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1 Ano 2 Semestre
Membrana biolgica
Funciona como barreira para prevenir que o contedo da clula escape ou se misture com o meio
circundante.
Quando a clula cresce ou muda de forma, a membrana acompanha.
Se a membrana for perfurada, rapidamente reparada.
As bactrias mais simples tm uma nica membrana membrana plasmtica.
Os eucariotas contm vrias membranas internas que envolvem compartimentos intracelulares e
funcionam como barreiras entre espaos contendo coleces distintas de macromolculas (membrana
plasmtica, mitocndria, vescula, RE, ncleo, peroxisoma, lisossoma, aparelho de Golgi)
As membranas de cada organelo permitem dot-lo de caractersticas distintas.
A sntese de nova membrana d-se no retculo endoplasmtico.
Constituio
Lpidos
o Dupla camada lipdica constituda por fosfolpidos, molculas anfipticas, com cabea
hidroflica e cauda hidrofbica.
o Esterides como o colesterol fornecem fluidez membrana.
o Fornecem impermeabilidade membrana, bem como fluidez.
o No caso de rompimento de membrana, os lpidos actuam de modo a reparar a mesma.
Protenas
o Desempenham mais funes que o transporte de nutrientes, metabolitos ou ies.
o Algumas ancoram a membrana a macromolculas de ambos os lados.
o Algumas funcionam como receptores que detectam sinais qumicos no meio ambiente da
clula e transmitem ao interior.
o Actuam como coenzimas que catalizam reaces qumicas.
o H 2 modos como se podem associar membrana celular:
Intrnsecas (transmembranar) tm regies hidrofbicas e hidroflicas.
As hidroflicas so expostas ao meio aquoso em ambos os lados da membrana.
Em gua agregam-se pela zona hidrofbica.
No se tornam solveis. Tm de se usar detergentes.
Perifricas Localizadas fora da bicamada ligadas ou a lpidos ou a outras protenas de
membrana.
Solveis em gua
Podem ser libertadas da membrana e deixam a bicamada lipdica intacta.
Acares
o Sempre na camada externa da membrana.
o A maioria das protenas tem cadeias curtas de acares denominados oligossacardeos
(glicoprotenas).
o Outras protenas das membranas tm uma ou mais cadeias longas de polissacardeos ligadas
a elas proteoglicans.
o No lado no-citoslico formam uma cobertura de acar chamada glicoclice.
Ajuda a proteger a superfcie celular de leses mecnicas e qumicas.
Os oligossacardoes e os polissacardeos no glicoclice absorvem gua e conferem
clula uma superfcie lisa, auxiliando clulas mveis como os leuccitos a abrir caminho
e impedindo as clulas sanguneas de se juntaram umas s outras ou s paredes dos
vasos sanguneos.
o Tm um papel importante no reconhecimento clula clula e na adeso.
o Algumas protenas como as lectinas so especializadas em reconhecer cadeias laterais
particulares de oligossacardeos e ligar-se a elas.
o Os oligossacridos esto ainda envolvidos na resposta inflamatria.
o Permevel a:
Pequenas molculas hidrofbicas
Pequenas molculas polares no carregadas
o Ligeiramente permevel a:
gua
Ureia
o Impermevel a:
Ies
Grandes molculas polares
Protenas de Transporte
Mecanismos de Transporte
Difuso Simples
Difuso Facilitada
Existem 4 tipos:
o P
o V
o F
o ABC
Protenas P
Protenas V
Protenas F
Protenas ABC
Modelo operacional da ATPase Ca2+ das membranas do retculo sarcoplsmico de clulas do msculo
estriado
Bomba P tem uma subunidade para ligao de ATP, aspartato e domnio actuador.
O clcio extracelular entra e o ATP liga-se.
D-se a fosforilao do grupo aspartato e sada de ADP.
Mudana conformacional.
Libertao de clcio no citosol.
Desfosforilao.
Nova mudana conformacional para a conformao inicial.
ATPase H+ da classe V
A parte hidrofbica da molcula substrato vai-se ligar face citoslica da membrana plasmtica, com a
ponta carregada mantendo-se no citosol.
O substrato difunde lateralmente at encontrar o stio de ligao na protena MDR1 na bicamada.
A protena flipa o substrato carregado para a face exoplasmtica, uma reaco desfavorvel com
gasto de ATP que provm do domnio citoslico.
J na face exoplasmtica, o substrato pode difundir lateralmente na membrana e move-se para a fase
aquosa do exterior da clula.
Canais inicos abertos (K+) e criam um potencial de membrana (que aparece porque as protenas
deixam passar ies de forma diferente, porque a membrana permevel)
o Uma membrana impermevel a solutos, no os deixa passar e portanto no registado
qualquer potencial de membrana.
o Numa membrana permevel somente ao sdio, cria-se um potencial de membrana j que fica
mais carga positiva num lado e menos dentro da clula. Potencial negativo.
Calculado pela equao de Nernst
o Numa membrana permevel ao potssio, cria-se tambm potencial de membrana, j que fica
mais carga negativa de um lado. Potencial positivo.
Movimento selectivo de ies gera potencial de membrana.
O potencial elctrico das membranas depende dos canais de potssio abertos.
Canais inicos tm filtros selectivos formados por domnios transmembranares conservados, hlices
e segmentos P.
Todos os canais inicos so tetrmeros.
H interaces mais directas com o canal de K+ do que com o de Na+, porque o io de Na+ mais
pequeno.
medida que os ies de K+ e Na+ passam pelo canal inico perdem as suas molculas de gua. Os
ies K+ conseguem relacionar-se perfeitamente com os oxignios, mas os de Na+ no porque so
demasiado pequenos.
Mostra os ies K+ a passar pelo canal inico. Dentro deste, cada io K+ interage com oito oxignios
A entrada de Na+ em clulas de um mamfero tem G negativo.
As duas foras que influenciam o movimento dos ies K+, Cl- e Na+ atravs de uma membrana so:
o Potencial elctrico da membrana
o Gradiente de concentrao inica.
Co-transporte
Clulas musculares
Eritrcito
Vacolos
Movimento de gua
Presso osmtica
o A gua passa do meio mais concentrado para o meio menos concentrado.
Apesar de serem molculas polarizadas, tambm podem passar pela zona lipdica da membrana por
difuso simples.
As protenas de transporte so importantes para acumulao de metabolitos e ies nos vacolos.
o Vacolos tm pH devido bomba de H+ que sai, com entrada de Na+, Ca2+ e sacarose.
Aquaporina
Quando temos um epitlio (em monocamada, pousado numa lmina basal h transporte a nvel das
membranas pelas tight-junctions, junes aderentes, GAP junctions e desmossomas.
Junes aderentes Actina e miosina capacidade de contraco
Desmossomas dispersos por vrias zonas da membrana.
Barreira passagem por entre as clulas do ponto de vista estrutural morfologia em rede.
Existem vrios tipos de epitlio, entre eles simples (cbico, cilndrico, simples) ou estratificado
(queratinizado ou no) e de transio.
o Tem superfcie apical e baso-lateral, apoiadas numa lmina basal e num tecido conector.
A superfcie basal est apoiada na lmina basal enquanto que a superfcie apical pode ter
microvilosidades que projectam o lmen intestinal. Logo abaixo das microvilosidades existem tight
junctions que evitam a difuso de substncias entre o lmen intestinal e o sangue. As Gap junctions
permitem movimentos de pequenas molculas e ies entre os citosis de clulas adjacentes. Os
restantes trs tipos (aderentes, desmossomas e hemidesmossomas) so crticas para a adeso
celular e sinalizao
Especializaes membranares
Tight Junction
Evitam a difuso de macromolculas e de pequenas molculas solveis em gua e ies pelo epitlio e
pelos espaos entre as clulas.
Mantm a polaridade das clulas epiteliais prevenindo a difuso de protenas de membrana e
glicolpidos entre a membrana apical e a basolateral assegurando que estas regies contm
componentes diferentes na membrana.
As duas principais protenas encontradas nas tight junctions so a ocludina e a claudina.
Nas preparaes por criofractura, as tight junctions aparecem como uma rede que liga as clulas.
As duas principais protenas integrais das tight junctions so as ocludinas e as claudinas. Mais
recentemente foram descobertas as JAM que contribuem para a adeso hemoflica.
