THE ROLE OF INFLAMMATORY CYTOKINES IN RHEUMATOID ARTHRITIS:

COMPARISON TO ALLERGIC DISEASES

Annemie J. Schuerwegh

2002
Proefschrift voorgelegd tot het behalen van de graad van Doctor in de Medische
Wetenschappen aan de Universitaire Instelling Antwerpen

SUMMARY

The objective of this work was to investigate the role of cytokines in rheumatoid
arthritis (RA) and to compare cytokine profiles, observed in RA, with those in allergic
diseases, such as allergic asthma, atopic dermatitis and hymenoptera allergy.

In order to investigate cytokines, we applied a single cell flow cytometric technique

that determines intracellular blocked cytokine production. Appropriate inhibition of
secretion of the produced cytokines is required for studying intracellular cytokine
expression by flow cytometry. In the first part of the study (Chapter II), the efficiency
of the most widely used inhibitors of cytokine secretion, the antibiotics monensin and
brefeldin A, was evaluated. A more toxic effect of monensin, compared to brefeldin A
on the viability of monocytes, was observed. In addition, lower amounts of cytokine
production in monocytes after inhibiting secretion with monensin, were found. This
might be explained by the fact that in monensin treated monocytes, the intracellular
produced cytokines are bypassing the Golgi complex, using an unknown alternative
secretory pathway. These findings lead to the conclusion that brefeldin A is a more
potent, effective and less toxic inhibitor of cytokine secretion than monensin for flow
cytometric determination of intracellular monocytic cytokines (IL-1, IL-6, TNF-).

The intracellular flow cytometric method can identify the cytokine producing cell type
but gives no absolute quantitative measurement of the produced cytokine. In
Chapter III, we investigated whether the technique that determines intracellular
cytokine production is well correlated with extracellular cytokine determination. First,
a flow cytometric technique based on the single cell method was used to identify
intracellular cytokine production in T-lymphocytes and monocytes. In parallel, a
microsphere based flow cytometric immunoassay was performed on the same
samples of RA patients to evaluate cytokine secretion. The data of this study
demonstrated that semi-quantitative flow cytometric detection of cytokines (IL-1, IL-
6, IL-10, IL-12) in monocytes is well correlated with extracellular cytokine secretion.
Measurement of IL-2 and IFN- production performed by enumerating cytokine-
producing T-lymphocytes or by quantification of cytokine in culture plasma, yielded
results that showed a good correlation. For IL-4, moderate correlations between
intracellular and extracellular cytokine levels were observed. Therefore, in RA
patients, there is no secretion deficit of intracellularly produced cytokines, since good
correlations are observed between intracellularly blocked and extracellular cytokine
detection.

Chapter IV presents a transversal study, in which we applied the intracellular flow

cytometric method to examine cytokine production in patients with different types of
immune mediated disorders. Active atopic dermatitis patients showed a type 2
cytokine profile, whereas stable asthma patients with lower disease activity did not
show a predominance of type 2 cytokines. Rheumatoid arthritis patients under
treatment with salazopyrin had a type 1 cytokine profile, which could not be
demonstrated in patients treated with methotrexate. The imbalance between type 1
and type 2 cytokines in different immune mediated disorders could be related with
treatment and the grade of disease activity.

These results stressed the need for further investigation of the influence of therapy
on cytokine profiles. Prospective studies were set up to investigate the influence of
therapy on cytokine profiles in T-lymphocytes and monocytes in RA and allergic
patients (Chapter V-VII).

In Chapter V, the influence of immunotherapy on the cytokine profile in T-

lymphocytes was evaluated in a type 2 allergic disease, in casu hymenoptera venom
allergy. Since immunotherapy induces a switch from an allergic status to wasp/bee
venom towards clinical tolerance, we hypothesised that modulation of the cytokine
balance by therapy could explain the immunoregulatory action of venom
immunotherapy. We could demonstrate that wasp venom immunotherapy induced a
shift from IL-4-producing towards IFN--producing CD4+ as well as CD8+ T-
lymphocytes.

