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Tema 10: Plegamiento de protenas

La informacin para el plegamiento de una protena viene determinada por su secuencia.


Cualquier polipptido con n residuos puede adoptar 8n conformaciones (slo se permiten
estequiomtricamente 8 ngulos de enlace). Sin embargo cada protena adopta una nica
conformacin conformacin nativa.

Se descubri por el experimento de Anfinsen con la ribonucleasa A. Se


llega a purificar la protena y su secuencia. Se conoce la presencia de
puentes disulfuro entre Cys. Para ver como se conforma as, degrad la
protena hasta cierto punto y aadi mercapto-etanol y urea, que rompe
los puentes disulfuro sin degradar la estructura. Se mide la accin de la
protena y se ve que es inactiva. Para ver si poda recuperar la actividad,
intent recuperar la estructura mediante dilisis (queremos cambiar el
entorno de una protena pura; mb semipermeable que no permite paso
de protenas peor s de disolvente -4 cambios de 10 horas-). Observa que
la protena vuelve a ser activa.

Al comprobar los puentes disulfuro, se comprueba que se conforman


exactamente de la misma manera que al principio.

La clula dispone de una maquinaria muy precisa para conseguir la correcta formacin y
plegamiento de las protenas (tambin en el tiempo correcto). El plegamiento errneo lleva a
enfermedad.

El plegamiento de protenas permite:

1. Reducir las posibilidades de que se formen protenas mal plegadas.

2. Eliminar las que no necesita la clula, o bien las que se han formado de forma
inadecuada.

3. Establecer la conformacin adecuada en un tiempo determinado con alta eficacia y


seguridad. Incluso puede haber altas concentraciones de una protena sin que
precipite.

4. Regular procesos importantes como el ciclo celular y la activacin/desactivacin de


protenas.

Los plegamientos se llevan a cabo por un sistema celular especializado, las chaperonas:
chaperonas moleculares y chaperoninas.
CHAPERONAS
Las chaperonas son protenas importantes para la funcin y supervivencia celular, por eso
estn muy conservadas evolutivamente: se encuentran desde las bacterias hasta humanos. En
eucariotas estn en mltiples orgnulos celulares.

Las chaperonas moleculares y las chaperoninas son protenas que unen y estabilizan
conformaciones inestables de otras protenas. Mediante uniones y liberaciones controladas,
facilitan la conformacin nativa de las protenas o el ensamblaje entre stas para crear
oligmeros estables. En ambas se da un ciclo de unin a ATP, su hidrlisis y liberacin de ADP.
Este ciclo est asociado a la unin de clientes, a sus cambios conformacionales y a su
liberacin.

CHAPERONAS MOLECULARES

Las chaperonas moleculares se unen a protenas que no estn plegadas o que no han
terminado de plegarse, evitan que se agreguen y sean degradadas. Entre estas encontramos
Hsp70 y sus homlogos (Hsp70 y Hsp90 en citosol y matriz mitocondrial), BiP en retculo
endoplsmico y Dna K en bacterias.

Las protenas Hsp son las protenas que primero aparecen tras estrs celular por choque de
calor.

- Hsp70 se unen a ATP, forman un bolsillo hidrofbico y se asocian transitoriamente a


zonas hidrofbicas. La hidrlisis del ATP cierra el bolsillo, la protena se separa y puede
plegarse correctamente. El 90% de las protenas sigue esta va.
- La Hsp90 pueden participar en que la protena pase de inactiva activa, o puede formar
complejos estables hasta que una seal libere la forma activa (vg con factores de
transcripcin, receptores para HT y hormonas esteroideas, protenas kinasas).

Las Hsp70 funcionan como un monmero y las Hsp 90 como dmero.

Hsp70

Las Hsp 70 y sus homlogos tienen un dominio ATPasa N-terminal de 45 kD y un dominio C-


terminal de 25kD de unin al sustrato, adems de mltiples cofactores.

Existen muchas protenas anlogas con especificidad diferente y distintas funciones. El ciclo de
unin e hidrlisis de ATP consiste en alternar la unin al ATP con una baja afinidad y rpido
intercambio de sustratos, con la unin al ADP y una alta afinidad e intercambio lento del
sustrato.