Estas molculas pertencem a famlia das IgCAMS.
O tratamento do epitlio com protease tripsina destri estas tight junctions.
Diferenas de permeabilidade das tight junctions podem controlar a passagem de pequenas molculas
atravs do epitlio.
o Hipomagnesiemia familiar mutaes no gene que codifica a protena claudina 14, alterando o
fluxo paracelular normal de Mg atravs das tight junctions do rim. Resulta numa concentrao
muito baixa de Mg no sangue, que pode provocar convulses.
GAP junction
Desmossomas
Clulas do estmago
Tipos de tecido
Tecido Epitelial
Tecido Conjuntivo
Tecido muscular
Tecido nervoso
Sangue
o O custo de manter tecidos e rgos grande mas confere uma vantagem adaptativa s
variaes de ambientes.
H um espao fora das clulas que importante, definido pela presena de protenas da membrana
que mantm o espao entre as clulas (matriz celular).
o Protenas CAM transmitem informao transduo de sinal.
Interaces homoflicas
Caderinas
Ig (NCAMs)
Interaces heteroflicas
Integrinas
Selectinas
o Os domnios citoslicos das CAMs recrutam protenas adaptadoras multifuncionais. Estas
protenas adaptadoras interagem, directa ou indirectamente, com o citoesqueleto (forma) ou via
de sinalizao (funo).
As molculas de adeso celular ligam-se entre si e a protenas intracelulares.
A formao de adeses entra as clulas d-se por constante aproximao das protenas que se vo
unir tipo zipper.
Matriz extracelular
o Proteoglicanos
Grande parte da molcula so glcidos
o Colagnio
Est fora da membrana no est directamente ligado membrana
H diferentes tipos de colagnio onde predominam a glicina e a prolina.
Tecido conjuntivo dos tendes. Cartilagens, ossos
Substituies de glicina doenas letais osteogenesis imperfecta e sndrome de
Ehlers-Dantos.
No colagnio existem molculas que controlam a diferenciao e morfognese.
o Protenas multiadesivas (fibronectina)
A associao entre as clulas e o proteoglicano da matriz extracelular mediada por uma integrina e
por uma fibronectina
Funes da matriz extracelular
o Adeso indirecta entre as clulas atravs das ligaes, receptores membranares e protenas
da matriz.
o Suporte mecnico dos tecidos
Fora nos tendes, dentes e ossos
Acolchoamento nas cartilagens
Adeso na maior parte dos tecidos
o Indicadora para a clula sobre a sua localizao e qual a funo que deve desempenhar.
o Reservatrio de muitas molculas sinalizadoras extracelulares, que controlam a diferenciao
e morfognese.
Todos os mRNAs codificados no ncleo so traduzidos nos ribossomas citoslicos e podem seguir
duas vias distintas:
o Caso tenham uma sequncia sinal para o RE seguir a via secretora. Aps o final da traduo
no RE as protenas movem-se atravs de vesculas de transporte para o complexo de Golgi.
No fim, so transportadas ou para a membrana plasmtica ou para os lisossomas.
o Caso no tenham uma sequncia sinal para o RE seguem uma via no secretria, a sntese de
protenas completada nos ribossomas livres e as protenas so libertadas no citosol. As que
tm uma sequncia de direccionamento so, depois de libertadas no citosol, importadas para
dentro das mitocndrias, dos cloroplastos, dos peroxisomas ou do ncleo.
As protenas mitocndriais e dos cloroplastos passam normalmente as membranas
interna e externa para entrar na matriz ou no espao do estroma.
As protenas externas so distribudas para outros subcompartimentos desses
organelos em outras etapas de distribuio.
As protenas nucleares entram atravs dos poros nucleares.
Se houver um engano e a protena for para um lugar incorrecto na clula, a protena vai ser degradada
com custo energtico.
Ribossomas livres e ligados no tm diferenas estruturais.
As clulas humanas tm 10000 protenas diferentes.
Vias de secreo
Experincia
o Ribossomas livres
o Ribossomas ligados
So separados por fraccionamento celular, que permite separar organitos.
o Ruptura da membrana suspenso
o Centrifugao em gradiente de densidade
o Pellet tem ribossomas livres
o Suspenso tem ribossomas ligados (banda a meio)
Tm densidades diferentes porque os ribossomas ligados a membranas esto com lpidos.
Ribossomas das mitocndrias
o Sintetizam todas as protenas de DNA mitocondrial
Ribossomas dos cloroplastos
o Sintetizam todas as protenas de DNA do cloroplasto.
Ribossomas livres ou citoslicos
o Protenas do citoesqueleto
o Protenas ligadas s membranas por lpidos ou outros
o Protenas do cloroplasto e mitocndria mas de DNA nuclear.
o Protenas do peroxissoma
o Protenas nucleares
Ribossomas ligados s membranas
o Protenas intrnsecas das membranas
o Protenas de secreo
o Protenas do lisossoma
o Protenas do RER
o Enzimas do complexo de Golgi
As protenas entram para dentro do RER por sinal, a sequncia sinal permite a entrada de protenas,
mas isso no chega.
Cauda hidrfoba na extremidade N-terminal.
Experincias in vitro mostram que preciso adicionar mRNA e microssomas dentro do tubo do ensaio
tudo ao mesmo tempo para que a entrada seja feita ao mesmo tempo que ocorre a traduo.
Tm de ser produzidos mais aminocidos para que os primeiros saiam do ribossoma e sejam
detectados pela partcula reconhecedora de sinal
Protenas G activadas unidas a GTP. Protenas G inactivadas unidas a GDP.
A translocao iniciada por duas protenas G e co-traducional.
o Uma vez que a sequncia sinal emerge do ribossoma, h uma partcula reconhecedora de
sinal (SRP) que se liga ao sinal.
o A SRP vai ligar o ribossoma com o polipptido nascente ao receptor SRP na membrana do
retculo. A interaco feita com a ligao do GTP tanto ao SRP como ao receptor.
o A transferncia do complexo polipptido nascente/ribossoma leva abertura do canal de
translocao e insero da sequncia sinal no poro central. Tanto o SRP como o receptor de
SRP, depois de dissociados do translocador hidrolisam o GTP em GDP + Pi e esto prontos
para iniciar a insero de outra cadeia polipeptdica.
o Enquanto a cadeia polipptidica sofre elongao, passa pelo canal do translocador para dentro
do RE onde a sequncia sinal depois clivada por uma protease e este rapidamente
degradado.
o O polipptido continua a crescer para dentro do RE
o Assim que a traduo esteja completa, o ribossoma libertado, a protena libertada para
dentro do lmen do RE e o transloco fecha. A protena adquire a sua conformao nativa.
A SRP constituda por seis polipptidos ligados a uma cadeia de RNA
o P54 Liga o sinal ao RE
o P19
o P68/P72 Necessria para a translocao da protena
o P9/P14 Interage com os ribossomas
A SRP vai inibir a traduo na ausncia de receptor para a SRP
Experincias de traduo in vitro
o Os ribossomas livres produzem sequncias sinal, mas s in vitro.
Translocao
por onde passam protenas, porque h interaco entre os aminocidos da protena que entra com
os aminocidos do transloco.
Protenas BIP mantm a protena desenrolada. A ligao faz-se por zonas hidrfobas, que vo ficar
no interior.
o da famlia das chaperons.
o Associam-se a outras protenas e enrolam ou desenrolam-nas, de modo a ficarem funcionais.
o Tambm puxa a protena, ao nvel do transloco.
o A protena BIP mantm a protena desenrolada e permite que outras protenas se liguem a
elas.
o A levedura fcil de comparar com as protenas humanas porque h muitas semelhanas.
A Sec61 um componente do transloco que contacta com as protenas nascentes enquanto elas
passam pelo transloco. Fornece um codo de terminao da cadeia para que possa ser libertada do
ribossoma.
Na transcrio ps-traducional, a hidrlise de ATP muito importante
o O mecanismo comum na levedura
o A protena BIP ligada ao ADP liga-se ao polipptido nascente, medida que este vai saindo do
transloco impedindo que a cadeia adquira a conformao nativa antes de estar completa.
No retculo, as protenas sofrem modificaes que so importantes para que fiquem funcionais.
Sofrem
o Clivagem da sequncia sinal
o Glicosilao
Adio de um acar protena nascente no RER.
