Pruebas Microbiologicas 2 Final

INDUSTRIA FARMACUTICA UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA IX CICLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA
BPL de la OMS
Introduccin y alcance del documento Los laboratorios de microbiologa farmacutica pueden
involucrarse en:
Ensayos de esterilidad
Deteccin, aislamiento, recuento e identificacin de microorganismos y pruebas de endotoxinas

bacterianas en diferentes materiales, productos, superficies, vestimentas y el medio ambiente.
Valoracin usando microorganismos como parte del sistema de pruebas.
Se deben establecer lmites de aceptacin de los resultados de la medicin cepas de referencia

Microorganismos definidos al menos a nivel de gnero y especie, catalogados y descritos de acuerdo
a sus caractersticas e indicando preferiblemente su origen.
Buenas prcticas de la OMS para laboratorios de microbiologa farmacutica

1. Personal
1.1. Los ensayos microbiolgicos deben ser realizados y supervisados por una persona
experimentada, calificada en microbiologa o su equivalente. El personal debe tener
entrenamiento bsico en microbiologa y experiencia prctica relevante antes de ser
autorizado a realizar el trabajo que implican los ensayos microbiolgicos.
1.2. Se deben mantener descripciones de los puestos de trabajo vigentes para todo el personal
involucrado en ensayos y/o calibraciones, validaciones y verificaciones. El laboratorio
tambin debe mantener registros de todo el personal tcnico, describiendo sus reas de
competencia, entrenamiento y experiencia.
1.3. Si el laboratorio incluye opiniones e interpretaciones de los resultados de los ensayos en
los informes, estos deben ser hechos por personal autorizado con experiencia adecuada y
conocimientos relevantes de la aplicacin especfica incluyendo, por ejemplo, requisitos
regulatorios y tecnolgicos y criterios de aceptacin.
1.4. La gerencia del laboratorio debe asegurar que todo el personal haya recibido un
entrenamiento adecuado para la ejecucin competente de los ensayos y el manejo de los
equipos. Esto debe incluir entrenamiento en tcnicas bsicas, ej. vertido de medio de
cultivo en placas, recuento de colonias, tcnica asptica, preparacin de medios, dilucin
en serie y tcnicas bsicas de identificacin, determinando la aceptabilidad con criterios
objetivos cuando sea relevante. El personal solo puede realizar ensayos de muestras si se
ha reconocido su competencia para realizar dichos ensayos o los realizan bajo supervisin
adecuada. Se debe monitorear la competencia de manera continua con la previsin de un
reentrenamiento, cuando sea necesario. Cuando un mtodo o tcnica no se usa
regularmente, se debe verificar la competencia del personal para realizar dicho ensayo
antes de llevarlo a cabo. En algunos casos es aceptable relacionar la competencia a una
tcnica general o instrumento en uso en lugar de relacionarla a mtodos particulares.
1.5. El personal debe estar entrenado en los procedimientos necesarios para la contencin de
microorganismos dentro de las instalaciones del laboratorio.
1.6. El personal debe estar entrenado en el manejo seguro de microorganismos.
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2. Medio ambiente
2.1. Dependencias
2.1.1. Los laboratorios microbiolgicos y algunos equipos de apoyo (ej. autoclaves y
material de vidrio) deben ser de dedicacin exclusiva y estar separados de otras reas,
especialmente de las reas de produccin.
2.1.2. Los laboratorios microbiolgicos deben estar diseados para adaptarse a las
operaciones que se llevan a cabo en los mismos. Debe haber espacio suficiente para
todas las actividades de manera tal de evitar confusiones, contaminacin y
contaminacin cruzada. Debe haber espacio suficiente y adecuado para las muestras,
microorganismos de referencia, medios (con enfriamiento, si fuera necesario),
ensayos y registros. Debido a la naturaleza de algunos materiales (ej. medios de cultivo
estriles vs. microorganismos de referencia o cultivos incubados), puede ser necesario
disponer de lugares de almacenamiento separados.
2.1.3. Los laboratorios deben disearse adecuadamente y debe tenerse en cuenta la aptitud
de los materiales de construccin para permitir una adecuada limpieza y desinfeccin
y minimizar el riesgo de contaminacin.
2.1.4. Los suministros de aire para los laboratorios y para las reas de produccin deben
estar separados. Los laboratorios de microbiologa deben contar con unidades de
manejo de aire separadas y otras provisiones, incluyendo controles de temperatura y
humedad cuando se requieran. El aire suministrado al laboratorio debe ser de calidad
adecuada y no debe representar una fuente de contaminacin.
2.1.5. El acceso al laboratorio de microbiologa debe estar restringido al personal
autorizado. El personal debe estar al tanto de:
a) Los procedimientos adecuados de ingreso y salida, incluyendo la vestimenta
b) El uso previsto de un rea determinada
c) Las restricciones impuestas al trabajo dentro de tales reas
d) Las razones por las cuales se imponen tales restricciones
e) Los niveles apropiados de contencin.
2.1.6. Las actividades del laboratorio, tales como la preparacin de la muestra, la
preparacin de medios de cultivo y de equipos y el recuento de microorganismos,
deben estar segregadas en espacios diferentes o al menos por tiempos, con la
finalidad de minimizar el riesgo de contaminacin cruzada y los resultados falsos
positivos o falsos negativos. Cuando se utilizan reas no dedicadas se deben aplicar
los principios de la gestin de riesgos. El ensayo de esterilidad siempre debe realizarse
en un rea de dedicacin exclusiva.
2.1.7. Se debe considerar el diseo de reas clasificadas que sean adecuadas para las
operaciones a desarrollar dentro del laboratorio de microbiologa. La clasi- Buenas
prcticas de la OMS para laboratorios de microbiologa farmacutica 3 ficacin se
debe basar en la criticidad del producto y la operacin a llevarse a cabo en el rea. El
ensayo de esterilidad debe realizarse en la misma clase de rea usada para las
operaciones de fabricacin estril/asptica de productos. El Apndice 1 presenta
recomendaciones para la clasificacin de zonas.
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2.1.8. En general, los equipos de laboratorio no deben moverse rutinariamente entre reas
de diferente clase de limpieza para evitar la contaminacin cruzada accidental. Los
equipos de laboratorio utilizados en el laboratorio de microbiologa no deben usarse
fuera del rea de microbiologa, a menos que existan precauciones especficas para
prevenir la contaminacin cruzada.
2.2. Monitoreo ambiental en el laboratorio
2.2.1. Cuando sea necesario y apropiado (ej. en reas para ensayos de esterilidad) debe
establecerse un programa de monitoreo ambiental que cubra, por ejemplo, el uso de
monitoreo de aire activo, placas de sedimentacin o placas de contacto, diferenciales
de presin y temperatura. Se deben definir lmites de alerta y de accin. Debe
realizarse un anlisis de tendencia de los resultados del monitoreo ambiental.
2.3. Limpieza, desinfeccin e higiene
2.3.1. Se debe contar con un programa documentado de limpieza y desinfeccin. Cuando
sea relevante, se deben considerar los resultados del monitoreo ambiental.
2.3.2. Se debe contar con un procedimiento para el manejo de derrames.
2.3.3. Se debe disponer de instalaciones adecuadas para lavado y desinfeccin de manos.
2.4. Instalaciones para el ensayo de esterilidad
2.4.1. Las instalaciones para el ensayo de esterilidad tienen requisitos ambientales
especficos para asegurar la integridad de los ensayos realizados. Las Buenas prcticas
de fabricacin (BPF) de la OMS para productos farmacuticos estriles (8) requieren
la ejecucin del ensayo de esterilidad y especifican los requisitos para el mismo. Esta
seccin detalla los requisitos de cuarto limpio para una instalacin de ensayo de
esterilidad.
2.4.2. El ensayo de esterilidad se debe realizar bajo condiciones aspticas, las cuales deben
ser equivalentes a las normas de calidad de aire requeridas para la fabricacin asptica
de productos farmacuticos. Las dependencias, servicios y equipos deben estar
sujetos a un proceso de calificacin apropiado.
2.4.3. El ensayo de esterilidad se debe llevar a cabo dentro de una zona protegida con flujo
de aire unidireccional de Grado A o una cabina de bioseguridad (si se justifica), que
debe localizarse dentro de un cuarto limpio con un entorno de Grado B.
Alternativamente, el ensayo puede realizarse dentro de un aislador. 4 Serie Red PARF
- Documento Tcnico N 11 Se debe tener cuidado con el diseo de las instalaciones y
los patrones de flujo de aire de los ambientes, para asegurar que el flujo de aire
unidireccional no sea perturbado.
2.4.4. La clasificacin de cuartos limpios y los equipos de manejo de aire de las instalaciones
para ensayos de esterilidad deben recalificarse por lo menos una vez al ao por una
persona o contratista competente. El ambiente debe cumplir con los lmites de
partculas no viables y viables y se debe realizar la verificacin de la integridad de los
filtros de partculas de aire de alta eficiencia (HEPA, por sus siglas en ingls). No
obstante, se puede justificar una frecuencia alternativa de monitoreo basada en la
gestin de riesgos de calidad (QRM, por sus siglas en ingls). Se debe documentar el
mapeo de los puntos de muestreo para el monitoreo rutinario, as como el tiempo de
exposicin, y debe especificarse en procedimientos escritos la frecuencia de todos los
tipos de monitoreo microbiolgico ambiental.
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2.4.5. El aire suministrado a las zonas de Grado A y B debe filtrarse a travs de filtros HEPA
terminales.
2.4.6. Deben proveerse alarmas apropiadas del flujo de aire, diferenciales de presin e
instrumentos indicadores [BPF: Sistemas de calentamiento, ventilacin y aire
acondicionado para formas farmacuticas no estriles (8); y BPF para productos
farmacuticos estriles (8)].
2.4.7. Se deben tomar y registrar las lecturas de presin en los cuartos desde medidores
externos a menos que sea instalado un sistema de monitoreo continuo validado.
Como mnimo, se deben tomar las lecturas antes de que ingrese el operador al cuarto
del ensayo. El medidor de presin se debe rotular para indicar el rea en servicio y las
especificaciones aceptables.
2.4.8. El ingreso al cuarto limpio debe realizarse a travs de un sistema de exclusas y un
vestuario donde se requiere que los operadores se pongan vestimenta de cuarto
limpio. El ltimo vestuario debe tener en condiciones de reposo el mismo grado de
limpieza que el cuarto de ensayo al que comunica. Los vestuarios deben ser de tamao
adecuado para facilitar el cambio de vestimenta. Debe haber una clara demarcacin
de las diferentes zonas.
2.4.9. La vestimenta para el operador del ensayo de esterilidad debe cumplir con los
principios de la seccin 10 de las BPF de la OMS para productos farmacuticos estriles
(8). Los operadores deben estar entrenados y certificados en los procedimientos de
vestimenta y se deben mantener los registros del entrenamiento.
2.4.10. Los accesorios y acabados de las dependencias deben cumplir con la seccin 11 de
las BPF de la OMS para productos farmacuticos estriles (8).
2.4.11. El monitoreo microbiolgico ambiental debe reflejar la instalacin utilizada (cuarto
o aislador) e incluir una combinacin de mtodos de muestreo de aire y superficie
apropiados para la instalacin, como por ejemplo:
a) Muestreo de aire activo
b) Placas de sedimentacin (exposicin)
c) Superficie de contacto
d) Placas RODAC para deteccin y recuento de microorganismos, hisopos o pelculas
flexibles
e) Impresiones de los guantes del operador. El monitoreo microbiolgico ambiental
de la zona del ensayo de esterilidad se debe realizar durante cada sesin de trabajo
bajo las condiciones operativas (dinmicas).
Se debe contar con especificaciones escritas, incluyendo lmites de alerta y accin
apropiados para la contaminacin microbiana. Los lmites para el monitoreo
microbiolgico ambiental se presentan en las BPF de la OMS para productos
farmacuticos estriles (8).
3. Validacin de mtodos de ensayo
3.1. Los mtodos de ensayo estndares (farmacopeicos) se consideran validados. Sin embargo,
se necesita demostrar que el mtodo de ensayo especfico a ser utilizado por un
determinado laboratorio para el anlisis de un producto dado es adecuado para su uso en
la recuperacin de bacterias, levaduras y hongos filamentosos en presencia del producto
especfico. El laboratorio debe demostrar que los criterios de desempeo del mtodo de
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ensayo estndar pueden ser satisfechos por el laboratorio antes de introducir el ensayo
como ensayo de rutina (verificacin del mtodo) y que el mtodo de ensayo especfico para
un producto dado es adecuado (aptitud del mtodo de ensayo incluyendo controles
positivos y negativos).
3.2. Los mtodos de ensayo que no se basan en las farmacopeas u otras referencias reconocidas
deben ser validados antes de su uso. La validacin debe incluir, cuando sea apropiado,
determinacin de la exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de
cuantificacin, linealidad y robustez. Los potenciales efectos inhibitorios de la muestra
deben tomarse en cuenta al analizar diferentes tipos de muestra. Los resultados deben
evaluarse con mtodos estadsticos apropiados, ej. los descritos en las farmacopeas
nacionales, regionales o internacionales.
4. Equipamiento
Cada equipo, instrumento u otro dispositivo utilizado para el anlisis, verificacin y calibracin
debe identificarse individualmente. Como parte de su sistema de calidad, el laboratorio debe
tener un programa documentado para la calificacin, calibracin, verificacin del desempeo y
mantenimiento de sus equipos y un sistema para el monitoreo del uso de los mismos.
4.1. Mantenimiento de equipos
4.1.1. El mantenimiento de los equipos esenciales debe llevarse a cabo en intervalos
predeterminados de acuerdo con un procedimiento documentado. Deben
mantenerse registros detallados. (Para ejemplos de mantenimiento de equipos y de
intervalos, ver Apndice 2).
4.2. Calificacin
4.2.1. Para la calificacin de los equipos ver las secciones 8 y 12 de Buenas prcticas para
los laboratorios de control de calidad de productos farmacuticos (1).
4.3. Calibracin, verificacin de desempeo y monitoreo de uso
4.3.1. La fecha de calibracin y mantenimiento y la fecha en que debe realizarse la
recalibracin deben indicarse claramente en una etiqueta adherida al instrumento.
4.3.2. La frecuencia de calibracin y verificacin de desempeo se determinar por la
experiencia documentada y se basar en la necesidad, el tipo y el desempeo previo
del equipo. Los intervalos entre la calibracin y verificacin deben ser ms cortos que
el tiempo en el que el equipo ha demostrado desviarse de los lmites aceptables. (Para
ejemplos de chequeos e intervalos de calibracin para los diferentes equipos de
laboratorio, ver el Apndice 3; y para calificacin y monitoreo de equipos, ver el
Apndice 4). El desempeo de los equipos debe ajustarse a criterios de aceptacin
predefinidos.
4.3.3. Dispositivos de medicin de temperatura
4.3.3.1. Cuando la temperatura tiene un efecto directo sobre el resultado de un
anlisis o es crtica para el correcto funcionamiento de los equipos, los
dispositivos de medicin de temperatura deben ser de la calidad apropiada para
alcanzar la exactitud requerida (ej. termmetros de lquido en vidrio,
termocuplas y termmetros de resistencia de platino (TRP) empleados en las
incubadoras y autoclaves).
4.3.3.2. La calibracin de los dispositivos debe ser trazable a estndares de
temperaturas nacionales o internacionales.
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4.3.4.Incubadoras, baos de agua y hornos La estabilidad de la temperatura, la uniformidad

