BAB IV

METODELOGI PENELITIAN

4.1 Desain Penelitian

Penelitian ini adalah penelitian eksperimental dirancang dengan menggunakan

rancangan Randomized post-test control only group design. Rancangan penelitian ini

digambarkan dengan skema sebagai berikut :

P0

O0

P1

P S R O1

P2

O2

Gambar 4.1 Skema Rancangan Penelitian

Keterangan

P : Populasi

S : Sampel

R : Randomisasi

P0 : Kelompok Kontrol (tanpa pemberian dexametasone dan rHuEpo)

P1 : Kelompok Perlakuan 1 (dengan injeksi dexametasone 1 mg/kg BB 2x

seminggu selama 5 minggu, tanpa pemberian rHuEpo dosis 500

u/kgbb/hari selama 5 minggu)

P2 : Kelompok Perlakuan 2 (dengan injeksi dexametasone 1 mg/kg BB 2x

seminggu selama 5 minggu dan pemberian rHuEpo dosis 500

u/kgbb/hari selama 5 minggu)

O0 : Tulang femur tikus tanpa perlakuan

O1 : Tulang femur tikus setelah injeksi dexametasone 1 mg/kg BB

intramuskular

O2 : Tulang femur tikus setelah 5 minggu dexametasone 1 mg/kg BB

intramuskular dan pemberian rHuEpo dosis 500 u/kgbb/hari

4.2 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian dan pemeriksaan histopatologi dan imunnohistokimia dilaksanakan di

Laboratorium Patologi Veteriner Fakultas Kedokteran Hewan Universitas Udayana

Bali, waktu dilaksanakan mulai bulan Desember 2017 sampai bulan Februari 2018.

4.3. Penentuan Sumber Data

4.3.1. Populasi dan Sampel

Populasi penelitian adalah Wistar Rat jenis kelamin jantan yang telah
dikondisikan baik lingkungan kandang maupun makanannya. Penggunaan hewan
coba ini akan dimintakan sertifikat Laik Etik Penelitian.

4.3.2. Kriteria Eligibilitas

Sampel diambil dari populasi terjangkau dengan kriteria sebagai berikut:

Kriteria Inklusi
Tikus jantan
Umur 12 minggu
Berat 200-250 gram
Sehat, ditandai dengan gerakan aktif
Kriteria Eksklusi

Tikus dalam kondisi sakit, dinilai dari gerakan tidak aktif

Ada luka kulit
Ada mata merah
Kecepatan pernafasan >60x/menit
Suhu rektal >40oC

4.3.3. Besar Sampel

Besar sampel dihitung dengan menggunakan rumus Federer (Federer, 2008).

(t-1)( n-1) 15

(3-1)(n-1) 15

2n-2 15

2n 17

n 8,5

N = Besar sampel

T = Jumlah perlakuan

Dari hasil perhitungan rumus di atas, besar sampel minimal yang diperlukan

sebesar 9 sampel dalam satu kelompok. Untuk mengantisipasi kemungkinan drop out,

sampel ditambahkan 10%,maka jumlah sampel dalam penelitian ini adalah :

N = n/(1-f)

Dimana :

N = jumlah hewan coba yang diperlukan tiap kelompok.

n = jumlah sampel minimal untuk tiap kelompok.

f = perkiraan proporsi drop out.

Maka :

N = 8,5/(1 0,1)

N = 8,5/0,9
 N = 9,44 N dibulatkan menjadi 10

Berdasarkan rumus di atas, maka jumlah sampel yang diperlukan pada

penelitian ini sebanyak 10 ekor hewan coba untuk tiap kelompok atau total 30 tikus.

Teknik pengambilan sampel digunakan cara Simple Randomization karena

populasi relatif homogen.

4.4 Variabel Penelitian

4.4.1 Klasifikasi variabel

a. Variabel Bebas : pemberian rHuEPO subkutan

b. Variabel tergantung : Osteonekrosis caput femur, jumlah sel adiposit sumsum

tulang tikus, jumlah osteosit nekrosis, kadar BMP-2 dan VEGF

c. Variabel kendali : Jenis tikus, jenis kelamin, umur, berat badan, lingkungan,

nutrisi.