O acar tem uma regio conservada e outra varivel.
A glicosilao pode ser de tipo N (aminocido asparagina) ou tipo O (com
menos acares)
Os acares que se vo ligar a aminocidos esto no citosol associados a
nucletidos (tm fosfato, os nuclesidos que no)
Biossntese de precursores de oligossacridos tipo N
Dolichol fosfato um lpido que se encontra na membrana do RER. Duas
GlcNAc e cinco resduos de manose so adicionados, uma de cada vez, ao
dolichol fosfato na face citoslica do RER
Tunicamicina bloqueia a primeira enzima desta etapa.
Quando h cinco manoses, o lpido inverte e vai para o lmen da membrana
(flip-flop atravs de flipases)
Adio e processamento dos oligossacridos tipo N no RER
Depois do precursor estar formado, transferido para um resduo de asparagina
numa protena nascente.
Em reaces sequenciais os resduos de glucose e depois um de manose so
removidos.
Pode-se dar novamente a ligao de um resduo de glucose de forma a enrolar
correctamente algumas protenas.
A enzima oligossacaride protein transferase liga a asparagina da protena
nascente ao resduo oligossacrido.
Adio Sequencial de Acares
Ramificao ainda maior, quando os acares so adicionados a outros
acares.
o Formao de ligaes persulfuretos (S S)
Enxofre.
Glutationa formao de ligao persulfureto est no estado oxidado, vai interagir
com a protena que est no estado reduzido.
S na metionina e na cistena.
No RER h uma enzima PDI (que pode variar entre o estado reduzido e o estado
oxidado)
medida que a protena entra, as cistenas vo-se unindo. necessria a aco de
uma isomerase que vai refazer a protena de acordo com a sua estrutura
Ligaes S so ligaes covalentes, que estabilizam as estruturas tercirias.
A Ero1 vai transformar a PDI reduzida a oxidada.
Aplicao bioctecnolgica
Criao de um meio favorvel. Produzir a protena em clulas eucariotas.
Produo de:
o Activador de plasminognio anticoagulante
o Eritropoietina hormona que estimula a produo de clulas do sangue
o Aquisio de estrutura quaternria
A BIP liga-se protena impedindo um mau arranjo da mesma. Liberta-se por hidrlise
de ATP.
H protenas no retculo que facilitam a aquisio de estrutura quaternria
Chaperoninas como a BIP
PDI
Lecinas (Calreticulina, Calnexina)
Resposta presena de protenas desenroladoras
Ire1, uma protena transmembranar do retculo tem um local de ligao para a
BIP no domnio luminal e tem uma endonuclease na parte citoslica.
Protenas desenroladas acumulam-se na parte luminal ligadas a BIP libertando-
as da Ire1, activando a parte endonuclease.
O mRNA com o factor de transcrio Hac1 clivado pela Ire1 e os dois exes
so unidos para formar Hac1 funcional
Hac1 transcrita para protena que vai depois para o ncleo activar a
transcrio de genes.
Enfisema problemas respiratrios
o Doena resulta do mau enrolamento das protenas
o Mutao no gene 1-antitripsina
o Deixa de haver inibio das proteases, tripsina e elastase, que destroem
o tecido pulmonar.
Secretria
o A sntese de protenas em ribossomas ligados e transporte co-traducional de protenas pela
membrana do RE
o Algumas protenas ficam na membrana do RE, outras seguem a via de secreo.
o As que seguem a via so incorporadas em vesculas que se vo fundir com a cisterna cis do
Golgi.
o As que so para ficar no retculo voltam para trs atravs de transporte retrgrado por
vesculas.
o Cada vescula cis, com o seu contedo em protenas move-se fisicamente de uma zona cis
para uma zona mdia e depois trans por um processo no vesicular chamado maturao de
cisternas.
o As vesculas de transporte retrgrado movem protenas residentes do Golgi para a cisterna
correcta
o Em todas as clulas, determinadas protenas solveis movem-se para a superfcie da clula
em vesculas de transporte e so secretadas continuamente.
o Em certos tipos de clulas, algumas protenas solveis so armazenadas em vesculas e
libertadas aps a clula receber um determinado estmulo.
o As protenas para a membrana do lisossoma movem-se primeiro para o endossoma e depois
para o lisossoma.
A via endoctica
o Protenas extracelulares e de membrana so captadas em vesculas que se formam da
membrana plasmtica e podem-se mover para o lisossoma atravs do endossoma.
Fentipos dos mutantes sec das leveduras que identificam as fases da via secretora
Glicosilaes
o Aps a remoo de trs resduos de manose no cis-Golgi, a protena move-se por maturao
de cisterna para a medial-Golgi.
o Na medial-Golgi os resduos de N-acetilglucosamina (GlcNAc) so adicionados
o O processamento fica completo nas trans-Golgi pela adio de trs resduos de galactose e
finalmente pela adio de cido N-acetilneuraminico a cada resduo de galactose.
A uridina difosfato perde o acar para a protena, actua uma fosfatase e depois uma protena anti-
porte.
As protenas so glicosiladas, entram para o Golgi e so fosforiladas
No aparelho de Golgi
o onde as protenas sofrem marcao e vo fazer com que se encaminhem para o lisossoma.
Transporte mediado por vesculas no domnio trans-Golgi
o As vesculas com COP I medeiam o transporte retrgrado para o trans-Golgi.
o Protenas que funcionam no lmen ou na membrana do lisossoma so transportadas do trans-
Golgi via vescula com clatrina.
o Aps perderem a franja, estas vesculas fundem-se com os endossomas tardios que vo deitar
o seu contedo nos lisossomas. A franja nas vesculas com clatrina contm protenas
adicionais como os complexos AP.
o Algumas vesculas do trans-Golgi que contm cargo so directamente enviadas para o
lisossoma. Estas vesculas contm uma franja com complexos AP. No se sabe se contm
clatrina.
o As vesculas que transportam elementos constitutivos e para o exterior ainda no esto
caracterizadas.
Envolvimento dos trs principais tipos de protenas de revestimento no trfego vesicular nas vias
secretora e endoctica
o Aps a formao de vesculas a partir da membrana dadora, as capas so despolimerizadas
nas suas subunidades que so reutilizadas formando outras vesculas de transporte.
o As vesculas de COP II promovem o transporte anterrgrado do RE para o cis-Golgi. As
vesculas COP I promovem o transporte retrgrado do cis-Golgi de volta para o retculo.
o As protenas de revestimento que envolvem as protenas secretoras ainda no foram
caracterizadas.
o As vesculas revestidas com clatrina saem da rede trans-Golgi da membrana e aps a remoo
do revestimento, fundem-se com os endossomas tardios.
o As protenas secretoras movem-se do cis para o trans sem recorrer a vesculas, por maturao
das cisternas.
Estrutura das capas de clatrina
o Clatrinas
Uma molcula de clatrina, chamada trikelion, composta por 3 cadeias pesadas e 3
cadeias leves.
Apresenta uma curvatura intrnseca devido s cadeias pesadas.
O revestimento fibroso da clatrina em volta da vescula constitudo por 36 trikelions.
Os complexos AP2 tambm ajudam na formao da rede.
Formam uma estrutura em rede que d rigidez
Ao microscpio electrnico de varrimento so visveis os hexgonos de clatrina.
As vesculas perdem as clatrinas atravs da interveno de protenas chaperons.
o A dinamina essencial para a separao de vesculas
A hidrlise de GTP mediada pela dinamina vai libertar a vescula.
Endocitose
As protenas fibrosas ajudam na localizao de vesculas sinpticas na zona activa das terminaes
do axnio.
As vesculas em direco ao centro esto em recarregamento com NT.
Libertao dos NT e reciclagem das vesculas sinpticas
o As vesculas sinpticas carregadas com o NT movem-se para a zona activa e fixam-se em
stios definidos da membrana plasmtica da clula pr-sinptica.
o A sinaptotagmina impede a fuso da membrana e a libertao do NT.
o A toxina botulnica impede a exocitose pela clivagem proteoltica de VAMP, a protena v-
SNARE presente nas vesculas
o Em resposta a um estmulo nervoso (PA) os canais de clcio voltagem-dependentes abrem
permitindo o influxo de clcio do meio extracelular.
o A alterao conformacional da sinaptotagmina induzida pelo clcio provoca a fuso das
vesculas ancoradas na membrana plasmtica e a libertao de NT na fenda sinptica.
o Aps a formao de vesculas claritrina/AP contendo v-SNARE, NT e protenas
transportadoras e depois do seu desprendimento num processo mediado por dinamina, as
vesculas perdem o revestimento.
o As mutaes na dinamina bloqueiam a reformulao destas vesculas sinpticas causando
paralisia.
o As vesculas sem revestimento importam NT do citosol produzindo vesculas sinpticas
totalmente reconstitudas completando o ciclo.