de la distribucin de la temperatura y el tiempo necesario para alcanzar condiciones
de equilibrio en las incubadoras, baos de agua, hornos y cuartos de temperatura
controlada deben establecerse inicialmente y documentarse, en particular para los
usos habituales (por ejemplo, posicin y altura de las pilas de placas de Petri y el
espacio libre entre las mismas). La constancia de las caractersticas registradas
durante la validacin inicial del equipo debe chequearse y registrarse despus de cada
reparacin o modificacin significativa. La temperatura de operacin de estos equipos
debe monitorearse y registrarse. Se debe considerar el uso de los equipos al
determinar cules son los controles de temperatura requeridos.
4.3.5.Autoclaves, incluidos los preparadores de medios
4.3.5.1. Los autoclaves deben poder cumplir con las tolerancias de tiempo y
temperatura especificadas; el monitoreo exclusivo de la presin no es aceptable.
Los sensores utilizados para controlar o monitorear los ciclos operativos
requieren calibracin y el desempeo de los temporizadores debe verificarse.
4.3.5.2. La validacin inicial debe incluir estudios de desempeo (distribucin
espacial de la temperatura) para cada ciclo operativo y cada configuracin de
carga usada en la prctica. Se debe repetir este proceso despus de cualquier
reparacin o modificacin significativa (ej. reemplazo de la sonda
termorreguladora o programador, cambio en la disposicin de la carga o en el
ciclo operativo) o cuando sea indicado por los resultados de los controles de
calidad en los medios o la evaluacin de riesgos. Se deben colocar sensores de
temperatura suficientes dentro de la carga (ej. en recipientes llenos de
lquido/medio) para permitir demostrar las diferencias debidas a la ubicacin.
En el caso de los preparadores de medios, cuando el calentamiento uniforme no
se pueda demostrar por otros medios, el uso de dos sensores, uno junto a la
sonda de control y otro distante, en general, se considera apropiado. La
validacin y revalidacin deben considerar la pertinencia de los tiempos de
ascenso y descenso de las temperaturas as como el tiempo de permanencia a la
temperatura de esterilizacin.
4.3.5.3. Deben proporcionarse instrucciones operativas claras, basadas en los
perfiles de calentamiento determinados para los usos habituales durante la
validacin/revalidacin. Se deben establecer los criterios de aceptacin/rechazo
y mantener los registros de operacin del autoclave, incluyendo la temperatura
y el tiempo, para cada ciclo.
4.3.5.4. El monitoreo puede realizarse a travs de uno de los siguientes
procedimientos:
a) Uso de una termocupla y registrador para generar un grfico o
impresin
b) Observacin directa y registro de la temperatura mxima alcanzada y el
tiempo a esa temperatura. Adems de monitorear directamente la
temperatura de un autoclave, la eficiencia de su funcionamiento
durante cada ciclo se puede chequear por el uso de indicadores
qumicos o biolgicos para los propsitos de esterilizacin o
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descontaminacin. La cinta de autoclave o las tiras indicadoras deben

