Qumica Orgnica II cidos Nucleicos

Trabajo Prctico de Laboratorio 6

Tema: cidos nucleicos
Introduccin terica
Los nucletidos se unen entre s en el ADN y el ARN por enlaces ster fosfato entre el
componente de fosfato de un nucletido y el componente de azcar del nucletido siguiente.
Las bases nitrogenadas que constituyen parte del ADN son: O
adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Una N
NH
O
caracterstica importante de las bases nitrogenadas es su N N NH2
CH2 O
carcter aromtico. Esto les confiere la capacidad de
R NH2
absorber luz en la zona ultravioleta del espectro en torno a O
O P N
los 260 nm, lo cual puede aprovecharse para determinar el -
O O
coeficiente de extincin del ADN y calcular la O N
H2 C O
concentracin de los cidos nucleicos. Otra de sus
caractersticas es que presentan tautomera o isomera de O R O
R1
grupos funcionales. En las bases nitrogenadas se dan dos O P - HN
O
O
tipos de tautomeras: tautomera lactama-lactima, donde
CH2 O N
O
el hidrgeno migra del nitrgeno al oxgeno del grupo oxo
(forma lactama) y viceversa (forma lactima), y tautomera O R NH2
imina-amina primaria, donde el hidrgeno puede estar O P - N
O N
O
formando el grupo amina (forma amina primaria) o migrar CH2 N N
O
al nitrgeno adyacente (forma imina). La adenina slo
puede presentar tautomera amina-imina, la timina y el O R
-
O P O
uracilo muestran tautomera doble lactama-lactima, y la R= H/OH
O R1=H/CH3
guanina y citosina pueden presentar ambas. A
continuacin se presentan las formas tautomricas predominantes para cada base;

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NH2
NH

N
N N
HN

N
N H N
N H
NH2 NH2 NH
NH

N N HN
HN

O N HO N HO N
O N
H H
O O OH OH

N N N N
HN HN N N

N N N N
H2 N N HN N H H2 N N H HN N H
H H H
O OH
OH O

HN N
N HN

O N HO N
O N HO N
H H

Por otro parte, las bases nitrogenadas presentan suficiente carcter polar como para
establecer puentes de hidrgeno. Esto es debido a que tienen tomos electronegativos
(nitrgeno y oxgeno) que presentan carga parcial negativa y tomos de hidrgeno con carga
parcial positiva, de manera que se forman dipolos que permiten que se formen estos enlaces.
Estos puentes se forman respetando una estricta complementariedad: adenina slo se aparea
con timina mediante dos puentes de hidrgeno, y guanina con citosina mediante 3 puentes de
hidrgeno. Dado que timina no forma parte del ARN la complementariedad se establece entre
adenina y uracilo mediante dos puentes de hidrgeno. La complementariedad de las bases es
la clave de la estructura del ADN y tiene importantes implicancias debido a que permite
procesos como la replicacin del ADN, la transcripcin de ADN a ARN y la traduccin del ARN
en protenas.
El modelo de estructura en doble hlice del ADN fue propuesto en 1953 por James Watson y
Francis Crick en su artculo denominado Molecular structure of nucleic acids: a structure for
deoxyribose nucleic acid que fue publicado en la revista Nature. Este trabajo se vio reconocido
con el premio Nobel en 1962, que compartieron con M. H. F. Wilkins y que se les concedi por
sus descubrimientos en relacin con la estructura molecular de los cidos nucleicos y su
significacin para la transmisin de la informacin en la materia viva. Sin embargo, en rigor
Chargaff fue quien descubri (en 1940) que en el ADN las proporcin de purinas era idntica a la
de pirimidinas, lo que se conoce como equimolecularidad de las bases ([A]=[T], [G]=[C]). Con esta
informacin y junto con los datos de difraccin de rayos X proporcionados por Rosalind Franklin

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fue que trabajaron Watson y Crick propusieron para proponer el modelo de la doble hlice de
ADN.
A valores de pH extremos las bases nitrogenadas se protonan o se ionizan perdiendo la
posibilidad de aparearse mediante la misma cantidad de interacciones puente de hidrgeno que
lo hacen normalmente a pH fisiolgico.