El ATP se une al dominio del bolsillo terminal (domino ATPasa). Mientras est unido, transmite
informacin de forma que el saco donde se unir un determinado sustrato de la otra parte de
la molcula (C-terminal), tiene una conformacin relajada. As, permite la entrada de
sustratos diversos. Cuando entra la protena adecuada, intervienen otras chaperonas de modo
que se cierra el bolsillo de la protena y comienza a salir la protena bien plegada, a la vez que
el ATP se hidroliza.
Existen varias posibilidades respecto a los mecanismos de control, algunas de ellas con efectos
opuestos:

A veces las Hsp 70 prefieren las protenas mutadas (p53mutada, la D508 de CFTR, el
mutante de la superxido dismutasa) en vez de a sus homlogas wild-type, y las
protegen hasta que situaciones de estrs las dejan al descubierto porque se necesitan
ms chaperonas para acudir hacia nuevas protenas que estn perdiendo su
conformacin nativa.

Alternativamente las protenas mutadas pueden dirigirse a las Hsp70 y sus co-
chaperonas para ser degradadas El desequilibrio entre ambos mecanismos est
asociada a diferentes patologas: oncognesis (p53 mutada), enfermedades
neurodegenerativas (esclerosis lateral amiotrfica -SOD mutada-), Parkinson
(mutaciones en -sinucleina) y Corea de Huntington (expansin de poli-Gln en la
huntingtina).

Otras veces no interesa que las protenas se plieguen inmediatamente.

- Porque se necesita la protena completa para el plegamiento adecuado

- Porque tiene que modificarse qumicamente primero, v.g. para ir a un orgnulo.

- Para que una protena potencialmente peligrosa no tenga su conformacin nativa


antes que su inhibidor, v.g. la Dnasa activada por caspasas (CAD) debe plegarse
adecuadamente slo si est presente su inhibidor (ICAD)

CHAPERONINAS

Es un enorme ensamblaje molecular cilndrico formado por dos anillos de oligmeros.

- La chaperonina TriC en eucariotas est formada por 8 unidades por anillo (7 en


procariotas).
La protena parcialmente plegada, o plegada de forma incorrecta, entra en el complejo,
interacciona con el interior y se pliega en su conformacin nativa. El proceso es
dependiente de la hidrlisis del ATP:

- GroEL cambia de conformacin al unir el ATP, se expande y libera la protena plegada


despus de hidrolizarse el ATP. Cuando entra el ATP, cambia la conformacin de GroEl,
de modo que se hace ms laxo. En esta conformacin tienen lugar todas las
interacciones que modificarn la protena.

- La co-chaperonina GroES, que tapa el extremo de la chaperonina GroEL, coopera en el


proceso.

Si la protena no sale completamente pegada, el proceso se vuelve a repetir.


La causa de algunas enfermedades degenerativas, como el Alzheimer, se debe a la formacin
de agregados de protenas que se han plegado de forma estable en una conformacin
alternativa que resulta insoluble y forma placas.

MODIFICACIN DE PROTENAS

La modificacin de protenas ocurre en residuos de aminocidos, pasando de 20aa a ms de


100.

La acetilacin en el residuo amino terminal, por ejemplo, est presente en el 80% de las
protenas y puede alargar la vida media de la protena porque impide su degradacin por
proteasas.
UBIQUITINACIN

Las clulas marcan a las protenas que deben degradarse por adicin de ubiquitina (protena de
76 aa con varias lys y una gly terminal). La va principal de degradacin de protenas es el
lisosoma, y el otro mecanismo importante es a travs del proteasoma (el 90% de la
degradacin proteica en clulas de mamfero).

El proteasoma est formado por: un ncleo cataltico


(20S) con 50 subunidades proteicas, unido a una o dos
tapas de 19S, con 16-18 subunidades, 7 de las cuales
hidrolizan ATP. Las subunidades que hidrolizan ATP
regulan la actividad de la subunidad 20S y le proveen
de la energa necesaria para introducir la protena a
degradar dentro del ncleo cataltico, donde se
degrada por mltiples cortes y se liberan pptidos
pequeos al citosol.

La ubiquitina forma un complejo con el ATP, de modo


que se forma una unin tioester entre la ubiquitina y
E1. Este complejo, por una reaccin de
transtioesterificacin cede la ubiquitina a la enzima 2.
Esta E2 es reconocida por E3 que acopla E2-Ubi con el
sustrato. El sustrato es susceptible de ubiquitinizarse
en el extremo N-terminal o en lisinas. La protena
ubiquitinizada entra en el proteasoma para ser degradada.