utilizarse slo para demostrar que una carga ha sido procesada, pero no
para demostrar que se ha completado un ciclo aceptable. Los
laboratorios deben tener un autoclave dedicado a la descontaminacin.
No obstante, en casos excepcionales, un nico autoclave puede ser
aceptable siempre que se tomen precauciones exhaustivas para separar
las cargas de descontaminacin y de esterilizacin, y se cuente con un
programa de limpieza documentado que considere tanto los entornos
interno como externo del autoclave.
4.3.6. Pesas y balanzas Las pesas y balanzas deben calibrarse en forma trazable a intervalos
regulares (de acuerdo a su uso previsto) usando las pesas estndares apropiadas,
trazables a pesas estndares certificadas.
4.3.7. Equipo volumtrico
4.3.7.1. Los laboratorios de microbiologa deben llevar a cabo la verificacin inicial
del equipo o material volumtrico (dispensadores automticos,
dispensadores/dilutores, pipetas mecnicas de carga manual y pipetas
desechables) y luego hacer chequeos regulares, segn corresponda, para
asegurar que el equipo se desempea dentro de las especificaciones requeridas.
La verificacin inicial no es necesaria para el material de vidrio que haya sido
certificado para una tolerancia especfica. El equipo volumtrico se debe
chequear en cuanto a la exactitud del volumen entregado en funcin del
volumen definido (varios volmenes en el caso de instrumentos de volmenes
variables) y se debe medir la precisin de las entregas de volumen repetidas.
4.3.7.2. En el caso de equipos volumtricos desechables de uso nico, los
laboratorios deben obtenerlos de compaas con un sistema de calidad
relevante y reconocido. Despus de la validacin inicial de la aptitud de un
equipo, se recomienda efectuar chequeos aleatorios de la exactitud del mismo.
Si el proveedor no tiene un sistema de calidad reconocido, los laboratorios
deben chequear cada lote de equipos para determinar su aptitud.
4.3.8. Otros equipos Los conductmetros, medidores de oxgeno, medidores de pH y otros
instrumentos similares deben verificarse regularmente o antes de cada uso. Las
soluciones amortiguadoras usadas en la verificacin deben almacenarse en
condiciones apropiadas y etiquetarse con una fecha de vencimiento. Cuando la
humedad sea importante para el resultado del ensayo, los higrmetros deben
calibrarse, y la calibracin debe ser trazable a estndares nacionales o internacionales.
Los temporizadores, incluyendo el temporizador del autoclave, se deben verificar
usando un temporizador calibrado o la seal horaria nacional. Buenas prcticas de la
OMS para laboratorios de microbiologa farmacutica 9 Cuando se utilizan centrfugas
en los procedimientos del ensayo, se debe hacer una evaluacin de las revoluciones
por minuto (rpm). Cuando sea crtica, la centrfuga debe calibrarse.
5. Reactivos y medios de cultivo Los laboratorios deben asegurar que la calidad de los
reactivos y los medios utilizados es apropiada para el ensayo en cuestin.
5.1. Reactivos
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5.1.1. Los laboratorios deben verificar la aptitud de cada lote de reactivos crticos para el
ensayo, inicialmente y durante su vida til.
5.2. Medios
5.2.1. Los medios pueden prepararse en el laboratorio o comprarse, ya sea parcial o
totalmente preparados. Los proveedores de los medios deben estar aprobados y
calificados. El proveedor calificado puede certificar algunos de los parmetros de
calidad detallados posteriormente. La prueba de promocin del crecimiento y, si
fueran apropiadas, otras pruebas de desempeo adecuadas (ver la seccin 5.2.2),
deben realizarse para todos los medios, en cada lote y en cada envo. Cuando el
proveedor de medios totalmente preparados est calificado y provee certificacin de
la promocin del crecimiento para cada lote de medio y las condiciones de transporte
han sido calificadas, el usuario puede confiar en el certificado del fabricante con una
verificacin peridica de sus resultados.
5.2.2. El desempeo adecuado de los medios de cultivo, diluyentes y otros lquidos de
suspensin se debe chequear, cuando sea relevante, en relacin a:
a) Recuperacin o mantenimiento de la supervivencia de los microorganismos
objetivo o blanco. Se debe demostrar una recuperacin del 50-200% despus de
la inoculacin de no ms de 100 unidades formadoras de colonias (UFC o ufc)
b) Inhibicin o supresin de los microorganismos diferentes al objetivo o blanco
c) Propiedades bioqumicas (diferenciales y de diagnstico)
d) Otras propiedades adecuadas (ej. pH, volumen y esterilidad). Se prefieren los
procedimientos cuantitativos para la evaluacin de la recuperacin o
supervivencia.
5.2.3. Las materias primas (tanto formulaciones comerciales deshidratadas como
componentes individuales) y los medios deben almacenarse bajo las condiciones
apropiadas recomendadas por el fabricante, ej. ambiente fresco, seco y oscuro. Todos
los envases, especialmente aquellos de medios deshidratados, deben estar
hermticamente sellados. Los medios deshidratados que estn apelmazados o
agrietados o muestren un cambio de color no deben utilizarse.
5.2.4. Para la preparacin se debe usar agua de calidad microbiolgica adecuada y libre de
sustancias bactericidas, inhibidoras o interferentes, a menos que el mtodo de ensayo
especifique algo diferente.
5.2.5. Los medios conteniendo antimetabolitos o inhibidores se deben preparar utilizando
material de vidrio dedicado para esos medios, debido a que el arrastre de estos
agentes dentro de otros medios podra inhibir el crecimiento y la deteccin de
microorganismos presentes en la muestra en anlisis. Si no se emplea material de
vidrio dedicado, los procedimientos de lavado para el material de vidrio deben estar
validados.
5.2.6. La distribucin de los medios despus de la esterilizacin debe realizarse bajo flujo de
aire unidireccional (UDAF, por sus siglas en ingls) para minimizar la posibilidad de
contaminacin ambiental. Esto debe considerarse como un requisito mnimo para los
medios que se usan en ensayos de productos estriles, e incluye el enfriamiento de
los medios, ya que las tapas de los envases necesitarn ser retiradas durante el
enfriamiento para prevenir la condensacin.
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5.2.7. Los medios en placa a ser irradiados pueden requerir la adicin de un antioxidante y
secuestrador de radicales libres que protege de los efectos del proceso de irradiacin.
Los medios irradiados deben validarse mediante la realizacin de pruebas
cuantitativas de promocin del crecimiento en ambos medios, irradiados y no
irradiados.
5.2.8. Se debe determinar y verificar el periodo de vida til de los medios preparados, bajo
condiciones definidas de almacenamiento.
5.2.9. Los lotes de los medios deben ser identificables y su conformidad con las
especificaciones de calidad debe quedar documentada. Para los medios comprados,
el laboratorio usuario debe asegurarse de que ser notificado por el fabricante de
cualquier cambio en las especificaciones de calidad del producto.
5.2.10. Los medios deben prepararse de acuerdo con todas las instrucciones del fabricante,
teniendo cuidadosamente en cuenta especificaciones tales como el tiempo y la
temperatura de esterilizacin.
5.2.11. Los dispositivos de microondas no deben utilizarse para la fusin de los medios
debido a la distribucin desigual del proceso de calentamiento.
5.3. Etiquetado
5.3.1. Los laboratorios deben asegurar que todos los reactivos (incluidas las soluciones stock
o de reserva), medios, diluyentes y otros lquidos de suspensin, estn
adecuadamente etiquetados para indicar, segn corresponda, la identidad,
concentracin, condiciones de almacenamiento, fecha de preparacin, fecha Buenas
prcticas de la OMS para laboratorios de microbiologa farmacutica 11 de
vencimiento validada y/o perodos de almacenamiento recomendados. La persona
responsable de la preparacin se debe poder identificar a partir de los registros.
5.4. Reanimacin de microorganismos
5.4.1. La reanimacin de microorganismos es necesaria cuando las metodologas de ensayo
pueden producir clulas daadas sub-letalmente. Por ejemplo, por exposicin a:
a) Efectos dainos del proceso, ej. Calor
b) Agentes antimicrobianos
c) Conservantes
d) Extremos de presin osmtica
e) Extremos de pH.
5.4.2.La reanimacin de microorganismos se puede lograr mediante:
a) Exposicin a un medio lquido como una simple solucin salina a temperatura
ambiente durante 2 horas
b) Exposicin a un medio de reparacin slido durante 4-6 horas.
6. Materiales de referencia y cultivos de referencia
6.1. Estndares internacionales y sustancias de referencia farmacopeicas
6.1.1. Los materiales de referencia y materiales de referencia certificados son generalmente
usados en un laboratorio de microbiologa para calificar, verificar y calibrar equipos.
Siempre que sea posible, estos materiales de referencia deben utilizarse en matrices
apropiadas. Los estndares internacionales y las sustancias de referencia
farmacopeicas se emplean, por ejemplo, para:
a) Determinar potencia o contenido
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b) Validar mtodos
c) Comparar mtodos
d) Realizar controles positivos
e) Realizar las pruebas de promocin del crecimiento.
Si fuera posible, los materiales de referencia deben usarse en matrices apropiadas.
6.2. Cultivos de referencia
6.2.1. Los cultivos de referencia se requieren para establecer el desempeo aceptable de
los medios (incluidos los kits de ensayos), para validar mtodos, verificar la aptitud de
los mtodos de ensayo y para determinar o evaluar el desempeo en curso. La
trazabilidad es necesaria, por ejemplo, cuando se establece el desempeo de los
medios para las validaciones de los mtodos y kits de ensayos. Para demostrar la
trazabilidad, los laboratorios deben utilizar cepas de referencia de microorganismos
obtenidas directamente de una coleccin nacional o internacional reconocida, cuando
stas existan. Alternativamente, se pueden emplear derivados comerciales para los
cuales el laboratorio ha demostrado la equivalencia de todas las propiedades
relevantes en el punto de uso.
6.2.2. Las cepas de referencia pueden ser subcultivadas una sola vez para proporcionar
stocks de referencia. Se deben realizar chequeos de pureza y bioqumicos en forma
paralela segn correspondan. Se recomienda almacenar los stocks de referencia en
alcuotas ya sea congeladas o liofilizadas. Los cultivos de trabajo para el uso rutinario
deben ser subcultivos primarios de los stocks de referencia (ver el Apndice 5 sobre el
uso general de cultivos de referencia). Si los stocks de referencia han sido
descongelados, no deben volver a congelarse ni reutilizarse.
6.2.3. Normalmente, los cultivos de trabajo no se deben subcultivar. Usualmente, no ms
de cinco generaciones (o pasajes) de la cepa de referencia original pueden ser
subcultivadas si ello est definido en un mtodo estndar o si el laboratorio puede
proveer pruebas documentales de que no ha habido cambio en ninguna propiedad
relevante. Derivados comerciales de las cepas de referencia slo pueden ser usados
como cultivos de trabajo.
7. Muestreo:
7.1. Cuando los laboratorios de ensayo son responsables del muestreo primario para obtener
las muestras de ensayo, es altamente recomendable que este muestreo est cubierto por
un sistema de garanta de calidad y sea objeto de auditoras peridicas.
7.2. Cualquier proceso de desinfeccin utilizado en la obtencin de la muestra (ej. desinfeccin
de los puntos de muestreo) no debe comprometer el nivel microbiano dentro de la
muestra.
7.3. El transporte y almacenamiento de las muestras deben realizarse en condiciones que
mantengan la integridad de la muestra (ej. refrigerada o congelada, cuando corresponda).
Los anlisis de las muestras se deben realizar lo ms pronto posible despus del muestreo.
Para las muestras en las que sea posible un crecimiento en la poblacin microbiana durante
el transporte y el almacenamiento, se deber demostrar que las condiciones de
almacenamiento, el tiempo y la temperatura no afectarn la exactitud del resultado de los
ensayos. Las condiciones de almacenamiento deben monitorearse y registrarse. La
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responsabilidad del transporte y almacenamiento entre el muestreo y la llegada al