O H2N N NH2 O N

N N
NH N N HN

N N N N

O H2N
O

T=A GC
Apareamientos a pH 7.0

Apareamientos a pH 3.0

NH2 O N
O H2N N

N N N
N N N
N N
N N
O H2N
OH

Apareamientos a pH 11.0

Los extremos de cada una de las hebras del ADN son denominados 5-P (fosfato) y 3-OH
(hidroxilo). Las dos cadenas se disponen en direcciones inversas antiparalelas.

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El ADN existe en muchas conformaciones. Sin embargo, en organismos vivos slo se han
observado las conformaciones ADN-A, ADN-B y ADN-Z. La conformacin que adopta el ADN
depende de su secuencia, la cantidad y direccin de super-enrollamiento que presenta, la
presencia de modificaciones qumicas en las bases y las condiciones de la solucin, tales como la
concentracin de iones de metales y poliaminas. Estructuralmente las diferencias estn basadas
en las conformaciones del anillo del azcar y del enlace N-glicosdico. De las tres conformaciones,
la forma "B" es la ms comn en las condiciones existentes en las clulas. La misma se presenta a
continuacin;

Posibles conformaciones de la ribosa y/o desoxirribosa: el azcar puede presentar forma de

sobre (forma E: envelope) cuando uno de los carbonos queda por fuera del plano, o forma de
media silla (forma T: twist) cuando dos de los carbonos quedan por fuera del plano y en lados
opuestos. Adems, para cada uno de estos carbonos la conformacin puede ser "endo", si el

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carbono est dirigido hacia donde lo est el carbono 5', o "exo", si est dirigido hacia el lado
opuesto. Los nicos carbonos que pueden dar lugar a estos plegamientos son los carbonos 2' y 3'.

El enlace N-glicosdico puede aparecer en la conformacin "anti", si la parte ms voluminosa de la

base queda alejada del azcar, o en la conformacin "syn" si el plano de la base nitrogenada est
dirigido hacia el azcar. La conformacin "anti" es ms estable que la conformacin "syn".
NH2 NH2
NH2 NH2

N N
N N
N N

O N N O
N N N
N
HO HO HO HO

O O O O
H H H H
H H H H
H H H H
H H H H OH H OH H
OH R OH R Sym Anti
Sym Anti

En el ADN-B, la conformacin que adopta el azcar es E C2'-endo y anti para el enlace N-

glicosdico de todas las bases.

Propiedades qumicas de los cidos nucleicos

En medio cido suave es posible obtener los cidos apurnicos a partir de ADN de acuerdo a la
siguiente reaccin general:

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A travs del anlisis del mecanismo de reaccin es posible racionalizar porqu la unin N-
glicosdica que se hidroliza corresponde a las bases pricas y porqu slo se hidrolizan las mismas
en ADN y no en ARN en estas condiciones.
Anlisis del mecanismo de hidrlisis en medio cido sobre 2desoxinuclesidos
Cul es el nitrgeno ms bsico de una base prica?. La posicin de
H
protonacin se justifica por la posibilidad de plantear estructuras NH2

N
contribuyentes al hbrido de resonancia del cido conjugado, que N

indican que aun tratndose de un tomo de nitrgeno sp2 ste resulta HO

H N N
H

ms bsico que la amina primaria que se encuentra como O

H H

sustituyente en la posicin 6 y que aparentemente presenta H H

OH R

hibridacin sp3.

Acido conjugado de adenosina

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Habiendo definido cul es la posicin ms bsica, es posible entonces plantear el mecanismo de
hidrlisis cida de nuclesidos pricos sobre estructuras en conformacin syn. La proximidad
espacial del oxgeno anular de la desoxirribosa con el nitrgeno protonado de la posicin 3 de la
base prica (que se encuentra en conformacin syn) justifica el planteo de un mecanismo de
hidrlisis con protonacin del oxgeno anular. Esto implica la ruptura del enlace entre el carbono
anomrico y el oxgeno anular en la etapa lenta de la reaccin.

