UNIVERSIDAD AUTNOMA DE YUCATN

FACULTAD E INGENIERA QUMICA

INGENIERA EN BIOTECNOLOGA
CURSO DE BIOLOGA MOLECULAR
PRCTICA 1 Extraccin de ADN Genomico
Introduccin
El ADN es un polmero de desoxirribonucletidos que forma el material gentico de
todos los organismos vivos. Se encuentra principalmente en el ncleo de clulas eukariotas
y en el nucleolo de las prokariotas. En l, est codificada la informacin para sintetizar y
operar la maquinaria compleja de la clula. Hasta 1970 el ADN era la macromolcula celular
ms difcil de analizar (Alberts et al., 2002), sin embargo hoy en da, se han desarrollado
tcnicas para la extraccin relativamente sencilla del ADN genmico. Ahora es posible aislar
una regin especfica del genoma, amplificarlo (producir muchas copias de un fragmento de
ADN) y secuenciarlo en un da. Sin embargo, para amplificarlo por PCR se necesita extraer
el ADN ntegro y con un alto grado de pureza, debido a que restos celulares y protenas
pueden inhibir el proceso de amplificacin.

La extraccin de ADN consiste en el aislamiento y purificacin de molculas de ADN y se

basa en caractersticas fisicoqumicas de la molcula. Los grupos fosfato del ADN estn
cargados negativamente y son polares, lo que le confiere solubilidad en agua y le permite ser
separado al aplicarle un campo elctrico. En solucin el ADN tiene una capa hidratante, la
cual puede romperse al aadir etanol, exponiendo los grupos fosfato. En estas condiciones,
se puede aadir sal (NaCl, por ejemplo), de esta forma los grupos fosfato tendrn una
atraccin ms fuerte hacia los cationes ( Na+ )que hacia el agua, permitiendo que el ADN
precipite (Sambrook et al. 1989).

Se han desarrollado diversos protocolos para la extraccin de ADN genmico, con un alto
grado de pureza. En general los protocolos consisten principalmente de dos pasos: lisis
celular y purificacin.

La lisis celular puede llevarse acabo por tres mtodos: fsicos, qumicos y enzimticos. Por
va fsica, uno puede romper la clula utilizando fuerza mecnica ( molienda con licuadora o
molino de perlas, por ejemplo) u ondas ultrasnicas. Por mtodos qumicos, se utilizan
usualmente soluciones detergentes con SDS (Dodecil Sulfato de Amonio), o CTAB (
Bromuro de Cetiltrimetilamonio). Algunas soluciones lticas tambin contienen agentes
quelantes como el EDTA que formando complejos con iones metlicos y as inhibir a las
DNasas. La lisis enzimtica puede acoplar la ruptura de la pared y/o membrana
celular(utilizando celulasas, fosfolipasas y lisozima) y la hidrlisis de protenas (endo y
exopeptidasas) para liberar a los cidos nuclicos. Para la purificacin se hace una extraccin
lq.-lq. con solventes orgnicos (fenol, cloroformo, alcohol isoamlico para precipitar
protenas) y la precipitacin del ADN con alcohol en alta presencia de sal. Los remanentes
celulares y algunas protenas se separan por Centrifugacin.

El ADN obtenido puede refrigerarse a 4 C por una o dos semanas, o congelarse a -20 C en
etanol al 70% v/v y conservarse por un largo periodo de tiempo (meses) o a -85 C para
conservarlo por aos. El ADN obtenido puede utilizarse para un sinfn de aplicaciones como
anlisis mdicos, filogenticos, edicin de genes, clonacin, secuenciacin, bsqueda de
enzimas, etc.

Objetivos

Repasar los conceptos fundamentales de extraccin de ADN.

Ensayar la preparacin de ADN genmico de un cultivo puro.

Resultados

*Nota: Debido a que nuestra muestra se cay, utilizamos los resultados del Equipo 1 para
este reporte.

