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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS Cdigo:

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA FMVZ.UNIETAR.POE.004


Versin: 001
Cuantificacin de patgenos en
muestras aviares Fecha: 17-07-2017

Cuantificacin de Campylobacter y E. coli en muestras aviares

El presente documento ofrece una gua que promueva un ambiente de trabajo


adecuado y seguro durante la funcin de actividades que realizan los profesionales,
personal de apoyo y estudiantes, que laboran y/o realizan prcticas dentro de la
UNIETAR.

1 Objetivo

Cuantificar el nmero de microorganismos presentes en muestras mediante conteo


en placa.

2 Alcance

Se aplica para todas las muestras de origen agropecuario que sern analizadas en
la UNIETAR.

3 Simbologa y abreviaturas

FMVZ: Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia


MP: Manual de Procedimientos
POE: Procedimiento Operativo Estandarizado
UCE: Universidad Central del Ecuador.
RC: Rapid Campylobacter
mCCDA: Modified charcoal cefoperazone deoxycholate
TBX+C: Tryptone Bile X-Glucuronide Medium + Cefotaxima
UNIETAR: Unidad de Investigacin de Enfermedades Trasmitidas por Alimentos
y Resistencias a los Antimicrobianos.
l: Micro litros
m: Micrmetros
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4 Responsabilidades

Es responsabilidad del Coordinador de la UNIETAR la aplicacin, modificacin y


cumplimiento del presente manual.

5 Definiciones

Campylobacter spp.
Es un bacilo curvo, Gram negativo espiralado, microaerfilo y capnfilo.
Campylobacter es motil por poseer uno o dos flagelos en sus polos, mide entre 0,2-
0,8 m de ancho y 0,5-5 l de largo (Quinn et al., 2011). Su metabolismo es no
fermentador y no oxidativo. Habita una amplia variedad de nichos ecolgicos y
ambientes, adems es comensal de la mucosa intestinal de muchos animales de
sangre caliente (E. Koneman et al., 2006; Lapierre, 2013).
Escherichia coli
Es un bacilo gram negativo, indol y oxidasa positivos y fermenta lactosa. Posee
movilidad debido a sus flagelos pertricos. Es un comensal comn del tracto
intestinal de todos los animales de sangre caliente y principal patgeno oportunista
en una gran variedad de sepsis. (E. W. Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger,
& Winn, 2013; Quinn et al., 2011)

Medio Tryptone Bilis X-glucurnido (TBX)

Es un medio cromgeno selectivo para la deteccin y enumeracin de Escherichia


coli en alimentos y piensos. Este medio cumple con los criterios de formulacin y
desempeo establecidos en ISO 16649 e ISO 11133:2014 (Vergine, Salerno, Barca,
Berardi, & Pollice, 2017).

Medio Rapid Campylobacter

RAPID Campylobacter Medium es un agar cromognico selectivo utilizado para la


deteccin y enumeracin de Campylobacter spp. en muestras alimentarias y
ambientales. Posee certificado NF VALIDATION segn la norma ISO 16140 y est
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validado por AOAC para cuantificar Campylobacter (Seliwiorstow, Bar, Verhaegen,


Uyttendaele, & de Zutter, 2014).

Cefotaxima

Cefalosporina de tercera generacin que basa su mecanismo de accin en la


interferencia con la sntesis de peptidoglucano bacteriano despus de unirse a las
protenas fijadoras de betalactmicos. La resistencia a este grupo de frmacos ha
aumentado debido a betalactamasas codificadas por plsmidos o cromosmicas
(Rang, Dale, Ritter, & Flower, 2008).

6 Materiales, Reactivos y Equipos

6.1 Materiales
Asa de platino
Asas desechables de 1 l
Asas desechables de 10 l
Asas de Digralsky
Puntas para micropipetas de 100 y 1000 l
Guantes
6.2 Reactivos
Safranina
Agar RC
Agar TBX + C (3 g/l)
Agar Sangre
Sangre desfibrinada de oveja
Caldo tripticasa soya (TSB)
Glicerol
6.3 Equipos
Incubadoras a 42C y 37C
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Mechero bunsen o cmara de bioseguridad


Micropipetas de 100 l y 1000 l
Jarra de Microaerofilia
Bomba de vaco
Microscopio ptico
Ultra congelador (-80C)

7 Descripcin del procedimiento

El siguiente procedimiento se aplica tanto a Campylobacter spp. como a Escherichia


coli y a E. coli resistentes a betalactmicos, en las distintas matrices de origen
animal. Para ello las muestras debern ser tomadas y transportadas en refrigeracin
con anterioridad al laboratorio de la UNIETAR.
7.1 Diluciones
La cuantificacin bacteriana se hace mediante diluciones decimales (Flujograma)
Para realizar la dispersin sobre el medio se utiliza asas de Digralsky.
Se pesa 25 g (u otra cantidad conveniente segn la muestra) de la muestra y se
agrega peptona bacteriolgica (Anexo B) hasta alcanzar los 250 g; (dilucin 10-
1 (1:10)).