NH2+
NH2 NH2
N
N
N N
N N

N N
HO HO N HO N
H N N
O OH OH
H H H H H H

H H H H H H
OH R OH R OH R O
H
H

NH2
NH2
N
N N
N

N N
H N
HO N
HO HO
OH
O OH H H H O H
H H (H, OH) H H
O H H
H OH R
H
OH R OH R

Asimismo, es posible justificar la mayor labilidad del enlace N-glicosdico en nuclesidos de 2-

desoxirribosa respecto de los de ribosa. Esto es debido a que en los 2-desoxirribonucleosidos
no se manifiesta el efecto inductivo atractor de electrones del grupo 2OH, el cual competira
con el desplazamiento de los electrones del enlace entre el carbono anomrico hacia el
oxgeno anular.
Complementariamente a lo discutido en prrafos anteriores, el ARN es ms lbil en medio
bsico que el ADN, obtenindose como producto de su hidrlisis una mezcla de nuclesidos
monofosforilados en las posiciones 2 y 3. Este comportamiento puede racionalizarse a travs
del siguiente mecanismo de reaccin:

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O
O N NH NH2
N NH O N N NH2 N
O OH
N N NH2 H2C
CH2 O O O N
CH2
O
O O-
O OH NH2 NH2
O P - O
O O O
O P - N N
N
O O O P NH
O N CH2 O N O O- OH
H2 C O N N NH2
O CH2 O

HO- O O- O H
OH O O O
O O P
O- O P
O P HN HN O O-
O- O
O HN
CH2 O N
CH2 O N
O
HO
O O N
CH2
O
O O-
O OH NH2 NH2
P - O O
O P O O N NH2
O- N
N N P
O O O
CH2 O- N N
CH2 N N N
N O
O HO
N N
CH2 O
O O-
O OH
O-
O P O- O P O O
O O P
O O-

Trabajo Prctico
Objetivo: Aislar y purificar e hidrolizar ADN. Caracterizar qumicamente sus componentes.

PROTOCOLO DE LABORATORIO
Preparacin de buffer de lisis: Colocar 40 ml de agua destilada, 5 ml de detergente y una punta
de esptula de NaCl. Agitar con varilla de vidrio.
Extraccin de ADN: Colocar media banana cortada en trozos en un tubo falcon de 50 ml, agregar
el buffer de lisis y homogenizar con varilla de vidrio. Centrifugar durante 10 min a 5000 rpm.
Filtrar el sobrenadante con un algodn y embudo, colectarlo en un nuevo tubo falcon. Agregar

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etanol 96 % fro (agente precipitante) en una proporcin 2:1 (etanol: filtrado). Esperar unos
segundos y observar como comienza la precipitacin del ADN (el ADN tiene una apariencia de
mucus blanco y fibroso). Dejar reposar unos minutos y centrifugar 10 min a 5000 rpm. Descartar
el sobrenadante con la ayuda de una varilla de vidrio. Resuspender el pellet de ADN obtenido en
10 ml de agua.
Caracterizacin qumica de los componentes estructurales del ADN
Hidrlisis cida de ADN: Colocar la solucin de ADN obtenida en un erlenmeyer, agregarle 30 ml
de H2SO4 al 10% y calentar a bao mara durante 30 min. En caso de excesiva evaporacin agregar
agua destilada hasta alcanzar el volumen inicial.
Reconocimiento de azcares, reaccin de Molisch: Trasvasar 5 ml del hidrolizado a un tubo de
ensayo, agregar 4 gotas de solucin de -naftol, agitar y aadir por las paredes del tubo 3 ml de
H2SO4 (c). Observar y anotar los resultados.
Caracterizacin de fosfatos: Colocar 3 ml del hidrolizado en un tubo de ensayo y alcalinizar con
NH4OH. Posteriormente, acidificar con HNO3 (c) y agregar 3 ml de molibdato de amonio al 30%.
Calentar y observar los resultados.
Caracterizacin de bases pricas: Colocar 3 ml del hidrolizado en un tubo de ensayo y agregarle
NH4OH hasta reaccin alcalina. Luego agregar gota a gota solucin de AgNO3 al 10 %. Observar y
anotar los resultados.