LAPORAN PRAKTIKUM BIOFARMASETIKA

ANALISIS OBAT DALAM CAIRAN HAYATI

OLEH:

NAMA : Habel aryanto pitay

NIM : 154111052

KELAS /SEMESTER : FARMASI B/ V

SEKOLAH TINGGI ILMU KESEHATAN

CITRA HUSADA MANDIRI

KUPANG

2016/2017
I. Tujuan Percobaan
Agar mahasiswa dapat mempelajari dan memahami langkah-langkah analisis obat
dalam cairan hayati.
II. Dasar Teori
Ketersediaan hayati suatu obat dapat diukur pada keadaan pasien yang
bersangkutan (secara in vivo) dengan menentukan kadar dalam plasma darah
setelah mencapai keseimbangan antara serum cairan tubuh (keadaan tunak). Ada
kolerasi yang baik antara kadar obat dalam plasma dengan efek terapi.
Ketersediaan hayati digunakan untuk memberikan gambaran mengenai keadaan
dan kecepatan obat diabsorbsi dari bentuk sediaan dan digambarkan dengan kurva
kadar waktu setelah obat diminum dan berada pada jaringan biologik atau
larutan seperti darah dan urin.
Data ketersediaan hayati dapat pula digunakan untuk menentukan :
a) Jumlah atau bagian obat yang diabsorbsi dari bentuk sediaan
b) Kecepatan obat diabsorbsi
c) Masa kerja obat berada didalam cairan biologik atau jaringan, bila
dihubungkan dengan respon pasien
d) Hubungan antara kadar obat dalam darah dengan efektivitas terapi/efektoksik
(Anief, 2002).
Pengukuran konsentrasi obat di darah, serum, atau plasma adalah pendekatan
secara langsung yang paling baik untuk menilai ketersediaan hayati obat di tubuh.
Darah mengandung elemen seluler mencakup sel darah merah, sel darah putih,
keping darah, dan protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya serum
atau plasma digunakan untuk pengukuran obat. Untuk mendapatkan serum, darah
dibekukan dan serum diambil dari supernatan setelah disentrifugasi. Plasma
diperoleh dari supernatan darah yang disentrifugasi dengan ditambahkan
antikoagulan seperti heparin. (Shargel, 1999).
Persyaratan yang dituntut bagi suatu metode analisa adalah jika metode
tersebut dapat memberikan nilai perolehan kembali yang tinggi (75-90% atau
lebih), kesalahan acak dan sistematik kurang dari 10%. Kepekaan dan selektivitas
merupakan kriteria lain yang penting dan nilainya tergantung pula dari alat
pengukur yang dipakai. Dalam percobaan ini akan dilakukan langkah-
langkah yang perlu dikerjakan untuk optimalisasi analisis meliputi:
 1. Penentuan jangka waktu larutan obat yang memberikan resapan tetap (khusus
untuk reaksi warna).
2. Penetapan panjang gelombang larutan obat yang memberikan resapan maksimum
(sulfametoksazol). Pembuatan kurva baku (sulfametoksazol).
3. Perhitungan nilai perolehan kembali, kesalahan acak dan kesalahan sistematik
Dalam penetapan kadar obat dalam darah (cairan tubuh), metode yang digunakan
harus tepat, dan dalam pengerjaannya diperlukan suatu ketelitian yang cukup tinggi
agar diperoleh hasil yang akurat. Sehingga nantinya dapat menghindari kesalahan
yang fatal. Dalam analisis ini, kesalahan hasil tidak boleh lebih dari 10% (tergantung
pula alat apa yang digunakan dalam analisis) (Ritschel, 1976).
III. Alat Dan Bahan
Alat yang digunakan dalam percobaan adalah:
Labu takar 10 ml, Pipet volume 0,1; 0,2; 1,0; 2,0 ml, Tabung
reaksi/flakon, Pipet ukur 5 ml, Spektrofotometer dan kuvet, Skalpel/silet,
Sentrifuge, Stopwatch, Ependorf, Alat vortex, Propipet, Mikropipet dan tip
Bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah:
Asam trikloroasetat (TCA), Natrium nitrit 0,1 %, Amonium Sulfamat
0,5%, N(1-naftil) etilendiamin 0,1%, Antikoagulan (heparin),
Sulfametoksazol, dan Darah tikus.