Endocitose
o H invaginao porque puxada pela clatrina.
Fagocitose
o O destino tambm vai ser o lisossoma
o Aqui a membrana emite prolongamentos pseudpedes
A entrada especfica porque a membrana tem receptores aos quais se ligam. A entrada de vrus
especfica
Mitocndria
As protenas precursoras sintetizadas nos ribossomas citoslicos so mantidas num estado no-
dobrado pelas chaperoninas como a Hsc70.
Depois de uma protena se ligar ao receptor de importao prximo do local de contacto com a
membrana interna, transferida para dentro do poro principal de importao.
A protena atravessa ento esse canal e um canal adjacente na membrana interna.
O transporte ocorre em locais de contacto raros, onde as membranas interna e externa parecem que
tocam.
A ligao da protena transportada pela chaperonina Hsc70 da matriz e a hidrlise de ATP ajudam a
direccionar a importao para dentro da matriz.
Uma vez que a sequncia sinal seja removida pela protease da matriz e a Hsc70 seja libertada, a
protena dobra-se na sua conformao madura e torna-se activa dentro da matriz.
Experincias
Ao adicionarmos uma qualquer sequncia aps a sequncia sinal, ela vai tambm entrar para a
mitocndria em conjunto com a protena.
O metotrexato inibe a passagem pois dobra a protena. Se a sequncia espaadora comprida o
suficiente para se estender atravs dos canais de transporte, um intermedirio estvel de
translocao, com a sequncia sinal clivada, gerado na presena de metotrexato.
A extremidade C-terminal do intermedirio de translocao pode ser detectada incubando a
mitocndria com anticorpos que se ligam ao segmento da protena seguido por partculas de ouro.
A protena precursora liga-se a chaperoninas no citosol com gasto de ATP que a mantm desenrolada.
Passa pelo canal ISP42 e ao sair na matriz vai-se ligar a chaperoninas da matriz que a mantm
desenrolada.
Estas vo prevenir que a protena se ligue prematuramente de forma errnea.
H depois chaperoninas que vo ajudar no enrolamento como as Hsp60 e no fim clivada a
sequncia sinal.
As protenas podem ter sequenciais sinais para a matriz, membrana interna e membrana externa.
H 3 vias para transportar as protenas do citosol para a membrana interna.
As protenas com diferentes sequncias sinal so encaminhadas para a membrana interna por vias
diferentes. Nas 3 vias, as protenas cruzam a membrana externa pelo poro Tom40.
o A protena contm uma sequncia stop na sua sequncia. A via A contm uma sequncia sinal
para a matriz na extremidade N-terminal que reconhecida pelo receptor de importao
Tom20/22 na membrana externa. Passa atravs do canal Tom40, vai para o espao
intermembranar e directamente para o Tim23/17 na membrana interna. Pela aco do Tim44
deslocada lateralmente e fica a.
o A protena da via B tem duas sequncias reconhecidas pela Oxa1. Passa atravs do Tom40 e
vai directamente para Tim23/17 ligando-se Chaperonina Hsc70. Sai da membrana e depois
de clivada a sequncia sinal reconhecida pela Oxa1 fixa-se membrana.
o A protena da via C tem vrias sequncias reconhecidas pelo Tom70 e pelo complexo Tim22. O
Tom70 vai reconhecer e permitir a passagem pelo canal Tom40. A Tim9/10 vai impedir o
enrolamento e lev-la at ao complexo Tim22 que est associada Tim54. A Tim54 vai
deslocar a protena lateralmente na membrana, ficando a ancorada.
H 2 vias para transportar as protenas do citosol para o espao intermembranar mitocondrial
o Na via A, a principal via para o espao intermembranar, a sequncia reconhecida pelo
complexo Tom20/Tom22 que vai permitir a entrada no canal Tom40. Passa depois pelo canal
Tim23/17, a sequncia sinal reconhecida por uma protease e a Tim44 desloca a protena na
membrana. depois clivada e libertada, dobrando-se e ligando-se ao co-factor heme dentro do
espao intermembranar.
o Na via B, feito o encaminhamento directo para o espao intermembranar atravs do canal
Tom40.
Sntese da histidina
o sintetizado o mRNA 1, aco da tRNA sintetase citoslica da histidina
o sintetizado o mRNA 2, aco da tRNA sintetase mitocondrial da histidina
o Como a que a clula decide para onde a protena vai?
No gene j h esta indicao.
ao nvel da transcrio que fica definido para onde a protena vai.
Para ir para a mitocndria tem de ter um sinal especfico que depois removido.
Cloroplasto
Desenvolvimento do cloroplasto
o Comea como um pr-plastdeo com membrana interna e externa
o Com o estmulo da luz, a membrana interna comea a formar vesculas
o Depois forma tilacides.
o Agrupados, formam grana.
o volta dos grana est o estroma.
Um etioplasto um cloroplasto que ainda no sofreu exposio solar.
o mais pequeno que um cloroplasto.
o Ainda no tem tilacides nem grana definidos.
o A luz ainda no desencadeou a formao de vesculas.
Um proplastdeo pode dar origem a
o Cloroplasto convertem a luz solar a glucose. Utilizam a clorofila e outros pigmentos para
produzir glucose. O ATP formado na fase clara e gasto na fase escura.
A fotossntese s ocorre nos cloroplastos porque tm os pigmentos e enzimas
necessrias ao Ciclo de Calvin.
o Etioplasto
o Amiloplasto armazenam amido
o Elaioplasto armazenam lpidos
o Cromoplasto cores, principalmente nas flores
Funcionamento no cloroplasto
o A luz entra, O NADP+ passa a NADH, o H2O a O2 e entra um H+ para dentro da membrana do
tilacide.
o O complexo F0F1 faz sair um H+ com gasto de ATP.
A sequncia sinal dos cloroplastos est no N-terminal e removida.
DNA no cloroplasto
o Molcula circular
o Codifica rRNA, tRNA e algumas protenas envolvidas no transporte de electres fotossintticos
e sntese de ATP.
o As evidncias mostram que houve troca de genes entre o cloroplasto e o ncleo.
Duas vias para transportar as protenas do citosol para o lmen do tilacide
o Os precursores no dobrados so encaminhados para o estroma atravs das mesmas
protenas da membrana externa que importam as protenas localizadas no estroma.
o A hidrlise da sequncia sinal para o estroma na extremidade N-terminal por proteases
revelam a sequncia de direccionamento para os tilacides. Surgem duas vias
A plastocianina e outras protenas similares so mantidas no dobradas no espao do
estroma por um grupo de chaperoninas e encaminhadas pela sequncia sinal para os
tilacides ligadas s protenas que esto relacionadas SRP bacteriana, ao receptor da
SRP e ao transloco SecY, os quais medeiam o movimento para o lmen. Depois da
sequncia sinal ser removida, no lmen do tilacide por uma endoprotease, a protena
dobra-se na sua conformao madura.
Na via dependente de pH, as protenas ligam-se aos metais e dobram-se no estroma e
os co-factores redox complexos so adicionados. So necessrios dois resduos de
arginina na extremidade N-terminal da sequncia sinal para os tilacides e um
gradiente de pH atravs da membrana interna para a translocao da protena dobrada
para o lmen do tilacide. O transloco da membrana tilacide composto, no mnimo,
por 4 protenas relacionadas com as potenas da membrana interna bacteriana.
Peroxissoma
Degradam lpidos complexos (com caudas hidrfobas muito grandes) por oxidao, enquanto nos
lisossomas por hidrlise.
Na mitocndria, os electres so captados por NAD e FAD, que depois vo ser usados na cadeia
respiratria. O H2O2 tem de ser convertido em O2 e H2O pela catalase, que existe nos peroxissomas
em grande quantidade.
