PROCEDIMIENTO:

Muestra B 1 2 3 4
Solucin C (ml) 2.0 --------------- --------------- --------------- --------------

ADN Argopecten ----------------- 1.0 1.0 --------------- --------------

diluido (ml)

ADN Pisum ----------------- ---------------- --------------- 1.0 1.0

diluido (ml)

Agua destilada (ml) ----------------- 1.0 --------------- 1.0 --------------

NaOH 1N (ml) ----------------- ---------------- 1.0 --------------- 1.0

Abs 260 Abs 280

ADN animal H2O 1: 0.299 0.158
NaOH 2: 0.354 X
ADN vegetal H2O 3: 0.203 0.126
NaOH 4: 0.210 X

Incremento porcentual:
A: Estado del ADN :
tubo 1 VS tubo 2 Comparando tubo 2 VS 1 ;
0.299 - 100% Incremento del 18.394 % ya que no supera el 30% ;
0.354 - X entonces el ADN se encuentra en estado denaturado o
X: 118,39 persiste ARN en la solucin.
100 X = 18.394 Comparando tubo 4 VS 3
Incremento de 3.448 % igual que anterior no supera el
tubo 3 VS tubo 4 30%, por ende el ADN se encuentra en estado denaturado
0.203 100% o persiste ARN en la solucin.
0.210 X
X: 103.448
100- X : 3.448

tubo 1 ; 260 VS 280

0.299 100%
0.158 X
X: 189.2405
100X : 47,1571

tubo 3 ; 260 VS 280

0.203 100%
0.126 X
X: 62,068
100 X : 37, 931

B: Concentracin de la muestra:
Al evaluar la absorbancia de los tubos de ADN nativo animal y vegetal se obtuvo la siguiente
informacion:
Absorbancia a 260nm;
ADN animal: 0.220
ADN vegetal: 0.380
Que se le multiplicara por 10 puesto que la muestra esta diluida.
Y la absorbancia de:
ADN animal ser 2.20
ADN vegetal ser 0.380

Y teniendo en cuenta que :

-Para ADN en estado nativo
1 mg/ml ADN =20 unidades de absorbancia a 260 nm
-Para ADN en estado denaturado
1mg/ ml ADN = 27 unidades de absorbancia a 260 nm

Nuestra muestra es de ADN denaturado;

1 mg/ml 27,000
X 2.20
X: 0.0814
Volumen: 5 ml
Mg de ADN ; 0.0814 X 5 ml : 0.4074 mg

Rendimiento: MgADN/ gr tejido = 0.4074 /1.26 =0.3233 mg/gr

1 mg/ml 27,000
X 3.80
X: 0.1407
Volumen: 5 ml
Mg de ADN ; 0.1407 X 5 ml : 0.70370 mg

Rendimiento: MgADN/ gr tejido = 0.70370 / 8 =0.08796 mg/gr

C: Grado de pureza
Determinar la relacin Abs260/Abs280
Este valor debe aproximarse a 2.0. Si el valor es menor a 1.8, determinar la concentracin de
protenas contaminantes utilizando la siguiente relacin:
Protena (mg/ml) = 1.55 (Abs280) 0.76(Abs260)
Tubo 1:
0.299/ 0.158 = 1.8924

Tubo 3:
0.203/ 0.126 = 1.611
Protena (mg/ml) = 1.55 (Abs280) 0.76(Abs260)
= 1.55 (0.126) 0.76(0.203) = 0.04102
Accin de nucleasas:

A: Sobre sustrato natural (solucin de ADN)

Se utilizo la muestra del ADN animal puesto que es el ms puro.

Muestra B 1
Buffer pH 9.0 (ml) 3.0 1.4
ADN (ml) ---- 1.5

Se tomo la absorbancia a 260 nm ;se adicionara 0.1 ml de nucleasa (2mg/ml) e incubar a 37C
durante 15 min
y se tomar la absorbancia,
inicial, 0.110
final, 0.321

La absorbancia aumento un 191,81% por la accin de las nucleasas (son enzimas hidrolasas que
catalizan la ruptura de los enlaces fosfodiester, dejando las bases nitrogenadas expuestas
aumentando de esta manera la absorbancia)

B: Sobre sustrato sinttico (bis-pNFF)

Muestra B 1 2
Sustrato sinttico (ml) 0.5 0.5 0.5
Buffer pH 8.5 (ml) 0.5 0.4 0.4
Nucleasa (2 mg/ml) ---- 0.1 0.1

Incubar los tubos a 37C durante 3 minutos (tubo B y 1) y 6 minutos (tubo 2)

Posteriormente agregar 2.0 ml de NaOH 0.1 (esta sustancia detiene la reaccin)
Luego se registro a 400 nm obteniendo los siguiente:
Tubo 1 : 0.095
Tubo 2: -0.01

Determinar la actividad especifica (A.E) de la nucleasa empleada

A.E:Cantidad de producto liberado (uM) / Unidad de tiempo (min) / Cantidad de enzima usada (mg)

|E|: 2 mg/ml
V: 0.1 ml
0.2mg

1.000 6uM
0.095-- 0.57 uM
-0.01 -0.06 uM

A.E (3) = 0.57 uM / 3 min / 0.2 mg = 0.95

A.E (6) = -0.06 uM / 6 min / 0.2 mg = -0.05

Teorico Abs 400 nm

3 min 0.150
6 min 0.300