laboratorio de ensayo debe estar claramente documentada.
7.4. El muestreo debe realizarse solo por personal capacitado. Se debe llevar a cabo en
condiciones aspticas utilizando equipos estriles. Se deben tomar las precauciones
adecuadas para asegurar que se mantenga la integridad de la muestra, usando envases
estriles sellados para la recoleccin de las muestras cuando corresponda. Puede ser
necesario monitorear las condiciones ambientales en el sitio de muestreo, por ejemplo, la
contaminacin del aire y la temperatura. El tiempo del muestreo se debe registrar, si fuese
necesario.
8. Manejo e identificacin de muestras
8.1. El laboratorio debe tener procedimientos que cubran la entrega y recepcin de las
muestras y la identificacin de las mismas. Si la muestra es insuficiente o se encuentra en
malas condiciones debido al deterioro fsico, temperatura incorrecta, envases rotos o
etiquetado deficiente, el laboratorio debe consultar con el cliente antes de decidir si va a
analizar o rechazar la muestra.
8.2. El laboratorio debe registrar toda la informacin relevante:
a) Fecha y, cuando sea relevante, la hora de la recepcin;
b) Condicin de la muestra al momento de la recepcin y, cuando sea necesario, la
temperatura
c) Caractersticas de la operacin de muestreo (incluyendo la fecha y condiciones de
muestreo).
8.3. Las muestras en espera de los ensayos deben almacenarse en condiciones adecuadas para
minimizar los cambios en cualquier poblacin microbiana presente. Las condiciones de
almacenamiento deben estar validadas, definidas y registradas.
8.4. Los envases y etiquetas de las muestras pueden estar altamente contaminados y deben
manipularse y almacenarse con cuidado a fin de evitar la propagacin de la contaminacin.
Los procesos de desinfeccin aplicados al envase exterior no deben afectar la integridad de
la muestra. Se debe destacar que el alcohol no es esporicida.
8.5. El submuestreo por parte del laboratorio, inmediatamente antes del ensayo, puede ser
requerido como parte del mtodo de ensayo. Puede ser apropiado llevarlo a cabo de
acuerdo a normas nacionales o internacionales, cuando existan, o por mtodos internos
validados. Los procedimientos de submuestreo deben disearse para recoger una muestra
representativa.
8.6. Debe haber un procedimiento escrito para la retencin y eliminacin de muestras. Si la
integridad de las muestras se puede mantener, puede ser apropiado almacenar las
muestras hasta que se obtengan los resultados de los ensayos o por ms tiempo, si fuera
necesario. Las porciones de muestras del laboratorio que se sabe estn contaminadas
deben descontaminarse antes de su eliminacin (ver seccin 11.1).
9. Eliminacin de residuos contaminados
9.1. Los procedimientos para la eliminacin de materiales contaminados deben disearse para
minimizar la posibilidad de contaminacin del ambiente o materiales de trabajo. Esta
cuestin corresponde a las buenas prcticas de gestin del laboratorio y debe ajustarse a
las regulaciones ambientales o sanitarias y de seguridad nacionales e internacionales.
10. Garanta de calidad de resultados y control de calidad de desempeo
pg. 11
10.1. Control de calidad interno

10.1.1. El laboratorio debe contar con un sistema de garanta de calidad o control de calidad
interno (ej. manejo de desvos, uso de muestras con agregados (spiked), repeticiones
de ensayos y participacin en ensayos de competencia o aptitud) para asegurar la
consistencia de resultados da a da y su conformidad con los criterios establecidos.
11. Procedimientos de ensayos
11.1. Los ensayos deben realizarse normalmente de acuerdo a los procedimientos
descritos en las farmacopeas nacionales, regionales o internacionales.
11.2. Pueden emplearse procedimientos de ensayos alternativos siempre que estn
debidamente validados y su equivalencia con mtodos oficiales haya sido demostrada.
12. Informes de ensayos
12.1. Si el resultado de un recuento es negativo, ste deber informarse como no
detectado para una unidad definida o menor que el lmite de deteccin para una unidad
definida. El resultado no deber informarse como cero para una unidad definida a
menos que esto sea un requisito regulatorio. Los resultados de los ensayos cualitativos
deben informarse como detectado/no detectado en una cantidad o volumen definido.
Estos tambin pueden expresarse como menor que un nmero especfico de
microorganismos para una unidad definida cuando el nmero especificado de
microorganismos supera el lmite de deteccin del mtodo y esto ha sido acordado con el
cliente. En los datos crudos el resultado no debe informarse como cero para una unidad
definida a menos que sea un requisito regulatorio. Un valor informado 0 puede usarse
para la entrada de datos y clculos o el anlisis de tendencias en bases de datos
electrnicas.
12.2. Cuando el informe de ensayo incluye una estimacin de la incertidumbre del
resultado del ensayo, cualquier limitacin (particularmente si la estimacin no incluye el
componente aportado por la distribucin de microorganismos dentro de la muestra) debe
aclarase con el cliente
pg. 12
PRUEBAS MICROBIOLOGICAS:
PROCEDIMIENTOS GENERALES:
1.PROCEDIMIENTO DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO Y APTITUD DEL

MTODO DE RECUPERACIN:
-Se establece la capacidad de detectar microorganismos de un producto en un medio neutralizado.
-Debe establecerse la capacidad promotora del crecimiento de los medios usados en este procedimiento.
1.1 Preparacin de Cepas de Pruebas:

Usar los cultivos de los siguientes microorganismos:1 Candida albicans (ATCC N 10231), Aspergillus
brasiliensis (ATCC N 16404), Escherichia coli (ATCC N 8739),. Pseudomonas aeruginosa (ATCC N 9027)
y Staphylococcus aureus (ATCC N 6538).
Para cosechar los cultivos bacterianos y de C. albicans, emplear solucin salina SR estril, lavar la superficie
de crecimiento y recogerlo en un recipiente adecuado. Para cosechar las esporas de A. brasiliensis, usar solucin
salina SR estril que contenga 0,05% de polisorbato8'. La suspensin de esporas debe tratarse aspticamente
(p.ej., filtracin a travs de lana de vidrio estril) para eliminar hitas. Todas las suspensiones microbianas deben
prepararse para garantizar que no se produce un traslado de medio de crecimiento residual del inculo (p.ej.,
centrifugacin seguida de resuspensin en un lquido de suspensin estril apropiado).
1.2 Promocin de crecimiento de los Medios