Oxidaao de cidos gordos na mitocndria e no peroxissoma
o Em ambas as oxidaes, quatro reaces idnticas ocorrem que convertem o acetil-CoA e um
acil-CoA gordo de cadeia curta.
o Uma molcula de NAD+ reduzida a NADH e uma de FAD a FADH2
o O ciclo repetido com acil-CoA at que os cidos gordos com um nmero par de tomos de
carbono so completamente convertidos a acetil-CoA.
o Nas mitocndrias, os electres do FADH2 e do NADH entram na cadeia respiratria e no final
so utilizados para produzir ATP. O acetil-CoA gerado reduzido no ciclo de Krebs resultando
na sntese de mais ATP.
o Como os peroxissomas no possuem os complexos de transporte de electres da cadeia
respiratria e as enzimas do ciclo de Krebs, a oxidao dos cidos gordos no produz ATP.
A sequncia sinal para o peroxissoma , na maior parte das vezes, C-terminal e no clivada.
Importao de protenas da matriz peroxissomal direccionada pela sequncia de direccionamento
PTS1
o A catalase e a maioria das protenas da matriz do peroxissoma contm uma sequncia sinal
PTS1 que se liga ao receptor citoslico Pex5.
o O Pex5 com a protena ligada interage com o receptor Pex14 na membrana do peroxissoma.
o O complexo transferido para um grupo de protenas de membrana (Pex10, Pex12 e Pex2)
que so necessrias translocao para dentro da matriz do peroxissoma, por um mecanismo
desconhecido.
o Durante a translocao ou no lmen, Pex5 dissocia-se da protena de matriz e volta ao citosol
num processo que envolve o complexo Pex2/10/12 e protenas de membrana e citoslicas
adicionais.
o As protenas dobradas no podem ser importadas para os peroxissomas e a sequncia sinal
no removida.
Doenas peroxissomais
o Sndrome de Zellweger 20 genes diferentes envolvidos
o ALD adrenoleucodistrofia ligada ao X mutao no gene do transportador ABCD1 presente
nas membranas do peroxissoma. Afecta o transporte de fosfolpidos mais longos para o
peroxissoma.
Colorao com anticorpos fluorescentes de mutantes da biognese dos peroxissomas revela vias
diferentes para a incorporao de protenas de membrana e da matriz.
o As clulas foram marcadas com anticorpos contra PMP70, uma protena da membrana do
peroxissoma, ou com anticorpos contra catalase, uma protena da matriz e ento observadas
ao microscpio de fluorescncia.
o Nas clulas tipo selvagem, tanto as protenas da membrana como as dos peroxissomas so
visveis como focos claros em numerosos corpos peroxissomais.
o Nas clulas dos pacientes com deficincia em Pex12, a catalase est distribuda
uniformemente pelo citosol, enquanto a PMP70 est normalmente nos corpos peroxissomais.
o Nas clulas de pacientes deficientes em Pex3, as membranas do peroxissoma no podem ser
montadas e, em consequncia, os corpos peroxissomais no se formam.
Modelo para a biognese e diviso do peroxissoma
o A primeira etapa na formao de novos peroxissomas a incorporao de protenas de
membrana nos precursores de membrana.
o A Pex19 actua como receptor das sequncias sinal e a Pex3 e a Pex16 so necessrias
insero apropriada das protenas na membrana do peroxissoma em formao.
o A insero de todas as protenas produz um peroxissoma fantasma, que capaz de importar
protenas direccionadas para a matriz.
o As vias para importao de protenas para a matriz com PTS1 e PTS2 diferem na identidade
dos receptores citoslicos, Pex5 e Pex7 respectivamente, que se ligam sequncia sinal.
o A incorporao completa das protenas da matriz gera um peroxissoma maduro.
o A proliferao dos peroxissomas requer a diviso dos mesmos com ajuda da Pex11.
Aula 5 Microfilamentos
Microfilamentos
No lado (-), o microfilamento no aumenta e, no lado (+) mais rpida a associao e a dissociao.
Pode prever-se se o microfilamento aumenta ou diminui, depende da concentrao de actina
presente.
A concentrao de actina G determina a formao de filamentos
o A concentrao crtica a concentrao de monmeros de actina G em equilbrio com os
filamentos de actina. Em concentraes superiores, os filamentos so montados at que a
concentrao atinja o Cc.
o Quando acima de CC+ , o filamento aumenta.
A polimerizao da actina G in vitro ocorre em 3 fases
o Na fase de nucleao inicial, os monmeros de actina G-ATP formam complexos estveis de
actina. Estes ncleos so rapidamente alongados, na segunda fase, pela adio de
subunidades a ambas as extremidades do filamento.
o Na terceira fase, as extremidades dos filamentos esto em estado de equilbrio com a actina G-
ATP monomrica. Aps a incorporao no filamento, as subunidades lentamente hidrolisam o
ATP e tornam-se activas F-ADP estveis.
o A linha de tempo de polimerizao in vitro revela o perodo de adaptao (lag) inicial. Se alguns
fragmentos de filamentos de actina forem adicionados no incio, para actuarem como ncleos,
no h fase de adaptao.
As duas extremidades de actina tm velocidades de crescimento desiguais
o Os monmeros de actina so adicionados muito mais rapidamente na extremidade (+) do que
na (-).
o O bloqueio das extremidades (+) ou (-) de um filamento com protenas bloqueadoras de actina
permite o crescimento apenas da extremidade oposta.
Em concentraes de actina G intermdias os valores de Cc para as extremidades (-) e (+) podem
viajar ao longo dos filamentos, ligando-se preferencialmente extremidade (+) e dissociando-se
preferencialmente da extremidade (-). As subunidades mais antigas localizam-se na extremidade (-).
Toxinas que afectam os microfilamentos
o Citocalasina D alcalide produzido por um fungo, despolimeriza.
o Latrunculina produzido por espongirios, liga-se G-actina e impede a polimerizao.
o Jasplakolinodio produzido por outros espongirios, polimeriza
o Faloidina produzida por amanita phalloides, o anjo da morte, cogumelo. Impede a
polimerizao de microfilamentos.
In vitro
o Polimerizao induzida pela adio de sais necessria uma concentrao salina constante.
Nas clulas o ambiente favorvel polimerizao.
o Despolimerizao induzida pela diluio de F-actina.
o 40% Da actina na forma de G-actina.
o Protenas Capping ligam-se s extremidades impedindo a polimerizao e despolimerizao.
o Protenas severing vo cortar
o Timosina 4 Inibe a polimerizao, porque sequestra a actina ligada ao ATP.
o Profilina Protena que interage com a actina, transformando ADP em ATP, com consumo de
ATP. Estimula a polimerizao.
o Quando a actina entra tem de estar associada ao ATP.
o Gelsolina Est na rede de microfilamentos. Pode ser destruda quando h um aumento
grande da concentrao de clcio. Quando o clcio aumenta, a gelsolina liga-se aos
microfilamentos, cortando-os e destruindo a rede.
Papel da profilina da timosina na regulao da polimerizao da actina G
o As subunidades da actina complexadas com a timosina dissociam-se e adicionam-se
extremidade do filamento.
o No filamento, o ATP hidrolisado para ADP, a subunidade associada ao ADP eventualmente
dissocia-se na extremidade oposta do filamento.
o A actina G-ADP forma um complexo com profilina e o ATP permutado com ADP para formar
actina G-ATP.
o A profilina liberta os monmeros de actina para a extremidade (+) dos filamentos de actina ou a
timosina sequestra a actina G-ATP para o conjunto de subunidades prontas para a
polimerizao.
O PIP2, um lpido da membrana liga-se profilina, cofilina e gelsolina.
Sarcmeros no msculo-esqueltico com protenas bloqueadoras de actina
o A CapZ bloqueia as extremidades (+) dos filamentos finos da actina que esto localizados no
disco Z, separando os sarcmeros adjacentes.
o A tropomodulina bloqueia as extremidades (-) dos filamentos finos, localizados na direco do
centro de um sarcmero.
o A presena das duas protenas em extremidades opostas impede que as subunidades se
dissociem durante a contraco muscular.
Uma extensa rede de filamentos de actina preenche o citoplasma. Em cad ponto de ramificao situa-
se um complexo Arp2/3 que estimula a montagem da actina in vitro.
