PRACTICA N 12.

DETERMINACION DE LA HEMOGLOBINA GLICADA

HEMOGLOBINA GLICADA (Hb A1c). Es el producto de la condensacin irreversible de la

glucosa con el residuo N-terminal de la cadena de la hemoglobina A. Su concentracin en
sangre es directamente proporcional a la concentracin media de glucosa durante un
perodo de tiempo de 6-8 semanas, equivalente a la vida media de los eritrocitos. Es til en
la valoracin del control glucmico para el seguimiento de los pacientes diabticos,
proporcionando una informacin ms fiable que la concentracin de glucosa. Tambin sirve
en el diagnstico de la diabetes.

FUNDAMENTO DEL MTODO. Luego de preparar un hemolizado, donde se elimina la

fraccin lbil, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio catinico. La
HbA1c se eluye de forma especfica, previa eliminacin por lavado de la hemoglobina A1a+b
(HbA1a+b), y se cuantifica por lectura fotomtrica a 415 nm. La estimacin de la
concentracin relativa de HbA1c se realiza frente a la concentracin de hemoglobina total.

EQUIPOS: Fotmetro.

MATERIALES: Pipetas automticas y tips.

REACTIVOS: Reactivo A. Ftalato de potasio 50 mmol/L, detergente 5 g/L pH 5,0. Reactivo B.

Tampn fosfatos 30 mmol/L, pH 6.5. Reactivo C. Tampn fosfatos 72 mmol/L, pH 6.5 4.
Microcolumnas. Resina de intercambio catinico con tampn fosfatos 72 mmol/L, pH 6.5.

MUESTRAS. Sangre venosa recogida mediante procedimientos estndar y con EDTA como
anticoagulante. La HbA1C en sangre es estable 7 das a 2-8C.

PROCEDIMIENTO.

Preparacin del hemolizado y eliminacin de la fraccin lbil

1. Dejar atemperar reactivos y columnas durante unos minutos.

2. Pipetear en un tubo de ensayo 50 UL de sangre 50 L y 1200 ul de Reactivo A

3. Agitar y dejar durante 10-15 min. Este hemolizado se utilizar en los pasos 6 y 11.
Preparacin de la columna

4. Destapar la parte superior de la columna y romper a continuacin la lengeta inferior.

5. Con la ayuda del extremo plano de una pipeta, bajar el disco superior hasta el nivel de la
resina, evitando comprimirla. Dejar gotear hasta que el lquido alcance el nivel del disco,
desechando el eluido.

Separacin y lectura de la HbA1c.

6. Aplicar cuidadosamente sobre el disco superior 50 ul de Hemolizado. Desechar el eluido

7. Cuando haya penetrado todo el hemolizado aadir 200 ul de Reactivo B, procurando

arrastrar los posibles restos del mismo. Desechar el eluido

8. Pipetear 2 ml de Reactivo B. Desechar el eluido

9. Colocar la columna sobre un tubo de ensayo y aadir 4.0 ml de Reactivo C. Recoger el

eluido (Fraccin HbA1c)

10. Agitar bien y leer la absorbancia de la fraccin HbA1c a 415 nm frente a agua destilada
(A HbA1c).

Lectura de la Hb total

11. Pipetear en un tubo de ensayo 12 ml de Reactivo C y 50 ul del Hemolizado.

12. Agitar y leer la absorbancia de la Hb total a 415 nm frente a agua destilada (A Hb total).

CLCULOS. % HbA1c = A Hb A1c x 100

A Hb total x 3

VALORES DE REFERENCIA/GRADO DE CONTROL. Segn NGSP-DCCT (%): No diabtico 4.0

6.5; Objetivo 6.0 7.0; Buen control 7.0 8.0; Precisa actuacin: > 8.0

Interpretar con precaucin en pacientes con hemoglobinopatas (hemoglobina C, S, E, F),

Hb carbalimada, Hb acetilada, anemia hemoltica, deficiencia de hierro y post transfusin.