In Chapter VI, the influence of therapy with methotrexate in combination with low
dose corticosteroids on T-cell cytokine profiles was evaluated in RA patients. Before
therapy, RA patients showed a predominance of type 1 cytokines, in CD4+ T-cells
and CD8+ T-cells, compared to healthy controls. Long-term therapy with
methotrexate in combination with low dose corticosteroids reduced the predominance
of type 1 cytokines towards normalisation of the cytokine balance between type 1
and type 2 cytokine production, both in CD4+ and CD8+ T-lymphocytes.

In Chapter VII, the influence of anti-TNF- therapy on cytokine profiles in T-

lymphocytes and monocytes of RA patients was examined, to further investigate the
possible mechanism, responsible for the clinical efficacy of anti-TNF- therapy. We
examined the effects of anti-TNF- therapy after one single (24 hours) and after
multiple intravenous infusions (month 6) on in vitro intracellular cytokine production in
T-lymphocytes and monocytes. We observed a clear reduction of capacity to
produce IL-1, IL-6, TNF- and IL-12 in monocytes, immediately after the first
infusion of anti-TNF- therapy, which persisted after 6 months of therapy; In addition,
the Th2/Th1 cytokine ratio in CD4+ T-cells was significantly increased after 24 hours
and after 6 months of anti-TNF- therapy. These findings led to the conclusion that
repeated administering of anti-TNF- therapy downregulates the monocytic capacity
to produce pro-inflammatory cytokines and induces a shift to a more pronounced
anti-inflammatory Th2 cytokine balance.

In the next chapter (Chapter VIII), the direct influence of pro-inflammatory (IL-1, IL-
6, TNF-, IFN-) and anti-inflammatory (IL-4) cytokines on chondrocyte survival (cell
proliferation/necrosis/apoptosis), proliferation and nitric oxide production was
investigated in an in vitro model. No effect of IL-6 could be demonstrated on
chondrocyte function with respect to chondrocyte apoptosis, viability, proliferation and
nitric oxide (NO) production.
Pro-inflammatory cytokines such as IL-1 and TNF- but not IL-6 were able to induce
NO-mediated apoptosis, whereas only high levels of IL-4 could inhibit the effect of IL-
and TNF- on NO production and proliferation of chondrocytes but not apoptosis.
These changes in chondrocyte survival, induced by pro-inflammatory cytokines (IL-
1 and TNF-), might be of pathogenetic significance in the development of cartilage
degradation in rheumatoid arthritis.

Finally, Chapter IX focused on the interaction between chondrocytes, pro-

inflammatory cytokines and immune complexes (IC). IC are usually found in high
amounts in RA synovial fluids and IC deposits are often observed at the surface of
joint cartilage. In this part of the thesis, the influence of immune complexes on
chondrocyte function (proliferation, necrosis, apoptosis, production of inflammatory
mediators) was investigated. Since pro-inflammatory cytokines play a pivotal role in
the inflammation process of rheumatoid arthritis, all our experiments were performed
in a pro-inflammatory culture medium, containing IL-1, TNF- and IFN- at
pathophysiological concentrations. We observed a significant decrease in
chondrocyte proliferation and viability, when the cells were incubated with sera and
synovial fluid IC derived from RA patients. Moreover, IC derived from RA sera and
synovial fluid, were able to induce apoptosis of chondrocytes, determined with three
independent techniques (TUNEL/annexine-V/microscopy). Thus, immune complex
mediated apoptosis of cytokine-stimulated chondrocytes might be at least in part
responsible for the cartilage breakdown in rheumatoid arthritis.

In summary, this thesis provides further evidence for the role of cytokines in the
pathogenesis of rheumatoid arthritis and allergic diseases. Cytokine profiles can be
influenced by therapy as well in RA as in hymenoptera allergy. Furthermore,
evidence is presented that pro-inflammatory cytokines and immune complexes, able
to induce apoptosis in chondrocytes, can be involved in the development of cartilage
degradation in RA.

SAMENVATTING

Het doel van deze thesis is de rol van cytokinen en de pathogenese van reumatode
artritis (RA) te bestuderen en het cytokinenprofiel in RA te vergelijken met het
cytokinenprofiel in allergische aandoeningen.