Entre las posibilidades de ubiquitinacin tenemos: monoubiquitinacin, multiubiquitinacin


(varios lugares) y poliubiquitinacin (un mismo lugar pero todo seguido). Existen
deubiquitinasas que eliminan las ubiquitinas y revierten sus efectos.
Inhibidores de la actividad del proteasoma como agentes terapeticos

Actualmente se usan inhibidores de la actividad del proteasoma como agentes teraputicos,


porque si no hay actividad del proteasoma las clulas se mueren. Es el caso del mieloma
mltiple, las clulas tumorales se mueren porque son ms sensibles al tratamiento con
inhibidores del proteasoma que las clulas normales.

En el proceso de muerte celular, NFkB es una protena reguladora antiapopttica: si est activa,
la clula sobrevive. Para que est activa esta protena, su inhibidor, el IkB, debe estar ausente,
o lo que es lo mismo, que el proteasoma lo degrade. Cuando se tratan las clulas con
inhibidores del proteasoma, IkB no se degrada, inhibe NFkB y las clulas tumorales entran en
apoptosis, mientras que las clulas normales, ms resistentes a los inhibidores del proteasoma,
sobreviven mejor.

Ej.: Bortezomib o Velcade.

DFICIT DE 1- ANTITRIPSINA

El dficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es una enfermedad congnita poco frecuente (1/3.000-


5.000). Se describi por primera vez en 1963 por mdicos suecos que vieron una ausencia de la
banda 1 en la electroforesis de protenas de muestras de 5 pacientes de un total de 1500
analizados, 3 de esos 5 desarrollaron efisema. Ms tarde se asoci con enfermedad heptica.

La alfa1-antitripsina se sintetiza predominantemente en el hgado y es secretada a la


circulacin. Controla la degradacin de los tejidos por la enzima elastasa de neutrfilos. Hay
que relacionar efisema y enfermedad heptica con falta de 1-antitripsina.

La integridad de la pared de los alveolos pulmonares


depende del balance entre la elastasa y 1- AT.
- La elastasa es una proteasa que degrada la elastina de las paredes del alveolo y altera
su estructura. Est presente en los lisosomas de los leucocitos polimorfonucleares o
neutrfilos y se libera como mecanismo de defensa para eliminar los productos de
degradacin tisular en zonas donde hay inflamacin.

- La -1 antitripsina es un inhibidor de serinproteasas y de elastasa, protege la pared del


alveolo porque mantiene la tensin superficial y permite la entrada /salida de aire.

La falta de concentraciones circulantes 1-antitripsina expone a los pulmones al ataque


proteoltico por la elastasa de neutrfilos y por tanto, predispone a los homocigotos (PI*Z) al
inicio precoz del enfisema.

La deficiencia de alfa1-antitripsina (AT) se produce por la sustitucin de Lys por cido Glu en el
residuo 342. Esto altera el plegamiento de esta glicoprotena plasmtica derivada del hgado
durante la biognesis, de modo que: se estimula la polimerizacin, se forman agregados
insolubles en el RE de las clulas hepticas y escapan de la degradacin por proteasoma.

Aumenta su concentracin en hgado donde no puede salir, por lo que produce dao heptico.
(Existe una reduccin del 85 al 90% en las concentraciones circulantes de AT, el principal
inhibidor fisiolgico de la elastasa de neutrfilos).

Es una enfermedad compleja con distintos grados de afectacin. Se manifiesta por: EPOC,
enfisema, asma, hiperreactividad bronquial, bronquiectasias, enfermedad pulmonar,
enfermedad heptica y otras (renal, particulitis,...).

FIBROSIS QUSTICA

La FQ se produce por un fallo en la conductancia para el canal de Cloro, en la protena CFTR (C


F Transmembrane Regulator).

El CFTR (regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica o Cystic fibrosis


transmembrane conductance regulator) es una protena de membrana que pertenece a la
familia de transportadores ABC (ATP-binding cassette). Consta de una cadena nica
polipeptdica que contiene 1480 aminocidos y que acta como un canal de cloro, regulado por
monofosfato de adenosina cclico (AMPc). La forma totalmente elaborada del CFTR se
encuentra en la membrana plasmtica del epitelio normal.

Este canal presenta:


- Dos dominios transmembrana (MSD1 y MSD2), cada uno con seis subdominios
transmembrana (TM) formando un poro que posibilita el paso de la protena a travs
de la membrana celular y constituye el canal de Cl-.