IV. Cara Kerja

Penentuan kadar Sulfametoksazol
A. Prosedur Penetapan Kadar Bratton-Marshal
1. Pembuatan Larutan Stok Sulfametoksazol
- Timbang tablet Sulfametoksazol kemudian larutkan dengan pelarut
Metanol (Larutan A).
- Larutan A tersebut diencerkan dengan aquadest ad 100 mL hingga
diperoleh kadar 25, 50, 100, 200 dan 400g/ml

2. Pembuatan Kurva Baku Internal

- Tambahkan 250l larutan stok sulfametoksazol dalam darah
sehingga diperoleh kadar 25, 50, 100, 200, dan 400 g/ml lalu
homogenkan.
 - Kemudian tambahkan 2 mL TCA 2% didiamkan selama 2 menit lalu
divortex.
- Lakukan sentrifuge selama 5 menit pada 2500 rpm lalu diambil 1,5
mL beningan dan diencerkan dengan 2 mL aquadest
- Larutan NaNO2 0,1% ditambahkan sebanyak 0,1ml dan didiamkan
selama 3 menit
- Kemudian tambahkan larutan amonium sulfamat 0,5 % sebanyak
0,2 mL diperoleh larutan B dan didiamkan selama 5 menit ditempat
gelap
- Larutan B tersebut diambil secukupnya dan dipindahkan ke kuvet
dan dibaca intensitas warna pada spektrofotometer 288 nm

3. Pemprosesan Sampel Darah In Vivo

- Ambil 250 mL darah tikus lalu tambahkan heparin sebanyak 3 5
tetes.
- Tambahkan larutan obat sebanyak 250 mL dengan konsentrasi 50
mg/mL; 100 mg/mL; 300 mg/mL
- Tambahkan 2 mL TCA 5 % lalu vortexing selama 2 menit
- Sentrifuge selama 15 menit dengan 3500 rpm
- Ambil 1,5 mL beningan dan encerkan dengan aquadest sebanyak 2
mL
- Tambahkan larutan larutan NaNO20,1% sebanyak 0,1ml dan
diamkan selama 3 menit
- Tambahkan larutan N.EDTA 0,1% sebanyak 0,2 ml dan diamkan
selama 5 menit ditempat gelap
- Kemudian baca intensitas warna pada spektrofotometer dengan
panjang gelombang 288 nm

4. Pembuatan Kurva Baku Sulfametoksazol

- Ukur serapan larutan Sulfametoksazol dengan kadar 25, 50, 100,
200, dan 400 g/ml
- Buat kurva antara absorbansi vs kadar masing-masing
 - Buat persamaan garis menggunakan kuadrat terkecil y = bx+a
- Hitung nilai r2 dari plot tersebut

5. Menentukan Perolehan Kembali, Kesalahan Acak, dan Kesalahan

Sistemik
(West gard, 1978; Brettsheider dan Gloccke, 1983)
- Buat 3 replikasi dari larutan Sulfametoksazol dalam darah dengan
kadar 50, 100, dan 300 mg/mL
- Ambil 0,1 mL masing masing kadar dan masukkan ke dalam
tabung reaksi berisi 3,9 mL air suling
- Lakukan proses selanjutnya seperti analisis Sulfametoksazol
- Tentukan kadar berdasarkan persamaan garis!
- Hitung kadar rata rata dan simpangan baku!

V. DATA PERCOBAAN
Penimbangan obat

Wadah + Zat 0,2403 gram

Wadah 0,2344 gram
Zat 0,0059 gram

Hasil PercobaanSampel

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

50 0,234
1 100 0,270
300 0,254
50 0,232
2 100 0,378
300 0,453
50 0,180
3 100 0,253
 300 0,482
50 0,498
4 100 0,254
300 0,394
 Hasil Percobaan Larutan Baku

