MG.

MARA EUGENIA CARRASCO H.

APUNTE CLASE INTRODUCCIN AL ESTUDIO HISTOLOGICO

TCNICA HISTOLOGICA ESTANDAR O CLASICA

La tcnica histolgica abarca varios procedimientos, desde la preparacin de tejidos para
su estudio microscpico, esto se logra sometiendo todo o una parte de tejido previamente
seleccionado a una serie de procesos: fijacin, deshidratacin, aclaracin, inclusin, corte
y tincin; hasta proporcionar los cortes como se conocen, montados bajo un cubreobjeto
con imgenes de estructuras contrastadas, para su estudio bajo microscopia ptica o
electrnica.
Despus de la extraccin de un tejido del organismo o cuando se quita la irrigacin,
empieza a descomponerse a consecuencia de la ausencia de oxigeno y metabolitos
esenciales, de la acumulacin de dixido de carbono y otros productos del metabolismo
celular y de la accin de diversas enzimas. Por lo tanto, para conservar el estado natural
de las clulas de los tejidos, es necesario detener cuanto antes los procesos de
descomposicin. Para ello se debe colocar el tejido extirpado en un volumen adecuado de
solucin fijadora. Otra razn por la cual la fijacin es indispensable en cualquier tcnica
histolgica es que si las clulas no fueron fijadas puede perderse la membrana externa
que rodea el protoplasma fluido y consiste en una mezcla de solucin verdadera y coloidal
de sales, protenas, carbohidratos, lpidos, cidos orgnicos y enzimas.


ETAPAS FUNDAMENTO PRODUCTO

1- Toma de la muestra -Descamados (Epitelio bucal, etc) Pequeo tamao.

-Biopsias (Colonoscopa, etc.)
-Observacin de fluidos corporales (Vaginal,
Nasal, etc.)
-Frotis
2- Fijacin Conserva la estructura del tejido de forma - Formalina:
Identificacin y permanente. Sirve para: Solucin acuosa de formaldehdo al 37% en
rotulado Abolir el metabolismo celular combinacin con otras sustancias quimicas y
Impedir autodigestacin amortiguadoras.
Destruir m-o patogenos, bacterias,
hongos y virus
Endurecer el tejido
3- Lavado y Extraccin total del agua presente en Etanol en graduacin ascendente hasta alcan
deshidratacin clulas y tejidos alcohol al 100%
Detiene procesos vitales y facilita
penetracin de solvente.
4- Inclusin Otorga dureza para los cortes. Parafina.
Cortes de 5 a 15 micrmetros.
5 - Corte Permite visualizacin de estructuras Micrtomo.
pequeas.

6 Tincin - Coloracin Otorga colores diferenciales. Hematoxilina-eosina.

7- Montaje de la Preparacin permanente. Cubre objeto con adhesivo.

muestra Albmina, pineno o resinas acrlicas

Tincin:
FUNDAMENTOS DE LA TINCIN CON HEMATOXILINA. La hematoxilina es un colorante
natural que se extrae del corazn o duramen del rbol Hematoxylon campechianum.
Este rbol se encontr, por primera vez, en la regin de Campeche en Mxico, cuyos
habitantes conocan bien sus propiedades colorantes. En la actualidad existen
plantaciones comerciales, sobre todo en Jamaica. Cuando tienen unos 10 aos los rboles
se cortan, se quita la corteza y la madera alburente y el corazn se exporta en palos de
alrededor de un metro, estos se cortan en pequeos trozos para la extraccin y el
colorante obtenido se utiliza no solo para microscopia sino tambin para teir la seda y la
lana. De hecho durante muchos aos la nica aplicacin de la sustancia fue la industria
textil, hasta que Waldeyer estableci firmemente su lugar en la histologa en 1862.
El extracto natural que se obtiene del rbol no es un colorante activo; primero debe ser
oxidado para dar Hematena. En este proceso de transformacin oxidativa en hematena
el hematoxiln pierde dos tomos de hidrgeno, y uno de sus elementos se vuelve
quinona, en solucin alcohlica o acuosa, la oxidacin espontnea es muy lenta, y puede
requerir hasta un ao. Este proceso de oxidacin se llama maduracin y se puede lograr
casi instantneamente con oxidantes qumicos como el oxido de mercurio, el yodato de
sodio, el permanganato de potasio, el peroxido de hidrgeno y el hipoclorito de calcio.
Durante el proceso oxidativo se forman compuestos distintos de la hematena, algunos
tambin tienen propiedades colorantes, pero la hematena es el principal ingrediente
activo. Debe entenderse que un colorante de hematoxilina maduro es una mezcla de
hematoxilina, hematena, productos de oxidacin activa de la hematena y hematoxiln y
productos de ultra oxidacin inactivos. La oxidacin demasiado prolongada da lugar a
compuestos casi todos incoloros y sin utilidad.

La tincin de hematoxilina eosina se conoce desde la segunda mitad del siglo XIX. Sin
embargo existen diversas variaciones, cambiando el tipo de eosina (existen la eosina Y,
llamada amarilla o yellow y la eosina B, azul o blue) y de hematoxilina (existen la
hematoxilina de Harris, de Mayer) especfica para obtener resultados ms ntidos
dependiendo del tejido a tratar.
Protocolo: Una de las ventajas de esta tincin es que resulta fcil de llevar a cabo y
requiere poca instrumentacin. Primeramente si la muestra est incluida en parafina debe
hidratarse. Usualmente se emplea la parafina para incluir la muestra de forma que puedan
realizarse cortes de microtoma, obtenindose cortes muy finos.

En este punto se sumerge la muestra en hematoxicila durante un tiempo que ronda los 10
minutos. Tras unos breves lavados con agua y alcohol para eliminar el exceso de
hematoxilina se tie durante 30 segundos en eosina.