Con las muestras de ADN, se realiz una Electroforesis en gel de Agarosa, para observar la
migracin del ADN. El gel se coloc en la caja de electroforesis () y se observ bandas
visibles de la muestra en el carril 2 y 6 como se muestra en la figura 1. Adicionalmente se
observaron, en el carril 3 y 6 unas bandas ms abajo (menor peso molecular) en el gel, las
cuales, corresponden a ARN, se puede mencionar que estas bandas se encuentran corridas.
Adems, como se muestra en la figura 1, en el carril 4 y 5 no se observa ninguna muestra.
Figura 1. Se pude observar en la figura el gel de agarosa con las diferentes muestras en cada carril
preparadas por diferentes equipos. El carril 1 se encuentra el marcador molecular, el carril 2 se
observa una banda, en el carril 3 se observa otra banda corrida, el 4 y 5 no se observa nada y en la 6
se observa una banda y un corrimiento.

Discusin

La extraccin de ADN es un proceso relativamente sencillo de realizar, ya que solo se

utilizaron unos cuantos reactivos y centrifugacin para la extraccin. La extraccin de ADN
se lleva a cabo de manera rutinaria en Laboratorios y tambin de forma automatizada en
empresas Biotecnolgicas.
Debido a que no se trat la muestra con RNasas se observaron las bandas del ARN en la
muestra. Como se logra observar una banda estrecha, se puede decir que el ADN est ntegro.
Sin embargo se necesitara visualizar el Gel en el Fotodocumentador para comprobar los
resultados en el espectrofotmetro(). Si estuviera fragmentado se observara una banda
barrida. El ADN fragmentado dificulta la amplificacin de la PCR de alto peso molecular y
afecta la reproducibilidad de las tcnicas. (Alberts et al., 2002)
Debido a que no se midi la relacin de las Absorbancias a 260/280 nm no se pudo corroborar
la pureza del ADN previo a la Electroforesis. Obtener una relacin menor a 1.8 usualmente
est asociada a la contaminacin con protenas, por tanto, el ADN se puede tratar con
proteasas para re-purificar las muestras. (Alberts et al., 2002)
La disolucin completa del ADN es muy importante ya que puede afectar la lectura
espectrofotomtrica. Usualmente las muestras de ADN se calientan a 37 C por 30 minutos
antes de leerse en el espectrofotmetro, sin embargo, la tempertura ambiente del Laboratorio
permite estas condiciones por default. (Alberts et al., 2002)
Se esperaba que todas las muestras demostraran una banda slida y clara como las muestras
del Equipo 1 y 5. Las muestras de los dems equipos pueden estar ausentes debido a la
degradacin trmica, impurezas del ADN y errores en el pipeteo de los reactivos para la
precipitacin del ADN y de las protenas asociadas a este. (Alberts et al., 2002)
Conclusin
Se logr aislar y purificar ADN genmico ntegro con un cierto grado de pureza.
Cuestionario

1. Para qu sirven el fenol, el cloroformo y el alcohol isoamlico durante la extraccin

de ADN?

Para desnaturalizar y por tanto precipitar las protenas que pueden estar asociadas al ADN.
Despus de la adicin de un volumen de Fenol-Cloroforomo-Isoamlico , la muestra se agita
y se centrifuga; por densidad las protenas quedan en una pastilla en el fondo del tubo.

2. Con qu se precipit el ADN y cul es el fundamento?

El ADN se precipit con la ayuda de EtOH y sal; el fundamento es que el EtOH rompe la
capa hdrica que tiene el ADN en solucin permitiendo la interaccin de los grupos fosfato
con los cationes de la sal, liberando as los puentes de hidrgeno de ADN-agua, y por tanto
el ADN precipita.

3. Qu significa si la relacin 260/280 es menor que 1.8? Y si es cercana a 2?

Explique.

Si es menor que ocho significa un grado bajo de pureza, usualmente debido a contaminacin
por protenas. Si es cercana a 2 es ADN de alta pureza y se puede utilizar en PCR y
posteriormente en tcnicas de Ingeniera Gentica.

Referencias

Alberts B, Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al.New York: Garland Science; 2002. Molecular Biology
of the Cell 4ta Ed.