Los medios usados en este procedimiento deben ser capaces de permitir el crecimiento microbiano.Para medios
slidos, los recuentos obtenidos deben ser al menos 50% del valor calculado para un inculo estandarizado.
Para un inculo recientemente preparado, se produce un crecimiento de microorganismos comparable al
obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
2. ANLISIS DE PRODUCTOS
- CATEGORIS DE PRODUCTOS:
Existen 4 categoras para realizar un anlisis de productos:
pg. 13
- PROCEDIMIENTOS:
-Se realiza en 5 envases, pueden ser originales o bacteriolgicos
-Inocular cada envase o recipiente, segn corresponda, con uno de los inculos preparados y
normalizados, y mezclar. El volumen de suspensin del inculo empleado est entre 0,5% y 1,0% del
volumen del producto para minimizar los efectos potenciales en el producto.
-La concentracin de microorganismos de prueba agregados al producto (Categora 1; 2 3) es tal que
la concentracin final de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 x
105 y 1 x 106 ufc/mL del producto. En los productos de la Categora 4 (anticidos), la concentracin final
de la preparacin de prueba despus de la inoculacin est comprendida entre 1 x 103 y 1 x 104, ufc/mL
del producto.
-Incubar los envases o recipientes inoculados a 22,5 2,5. Tomar muestras de cada uno de ellos eri los
intervalos apropiados (especificados en la Tabla 3). Registrar todos los cambios de apariencia observados
en estos intervalos. Determinar mediante el procedimiento de recuento en placa el nmero de ufc
presentes en cada preparacin de prueba en los intervalos correspondientes.El recuento en placa se
realizar usando un mnimo de placas por duplicado con el nmero de ufc promediado antes de la
determinacin de ufc/mL deducido.
3- Criterios de Eficacia Antimicrobiana
pg. 14
4.INDICADORES BIOLGICOS-PRUEBAS DE RESISTENCIA
- Un indicador biolgico (BI, por sus siglas en ingls) es una preparacin bien caracterizada de un
microorganismo especfico de resistencia conocida a un proceso de esterilizacin especfico. El uso
correcto de los indicadores biolgicos en el desarrollo,validacin y control de los procesos de
esterilizacin requiere conocer con exactitud su poblacin y resistencia.
4.1 RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES
4.1.1 Recoleccin/Recuperacin de Muestras
INDICADORES DE PAPEL/FIBRA
-Retirar al menos cuatro muestras de prueba de sus envases individuales. Desmenuzar el indicador hasta
reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba en un vaso estril que contenga
100 mL de agua purificada esterilizada y enfriada a 2-8 y alterar mecnicamente: hasta lograr una
suspensin homognea. Para indicadores biolgicos autocontenidos, retirar aspticamente cuatro
portadores de indicador
biolgico de sus envases y proceder segn se indic anteriormente.
INDICADORES EN OTROS SUSTRATOS
-Para todos los dems indicadores biolgicos, retirar al menos cuatro muestras de sus envases
individuales.
-Colocar las muestras de prueba en un vaso estril que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada
y enfriada a 2-8 y alterar mecnicamente hasta lograr una suspensin homognea de las esporas en
agua.
pg. 15
SUSPENSIONES DE ESPORAS
-Seguir los procedimientos de recuento de esporas viables
RECUENTO DE ESPORAS VIABLES
-Transferir una alcuota de 10 mL de la suspensin a un tubo estril.
-Para indicadores biolgicos que usan esporas de Geobacilllus stearothermophilus, Bacillus coagulans
y otros formadores de esporas termfilos, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de
agua a 95-100 durante 15 minutos (choque trmico), comenzando a medir el tiempo cuando la
temperatura alcanza 95. Para indicadores biolgicos que contienen formadores de esporas no
termfilos, calentar el tubo que contiene la suspensin en un bao de agua a 80-85 durante 10
minutos, comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza 80.
- Enfriar rpidamente las suspensiones en un bao de agua con hielo a 0-4. Transferir dos alcuotas
de 1 mL a tubos adecuados y hacer diluciones en serie apropiadas en Agua Purificada esterilizada.
Calcular las diluciones para generar 30-300 colonias por placa para un par de placas, cuando se tratan
segn se indica a continuacin.
-Cuando el indicador biolgico tiene una concentracin baja de esporas, puede ser necesario modificar
la serie de diluciones y usar ms placas en cada dilucin. Preparar una serie independiente de placas
para cada alcuota. Colocar 1,0 mL de cada dilucin seleccionada en cada placa de un par de placas de
Petri de 15 mm x 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de Medio Agar
Digerido de Casena y Soja que se haya fundido y enfriado a aproximadamente 45.
-Agitar por rotacin suave para obtener una suspensin homognea y dejar solidificar. Incubar las
placas en posicin invertida a 55-60 para formadores de esporas termfilos y a 30-35 para los
formadores de esporas no termfilos o a la temperatura de recuperacin ptima especificada por el
fabricante. Examinar las placas despus de transcurridas al menos 48 horas, registrando el nmero de
colonias para cada placa. Calcular el nmero promedio de esporas por muestra de prueba a partir de
los resultados, usando el factor de dilucin apropiado. Al evaluar los indicadores biolgicos provistos
por proveedores, el recuento de esporas viables debe estar entre
50% y 300% del valor declarado por el fabricante.
DETERMINACIN DEL VALOR D:
Procedimiento
-Para indicadores biolgicos que son suspensiones de esporas, efectuar las determinaciones del valor D
para cada uno de los microorganismos que se proporcionan como una suspensin lquida de cultivo de
esporas. La prueba se efecta usando diluciones en serie apropiadas basadas en el ttulo declarado de
esporas de la suspensin en Agua Purificada en un tubo estril. Cuando la suspensin se coloca sobre o
en un sustrato como un cierre elastomrico o un producto formulado, su resistencia puede diferir de la
determinada en Agua Purificada. Esta diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores
biolgicos y para las medidas apropiadas tomadas antes del uso en actividades de validacin de la
esterilizacin.
Recuperacin
pg. 16
-Despus de completar el procedimiento de esterilizacin para los indicadores biolgicos y dentro de un

tiempo determinado (no mayor de 4 horas), retirar aspticamente y agregar cada indicador biolgico a
un medio adecuado, sumergindolo por completo en un tubo apropiado.
Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte
-Tomar dos grupos de indicadores biolgicos, cada uno integrado por 10 muestras de prueba, en sus
envases individuales originales. Colocar las muestras de cada grupo en portamuestras adecuados que
permitan exponer cada muestra a las condiciones de esterilizacin en una ubicacin especfica en la
cmara del BIER.
EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE RECUENTO MICROBIANO
-Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con una
especificacin establecida de calidad microbiolgica. Si se emplean con tales propsitos, seguir las
instrucciones que se indican a continuacin, incluyendo el nmero de muestras a tomar, e interpretar los
resultados segn se indi_ca ms abajo. Los mtodos no son aplicables a productos que contengan
microorganismos viables como ingredientes activos.
MTODOS DE RECUENTO
-Mtodo de Filtracin de Membrana o Mtodos de Recuento en Placa
-Mtodo del Nmero ms probable [MENOS EXACTO]
PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO, APTITUD DEL

MTODO DE RECUENTO Y CONTROLES NEGATIVOS
PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DE LOS MEDIOS

-Para medios slidos, el crecimiento obtenido no debe diferir en un factor mayor de.2 a partir del valor calculado
para un inculo estandarizado. Para un inculo recin preparado, se produce un crecimiento de
microorganismos comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada
previamente.
- Los medios lquidos son adecuados si se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos
comparable al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
APTITUD DEL MTODO DE RECUENTO EN PRESENCIA DEL PRODUCTO

-El producto a examinar difiere en sus procedimientos se debe tener en cuenta sus caractersticas fsicas.
pg. 17
PRODUCTOS SOLUBLES EN AGUA:
-Diluir el producto a examinar en solucin amortiguadora de Cloruro de Sodio, Solucin amortiguadora de

Fosfato de pH 7,2 ,Caldo digerido de casena y soja.
PRODUCTOS NO GRASOS INSOLUBLES EN AGUA :
-Suspender el producto a analizar (por lo general se prepara una dilucin 1 en 10) en Solucin Amortiguada de
Cloruro de Sodio-Peptona de pH 1,0, en Solucin Amortiguadora de Fosfato de pH 1,2 o en Caldo Digerido
de Casena y Soja.
PRODUCTOS GRASOS:
- Disolver el producto a examinar en miristato de isopropilo esterilizado por filtracin

- Mezclar cuidadosamente y, si fuera necesario, mantenerla temperatura en un bao de agua.
-Agregar una cantidad suficiente del diluyente seleccionado precalentado para obtener una dilucin 1 en 10 del
producto original.
-Mezclar cuidadosamente, manteniendo la temperatura durante el menor tiempo necesario para la formacin de
una emulsin.
LQUIDOS O SLIDOS EN FORMA DE AEROSOL:
-Transferir el producto aspticamente a un aparato con filtro de membrana o un recipiente estril para un
muestreo posterior. Usar el contenido completo o una cantidad definida de dosis fijas de cada envase
analizado.
PARCHES TRANSDRMICOS:
-Retirar las lminas protectoras del parche transdrmico
-Cubrir la superficie adhesiva con material poroso estril adecuado con el fin de prevenir que se peguen unos
a otros.
-Transferirlos a un volumen del diluyente seleccionado que contenga inactivadores [Ej. Polisorbato 80 y/o
lecitina]
-Agitar la preparacin durante 30 minutos.
INOCULACIN Y DILUCIN:
-Agregar a la muestra, preparada segn las instrucciones previas, y a un control (sin incluir material de la
prueba) un volumen suficiente de suspensin microbiana para obtener un inculo de no ms de 100 ufc. El
volumen de la suspensin del inculo no debe exceder del 1 % del volumen del producto diluido.
NEUTRALIZACIN/ELIMINACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA
-Los agentes neutralizantes pueden usarse para neutralizar la actividad de los agentes antimicrobianos. Pueden
aadirse al diluyente seleccionado o al medio, preferentemente antes de la esterilizadn. Si se usan, se debe
demostrar su eficacia y la ausencia de toxicidad para los microorganismos mediante un blanco con neutralizador
y sin el producto.
pg. 18
-Si no se encuentra un mtodo de neutralizacin adecuado, puede suponerse que la imposibilidad de aislar el
microorganismo inoculado es atribuible a la actividad microbicida del producto.
PRUEBA DE PRODUCTOS
EXAMEN DEL PRODUCTO:

FILTRACIN POR MEMBRANA: Usar un aparato de filtracin diseado para permitir la transferencia del
filtro al medio.
MTODOS DE RECUENTO EN PLACA:
-Mtodo de vertido en placa: Preparar al menos dos placas de Petri para cada medio por cada nivel de dilucin.
Incubar las placas de Agar Digerido de Casena y Soja a una temperatura entre 30 y 35durante un perodo de
3 a 5 das y las placas de Agar Sabouraud Dextrosa a una temperatura entre 20 y 25 durante un perodo de 5
a 7 das. Escoger las placas correspondientes a una dilucin determinada.
- Mtodo de extensin en superficie: Preparar al menos dos placas de Petri para cada medio y cada nivel de
dilucin.
INTERPRETACIN DE LOS RESULTADOS:
-El recuento total de microorganismos aerobios (RTMA) se considera equivalente al nmero de ufc encontrado
usando Agar Digerido de Casena-Soja; si se detectan colonias de hongos en este medio, contarlas como parte
del RTMA. El recuento total combinado de hongos filamentosos y levaduras (RTCHL) se considera equivalente
al nmero de ufc encontrado empleando Agar Sabouraud Dextrosa; si se detectan colonias de bacterias en este
medio, contarlas como parte del RTCHL.
EXAMEN MICROBIOLGICO DE PRODUCTOS NO

ESTRILES: PRUEBAS DE MICROORGANISMOS
ESPECFICOS
-Las pruebas han sido diseadas principalmente para determinar si una sustancia o preparacin cumple con
alguna especificacin establecida de calidad microbiolgica.
PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO E INHIBITORIAS DE

LOS MEDIOS
PRUEBA DE LAS PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO, MEDIOS LQUIDOS:

Inocular una porcin del medio apropiado con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del microorganismo
adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no mayor que el perodo menor indicado en
la prueba. Se produce un crecimiento claramente visible de microorganismos comparable al obtenido
anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
PRUEBA DE LAS PROPIEDADES DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO, MEDIOS SLIDOS:

Usar el Mtodo de Extensin en Superficie ,inoculando cada una de las placas C:on un nmero pequeo (no
ms de 100 ufc) del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un tiempo no
mayor que el perodo menor indicado en la prueba, Se produce un crecimiento de microorganismos comparable
al obtenido anteriormente con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
pg. 19
PRUEBA DE LAS PROPIEDADES INHIBITORIAS, MEDIOS SLIDOS O LQUIDOS: Inocular el

medio apropiado con al menos 100 ufc del microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada
durante un tiempo no menor del perodo mayor indicado en la prueba. No se produce crecimiento del
microorganismo de prueba.
PRUEBA DE LAS PROPIEDADES INDICADORAS: USAR EL MTODO DE EXTENSIN EN

SUPERFICIE: Inoculando cada una de las placas con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) del
microorganismo adecuado. Incubar a la temperatura especificada durante un perodo que se encuentre en el
intervalo indicado en la prueba. Las colonias son comparables, en apariencia y reacciones indicadoras, a
aquellas anteriormente obtenidas con una partida de medio analizada y aprobada previamente.
PRUEBAS DE PRODUCTO - Bacterias Gram-Negativas Tolerantes a la Bilis
PREPARACIN DE LA MUESTRA E INCUBACIN PREVIA:
Preparar una muestra empleando una dilucin 1 en 10 de no menos de 1 g del producto a analizar, excepto que
se debe usar Caldo Digerido de Casena y Soja como diluyente de eleccin, mezclar e incubar a una temperatura
de 20 a 25 durante un perodo suficiente para resucitar las bacterias pero que no estimule la multiplicacin de
los organismos(por lo general 2 horas pero no ms de 5 horas).
Prueba de Ausencia-A menos que se indique algo diferente, usar un volumen correspondiente a 1 g del producto,
segn se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa, para inocular Caldo Mosse/ para
Enriquecimiento de Enterobacterias. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48
horas. Subcultivar en placas de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante
un perodo de 18 a 24 horas.
El producto cumple con la prueba si no se desarrollan colonias.
PRUEBA CUANTITATIVA:
Seleccin y Subcultivo-lnocular cantidades adecuadas de Caldo Mosse/ para Enriquecimiento de

Enterobacterias con la preparacin segn se indica en Preparacin de la Muestra e Incubacin Previa y/o
diluciones de la misma que contengan respectivamente 0,1 g; 0,01 g y 0,001 g ( 0,1 ml; 0,01 ml y 0,001 ml)
del producto a examinar. Incubar a una temperatura de 30 a 35 durante un perodo de 24 a 48 horas. Subcultivar
cada uno de los cultivos en una placa de Agar Violeta Rojo Bilis Glucosa. Incubar a una temperatura de 30 a
35 durante un perodo de 18 a 24 horas.
INTERPRETACIN:El crecimiento de colonias constituye un resultado positivo. Indicar la menor cantidad

del producto que produce un resultado positivo y la mayor cantidad que produce un resultado negativo.
PRUEBAS DE ESTERILIDAD
-Estos procedimientos farmacopeicos no se han diseado para garantizar que una partida de un producto es
estril o ha sido esterilizada. Esta garanta se consigue principalmente mediante la validacin del proceso de
esterilizacin o de los procedimientos del procesamiento asptico.
PRECAUCIONES CONTRA LA CONTAMINACIN MICROBIANA
-Las precauciones para evitar la contaminacin se deben tomar de modo tal que no se afecte a ningn
microorganismo que deba detectarse en esta prueba.
pg. 20
MEDIOS DE CULTIVO Y TEMPERATURAS DE INCUBACIN
-Se ha hallado que los medios de cultivo siguientes son adecuados para la prueba de esterilidad. El Medio
Lquido de Tioglicolato sirve principalmente para el cultivo de bacterias anaerobias. Sin embargo, tambin
detecta bacterias aerobias. El Medio de Digerido de Casena y Soja es adecuado para el cultivo tanto de
hongos como de bacterias aerobias.
Esterilidad: Incubar porciones del medio durante 14 das. No se produce crecimiento de ningn
organismo.
PRUEBA DE PROMOCIN DEL CRECIMIENTO DE ORGANISMOS AEROBIOS,

ANAEROBIOS Y HONGOS
Inocular porciones de Medio Lquido de Tioglicolato con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de los
microorganismos siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Clostridium
sporogenes, Pseudomonas aeruginosa y Staphylococcus aureus.
Inocular porciones de medio de tioglicolato alternativo con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de
Clostridium sporogenes .
Inocular porciones de Medio de Digerido de Casena y Soja con un nmero pequeo (no ms de 100 ufc) de
los microorganismos siguientes, usando una porcin de medio distinta para cada una de las especies: Aspergillus
brasiliensis, Bacillus subtilis y Candida albicans. Incubar durante no ms de 3 das en el caso de bacterias y
durante no ms de 5 das en el caso de hongos.
pg. 21
LQUIDOS DE DILUCIN V LAVADO PARA FILTRACIN POR MEMBRANA
Lquido A: Disolver 1 g de digerido pptico de tejido animal en agua para obtener 1 litro, filtrar o centrifugar
para clarificar, si fuera necesario, y ajustar a un pH de 7, 1 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando
un proceso validado.
Lquido D: Agregar 1 mL de polisorbato 80 por cada litro de Lquido A, y ajustar a un pH de 7, 1 0,2.

Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado.
Lquido K: Disolver 5,0 g de digerido pptico de tejido animal, 3,0 g de extracto de carne bovina y 10,0 g de
polisorbato 80 en agua para obtener 1 litro. Ajustar el. pH para obtener, despus de la esterilizacin, un pH de
6,9 0,2. Transferir a envases y esterilizar empleando un proceso validado .
PRUEBA DE ESTERILIDAD DEL PRODUCTO A EXAMINAR
Nmero de Artculos a Evaluar: Tabla 2 y Tabla 3
pg. 22
FILTRACIN POR MEMBRANA

-Se usa filtros de membrana con un tamao nominal de poro no mayor de 0,45 m, cuya eficacia para retener
microorganismos haya sido establecida. Por ejemplo, se usan filtros de nitrato de celulosa para soluciones
acuosas, oleosas y con bajo contenido alcohlico; y se usan filtros de acetato de celulosa, por ejemplo, para
soluciones con alto contenido alcohlico. Es posible que para ciertos productos (p.ej., antibiticos) se necesiten
filtros especialmente adaptados.
INOCULACIN DIRECTA DEL MEDIO DE CULTIVO

-Transferir directamente en el medio de cultivo la cantidad de la preparacin a examinar que se indica en las
Tablas 2 y 3, de modo que el volumen del producto no sea mayor que el 10% del volumen del medio, a menos
que se indique algo diferente. Si el producto a examinar posee actividad antimicrobiana, realizar la prueba
despus de neutralizar esta actividad con una sustancia neutralizante adecuada o mediante su dilucin en una
cantidad suficiente de medio de cultivo. Cuando sea necesario usar un volumen grande del producto,
probablemente sea preferible usar un medio de cultivo concentrado preparado de tal modo que se tenga en
cuenta la dilucin subsiguiente. Cuando corresponda, el medio concentrado podr agregarse directamente al
producto en su envase.
SOLUCIONES ACUOSAS
-Transferir una pequea cantidad de un diluyente estril adecuado, como por ejemplo el Lquido A a la
membrana en el aparato y filtrar. El diluyente puede contener sustancias neutralizantes adecuadas y/o sustancias
inactivantes apropiadas, por ejemplo, en el caso de los antibiticos.
-Transferir a la membrana o membranas el contenido del envase o envases a analizar, si fuera necesario, despus
de diluirlo hasta el volumen usado con el diluyente estril elegido, Filtrar inmediatamente.
pg. 23
-Si el producto posee propiedades antimicrobianas, lavar la membrana no menos de tres veces; filtrando en cada
lavado el volumen del diluyente estril elegido.
-El ciclo de lavado no debe exceder de cinco lavados con 100 mL por filtro, cada uno, incluso si durante la
prueba de aptitud del mtodo se ha demostrado que tal ciclo no elimina por completo la actividad
antimicrobiana.
-Transferir la membrana completa al medio de cultivo o cortarla aspticamente en dos partes iguales y transferir
cada
mitad a sendos medios adecuados. Usar el mismo volumen de cada medio
-Alternativamente, transferir el medio a la membrana en el aparato. Incubar los medios durante no menos de 14
das.
SLIDOS SOLUBLES
-Usar para cada medio no menos de la cantidad de producto disuelto en un disolvente adecuado, como por
ejemplo el disolvente suministrado con la preparacin, Agua Estril para Inyeccin, solucin salina estril o
una solucin estril adecuada como por ejemplo Lquido A y proceder con la prueba usando una membrana
adecuada para el disolvente elegido.
ACEITES Y SOLUCIONES OLEOSAS
-Los aceites y las soluciones oleosas de viscosidad lo suficientemente baja se pueden filtrar sin dilucin a travs
de una membrana seca. Los aceites viscosos se pueden diluir segn sea necesario con un diluyente estril
adecuado, como por ejemplo el miristato de isopropilo, que ha demostrado no tener actividad antimicrobiana
en las condiciones de la prueba. Dejar que el aceite penetre la membrana por su propio peso y, a continuacin,
filtrar, aplicando presin o succin gradualmente. Lavar la membrana al menos tres veces filtrando cada vez
aproximadamente 100 mL de una solucin estril adecuada, como por ejemplo el Lquido A que contenga un
agente emulsionante adecuado a una concentracin que haya demostrado ser apropiada, como por ejemplo
polisorbato 80 a una concentracin de 10 g por L [Lquido K]. Transferir la membrana o membranas al medio
o medios de cultivo, o viceversa, e incubar a las. mismas temperaturas y durante los mismos tiempos.
UNGENTOS Y CREMAS
Los ungentos en base grasa y las emulsiones del tipo agua en aceite pueden diluirse al 1 % en miristato de
isopropilo, calentando si fuera necesario a no ms de 40. Es probable que en casos excepcionales se requiera
calentar hasta no ms de 44. Filtrar tan rpidamente como sea posible.
JERINGAS PRELLENADAS
-Para jeringas prellenadas sin agujas estriles acopladas, expulsar el contenido de cada jeringa en uno o dos
embudos para
filtracin por membrana individuales o en recipientes individuales antes de la transferencia. Si se adjunta una
aguja estril, expulsar directamente el contenido de la jeringa tal como se ha indicado anteriormente y proceder
segn lo descrito
pg. 24
OBSERVACIN E INTERPRETACIN DE RESULTADOS
-A intervalos durante el perodo de incubacin, y al momento de su finalizacin, examinar los medios en busca
de evidencias macroscpicas de crecimiento microbiano. Si el material que se est evaluando enturbia el medio
de modo que no puede determinarse fcilmente la presencia o ausencia de crecimiento microbiano mediante
examen visual, transferir porciones de medio (no menores de 1 ml cada una) 14 das despus de comenzada la
incubacin, a recipientes nuevos con el mismo medio y, a continuacin, incubar el recipiente original y el de
transferencia durante no menos de 4 das.
-Si no se hallan evidencias de crecimiento microbiano, el producto examinado cumple con la prueba de
esterilidad. Si se hallan pruebas de crecimiento microbiano, el producto examinado no cumple con la prueba de
esterilidad, a menos que pueda demostrarse claramente que la prueba result invlida por causas no relacionadas
con el producto examinado. La prueba puede considerarse invlida slo si se cumplen una o ms de las
siguientes condiciones:
a. Los datos de monitoreo microbiolgico de las instalaciones para pruebas de esterilidad demuestran una falla.
b. Una revisin del procedimiento analtico usado durante la prueba en cuestin revela un error.
c. Se halla crecimiento microbiano en los controles negativos.
d. Despus de determinar la identidad de los microorganismos aislados de la prueba, el crecimiento de esta
especie (o especies) puede atribuirse de manera inequvoca a errores con respecto al material o a la tcnica
usados al realizar el procedimiento de la prueba de esterilidad.
MTODOS DE ANLISIS MICROBIOLGICO.