Hematoxilina: este compuesto se extrae de Haematoxylum campechianum, una planta
leguminosa originaria de la pennsula de Yucatn, Mjico. Como curiosidad, el nombre de
esta planta significa madera que sangra. De la planta se obtiene una sustancia que al
oxidarse adquiere un color morado. Para aumentar su capacidad colorante se combina
con iones metlicos de hierro o aluminio, consiguindose as la hematoxilina. La
hematoxilina se une intensamente a las cargas negativas (aniones), como los cidos. Es
por esto que se une fuertemente al ADN (cido desoxirribonucleico). La tincin con
hematoxilina tie de color azul los ncleos.
Es, por lo tanto, un colorante vegetal. Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los
agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales
(xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.) Es un colorante
directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza
alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante),
comportndose en este caso como un colorante indirecto.


Eosina: Se obtiene de la interaccin del bromo con la fluorescena. Las cargas negativas
del compuesto hacen que se una a compuestos con cargas positivas, es decir, bsicos,
como el citoplasma. Sin embargo, sta misma carga es la que impide que penetre dentro
de clulas vivas, puesto que la membrana celular las expulsa.
Es un colorante artificial (se trata de derivados hidroxixantnicos halogenados con tres
grupos arilo). Presenta auto-fluorescencia espontnea. Se la emplea tanto en soluciones
acuosas como alcohlicas.

Es un colorante basofilo (afinidad con lo bsico, porque es acida), en forma de polvo rojo
cristalino, de uso ampliamente extendido en el mbito industrial, desde la industria textil
hasta el estudio biolgico e histolgico. Como curiosidad, tambin se utiliza en la
coloracin de la gasolina.

La tcnica Hematoxilina-Eosina es una tcnica histolgica que permite identificar o
diferenciar las pastes de un tejido. Hoy en da es muy til para estudiar los tejidos de los
rganos y observar anormalidades como es el caso del cncer crvico uterino.
(Papanicolau).

Algunos resultados de la tcnica:
Citoplasma: Rosa
Musculatura: Rojo , rosa o fucsia
Fibrina: Rosa
Colgeno: rosa plido.
Queratina: rojo intenso.
Ncleos: azul oscuro o prpura (en realidad se tie slo la cromatina).
Eritrocitos: color cereza.

Tarea: Completar: Qu otros componentes celulares tienen afinidad por hematoxilina y
por eosina?

Hematoxilina Eosina












Microscopio

PARTES DEL MICROSCOPIO

Para su estudio, se pueden distinguir dos partes, una mecnica y otra ptica.

Parte mecnica.- Constituye el soporte de la parte ptica y consta de:

El estativo, formado por el pie o base del microscopio y el brazo o asa, ambos
constituyendo un solo cuerpo.
La platina, placa cuadrada o circular en la que se apoya la preparacin a observar. Dispone
de unas pinzas que permiten sujetar la preparacin. La platina se halla perforada en el
centro para dejar paso a los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz.
El tubo, pieza cilndrica y hueca en cuya parte superior se sita una lente (el ocular) y en la
inferior se encuentra una pieza giratoria llamada revolver que lleva enroscadas otras
lentes (los objetivos) que, en este caso, son tres, aunque en otros modelos de microscopio
pueden ser ms.
Tornillos de enfoque, que permiten el desplazamiento del tubo mediante una cremallera
dentada, de modo que, al acercar o alejar el tubo de la preparacin se consigue el
enfoque de la misma. Son el tornillo macromtrico que hace un desplazamiento rpido y
el tornillo micromtrico que hace un avance fino.
Parte ptica.- Comprende los sistemas de lentes y el aparato de iluminacin. Consta de las
siguientes piezas:

El ocular, llamado as por ser la lente sobre la que se aplica el ojo de 1 observador.
Es la lente que recoge la imagen dada por el objetivo, a partir de la cual genera una
imagen aumentada. Igual que el objetivo est recubierto por un cilindro. El ocular est
formado por un sistema de lentes en el que se destacan la lente inferior de campo y la
lente superior, que acta como lupa
Tiene como misin aumentar la imagen producida por el objetivo.

El objetivo, es la lente que se encuentra sobre el objeto (preparacin) a observar. Es el
elemento ptico ms importante, puesto que es el que produce la imagen aumentada del
objeto, esta imagen, adems, la observamos invertida (el objetivo funciona como una
cmara fotogrfica) de ah que, lo que observamos a la derecha de la preparacin se
encuentre realmente a la izquierda y viceversa. Su aumento viene sealado por una cifra y
el signo X (5X, 10X, 20X, etc.)
El aumento total del microscopio se obtiene multiplicando los aumentos del ocular por los
del objetivo con el que se est realizando la observacin.

El condensador est formado por un sistema de lentes convergentes que estn situadas
en un suporte metlico. Su funcin es concentrar los rayos luminosos y proyectarlos sobre
el preparado. Para observaciones con objetivos de gran aumento se requiere que el
condensador est cerca de la platina, concentrando la luz sobre la pequea porcin de la
muestra que est siendo magnificada. Sin embargo, trabajando con objetivos de poco
aumento, es aconsejable retirar el condensador, para poder obtener una iluminacin en
todo el campo observado.

El diafragma, se encuentra por debajo del condensador. Grada la cantidad de rayos
luminosos que llegan al objeto

El aparato de iluminacin, est formado por una lmpara que ilumina directamente el
objetivo. Existe tambin un diafragma que se puede abrir o cerrar mediante una
palanquita regulando as la intensidad luminosa.

Tipos de microscopios

Existen diversas clases de microscopios, segn la conformacin, la naturaleza de los
sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imgenes.