Movimentos intracelulares e alteraes na morfologia da clula
o Nos fibroblastos infectados com Listeria monocytogenes, visvel um rasto de actina. As
clulas bacterianas movem-se dentro do citosol.
o A bactria produz uma substncia qumica que estimula a formao de microfilamentos que
vo empurrar a bactria da periferia para o centro.
Alteraes na morfologia da clula
o As plaquetas podem ter vrias formas.
o Quando h uma fuga de sangue, h emisso de substncias qumicas que chamam as
plaquetas, que alteram a sua forma esfrica, aderindo zona onde houve ruptura com emisso
de filopdia e que depois ficam espalmadas servindo de tampo.
o Nas plaquetas, uma rede tridimensional de filamentos de actina est ligada ao complexo de
glicoprotenas da membrana, pela filamina.
o O Gpd1-IX tambm se liga com as protenas em cogulo fora da plaqueta.
o As plaquetas apresentam uma rede cortical bidimensional de actina e espectrina semelhante
do eritrcito.
o Debaixo da membrana plasmtica da plaqueta existe uma rede de filamentos interligados com
espectrina.
o A filamina organiza os filamentos formando crtex da clula.
o A rede de feixes de filamentos forma adeses ao substrato adjacente.
o A forma de disco da clula mantida por um anel de microtbulos na periferia da clula.
Movimentos celulares com protenas motoras
o Conjuntos de protenas que se associam s fibras do citoesqueleto e nelas se movimentam,
consumindo ATP.
o Miosina uma famlia de genes com 9 elementos
Associao de protenas motoras a microfilamentos.
1 parte globular, 1 pescoo e uma cauda alongada que liga a membranas.
Cabea, pescoo (com cadeias leves reguladoras e essenciais) e cauda (com cadeias
pesadas)
Transporte de vesculas para dentro das clulas
Miosina tipo II Associadas umas s outras formando fibras.
Tratada com quimiotripsina, a miosina parte-se pela cauda. Tratada com papain separa
o pescoo
o A miosina I e a miosina V ficam localizadas nas membranas por stios indeterminados nos seus
domnios da cauda.
o Como resultado, essas miosinas esto associadas com vesculas de membrana intracelular ou
com a face citoslica da membrana plasmtica.
o Em contraste, os domnios da cauda em super-hlice das molculas de miosina II agrupam-se
lado a lado formando um filamento grosso do qual as cabeas se projectam. No msculo-
esqueltico o filamento grosso bipolar. As cabeas so as extremidades e so separadas por
uma zona lisa, que consiste em caudas dispostas lado a lado.
A cabea da miosina usa ATP para se ligar ao filamento de actina
o A cabea da miosina, ligada ao filamento curto, tem um local de ligao do ATP.
o O ATP vai-se ligar cabea da miosina e a cabea dissocia-se da actina.
o D-se a hidrlise do ATP e sai um Pi ficando o ADP na cabea da miosina.
o A cabea da miosina volta-se a ligar actina mas desta vez num local mais atrs porque o
filamento de actina se desloca para a direita, fazendo a actina se mover para a esquerda.
o O ADP liberta-se e a miosina fica presa.
Detectar o movimento gerado pela miosina
o Na presena de ATP as cabeas da miosina caminham na direco da extremidade (+)
Movimento de vesculas
Locomoo celular
Os filamentos de actina so montados numa rede ramificada na qual as extremidades dos filamentos
alcanam a membrana plasmtica num ngulo agudo,
A actina G-ATP adicionada extremidade do filamento e empurra a membrana para diante.
O complexo Arp2/3 liga-se s laterais dos filamentos e forma uma ramificao a partir do filamento. As
extremidades so bloqueadas pela protena bloqueadora.
As subunidades de actina G-ATP convertem-se em subunidades actina G-ADP e dissociam-se do
filamento pela aco de protenas cortadoras como a cofilina e gelsolina.
As subunidades libertadas formam complexos com a profilina de forma a passarem a G-ATP.
A elongao de microfilamentos provoca tenses.
o A rede de filamentos de actina suporta o alongamento dos filamentos e gerao de foras que
os empurram. Um filamento de actina rgido mas pode curvar-se devido a flutuaes
trmicas.
o O curvamento dos filamentos na margem de direco onde as extremidades (+) fazem
contacto com a membrana cria espaos na membrana para que as subunidades se liguem s
extremidades dos filamentos.
o A fora elstica dos recuos empurra a membrana para diante.
As foras contrcteis so geradas por uma clula em movimento
o A rede de filamentos de actina est na parte anterior da clula, enquanto a miosina II est na
parte posterior da clula.
o Ambas esto numa banda que atravessa a clula anterior ao ncleo.
o A contraco dessa banda puxa o corpo celular para a frente.
o Uma clula em movimento exerce fora de traco sobre o substrato.
o Um querancito colocado sobre uma membrana de silicone exerce foras laterais que fazem
com que a membrana se curve.
Funes das vias de transduo do sinal na locomoo das clulas e organizao do citoesqueleto
o Os sinais extracelulares so transmitidos atravs da membrana plasmtica por receptores
especficos para diferentes factores.
o Um grupo de factores de crescimento induz a polimerizao de actina na margem de direco
atravs de uma via dependente de Rac e Cdc42.
o Um outro grupo de factores actua atravs de uma via dependente de Rho, para induzir a
montagem de adeses focais e contraco cortical.
o A adeso de uma clula matriz extracelular acciona uma via de sinalizao paralela que
induz a activao de profilina, da cofilina e da geisolina. Isto activa a fosfolipase C (PLC) que
hidrolisa o PIP2 da membrana.
o O aumento de clcio citoslico estimula a renovao de actina.
Os receptores de cAMP esto distribudos uniformemente. Assim o gradiente interno deve ser
estabelecido por um outro componente da via de sinalizao.
Como os receptores de cAMP sinalizam por meio de protenas G estas foram marcadas e viu-se que
activavam as vias que vo aumentar o clcio citoslico como a Arp2/3.
Aula 6 Microtbulos
H MT estveis e MT instveis
o Estveis axnios, clios, flagelos. 1 Vez formados, mantm-se
o Instveis Fibras do citoesqueleto e do fuso mittico.
Tem volta de 25nm
o So formados por fiadas de tubulina protofilamentos quando so 13 formam um cilindro.
o Fibras com orientao radial (do centro para a periferia)
No so visveis ao MO mas podem ser vistos por marcao no MO de fluorescncia.
Os MT podem ser marcados com anticorpo e mostrados com fluorescncia. Os centros organizadores
de microtbulos (MTOC) tambm podem ser marcados.
o Centro organizador de MT (MTOC) de onde eles partem para a periferia. So mais evidentes
durante a diviso celular, porque constituem os plos.
O centrossoma, que funciona como um centro de organizao do MT, contm um par de centrolos
ortogonais, na maioria das clulas animais.
o Os centrolos organizam-se em ngulo recto. sua volta encontra-se uma nvoa de material, a
matriz pericentriolar que contm -tubulina e pericentrina. As extremidades (-) dos MT esto
embebidas no MTOC mas sem estarem em contacto com os centrolos.
Na interfase das clulas animais, a extremidade (-) da maioria dos MT est prxima do MTOC. De
maneira semelhante, os MT nos flagelos e clios tm a sua extremidade (-) contnua com o corpo
basal, que actua como MTOC para estas estruturas.
Assim que entram em mitose, a rede de MT arranja-se formando o fuso mittico. As extremidades (-)
de todos os fusos mitticos apontam na direco de um dos MTOCs, ou plos, como so chamados
nas clulas em mitose.
Componente do citoesqueleto e funo
o MTOC Organizar a polaridade da clula
o Arranjos de MT Movimentos dos cromossomas
o Motores de cinesina Transporte de vesculas e cromossomas dirigidas pela extremidade (+).
o Motores de dinena Montagem do fuso atravs do transporte de vesculas dirigido pela
extremidade (-).
Os clios, contendo MT impedem o movimento do vulo pelo oviduto.
Nas clulas nervosas, a extremidade (-) de todos os MT dos axnios esto orientadas para a base do
mesmo, mas os MT dendrticos tm polaridades misturadas.
O axnio tem MT e filamentos intermedirios
Numa clula em mitose, formam-se MT temporrios que vo montar-se no incio da mitose e
desmontar-se no final e que transportam os cromossomas para os plos.