4.4.2 Definisi Operasional Variabel

a. Obat terapeutik berbasis protein manusia berasal dari biomolekul alami di

tubuh yang memiliki peran fisiologis tertentu, seperti pembawa pesan seluler

(hormon), komponen struktural (sitoskeleton), mediator dari metabolisme sel

(enzim) dan komponen utama respon imun (antibodi dan limfokin).

Penggunaan EPO rekombinan manusia (rHuEPO) telah disetujui oleh Food

and Drug Administration (FDA) AS, dan sekarang banyak digunakan untuk

pengobatan anemia yang terkait dengan gagal ginjal, kanker, prematuritas,

penyakit radang kronis dan infeksi virus kekebalan tubuh manusia. Merk

dagang yang digunakan pada penelitian ini adalah Epotrex NP dengan

kandungan 2000 UI rHuEPO dalam dosis 500/u/hari/kg BB.

b. Diagnosis osteonekrosis dibuat berdasarkan adanya dua kriteria di bawah ini:

 1. Adanya sel-sel adiposit yang nekrosis.

2. Adanya trabekula tulang dengan lakuna kosong yang difus.

3. Adanya trabekula tulang dengan lakuna kosong tanpa sel-sel adiposit

nekrosis disekelilingnya tidak merupakan osteonekrosis (Yamamoto et al.,

2008).

Gambaran tersebut dibaca oleh bagian Patologi Veteriner Fakultas

Kedokteran Hewan Universitas Udayana. Tikus dengan setidaknya terdapat

satu lesi osteonekrosis pada area pemeriksaan, dianggap mengalami

osteonekrosis. (Nishida et al., 2008).

c. Steroid yang digunakan adalah injeksi dexametasone 1 mg/kg BB 2x seminggu

selama 5 minggu. Sediaan yang digunakan adalah merk dagang Cortidex

yang mengandung 5 mg/ml dexametason.

d. Jumlah sel-sel adiposit sumsum tulang didapatkan dengan menghitung per

delapan lapangan pandang pada mikroskop cahaya dengan perbesaran 200 kali.

e. Jumlah sel-sel osteosit yang nekrosis dihitung perseratus osteosit dengan

mikroskop cahaya dengan perbesaran 400 kali. Yang dimaksud sel-sel osteosit

yang nekrosis adalah adanya lakuna kosong tanpa osteosit.

f. Ekspresi VEGF: ekspresi VEGF dalam jaringan interstisial tulang yang

diperiksa menggunakan metode imunohistokimia dengan menghitung jumlah

sel yang mengalami perubahan warna secara acak pada 5 lapang pandang pada

regio proksimal, tengah, dan distal.

g. Ekspresi BMP 2: ekspresi BMP 2 dalam jaringan interstitial tulang allograft

yang diperiksa menggunakan metode imunohistokimia, dilihat secara acak 5

lapang pandang pada masing-masing regio proksimal, tengah dan distal.

4.5 Alat dan Bahan

4.5.1 Alat

Alat terdiri dari :

1. Kassa steril

2. Minor set bedah

3. Mesh steril no 11 dan 15

4. Ketamine

5. Phenobarbital

6. Formalin 10%

7. Plester

8. Plaster of Paris (Gypsona)

9. Buku

10. Pensil

Instrumen yang dipergunakan adalah :

1. Kandang tikus

2. Timbangan

3. Penggaris

4. Kamera digital

5. Komputer

6. Pinset

7. Pisau bedah

8. Gunting

9. Obyek Glass

10. Mikroskop
 11. Kamera

12. Sarung tangan

4.5.2 Bahan

Bahan yang dipergunakan adalah :

1. Hewan coba: tikus Wistar, jenis kelamin jantan, umur 12 minggu, berat badan

200 -250 gr, kondisi hewan coba sehat tanpa cacat.