NORMAS ISO y UNESCO:
CULTIVO DE BACTERIAS:
A) MEDIOS DE CULTIVO
Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes

que crean las condiciones necesarias para el desarrollo de los microorganismos.
a) Constituyentes habituales de un medio de cultivo:
- AGAR utilizado como agente gelificante para dar solidez a los medios de cultivo.
- EXTRACTOS son concentrados en polvo, deshidratado, de parte de rganos o tejidos animales

o vegetales para confeccionar el medio adecuado.
- PEPTONAS se obtienen por digestin enzimtica o qumica de protenas animales o vegetales.

Son muy ricas en pptidos y aminocidos.
- FLUIDOS CORPORALES (sangre o plasma) Se aaden a los medios de cultivo porque contienen
factores de crecimiento que facilitan el crecimiento de algunos microorganismos exigentes.
- SISTEMAS AMORTIGUADORES (fosfatos bisdicos y bipotsicos) se utilizan para mantener el

pH del medio en un determinado valor.
- INDICADORES DE pH son indicadores cido-base con el objeto de detectar variaciones de pH.
pg. 25
- AGENTES REDUCTORES se aaden para crear condiciones que permitan el desarrollo de los
grmenes microaerfilos o anaerfilos.
- AGENTES SELECTIVOS son sustancias que se adicionan para convertir al medio de cultivo en
selectivo.
b) Tipos de medios de cultivo:
1. Medios generales permiten el desarrollo de una gran variedad de microorganismos.
2. Medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de un determinado tipo de

microorganismo, sin llegar a inhibir totalmente el crecimiento del resto.
3. Medios selectivos permiten el crecimiento de un tipo de microorganismo determinado,

inhibiendo el desarrollo del resto.
4. Medios diferenciales ponen de relieve propiedades (normalmente bioqumicas) que un

determinado microorganismos posee y de esa forma se puede distinguir ese microorganismo
de otros que tambin pueden crecer en ese medio.
5. Medios de transporte y mantenimiento se utilizan en la recogida, transporte y conservacin

de muestras microbiolgicas. Son medios no nutrientes (los microorganismos se mantienen
pero no se multiplican), semislidos, que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas
dentro de las clulas y evitan los efectos laterales de la oxidacin. c) Preparacin de medios de
cultivo: La preparacin de un medio de cultivo consiste en pesar la cantidad necesaria del polvo
liofilizado, disolverla en agua destilada (libre de inhibidores del crecimiento) siguiendo las
instrucciones del fabricante y esterilizar la disolucin, previa comprobacin y correccin del pH
si es necesario. Antes de ser esterilizados en autoclave, los medios lquidos se distribuyen en los
recipientes adecuados (tubos o matraces) y se tapan; en ningn caso la altura del lquido el
recipiente debe exceder un tercio del volumen total de ste. Si se trata de un medio que
contenga agar (slido o semislido) suele ser preciso calentarlo (al bao Mara o al microondas)
para fundir el agar antes de esterilizarlo en el autoclave. Una vez fundido se reparte, en caliente,
en matraces o tubos (nunca en placas de Petri), se tapa y se esteriliza. Finalizada la esterilizacin
en el autoclave:
- Los medios lquidos se dejan enfriar a temperatura ambiente.
- Los medios slidos contenidos en tubo deben inclinarse para que al solidifarse, adopten la
forma de agar inclinado (slant), si tal es su finalidad.
- La preparacin de los medios slidos en placa de Petri se realiza rellenando las placas con el
medio estril fundido y atemperado a unos 50C en ambiente estril. El ambiente estril se
consigue en la proximidad de un mechero Bunsen o en una campana de siembra adecuada.
B) DILUCIONES DECIMALES
Primero se prepara el MACERADO INICIAL. El procedimiento ms frecuentemente empleado

para este fin consiste en la utilizacin de un homogenizador de paletas tipo "stomacher" en el
cual se homogenizan diluyente y muestra y, de esta forma se prepara una suspensin ms o
pg. 26
menos homognea de alimento y microorganismos que permite la preparacin posterior de las

oportunas diluciones que posteriormente sern utilizadas en los diversos mtodos de recuento.
Para ello se pesan aspticamente 10 g del alimento. La pesada suele realizarse en bolsa de
plstico para stomacher. Se aaden a la bolsa 90 mL de diluyente estril y se homogeniza el
alimento con el diluyente en Stomacher durante 2 minutos. As conseguimos el macerado inicial
que es la dilucin 1:10. Si es posible es mejor pesar 25 g de alimento. Aadir 225 mL de diluyente
estril y proceder como en el caso anterior homogenizando en Stomacher durante 2 minutos.
Para preparar las DILUCIONES DECIMALES, aadir 1 mL de macerado inicial (tambin llamado
dilucin madre o dilucin 1:10) a un tubo con 9 mL de diluyente, homogenizar usando un
agitador excntrico de tubos de ensayo durante 20 segundos o agitando manualmente. De esta
forma hemos preparado la dilucin 1:100 10
2. Repetir la operacin anterior transfiriendo 9 mL de la dilucin 1:100 a un tubo con 9 mL de

diluyente para preparar la dilucin 1:1000 10
3. Repetir la operacin anterior tantas veces como sea necesario hasta conseguir el nmero de
diluciones deseado. El nmero de diluciones que se necesita depende de lo contaminado que
este el alimento. De un alimento del que se sospecha un nmero alto de microorganismos/g
hay que hacer ms diluciones que de uno poco contaminado. Para los mtodos de ausencia /
presencia no es necesario preparar las diluciones decimales, stas se utilizan para los mtodos
de contaje.
C) MTODOS DE SIEMBRA Siembra en masa Se caracteriza porque durante la incubacin las

colonias crecen en el interior de la masa del agar.
Se deposita 1 mL de la muestra (si es lquida) o de cada dilucin en placas estriles, vacas.
Se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y

mantenido a unos 47C. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con
movimientos circulares y de vaivn (siempre sin levantar la placa de la mesa). Con esto se
consigue mezclar el inculo con el agar.
Se deja solidificar el agar a temperatura ambiente (esperar al menos media hora) y se llevan las
placas a incubar (la temperatura y el tiempo de incubacin elegidos vara segn el tipo de
microorganismos).
Pasado el tiempo de incubacin las colonias habrn crecido dentro del agar (en la masa del
agar). Elegir de entre todas las placas las dos correspondientes a aquella dilucin que presenten
un nmero de entre 30 y 300 colonias /placa (esto proporciona una precisin estadstica
suficiente y no es engorroso de hacer). Para realizar el contaje, se utiliza un cuenta-colonias; se
pone la placa de Petri con la base hacia arriba y, si es preciso, se divide en sectores marcando
mediante un lpiz graso a lo largo de los dimetros. El nmero de unidades formadoras de
colonia o UFC/g (o mL en muestras lquidas) de la muestra original ser: Nmero de UFC/g =
Nmero de colonias x factor de dilucin
Siembra en superficie se caracteriza porque durante la incubacin las colonias crecen en la

superficie del agar.
pg. 27
1. Se utilizan placas previamente preparadas que contienen el medio de cultivo solidificado