As clulas vegetais no tm centrolos, mas tm fuso acromtico, logo tm MTOC.
Na fase S h duplicao dos MTOCs.
Tubulina a unidade estrutural do protofilamento
o O GTP associado ao mnomero de -tubulina no permutvel, enquanto o GDP associado
ao monmero de -tubulina pode ser permutado em GTP.
o O taxol estabiliza a estrutura do dmero.
o A organizao das subunidades de tubulina num MT.
As subunidades esto alinhadas extremidade com extremidade, em protofilamentos que
se dispem lado a lado para formar um MT. Alternncia entre -tubulina com GTP e -
tubulina com GDP.
o Os protofilamentos podem estar organizados simples, duplos ou triplos
O MT simples tem 13 protofilamentos
O MT duplo tem mais 10 protofilamentos: 23.
Clio, flagelo
O MT triplo tem mais 10 protofilamentos: 33.
Corpos basais, centrolos
Polimerizao e Despolimerizao
Protenas Motoras
A velocidade de transporte das protenas no axnio pode ser determinada pela marcao radioactiva e
electroforese em gel.
Clios e flagelos
Mitose e Microtbulos
o Nas clulas animais, o cinetocoro consiste numa camada interna que contm protenas que se
ligam ao DNA centromrico e uma camada externa ligada s extremidades (+) dos MT dos
cinetocoros.
o Os MT encaixados na camada externa estendem-se na direco de um dos dois plos da
clula.
o A camada externa e a coroa fibrosa em volta das extremidades dos MT contm protenas que
se ligam aos MT e s protenas motoras, entre as quais a CLIP170, a dinena citoslica, as
cinesinas e a CENP-E e MCAK.
Relao da duplicao dos centrossomas com o ciclo celular
o Depois do par de centrolos paternos se separarem, um centrolo filho emerge a partir de cada
um e se elonga. Em G2, o aparecimento dos centrolos filhos est completo.
o No incio da mitose, o centrossoma divide-se e cada par de centrolos migra para as
extremidades opostas da clula.
Modelo para a participao de protenas motoras dos MT nos movimentos do centrossoma na profase.
o Na profase, os MT polares crescem a partir de plos opostos e so alinhados com o auxlio de
motores orientados para a extremidade (-).
o Depois, a cinesina mittica orientada para a extremidade (+) gera foras que empurram e
separam os plos.
o Alm disso, uma fora orientada para a extremidade (-) exercida pela dinena citoslica
localizada no crtex pode traccionar os steres na direco dos plos.
A dinena citoslica participa na formao e estabilizao dos plos.
Na metfase quando ocorre a ligao das fibras cinetocoro aos cromossomas.
o H uma espcie de paragem, para posicionar os cromossomas.
o Treadmilling nmero de tubulinas que entra igual ao que sai. O tamanho da fibra mantm-
se
Anafase A Por despolimerizao. As proteases actuam nos centrmeros.
o As fibras do cinetocoro tornam-se mais pequenas e puxam o centrmero para o centrossoma.
Anafase B H polimerizao do cinetocoro, h sobreposio das fibras e depois as protenas
motoras terminam com esta sobreposio.
As fibras astrais determinam o estrangulamento na citocinese.
Filamentos Intermedirios
O ciclo celular compreende uma srie ordenada de acontecimentos que levam diviso celular e
produo de duas clulas-filhas.
Controlo da diviso celular vital para todos os seres vivos (unicelulares e pluricelulares)
A perda de controlo do ciclo celular pode levar ao cancro, uma doena que mata cada vez mais
pessoas.
A replicao de cada clula tem de ser controlada finalmente, ocorre na altura certa, com mecanismos
fidedignos e reprodutveis de modo a cumprir o programa de desenvolvimento de cada organismo.
Mecanismos de vigilncia atravs de check-points (2 acontecimentos-chave)
o Replicao de cromossomas
Ocorre na fase S do ciclo celular
Cada cromossoma filho resultante distribudo clula filha na mitose.
o Segregao de cromossomas
necessrio assegurar que a segregao feita correctamente.
Mecanismos de controlo muito semelhantes em todas as clulas eucariotas
Nmero limitado de controladores principais
Conservados evolutivamente.
o feita por protenas quinases heterodimricas que contm uma subunidade reguladora
(ciclina) e uma cataltica (quinase dependente de ciclina), que regulam a actividade de
protenas envolvidas na replicao do DNA e na mitose por meio da sua fosforilao em stios
regulatrios especficos e tambm por cyclin dependent kinases CDK.
o A degradao regulada por protenas.
Eventos principais do ciclo celular dos eucariotas e destino do cromossoma da clula-me
o Nas clulas em proliferao, G1 o perodo entre o nascimento de uma clula aps a mitose
e a sntese de DNA, o que marca o incio da fase S.
o O cromossoma replicado consiste em duas molculas de DNA filhas e de protenas
cromossomais associadas.
o Cada uma das molculas de DNA filhas e suas protenas cromossomais tomam o nome de
cromatdeo-irmo.
o O final de G2 marcado pelo estabelecimento da mitose, durante a qual o fuso mittico se
forma e separa as cromatdeas-irms, seguindo-se a diviso do citoplasma (citocinese) para
gerar duas clulas filhas.
o As fases G1, S, G2 tomam o nome de interfase, que o perodo entre uma mitose e a prxima.
o As clulas que no esto a ser replicadas entram numa fase G0 podendo dar-se a sua morte
ou ento a continuao para G2.
Fases da mitose e citocinese
o Na interfase d-se ento a replicao do DNA formando-se duas molculas filhas de DNA que
com as suas protenas cromossomais tomam o nome de cromatdeo-irmo.
o Na mitose, na profase d-se a migrao dos centrossomas. Os centrossomas comeam a
condensar, d-se a desagregao do ncleo a formao do fuso j numa pr-metafase.
o O cinetocoro medeia a ligao de protenas ao fuso.
o Na metfase, d-se o alinhamento dos cromossomas e a sua disposio no plo equatorial.
o Na anafase d-se a separao dos cromossomas. Cada cromossoma ligado a um MT de
cinetocoro move-se para um plo.
o Na telofase e citocinese as membranas do ncleo formam-se novamente e os MT
despolimerizam. D-se a clivagem das clulas e as clulas-filhas entram em G1 novamente.
O DNA associado a protenas forma cordas com 11nm que associadas formam fibras de 30nm com
nucleossomas agregados.
Um cromossoma em metfase encontra-se altamente condensado, com protenas scaffold a ajudar no
enrolamento. Na interfase encontra-se mais descondensado.
Um cromossoma em metfase tem no centro um centrmero, os braos so os cromatdeos e na
ponta dos braos encontra-se o telmero.
Depende
o Fosforilao regulada de protenas
Fosforilao por cyclin dependent kinases, CDK
Heterodmeros formados por uma ciclina (unidade reguladora) e uma quinase
(unidade cataltica)
Trs classes de ciclinas
G1
S
M
o Degradao especfica de protenas
Degradao especfica em proteossomas
2 Tipos de ubiquitina ligases
o SCF
o APC/C Anaphase Promoting Complex
Viso geral do modelo de regulao do ciclo celular dos eucariotas
o A progresso no ciclo controlada pelos complexos ciclina G1, S e M.
o Esses complexos tm unidade reguladora e unidade cataltica quinase dependente de ciclina
(CDK). CDKs no funcionam sem ciclinas.
o Dois complexos ubiquitina ligase, SCF e APC vo actuar em substratos especficos que
incluem os inibidores da fase S, as securinas e as ciclinas M marcando os substratos para
degradao nos proteossomas.
o A protelise do inibidor da fase S activa os complexos ciclina da fase S-CDK, levando
replicao dos cromossomas.
o A protelise da securina resulta na degradao de complexos proteicos que conectam os
cromatdeos-irmos na metfase iniciando assim a anafase.
o A reduo da actividade dos complexos ciclina M-CDK como consequncia da protelise das
ciclinas M permite que aconteam eventos tardios da mitose e citocinese.
o Estas clivagens proteolticas impedem o ciclo de tomar o sentido contrrio.