De flow cytometrische bepaling is een kwalitatieve techniek, die twee belangrijke

voordelen heeft: de cytokinenproductie wordt op intracellulair niveau gedetecteerd en
het is mogelijk het producerend celtype te identificeren. De intracellulaire
cytokinenbepaling in lymfocyten, werd reeds uitvoerig beschreven door meerdere
onderzoekers. In een eerste deel (Hoofdstuk II) wordt de intracellulaire bepaling van
cytokinen in monocyten op punt gesteld. Voor intracellulaire bepaling van
geproduceerde cytokinen is het noodzakelijk dat secretie van geproduceerde
cytokinen genhibeerd wordt. Uit de resultaten blijkt dat brefeldin A efficinter is dan
monensin voor de inhibitie van secretie van cytokinen in monocyten ter hoogte van
het Golgi apparaat.

Vermits in de hierop volgende gerapporteerde studies steeds gebruik wordt gemaakt

van en flow cytometrische techniek, die intracellulair cytokinen bepaalt, wordt in
Hoofdstuk III deze intracellulaire techniek vergeleken met een extracellulaire
methode, de flow cytometrische microsfeer based Immunoassay (FMBA). Deze
extracellulaire techniek maakt gebruik van microsferen, waarop anti-cytokinen
antilichamen gebonden zijn, die aanwezig cytokine in serum of supernatans kunnen
binden. Op zijn beurt wordt het op de microsfeer gebonden cytokine flow
cytometrisch gedetecteerd met anti-cytokine antilichamen, die gemerkt zijn met een
fluorochroom. Een goede correlatie tussen intracellulaire cytokinen bepaling en
extracellulaire cytokinen secretie wordt aangetoond.

In een volgend deel (Hoofdstuk IV) van deze thesis worden type 1 (IL-2, IFN-) en
type 2 (IL-4, IL-5) cytokinen intracellulair bepaald bij verschillende immunologische
aandoeningen: in een transversale studie worden simultaan in CD4+ and CD8+ T-
lymfocyten cytokinenprofielen bepaald bij patinten met reumatode artritis,
behandeld met salazopyrine of methotrexaat, bij patinten met allergisch astma, bij
patinten met atopisch eczeem en controlepersonen. Er wordt aangetoond dat
klinische stabiele RA patinten onder therapie toch een overwicht aan type 1
cytokine producerende T-lymfocyten vertonen in vergelijking met IgE gemedieerde
aandoeningen (astma, atopisch eczeem). Een positieve correlatie wordt gevonden
tussen type 1 cytokine productie en ziekteactiviteitsparameters bij RA patinten.
Alhoewel een overwicht aan type 2 cytokine wordt verwacht bij de IgE gemedieerde
aandoeningen, wordt enkel bij patinten met actief atopisch eczeem een verhoogde
productie aan een type 2 cytokine, namelijk IL-4, vastgesteld.

Uit de resultaten van de vorige studie kan men afleiden dat er mogelijks een invloed
is op cytokinenprofielen door ziekteactiviteit en therapeutische interventie. Daarom
wordt vervolgens nagegaan of therapeutische interventies veranderingen in het
cytokinenprofiel van enerzijds type 1 en anderzijds type 2 aandoeningen kunnen
veroorzaken.

In tegenstelling tot astma en atopisch eczeem; kan hymenoptera allergie snel en

efficint behandeld worden met semi-rush immunotherapie. Aangezien
immunotherapie een duidelijke switch induceert van een allergische status voor
wespen gif naar klinische tolerantie, worden immunologische veranderingen tijdens
immunotherapie van wesp allergische patinten gevalueerd; in een eerste
prospectieve studie (Hoofdstuk V) wordt dus de invloed van wesp immunotherapie
bestudeerd op het cytokinenprofiel van deze wesp allergische patinten.

In een tweede prospectieve studie (Hoofdstuk VI) wordt het cytokinenprofiel van RA
patinten gevalueerd voor en na behandeling met zogenaamde disease-modifying
anti-rheumatic drugs (DMARDs), waarvan men aanneemt dat ze het verloop van het
ziekteproces in gunstige zin kunnen benvloeden en niet enkel de symptomen
behandelen.

