplsico)
(clulas inmovilizadas) Tritamina Ajmalicina (trast. circulat.)
Papaver sommiferum Codeinone Codeine
(clulas inmovilizadas)
Mucuna puriens Tirosina L-DOPA
(clulas inmovilizadas)
Rauwfolia serpentina Hidroquinona Arbutina
(clulas inmovilizadas) (cosmtica)
Brugmansia candida Antroquinona Arbutina
(races transformadas) (cosmtica)
Mentha spp. Mentona Neomentol
(clulas inmovilizadas)
Coffea arabica Teobromina Cafena
(clulas inmovilizadas)

Biotransformacin con
microorganismos
Clulas microbianas:
rpido crecimiento.
mayor adaptacin a las condiciones de cultivo.
gran cantidad de especies (variedad de actividades).
Usos
Obtencin
productos intermedios: 6- APA;
productos finales: sntesis hormonas esteroideas,
antibiticos, agentes antitumorales, resolucin de mezclas
racmicas, preparacin de cidos orgnicos.
Degradacin de compuestos orgnicos:
Fungicidas, insecticidas, pesticidas.

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 Biotransformacin con
microorganismos
Algunos esteroides producidos por
biotransformaciones

Reaccin Substrato Producto Microorganismo Industria

11-hidroxilacin Progesterona 11-Hidroxiprogesterona Rhizopus nigricans Upjhon Co.
11-hidroxilacin Compuesto S Reichtein Hidrocortisona Curvularia lunata Pfizer & Co. Gist-Brocades
16-hidroxilacin 9-Fluorocortisol Triamcinolona Streptomyces Squibb, Lederle
1-Dehidrogenacin Cortisol Prednisolona Arthrobacter simplex Schering & Corp.
1-Dehidrogenacin Dienediol Trienediol Corynebacterium Upjhon Co.
1-Dehidrogenacin,clivaje cadena lateral Progesterona Testolactona Cylindrocarpon Squibb
y expansin anillo D
Clivaje cadena lateral Sitosterol Androstadienediona Mycobacterium Searle & Co.

Produccin de hormonas esteroides por

biotransformacin con microorganismos
Granimportancia en la industria farmacutica mundial
Produccin de:
hormonas corticoadrenales (corticosterona, cortisona, hidrocortisona,
prednisolona, triamcinolona)
hormonas sexuales (estrona, estradiol, progesterona, testosterona, etc)
Principales reacciones:
11-hidroxilacin,
16-hidroxilacin,

C-1-deshidrogenacin

13
 Biotransformacin con clulas
animales
Clulas Animales y rganos perfundidos.
tiles en transformacin de compuestos orgnicos
Difcil operacin.
Alto costo de purificacin del P

Actualmente reemplazado por biotransformacin con microorganismos

Biotransformaciones con enzimas

Insuficiente permeabilidad del sustrato atreves de la membrana

Reacciones secundarias no deseadas

Preparaciones de
enzimas, libres de
clulas
Oxidoreductasas
Ligasas (reduccin y oxidacin) Transferasas
(formacin de (transferencia de
600
enlaces) grupos funcionales)

Clula con
12000 enzimas
Isomerasas Hydrolasas
(isomerizacin y 250
(clivaje con
racemizacipon) consumo de H2O)
Liasas
(formacin-clivaje de enlaces )

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Biotransformacin con enzimas aisladas

Mayor biotransformacin a
escala mundial con una
enzima inmovilizada

Biotransformacin
Cefaclor
(antibitico)
con
enzimas
aisladas

Derivado piretroide
(insecticida)

Acido neurmico
(influenza)

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Biotransformation at the pharma industry

Produccin de derivados de Penicilina G

Penicilin acilasa

Sntesis qumica de 6 APA

Solventes orgnicos
-40C
Condiciones anhidras

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Consideraciones para una
Biotransformacin exitosa
1- El sistema debe contener el biocatalizador
necesario para la transformacin del precursor a
producto.

alta concentracin de la enzima/clulas

localizacin intracelular (precursor debe pasar memb.)
considerar posibles cambios en la actividad enzimtica:
condiciones de cultivo (pH, temperatura, etc)
diferenciacin

Consideraciones para una

Biotransformacin exitosa
2- La velocidad de formacin del producto debe ser
mayor que la velocidad de metabolizacin.