(unos 15 mL/placa).
2. Se deposita en la superficie del agar 0,1 mL de la muestra o de cada dilucin.
3. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie

de las placas, usando un asa de Drigalski estril.
4. Esperar 2 3 minutos a que se seque el inculo.
5. Se llevan las placas a incubar y se procede de la misma manera que en el caso anterior.
D) TOMA DEL INCULO
Una vez que las colonias han crecido, puede ser necesario su confirmacin. Si la muestra
proviene de un medio lquido, el inculo se toma agitando el suavemente el asa dentro del
mismo, quedando la muestra adherida por tensin superficial en el extremo del filamento del
asa de siembra. Si el medio es slido y se encuentra en superficie la muestra a sembrar (placa
Petri), tome una pequea porcin de cultivo mediante un ligero roce con el asa de siembra. Si
la muestra se encuentra en la profundidad del agar, hunda el filamento dentro del medio hasta
tomar una pequea porcin de la misma. Flamee la boca del tubo antes de taparlo y colquelo
en el soporte necesario.
E) TRANSFERENCIA
La tcnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del tipo de
recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
- Siembra de medio lquido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubos de ensayo, matraces o frascos.
- Siembra de medio slido a medio lquido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo
o aguja y en tubo de ensayo, matraces o frascos.
- Siembra de medio slido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa o aguja y
en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, en superficie.
- Siembra de medio lquido a medio slido: El procedimiento se puede realizar con asa en anillo,
aguja o pipeta y en tubo de ensayo, ya sea en superficie o en profundidad o en placa Petri, ya
sea en superficie o por homogenizacin.
1. Tcnica de transferencia en tubos de ensayo
Tcnica para medio lquido
Los dos tubos, el que contiene el medio de cultivo sin sembrar y el que contiene los
microorganismos a transferir, se toman con una mano, con las bocas colocadas a la misma
altura. Se sostienen con los dedos ndice, medio y anular apoyndolos en el dedo meique, y se
los sujeta con el dedo pulgar muy cerca de la base para permitir la visualizacin de toda la
superficie del cultivo. Con los dedos pulgares e ndice (como un lpiz) de la otra mano, se toma
la pipeta estril o el mango de Koll con su aguja o asa en anillo y se esteriliza. Se destapan los
pg. 28
tubos con los dedos libres de la mano que sujeta el asa, de la siguiente manera: el tapn del
tubo ms alejado del operador (que es el que contiene la muestra) entre el dedo meique y la
palma de la mano; el tapn del tubo ms cercano al operador (que contiene el medio de cultivo
estril) entre el meique y el anular. Se flamean las bocas de los tubos, se toma el inculo; se
siembra; se flamean nuevamente las bocas de los mismos y se tapan respetando las
procedencias de los tapones y se quema el asa. Como el inculo procede de un medio lquido,
antes de realizar la transferencia se debe agitar el tubo para poner en suspensin a los
microorganismos que pudieran estar depositados. Si la siembra se realiza en medio lquido, se
agita el tubo sembrado para distribuir homogneamente el inculo. Para realizar la agitacin se
toma el tubo cerca del extremo superior con los dedos ndice y pulgar y se golpea suavemente
la base del mismo sobre el dedo ndice de la otra mano con una amplitud de 5 cm. Otra forma
consiste en hacer rotar los tubos entre las palmas de las manos. Tcnicas para medio slido.
Cuando el medio de cultivo a sembrar es slido, se puede sembrar en superficie, en profundidad
o en profundidad y superficie.
1) En superficie:
a) Por estra: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado hasta el fondo
diluyendo el inculo en el agua de condensacin que se acumula en esa parte, luego mover el
asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento en zig-zag ascendiendo desde
el fondo hasta la parte superior del medio.
b) Por trazo: Introducir el asa en anillo o aguja en el tubo de agar inclinado y trazar una lnea de
siembra desde la base del pico de flauta hasta el extremo superior, sin ejercer presin para que
no se rompa el medio.
2) En profundidad:
a) Por puncin: El medio de cultivo que se emplea est solidificado en tubo en forma vertical y
la siembra se realiza con aguja, la que se introduce con el inculo rpidamente en el seno del
medio y se retira de la misma forma. La puncin se realiza en el centro del medio o
excntricamente.
3) En profundidad y superficie: Por puncin y estra: Se utilizan para la siembra tubos con agar
inclinado pero con mucho fondo. Se introduce la aguja en el tubo de agar inclinado, se punza el
fondo, se retira y se realiza un trazo o estra en el pico de flauta. Tcnica de transferencia en
placa Petri. La siembra en placa Petri, puede hacerse: 1) En superficie: a. Por estra central: Se
levanta la tapa lo suficiente como para permitir la introduccin del asa con la carga de
microorganismos, inicindose la estra en el borde del medio ms alejado del operador y se la
extiende hasta llegar al centro de la placa, luego se gira sta 180 y se contina realizando otra
estra de la misma manera. Esta divisin evita el obstculo del borde de la placa b. Por estra en
cuadrantes: Se divide la placa en cuatro sectores y se siembra en estra cada uno de ellos,
partiendo del borde de la placa hacia el centro. El cuadrante a sembrar debe ser el ms alejado
del operador y el inculo en cada caso puede ser el mismo (la misma especie) o distinto
(diferente especie) para cada cuadrante. c. Por diseminacin con esptula de Drigalsky: Se
deposita sobre el medio slido contenido en la placa, una asada o una gota con pipeta del
material a sembrar, que luego se extender por toda la superficie del medio con una esptula
pg. 29
de DRIGALSKY. *La esptula se introduce inmediatamente despus de su uso en un recipiente

para su esterilizacin en autoclave o en formaldehdo al 5 %. d. Por diseminacin con hisopo: Se
sumerge en el caldo de cultivo, se escurre el exceso de lquido sobre la pared interior del tubo
y se estran ambas mitades de la placa de Petri, partiendo de los bordes hacia el centro, luego
se gira 90 y se estran nuevamente ambas mitades, finalmente se gira 45 y se estran ambas
mitades.
2 Por homogeneizacin:
a. Tcnica de la siembra en tubo para volcar en placa: El inculo se introduce con el asa o pipeta
en un tubo con el medio de cultivo fundido y enfriado a 45 C en cantidad suficiente para cubrir
la placa de Petri. Se homogeneiza por rotacin y se vuelca en la placa previo flameado de la boca
del tubo.
b. Tcnica del agar volcado: Se deposita el inculo con pipeta en el centro de la placa Petri y
luego se vuelca sobre el mismo el medio de cultivo fundido y enfriado a 45C. Se homogeneiza
por rotacin para lo cual se le imprime a la placa movimientos circulares, en sentido horario y
en sentido antihorario y movimientos rectilneos, horizontales y verticales. Se debe tener en
cuenta que de las placas Petri preparadas con medio de cultivo para sembrar, debe eliminarse
el agua de sinresis (condensacin) antes de efectuar dicha operacin. Para tal fin es
aconsejable preparar las placas con 24 hs. De anticipacin y dejarlas invertidas a temperatura
ambiente.
F) AISLAMIENTO El objeto es obtener cultivos en estado puro, operacin imprescindible y previa

al estudio e identificacin de una especie bacteriana. Se pueden realizar aislamientos por
mtodos generales y por mtodos especiales.
1) Mtodos generales de aislamiento. Estos mtodos utilizan medios de cultivos slidos en placa
Petri:
a. Por diluciones sucesivas: En general, para preparar diluciones seriadas, se parte de una
solucin concentrada y se preparan series de diluciones al dcimo (1:10) o al medio (1:2). De
esta manera se obtiene una serie de soluciones relacionadas por ejemplo por un factor de
dilucin 10 es decir 1/10; 1/100; 1/1000 y as sucesivamente. O la otra serie es 1/2; 1/4; 1/8;
1/16; 1/32 etc.
b. Por agotamiento en superficie en una placa: Es el mtodo ms utilizado. Se prepara una placa
Petri con el medio de cultivo a la que se le elimina el exceso de humedad segn se indic
anteriormente. Primero, se marca la parte exterior de la contratapa de acuerdo al esquema. Se
carga el asa con la muestra, se deposita en un punto de la superficie del sector (I) cercano al
borde, y se extiende en el mismo con estras prximas y paralelas. A continuacin se quema el
asa y se deja enfriar. Se gira la placa 90 , se pasa el asa una vez sobre la ltima estra de la
regin ya inoculada y se arrastra al sector (II) efectuando sobre l la siembra sin superponer las
estras con las realizadas antes. Se quema nuevamente el asa y de la misma manera se estra el
sector (III). Luego de quemar el asa, en el sector (IV) se realizan estras con el material que se
arrastra de (III), ms amplias y que terminan en el centro de la placa. Cualquiera sea el mtodo
empleado, si se realiza correctamente, podrn obtenerse colonias aisladas. Para comprobar la
pg. 30
pureza de la colonia aislada se puede realizar una coloracin de Gram. Para ello se pica la colonia
y se la identifica con una marca en el fondo de la placa con un nmero identificatorio. Se hace
el extendido con una porcin de la colonia y si todas las clulas observadas coinciden
morfolgicamente, se repica el resto de la colonia en un tubo con agar en estra para obtener
un cultivo puro. A veces la igualdad morfolgica en la coloracin de Gram resulta engaosa por
existir bacterias de diferentes especies (pero iguales morfolgicamente) presentes dentro de la
colonia seleccionada pero en muy bajo nmero debido a su imposibilidad de desarrollar. Por
consiguiente es necesario realizar siempre aislamiento para observar la uniformidad de las
colonias.
2) Mtodos especiales de aislamiento. Mtodos derivados de las propiedades de las bacterias:

Consisten en hacer desarrollar la mezcla bacteriana, en un medio de cultivo especial, donde una
especie puede dar lugar a colonias de un color que la identifiquen (ya sea por cambios de pH o
por precipitacin de elementos del medio).
Empleo de temperaturas disgensicas: La mayora de las bacterias desarrollan bien a 37C. Sin
embargo hay especies que lo hacen hasta 40C -42C y an ms, otras por debajo de 35 C. Estas
caractersticas se pueden usar para la separacin de especies.
Termorresistencia de las bacterias esporuladas: Los esporos de las bacterias son formas de
resistencia que toleran temperaturas que resultan letales para las formas vegetativas. Este
comportamiento se aprovecha para la separacin de las especies que tienen la capacidad de
esporular.
Movilidad del microorganismo: Las bacterias mviles desarrollan en gran parte de la superficie
del medio, mientras que las inmviles lo hacen solo en el punto de siembra. b. Mtodos
biolgicos: Estos mtodos utilizan la propiedad que tienen ciertos animales de laboratorio de
ser receptivos a algunos microorganismos.
http://www.analizacalidad.com/docftp/fi148anmic.pdf
pg. 31

Pruebas Microbiologicas 2 Final

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4.1.1 Recoleccin/Recuperacin de Muestras

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