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

25 0,216
50 0,253
1 100 0,232
200 0,203
400 0,144
25 0,154
50 0,109
2 100 0,078
200 0,058
400 0,053
25 0,050
50 0,030
3 100 0.090
200 0,044
400 0,075
25 0,125
50 0,496
4 100 0,458
200 0,168
400 0,094
VI. PENGOLAHAN DATA
Perhitungan regresi menggunakan kalkulator
Kelompok 1
Hasil percobaan larutan baku
Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi
25 0,216
1 50 0,253
100 0,232
200 0,203
400

a = 0,247
b = -0,0003
Hasil percobaan sampel

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

50 0,234
1 100 0,270
300 0,254

bX + a = Y

-0,0003 X + 0,247 = 0,234

-0,0003 X = 0,234 0,247

0,04
X = 0,0003

X = -133,33
 KELOMPOK 1
0.3
0.25
0.2
Axis Title

y = -0.0002x + 0.2479
0.15
R = 0.8391 Series1
0.1
Linear (Series1)
0.05
0
0 100 200 300 400 500
Axis Title

Kelompok 2
Hasil percobaan larutan baku

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

25 0,154
2 50 0,109
100 0,078
200 0,058
400 0,053

a = 0,124
b = -0,0002
Hasil percobaan sampel

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

50 0,232
2 100 0,378
300 0,453

bX + a = Y

-0,0002X + 0,124 = 0,232

 -0,0002 X = 0,232 0,124

0,108
X = 0,0002

X = 540

KELOMPOK 2
0.2
0.15
Axis Title

0.1
Series1
0.05 y = -0.0002x + 0.124
R = 0.6249 Linear (Series1)
0
0 100 200 300 400 500
Axis Title

Kelompok 3
Hasil percobaan larutan baku
Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi
25 0,050
3 50 0,030
100 0.090
200 0,044
400 0,075

a = 0,048
b = 0,00006
Hasil percobaan sampel

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

50 0,180
3 100 0,253
300 0,482
 bX + a = Y

0, 00006 X + 0,048 = 0,180

0,00006 X = 0,180 0,048

0,132
X = 0,00006

X = 2200

KELOMPOK 3
0.1
0.08 y = 6E-05x + 0.0482
Axis Title

0.06 R = 0.1511
0.04 Series1
0.02 Linear (Series1)
0
0 100 200 300 400 500
Axis Title

Kelompok 4
Hasil percobaan larutan baku
Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi
25 0,125
4 50 0,496
100 0,458
200 0,168
400 0,094

a = 0,373
b = -0,0007
Hasil percobaan sampel

Kelompok Kadar (g/ml) Absorbansi

50 0,498
4 100 0,254
 300 0,394

bX + a = Y

-0,0007 X + 0,373 = 0,254

0,0007 X = 0,254 0,373

0,119
X = 0,0007

X = -170

KELOMPOK 4
0.6
0.5
Axis Title

0.4
0.3
0.2 Series1
y = -0.0007x + 0.3731
0.1 Linear (Series1)
R = 0.2862
0
0 100 200 300 400 500
Axis Title

VII. PEMBAHASAN
Pada percobaan ini bertujuan untuk mempelajari dan memahami langkah-
langkah analisis obat dalam cairan hayati serta mengetahui prosedur obat dalam
cairan hayati.
Pada praktikum ini pertama-tama kita membuat kurva baku dari
Sulfametoksazol untuk mencari nilai a dan b dalam persamaan kurva baku y =a+
bx. Kurva baku yang baik apabila nilai r nya mendekati niali 1. Metode
spektrofotometri dan kuvet digunakan agar hasil analisis sesuai dengan ketentuan
yang ada. Parameter yang dilakukan pada metode ini adalah recovery ,presisi dan
akurasi. Dimana recovery merupakan suatu tolak ukur efisiensi analisis dan dapat
bernilai positive dan negative. Akurasi merupakan ketelitian metode analisis atau
kedekatan antara nilai terukur dengan nilai yang diterima , baik nilai konvensi,
nilai sebenarnya atau nilai rujukan. Sedangkan presisi merupakan ukuran
keterulangan metode analsisis dan biasanya diekspresikan sebagai simpangan
baku relative dari sejumlah sampel yang berbeda signifikan secara statistic.
Kemudian dilakukan penetapan kadar Sulfametoksazol sampel yang berupa
darah ditambahkan NaNO2 dengan tujuan untuk koagulasi darah agar tidak
mengental.kemudian sampel ditambahkan TCA 2% sebanyak 2 ml yang
dihomogenkan. TCA 2% sebanyak 2 ml digunakan untuk deproteinisasi pada
sampel darah. Apabila protein pada sampel tidak dihilangkan maka akan
mengganggu absorb. Setelah itu disentrifuge 350 rpm selama 15 menit.
Setelah didapat filtrate bening,sampel dibaca absorbansinya dengan
menggunakan spektrofotometer. Setelah itu didapatkan kadar dan dapat dihitung
recovery,kesalahan acak dan kesalahan sistemik.
Sulfametoksazol merupakan derivat dari Sulfisoxasol yang mempunyai
absorbsi dan ekskresi yang lebih lambat. Bersifat tidak larut dalam air, tetapi larut
dalam NaOH encer. Pembuatan seri kadar larutan baku (stok) sulfametoksazol
dengan cara mengencerkan stok larutan sulfametoksazol 1,0 mg/ml menggunakan
pelarut aquadest dengan labu takar 5,0 ml. Sehingga didapatkan konsentrasi
sulfametoksazol: 25; 50; 100; 200; 400 g/ml. Untuk blanko digunakan aquadest.
Penggunaan blanko bertujuan untuk mengoreksi aborbansi senyawa yang
terbentuk.