- Dos dominios de unin a nucletidos (NBD1 y NBD2), capaces de unirse e hidrolizar


adenosn trifosfato (ATP), lo que permite a la protena utilizar energa en forma de ATP.

- Un dominio regulador (R) que contiene sitios de fosforilacin de protenquinasas.

Los dominios transmembrana forman un "canal de cloro". Cuando se produce una fosforilacin
del dominio R y el ATP se une a los 2 dominios NBF, el canal de cloro se abre y los iones Cl-
salen de la clula. La CFTR normal, una vez sintetizada, es transportada al retculo
endoplsmico (RE) y aparato de Golgi para su procesamiento adicional (+ H de C) antes de ser
integrada en la membrana celular.

La protena atraviesa la membrana y acta como un canal inico conectando la parte interna
de la clula (citoplasma) con el fluido extracelular. Este canal es mayormente responsable de
controlar el paso de cloruro hacia (y desde) el medio interno.

Tras la unin de los agonistas, como por ejemplo la acetilcolina, a la clula epitelial, aumenta el
nivel de AMPc que activa a las quinasas. Lo primero que se produce es una fosforilacin
dependiente de AMPc sobre todo por las protenas quinasas A y C en el dominio regulador (R),
este paso es el que controla la actividad del canal. El ATP se une a los 2 dominios NBD y se
hidroliza por estos dos dominios de unin a nucletidos, que son los que controlan la apertura
del canal. Por ltimo, el canal de cloro se abre y los iones Cl- salen de la clula. El carboxilo
terminal (C-) de la protena est unido al citoesqueleto por interaccin con dominios proteicos
PDZ.

El CFTR tambin puede influir en la funcin de otras protenas de membrana como son los
canales de rectificacin del Cl- al exterior, el canal de Na+ epitelial (ENaC), los canales
rectificadores de K+ hacia adentro, el intercambiador de Cl-/HCO3-, canales de unin estrecha
y procesos celulares implicados en el transporte de ATP y la secrecin de moco. El
acoplamiento del CFTR en el citoesqueleto puede influir en su localizacin y funcin.

Agonista aumento de AMPc aumento de PKA


La FQ es una enfermedad autosmica recesiva consecuencia de mutaciones en el gen que
codifica el CFTR: 27 exones (250 kb) en el cromosoma 7q31.2. La mutacin ms comn (70% de
los casos) consiste en la delecin de tres pares de bases en la secuencia del gen, que resulta en
la ausencia de fenilalanina en la posicin 508 (F508), lo cual conduce a un fallo del transporte
celular y localizacin en la membrana celular de la protena CFTR. Esta mutacin se localiza en
el dominio NBD1.

1.- Fallo del transporte celular y localizacin en la membrana celular de la protena CFTR.

2.- El ATP no se une, alterando el funcionamiento del canal de cloro: iones Cl- e iones Na+ se
acumulan en el interior de las clulas y el agua retenida en el interior de las clulas ( el
moco secretado es demasiado viscoso).

Cuando la protena CFTR, con la mutacin delta F508 llega al retculo endoplsmico, el
mecanismo de control de calidad de este componente celular reconoce que esta protena no
tiene la conformacin correcta y marca (ubiquitinacin) la protena como defectuosa para su
degradacin. De esta manera, la delta F508 nunca llega a la membrana celular.

La delecin deltaF508 es la causa ms comn de la fibrosis qustica. La isoleucina (Ile) en la


posicin 507 permanece sin cambio debido a que tiene los cdigos ATC y ATT.

PROTENAS ABC

La familia de protenas ABC. Son las protenas cassette de unin a ATP (ABC) y forman una de
las mayores familias de protenas (hasta 48 identificadas en humanos). Muchas de estas
protenas ABC son bombas transmembrana activas, que puede transportar sustratos en contra
del gradiente de concentracin. La energa necesaria para este transporte activo se genera a
travs de la hidrlisis de ATP. Un ejemplo es el CFTR canal de Cl, o el transportador para HDL
(enfermedad de Tangier).

Al menos 6 genes que codifican para ABC estn relacionados con transporte de drogas y con el
desarrollo de resistencia (MDR), que presentan las clulas expuestas a txicos. Estos
mecanismos incluyen disminucin en la captacin y aumento de la detoxificacin. Eficacia en
el tratamiento con QT.

El ABD full-transporter es muy similar al canal de cloruro, excepto que el primero carece de
sitio regulador.