Opciones
remocin del producto
seleccin de lneas con menor tasa de metabolizacin
liberacin al medio
natural
inducida (permeabilizacin, inmovilizacin)

17
Consideraciones para una
Biotransformacin exitosa
3- El cultivo debe tolerar al precursor adicionado y al
producto formado.
Precursor o producto
txico para clulas
inhibidor de enzimas
Producto txico
liberacin al medio
secuestro en vacuolas

Consideraciones para una

Biotransformacin exitosa

4- El sustrato debe ingresar a la clula y el producto

debe ser liberado al medio (preferentemente).
La mayora de las biotransformaciones son
intracelulares.

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 Biotecnologa

Inmovilizacin

Biotransformaciones

En que consiste?

Una molcula inmovilizada es aquella cuyo

movimiento a sido restringido completamente
o limitado a un espacio pequeo por unin o
interaccin de la misma con una matriz slida.

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Biocatalizadores Inmovilizados

Consiste en la localizacin de un
biocatalizador (sean enzimas o clulas) en
una regin definida del espacio, con
retencin de la actividad cataltica y/o de la
viabilidad y permitiendo su reutilizacin.
PRINCIPAL
VENTAJA!!!

Biocatalizadores Inmovilizados
Otras Ventajas
Fcil separacin del biocatalizador y producto.
Altas concentraciones de biocatalizador.
Proteccin de fuerzas de corte (clulas).
Mayor estabilidad de enzimas.
Clulas: menor probabilidad de contaminacin; fcil
separacin de clulas contaminantes.
Diferentes configuraciones del biorreactor.

20
 Biocatalizadores Inmovilizados
Desventajas
Prdida de actividad o viabilidad de enzimas y clulas.
Velocidad de difusin de sustrato y producto puede
ser limitante.
La sntesis del producto debe estar disociada del
crecimiento
Incorporacin de una nueva etapa al proceso
productivo: mayor costo y mayor complejidad.
Compensar con:
Aumento notorio de la productividad.
Mejor separacin entre producto y biocatalizador
Mayores perodos de utilizacin del biocatalizador

Consideraciones previas
Biocatalizador
Enzimas: 1 sola etapa.
Clulas: Mltiples etapas; cofactores.
IMPORTANTE! Puede ocurrir la formacin de productos no
deseados.

Mtodo de inmovilizacin
Alta retencin de actividad
Versatilidad
Resistencia a agentes fsicos, qumicos y biolgicos
Fcil escalado
Costo

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Coeficiente de eficiencia

Parmetro importante al evaluar un proceso de

inmovilizacin

Actividad biocatalizador inmovilizado

=
Actividad biocatalizador libre

Mtodos de inmovilizacin

Adsorcin a una
superficie Inclusin
Enlaces cruzados

Unin covalente a una

superficie Autoinmovilizacin Retencin por membranas

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Inmovilizacin por Adsorcin
Primer mtodo en desarrollarse. Es el ms simple.
Biocatalizador: clulas o enzimas.
Fundamento: Adsorcin del biocatalizador a un soporte.
Suspensin acuosa biocatalizador + adsorbente activo Adsorcin
Lavado
Tipos de unin: inica, puente de H, fuerzas de Van der Waals,
hidrofbica.
Soportes: orgnicos e inorgnicos. Ej.: resinas de intercambio
inico.
Ventajas: mtodo general, suave y simple. Retencin actividad y
viabilidad. Permite la recuperacin del soporte.
Desventajas: labilidad de la unin elucin (pH, temperatura,
fuerza inica). Unin inespecfica

Inmovilizacin por Enlaces

Covalentes
Biocatalizador: enzimas clulas NO
Fundamento: formacin de enlace covalente entre grupos
funcionales de la enzima y soporte. Puede requerir activacin
previa del soporte, agente enlazante.
Tipos de unin: covalente
Soportes: naturales y sintticos.
Ventajas: Alto % de inmovilizacin. Unin especfica; no hay
elucin. Amplio rango de soportes.
Desventajas: mtodo caro y complicado; difcil regeneracin del
soporte. Puede ocurrir prdida de actividad de la enzima.

23
Inmovilizacin por Enlaces
Covalentes (cont.)
Soportes:
Naturales:
celulosa
agarosa
dextrano

Sintticos:
derivados de poliacrilamida (txicos)
poliestireno,
copolmeros de anhdrido mlico.
cermicos, vidrio (previa activacin por silanizacin)

Matrices usadas para inmovilizacin por enlace

covalente
Grupo de la Grupo reactivo en
Ejemplo de Matriz Agente Acoplante
Matriz la protena
Hidroxilo Dextrano, celulosa BrCN Amino
Amino
Carboxilato Acrilamida Carbodiimidas