Heparin merupakan anti koagulansia langsung yang mengandung gugus

karboksil dan sisa sulfat, sehingga heparin merupakan salah satu asam terkuat
dalam tubuh. Heparin bekerja dengan menghambat pembekuan darah yang
kerjanya tergantung adanya anti-trombin III (suatu 2-globulin dan kofaktor dari
heparin dan memperkuat kerja heparin)
TCA merupakan asam organik yang sangat kuat, dimana di dalam 0,1 M
larutan ini mempunyai pH sebesar 1,2. TCA dapat dibuat dengan oksidasi
kloralhidrat dan asam nitrit. TCA mempunyai fungsi sebagai pemberi suasana
asam, sehingga dapat menghentikan kerja enzim pemetabolisme obat sekaligus
menyebabkan denaturasi protein plasma tanpa memecah protein menjadi asam
amino penyusunnya. Dengan demikian, protein yang terdapat dalam darah akan
mengedap dan memisah dengan plasma darah. Adanya suasana asam pada larutan
juga akan mendukung terjadinya proses diazotasi sehingga nantinya akan
didapatkan gambaran konsentrasi sulfametoksazol sebenarnya.
 Pengambilan darah hewan uji seharusnya dilakukan melalui ekor dengan cara
meletakkan hewan uji ke dalam holder, akan tetapi karena darah dari ekor tikus
tidak mau menetes, maka dilakukan pengambilan sampel darah melalui mata
tikus. Darah diamabil dari vena ocularis pada mata tikus (Rattus Novergicus/mus
muculus bacterianus) Pengambilan darah melalui mata tikus dilakukan oleh k
laboran dikarnakan mahasiswa belum berpengalaman untuk mengambil sediaan
hayati. Pengambilan darah dari vena ocularis pada mata tikus menggunakan pipa
kapiler yang dimasukkan kedalam bagian bawah kelopak mata dengan sedikit
pemutaran untuk melancarkan aliran darah. Kemudian darah ditampung pada
eppendorf yang sudah diberi heparin.

VIII. KESIMPULAN
Hasil kadar larutan baku
Kelompok 1 = -133.33
Kelompok 2 = 540
Kelompok 3 = 2200
Kelompok 4 = -170
 DAFTAR PUSTAKA

Ritschel, W. A, 1976, Handbook of basic pharmacokinetics, 1 st edition, hal 78, Drug

Inteligence Publication Inc, Hamillton, USA.

Siswandono, Bambang Soekardjo, 1998, Prinsip-Prinsip Rancangan Obat, hal 85, Airlangga
University Press, Surabaya.

Shergel, L., Yu, B. C. Andrew., 1999, Applied Biopharmaceutics & Pharmacokinetics, edisi
4, hal 30-32, Appleton & Lange, USA.

Donatus, I.A., 2008, Strategi Penelitian Farmakokinetika, Cermin Dunia Kedokteran No. 37,
Jakarta.