In deze prospectieve studies (Hoofdstuk V en VI) wordt duidelijk dat type 1 en type 2
cytokinen productie benvloed wordt door behandeling van patinten, enerzijds door
toediening van disease-modifying anti-rheumatic drugs (DMARDs) bij reumatode
artritis patinten (type 1), anderzijds door wesp immunotherapie bij patinten met
wesp allergie (type 2). Een normalisatie en verschuiving van de cytokinen balans
treedt op door behandeling van type 1 en type 2 aandoeningen.
In een volgend gedeelte (Hoofdstuk VII) wordt de invloed nagegaan van anti-TNF-
therapie op het cytokinenprofiel in T-lymfocyten en monocyten bij RA patinten.
Tumor necrosis factor alpha (TNF-), een cytokine dat vooral door monocyten en
macrofagen wordt geproduceerd, speelt een belangrijke rol bij auto-immuunziekten.
Er werd in muizenmodellen aangetoond dat anti-TNF- therapie de activiteit van
TNF- inhibeert en de ontwikkeling en inflammatie bij collageen genduceerde artritis
reduceert. Klinische studies rapporteren dat anti-TNF- therapie bij patinten met
actieve reumatode artritis, die niet reageerden op methotrexaat behandeling,
aanleiding geven tot een duidelijk verlaagde ziekteactiviteit. In hoofdstuk VII wordt de
invloed nagegaan van anti-TNF- therapie op de ziekteactiviteit (in vivo) en op het
cytokinen profiel (IL-2, IL4, IFN-, IL-10, IL-12, IL-1, IL-6, TNF-) in T-lymfocyten en
monocyten van patinten met reumatode artritis (in vitro).

Uit vorige hoofdstukken is gebleken dat reumatode artritis gekenmerkt is door

accumulatie van inflammatoire cellen (zowel T-lymfocyten als monocyten) in het
synovium en perifeer bloed, die pro-inflammatoire cytokinen produceren. Daarnaast
wordt destructie van het kraakbeen in de gewrichten bij RA patinten gezien. Het
doel van deze studie (Hoofdstuk VIII) is de invloed nagaan van pro-inflammatoire en
anti-inflammatoire cytokinen op chondrocyten. Er wordt een in vitro incubatie
uitgevoerd van chondrocyten met pro-inflammatoire cytokinen zoals recombinant IL-
1, IL-6, IFN- en met een anti-inflammatoir cytokine, namelijk IL-4. Er wordt
nagegaan of proliferatie, groei en viabiliteit van chondrocyten kan benvloed worden
door deze cytokinen. Ook inflammatoire mediatoren zoals zuurstofradicalen en
stikstofoxide (NO) productie worden bepaald. Uit de resultaten blijkt dat pro-
inflammatoire cytokinen apoptose van chondrocyten kunnen induceren en dat IL-4
als anti-inflammatoir cytokine enkel in zeer hoge concentraties het effect van pro-
inflammatoire cytokinen op viabiliteit en NO productie kan inhiberen.

In de pathogenese van reumatode artritis is de rol van immuuncomplexen nog niet

volledig gekend. Immuuncomplexen komen voor in serum, synoviaal vocht en
daarenboven in de oppervlakkige lagen van het gewrichtskraakbeen. Via Fc
receptoren op de chondrocyt kunnen deze immuuncomplexen interageren met
chondrocyten. In een laatste deel van deze thesis (Hoofdstuk IX) wordt de invloed
van immuuncomplexen op de chondrocyten functie bestudeerd in een pro-
inflammatoir milieu met cytokinen (IL-1, TNF-, IFN-), zoals in het synoviaal vocht
van patinten met reumatode artritis wordt aangetroffen. Er wordt aangetoond dat
kraakbeen destructie in RA gedeeltelijk kan verklaard worden door immuuncomplex
gemedieerde apoptose van chondrocyten in een pro-inflammatoir milieu.

We kunnen besluiten dat dit werk aantoont dat cytokinen een rol spelen, enerzijds in
reumatode artritis en anderzijds in allergische aandoeningen. Verder kan de
kraakbeendestructie bij reumatode artritis mogelijks verklaard worden door apoptose
van chondrocyten, genduceerd door pro-inflammatoire cytokinen en
immuuncomplexen.