Se coloca esta dilucin en el Stomacher y se homogeniza por 60 segundos.


Se realiza una segunda dilucin colocando 1ml de dicha solucin en un tubo que
contiene 9 ml de peptona bacteriolgica estril logrando una dilucin 10 -2
(Flujograma). Se repite este proceso de forma secuencial hasta llegar a las
diluciones requeridas (Public Health England, 2014).
7.2 Siembra
Las muestras se sembrarn en diluciones decimales en los medios Rapid
Campylobacter (RC) (Anexo C) y TBX+C (Anexo D). Para ello se dispersa 1 ml
de la dilucin 10-1 dividida en dos cajas (500 l por caja) para la dilucin 10-1,
100 l de cada dilucin para obtener cuantificacin en el siguiente logaritmo.
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7.3 Incubacin y Cuantificacin


Para Campylobacter spp. las placas se incuban en condiciones de microaerofilia
(Figura 1 y 2) (92% de N2, 8% de CO2), a 42C por 48 horas (ISO, 2006a, 2006b).
En el caso de E. coli se incuba a 37C por 24 horas.
Finalizado el proceso de incubacin se extraen las cajas, se clasifican por
muestra y dilucin y se cuentan las cajas que contengan de 15 a 200 colonias
aproximadamente. Los resultados se expresaran en UFC/g y/o en log10 (Public
Health England, 2014).

Figura 1. Bomba y cmara para microaerofilia

Figura 2. Vaco objetivo

7.4 Confirmacin
Los medios presentarn colonias con una morfologa caracterstica para
Campylobacter spp. (rojas, redondas, pequeas), y E. coli (verde azuladas,
pequeas, redondas). De presentarse colonias atpicas se confirmar mediante una
tincin Gram modificada en el primer caso y mediante TSI (Triple Sugar Iron) (Anexo
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E) en el segundo. La tincin modificada de Campylobacter spp. utiliza solo la


safranina como colorante.
7.4.1 Procedimiento para la tincin de Campylobacter
Colocar una gota de agua destilada en una placa portaobjetos con la ayuda de
un asa.
Tomar una colonia del microorganismo y dispersar de forma concntrica sobre
la gota de agua en la placa porta objetos.
Secar al ambiente y fijar a la llama del mechero.
Colocar safranina durante 1 minuto, lavar y dejar secar al ambiente.
Colocar una gota de aceite de inmersin y observar al microscopio, con el lente
de 100X.
7.4.2 Interpretacin
Al observar por el microscopio Campylobacter spp. se presenta como bacilos
curvos, pequeos, en forma de bastn o en alas de gaviota (Figura 3).

Figura 3. Campylobacter al microscopio (1000X)

7.4.3 Procedimiento para confirmacin de presencia de E. coli


Sembrar 2 colonias seleccionadas en agar TSI.
Incubar a 37C por 24 horas.
7.4.4 Interpretacin
Si la muestra es positiva a E. coli, observar la fermentacin de glucosa, lactosa
y sacarosa (A/A) ms la produccin de gas (Figura 4).
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Todo material en contacto con bacterias se debe autoclavar antes de eliminar.

Figura 4. Prueba de TSI para confirmar la presencia de E. coli.

Izquierda: Reaccin negativa a presencia de E. coli; derecha: Reaccin positiva a presencia de E. coli. La
fermentacin de los azcares glucosa, lactosa y sacarosa acidifica el medio, esto es detectado por el
indicador rojo fenol, que lo teir de color amarillo.

7.5 Crio conservacin

Para E. coli se tomar dos colonias independientes del crecimiento en TSI e


inocular en microtubos con 300 l de caldo TSB (Anexo F), los mismos sern
llevados a 37C por 24h. Transcurrido este tiempo se aadir 600 l de glicerol.
Por ltimo, se etiquetar y almacenar a -80C.

En el caso de Campylobacter spp. previo al almacenamiento se realiza un


repique en agar sangre para aumentar la cantidad de material bacteriano. Para
ello se toma una colonia aislada con un asa de 1 l y mediante estriacin nica
y masiva se la distribuye en agar sangre (Figura 5) (Anexo G).

Figura 5. Estriacin en agar Sangre


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Se incuba en microaerofilia (5-6% de O2, 10% CO2 y 84-85% N2) a 41,5C por
48 horas. Con un asa de 10 l se recolecta todo el material obtenido en un tubo
criognico con 700 l de sangre desfibrinada de oveja. Se etiqueta y almacena
a una temperatura de -80C.

De haber cepas con poco o nulo crecimiento se repetir el procedimiento


cambiando el medio de cultivo a RC o MCCDA (Anexo H).