Amino
Amino Cermicos Glutaralaldehdo

Polmeros de Reacciona va bases

Aldehdo Amino
aldehdo de Schiff
Reacciona
Imidoesters Nylon Amino
directamente
Cermicos y Reacciona Amino, Tir-hidroxil,
Arildiazonio
polisacridos directamente His-imidazol
Polisacridos Reacciona
Tiol Cis-tiol
modificados directamente

24
 Inmovilizacin por Enlaces Cruzados
y Autoinmovilizacin
Biocatalizador: enzimas o clulas
Fundamento: generacin de partculas slidas de biocatalizador
sin la intervencin de un soporte. Interaccin directa enzima-
enzima o clula-clula.
Enlaces cruzados (ENZIMAS): entrecruzamiento con un
agente bifuncional de bajo PM: glutaraldehdo,
diazobencidina. Uniones covalentes.

Autoinmovilizacin (CLULAS): clulas que tienen la

capacidad de formar agregados macroscpicos (pellets,
flculos).
Formacin segn condiciones de cultivo.
Distintas morfologas con diferentes actividades
metablicas.

25
Inmovilizacin por Enlaces Cruzados
y Autoinmovilizacin (cont.)
Ventajas:
Enlaces cruzados: reactivos comerciales de fcil
obtencin; proceso simple.
Autoinmovilizacin: no se requiere la adicin de reactivos.

Desventajas:
Enlaces cruzados: Control estricto del proceso;
preparaciones de baja resistencia fsica. Toxicidad de
reactivos (uso limitado para clulas)
Autoinmovilizacin: disponer de clulas con capacidad de
agregacin; fragilidad de los agregados y largos tiempos
para su formacin.

Inmovilizacin por Inclusin

Biocatalizador: mucho ms empleado para clulas que

para enzimas.
Fundamento: formacin de una matriz tridimensional
en presencia del biocatalizador, quedando ste
atrapado en la estructura.
Matriz: retencin del biocatalizador; difusin de sustrato y
producto.
Biocatalizador: no interviene directamente en la formacin
de la matriz; mtodo suave.

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 Inmovilizacin por Inclusin (cont.)
Matrices de inclusin
Polmeros Sintticos: polimerizacin (poliacrilamida, PEG,
polipropilenglicol). Toxicidad.
Geles naturales:
gelificacin por cambio de temperatura (agarosa,
carragenatos).
formacin de redes inicas: gelificacin por contacto
con in divalente de carga contraria a la del polmero.
(alginato de sodio-Ca2+).
Ventajas: mtodo simple; alto % viabilidad; control
tamao de partcula y control de dureza.
Desventajas: disolucin por quelantes (fosfato, citrato);
poca resistencia a agitacin.

Cmo hacer una inmovilizacin por inclusin?

Encapsulador

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 Clulas animales entrampadas en perlas de
alginato

Inmovilizacin por Retencin en

Membranas
Biocatalizador: enzimas o clulas
Fundamento: retencin del biocatalizador en un espacio limitado por
una membrana semipermeable.
Ventajas: permite mantener biocatalizador en susp. lquida pero
separado del medio externo de reaccin.
Mtodos:
Microencapsulacin: partculas esfricas que se preparan en presencia
del biocatalizador que queda incluido en suspensin.
Sistemas con membranas preformadas: membranas fabricadas con
anterioridad a la introduccin del biocatalizador.

28
Inmovilizacin por Retencin en
Membranas (cont.)
Microencapsulacin: tcnica compleja
a partir de una emulsin:
emulsin o/w + polimerizacin en la interfase.
Ej: microcpsulas esfricas de nylon.
a partir partculas slidas:
partculas slidas + polimerizacin en la superficie + disolucin de
la partcula slida.
Ej.: cpsulas de alginato.
Importante: encontrar las condiciones ptimas para
obtener partculas regulares y resistentes.
Membranas preformadas (para clulas):
sistema de fibras huecas: sistema ms usado.

Biorreactor de membrana

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 Bioreactores para clulas inmovilizadas

Agitacin mecnica Lecho empaquetado Lecho fluidizado

Comparacin entre distintos mtodos

de inmovilizacin
Caracterstica Adsorcin Enlace covalente Enlaces cruzados Inclusin

Preparacin Fcil Difcil Difcil Moderada

Actividad Alta Alta Moderada Alta

Especificidad de
No alterable Alterable Alterable No alterable
sustrato
Fuerza de
Dbil-moderada Fuerte Fuerte
enlace

Regeneracin Posible Imposible Imposible Imposible

Aplicabilidad
Moderada Moderada Baja Alta
general

Costo Bajo Alto Moderada Bajo

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