2. Cortidex ampul injeksi yang mengandung 5 mg/ml dexametason.

3. Epotrex NP dengan kandungan 2000 UI rHuEPO

4.6 Prosedur Penelitian

1. Tikus yang akan diteliti dilakukan penyesuaian terhadap tempat dan makanan. Makanan

yang diberikan dialihkan dari makan sayur ke ekstrak makanan tikus yang terdiri dari

protein 20-25%, lemak 5%, pati 40-50%, serat kasar 5%. Tiap hari setiap tikus diberi

makan 12-20 gram makanan. Untuk air minum akan diberikan 80-100 cc/kgBB per hari,

dan akan tetap disediakan air minum ad libitum (Smith & Mangkoewidjojo, 1988).

2. Setiap tikus akan menempati satu kandang tikus yang dibuat dari kayu atau bambu dan

akan tetap dijaga kebersihannya, terlindung dari angin, hujan dan cahaya matahari

langsung, suhu lingkungan sekitar 15-20 oC (Smith & Mangkoewidjojo, 1988).

3. Kedua kelompok tikus dikandangkan di Laboratorium Veteriner Fakultas Kedokteran

Hewan Universitas Udayana dengan ukuran 30x20 cm dan diberikan diet normal berupa

pelet dan air dua kali sehari.

4. Penelitian dilakukan pada pagi hari pukul 09.00 WITA.

5. Digunakan 30 ekor tikus jantan dengan jenis Wistar jantan dengan umur antara

12 minggu.
6. Tikus kemudian dibagi menjadi 3 kelompok, Kelompok P0 tidak mendapat

perlakuan dan kelompok P1 mendapat perlakuan berupa injeksi dexametasone 1

mg/kg BB intramuskuler, kelompok P2 mendapat perlakuan berupa injeksi

dexametasone 1 mg/kg BB 2x seminggu selama 5 minggu dan pemberian rHuEpo

dosis 500 u/kgbb/hari selama 5 minggu.

7. Berat badan masing-masing tikus ditimbang setiap minggu selama penelitian.

8. Pada hari terakhir minggu kelima, tikus disuntik mati dengan ketamin, kemudian bagian

interstisial pada tulang femur tikus diambil sisi proksimal, distal dan bagian tengah untuk

dilakukan pemeriksaan kadar VEGF, kadar BMP 2 dan osteocalcin. Sisa tubuh tikus

dibakar.
 Populasi: Tikus Wistar

RANDOMISASI

Sampel

Kriteria inklusi
Kriteria Eksklusi
1. Tikus jantan 1. Tikus sakit (gerakan tidak aktif)
2. Usia 12 minggu 2. Tikus tidak mau makan saat
3. Berat 200-250 gram penelitian.
4. Sehat, ditandai gerakan aktif

Eligible Subject

RANDOMISASI

Kelompok Perlakuan Kelompok Kontrol

Perlakuan berupa injeksi dexametasone 1 Injeksi Deksametason tanpa Injeksi

mg/kg BB dan pemberian rHuEpo dosis 500 rHuEPO
u/kgbb/hari

5 minggu

Pemeriksaan imunohistokimia VEGF, BMP 2

Pemeriksaan :
- Osteonekrosis caput femur
- Jumlah adiposit sumsum tulang
- Jumlah osteosit yang nekrosis caput
femur

Analisis data

Gambar 4.2 Alur Penelitian

4.7 Analisis Data Penelitian

Data yang terkumpul akan dianalisis dengan program statistik SPSS for

Windows version 22.0. Setelah dilakukan analisa data, data VEGF dan BMP 2

berdistribusi tidak normal sehingga uji statistik yang digunakan adalah non-

parametrik.

Data yang diperoleh dianalisis dengan langkah-langkah sebagai berikut.

1. Analisis Deskriptif

2. Analisis Normalitas

Uji normalitas data dengan Shapiro-Wilk test untuk mengetahui data sampel

berasal dari populasi berdistribusi normal atau tidak.

3. Analisis Homogenitas dengan Levene test untuk mengetahui varian data

homogen atau tidak.

4. Pada hipotesis pertama, kedua dilakukan uji one way ANOVA dan hipotesis

ketiga dilakukan uji Chi-square