Clulas estimuladas para replicar
o Incio da fase G1
H expresso dos complexos ciclina G1-CDK, que aps atingirem determinada
quantidade:
Activam os factores de transcrio para expresso dos genes:
o Que codificam enzimas para a replicao do DNA
o Que codificam as ciclinas da fase S.
Fosforilao de Cdh1, inactivando-o, permitindo acumulao de ciclinas S e M.
o No final da fase G1
Induzem a degradao dos inbidores da fase S fosforilando-os e induzindo a sua
poliubiquitinao pela ligase SCF da ubiquitina.
Activao dos complexos ciclina-S-CDK.
o Fase S
Complexos ciclina S-CDK activos
Fosforilam protenas que fazem parte dos complexos de pr-replicao do DNA,
ligadas s origens de replicao em G1
o Inicia-se a replicao do DNA
o Inibe a formao de novos complexos de pr-replicao.
Sntese de complexos ciclina M CDK que, esto inibidos, por fosforilao, at ao final
da fase S.
o Complexos ciclina M CDK
Activados por desfosforilao
Fosforilam vrias protenas que:
Promovem condensao de cromossomas
Retraco da membrana nuclear
Formao do fuso acromtico
Alinhamento dos cromossomas na placa equatorial
o APC Anaphase Promoting Complex
APC um complexo multiproteico com actividade ubiquitina quinase.
Poliubiquitina especifica protenas que vo ser degradadas.
Poliubiquitina Securina inibidor da degradao de protenas de cross-linking do
centrmero. S depois da metfase
Degradao das protenas de cross-linking e separao dos cromatdeos
Poliubiquitina s ciclinas M
Activa fosfatases que desfosforilam protenas permitindo:
Reformao da membrana nuclear
Reformao do aparelho de Golgi
Induo de citocinese
Desfosforilao das protenas do complexo de pr-replicao, activando-as.
o 3 Pontos regulados por ubiquitina ligases:
G1 S
Metafase Anafase
Anafase Telofase e citocinese
Pontos irreversveis pois resultam da degradao de protenas (Sic1, Securina,
Ciclinas mitticas do tipo B)
Restriction Point
o Pontos de Regulao Crticos
Iniciao da fase S
Iniciao da mitose
Separao dos cromatdeos na anafase
Sistemas experimentais para identificar protenas que regulam o ciclo celular
Utilizao de extractos de ocitos de Xenopus (sem ncleo) contm todo o material necessrio para
as primeiras 12 divises, aps a fertilizao.
Formao da blstula em Xenopus
o Fertilizao do ovo
o 12 Divises sincronizadas, em que as fases G1 e G2 so muito pequenas.
o As primeiras 12 divises no necessitam da presena de ncleo, ou seja, todos os elementos
necessrios sntese de DNA (fase S) e diviso celular (fase M), encontram-se no citoplasma
do ovo no fertilizado.
Localizao da MPF e ciclina B nas diferentes fraces obtidas em tempos sequenciais aps
fertilizao
o Alta actividade cinsica da MPF resulta na entrada em mitose
o Baixa actividade cinsica de MPF necessria para sair da mitose.
MPF e ciclina B esto nas mesmas condies
o A actividade MPF e a mitose dependem da sntese e degradao de ciclina B em Xenopus.
Funes da ciclina B
o Para haver alternncia entre as fases S e M, nas primeiras 12 divises em Xenopus
necessria:
A presena de mRNA (codifica ciclina B)
A sntese proteica para entrada em mitose (dispensvel para entrada em fase S)
A ciclina B a nica protena sintetizada nestas condies (nos extractos)
A ciclina B precisa de ser sintetizada para iniciar a fase M
A ciclina B regula a actividade de MPF
A ciclina B precisa de ser degradada para terminar a fase M.
Ciclinas M em vertebrados
o H 3 protenas com a mesma funo da ciclina B de Xenopus, Ciclina B, B1 e A
o As ciclinas M so degradas no final da anafase nos proteossomas aps poliubiquitinao pelo
APC (Anaphase promoting complex)
Regulao da quantidade de ciclina B em clulas embrionrias
o Na anafase tardia, o complexo promotor da anafase (APC) poliubiquitina as ciclinas B.
o medida que as ciclinas so degradas pelos proteossomas, a actividade cinsica do MPF
diminui, determinando o incio da telofase.
o A actividade do APC est relacionada com as ciclinas mitticas (B) pela aco de um factor
especfico, Cdh1, que fosforilado e assim inactivado por complexos ciclina G1 CDK.
o Uma fosfatase especfica chamada Cdc14 remove o fosfato regulador do factor de
especificidade na anafase tardia.
o Assim que o factor inibido em G1, a concentrao de ciclina M aumenta de forma a permitir
nova entrada na mitose.
Identificao de subunidade cataltica da cinase, CDK, numa levedura
o Mutantes doc maiores que as normais
o Mutantes wee menores do que as normais
o Nas leveduras a membrana nuclear no se dissocia.
o Cdc2 uma protena homolgada com as cinases eucariotas
Reguladora da entrada na mitose.
o Cdc13 codifica uma ciclina semelhante ciclina B da xenopus.
o Cdc13 + Cdc2 = MPF
o Complexo MPF
altamente conservado da levedura s clulas humanas.
Em xenopus e ourio-do-mar, formado por uma ciclina B (subunidade reguladora) e
uma cinase (cataltica).
Em S. Pombae formado por Cdc13 (ciclina) e Cdc2 (CDK)
Fosforilao da cinase (CDK) activa MPF.
o Reguladoras da actividade de CDK em S. Pombae
Wee1
Cdc25
Incio da mitose
Estudos em S. cerevisae
o Ciclinas G1 Cln1, 2, 3
o Ciclinas M Clb 5, 6, 3, 4, 1, 2
o Ubiquitinas cinases SCF e APC
Depois do ponto START (G1 S) as clulas ficam irreversivelmente commited
o As clulas filhas nascem mais pequenas que as mes e tm de crescer em G1 antes que esto
grandes o suficiente para entrarem em fase S.
o Aqui, o invlucro nuclear tambm no se quebra durante a mitose (caso da S. cerevisae)
o Os cromossomas no condensam o suficiente para serem visveis ao MO.
Mutantes em cdc28 em G1 antes do START, crescem mas no entram em mitose
o Clulas em G1 depois de START dividem-se
Mutantes em cdc7 Pram antes da citocinese
Mutantes em cdc
o Cdc28 mutantes de protena, que uma cinase, CDK em s. cerevisae
Semelhante ao cdc2 em s. pombae
o Ambas as leveduras s tm uma CDK.
o Cdc28 necessrio para entrar em fase S e M
o Cdc2 necessrio para entrar na fase M e tambm na S.
o CDKs necessrios para entrar na fase M e S.
Estratgia de isolamento da ciclina G1 de S. cerevisae
o MPF ciclina M + CDK
o SPF ciclina G1 + CDK
Identificao de ciclina G1, por supresso de mutantes cdc28 temperatura sensveis.
o Ciclina M em S. pombae corresponde ao gene cdc13+ e homloga s protenas ciclina B
em Xenopus e ourio-do-mar que associadas a CDK formam MPF (que fosforila a histona-11)
Sem ciclinas G1 as clulas no passam para a fase S e G2.
Ciclina G1 Cln3
o Protena durante todo o ciclo celular
o Protena muito instvel
o Traduo regulada pela disponibilidade de nutrientes (traduo inibida por uma ORF, do
prprio mRNA quando h pouca disponibilidade de nutrientes).
o Cln3-CDK activa factores transcrio SBF e MBF que estimulam:
Expresso dos genes CLN1 e CLN2
Subunidades da DNA polimerase
Subunidades de RPA (ssDNA binding proteins)
DNA ligase
Enzimas necessrias para a sntese de desoxirribonucletidos
o Cln1/Cln2-CDKs fosforilam cdh1, inactivando-o, impedindo a degradao das ciclinas mitticas
que se vo formar.
Factor de transcrio MBF
o Activa genes CLB5 e CLB6 produzem
o Protenas Clb5 e Clb6 do tipo ciclina B mas que codificam ciclinas da fase S durante a fase
S.
o Complexos Ciclina S CDK so essenciais para o incio da fase S ou seja para a sntese de
DNA.
o Complexos Ciclina S- CDK s ficam activos na fase S, depois da degradao do inibidor
especfico Sic1.
Fase de iniciao
Regulao da reentrada em G1