8 Referencias bibliogrficas

ISO, (International Organization for Standardization). Horizontal method for


detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 1: Detection method,
Pub. L. No. ISO/TS 10272-1:2006, 28 (2006).
ISO, (International Organization for Standardization). Horizontal method for
detection and enumeration of Campylobacter spp. Part 2: Colony-count
technique, Pub. L. No. ISO/TS 10272-2:2006, 13 (2006).
Koneman, E. W., Allen, S. D., Janda, W. M., Schreckenberger, P. C., & Winn, W.
C. (2013). Diagnstico microbiolgico, Texto y Atlas en Color. (E. W. Koneman,
S. D. Allen, W. M. Janda, P. C. Schreckenberger, & W. C. Winn, Eds.) (6a).
Mexico: Panamericana Editorial.
Koneman, E., Winn, W., Allen, S., Janda, W., Procop, G., Schreckenberger, P.,
& Woods, G. (2006). Diagnstico microbiolgico (6th ed). Buenos Aires: Mdica
Panamericana.
Lapierre, L. (2013). Factores de Virulencia asociados a especies zoonticas de
Campylobacter spp. Avances En Ciencias Veterinarias, 28(1), 2531.
https://doi.org/10.5354/0719-5273.2013.27866
Public Health England. Detection and enumeration of Campylobacter species.
Microbiology Services. Food, Water & Environmental Microbiology Standard
Method., Pub. L. No. FNES15 (F21). V2 (2014). England.
Quinn, P., Markey, B., Leonard, F., FitzPatrick, E., Fanning, S., & PJ, H. (2011).
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Veterinary Microbiology and Microbial Disease (2nd ed.). Iowa: Wiley Blackwell.
Rang, H. P., Dale, M. M., Ritter, J. M., & Flower, R. J. (2008). Rang y Dale
farmacologia. (V. Iglesias, Ed.) (6th ed.). Barcelona: Elsevier Ltd.
Seliwiorstow, T., Bar, J., Verhaegen, B., Uyttendaele, M., & de Zutter, L. (2014).
Evaluation of a new chromogenic medium for direct enumeration of
Campylobacter in poultry meat samples. Journal of Food Protection, 77(12),
21114. https://doi.org/10.4315/0362-028X.JFP-14-237
Vergine, P., Salerno, C., Barca, E., Berardi, G., & Pollice, A. (2017). Identification
of the faecal indicator Escherichia coli in wastewater through the? -D-
glucuronidase activity: comparison between two enumeration methods,
membrane filtration with TBX agar, and Colilert? -18. Journal of Water and
Health, 15(2), 209217. https://doi.org/10.2166/wh.2016.119

9 Anexos
9.1 Anexo A: Tcnicas de estriacin
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9.2 Anexo B: Preparacin de Bacteriological Peptone (BP) (LAB)


Presentacin: Agar 500g Cdigo: MC024

Frmula del agar por litro de agua purificada


Amino nitrgeno 5% 0.5
Nitrgeno total 12% 0.5
pH con solucin al 2%: pH 7,2 +/- 0,2 (25C)

Preparacin
Aadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml
Pesar 0.5g de Peptona Bacteriolgica y agregar al matraz
Una vez disuelto autoclavar a 121C durante 15 minutos.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4C hasta su utilizacin. (No ms de 12
das).
9.3 Anexo C: Preparacin de Agar Rapid Campylobacter (RC) (BIO-RAD)
Presentacin: Agar Base: 500g Cdigo: 356-4295
Suplemento Liofilizado: 10 viales 400mlc/u Cdigo: 356-4296

Frmula del agar por litro de agua purificada


Mezcla nutritiva No.2 28,5 g
Mezcla reducida 1,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Buffer 1,25 g
Mezcla selectiva 0,082 g
Substrato cromgeno 0,05 g
Agar 14,0 g
pH 7,4 7,5 (25C)

Frmula* del suplemento liofilizado por litro de agua purificada


Cefoperazona 32,0 mg
Anfotericina B 10,0 mg
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*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento

Preparacin
Aadir 370ml de agua destilada en un matraz de 500ml.
Pesar 20g de agar RC (Base) y agregar al matraz.
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas).
Una vez disuelto autoclavar a 121C durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50C
Reconstituir un vial de complemento (RC) en 40ml de agua estril.
Agregar el complemento reconstituido al medio autoclavado.
Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estriles.
Dejar enfriar y almacenar en completa obscuridad entre 18 y 24 horas.
Almacenar luego entre 2 y 4C hasta su utilizacin. (No ms de 12 das).
9.4 Anexo D: Preparacin del agar Tryptone Bile X-Glucuronide Medium (TBX agar
+ Cefotaxima) (BIO-RAD)
Presentacin: Agar: 500 g Cdigo: 356-4035
Cefotaxime sodium salt: Frasco Cdigo: C7912-1G

Frmula* del agar por litro de agua purificada


Triptona 20,0 g
Sales Biliares 1,5 g
Agar 0,075 g
X-b-D-glucornido 15,0 g
pH 7,2 +/- 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento

Preparacin
Disolver 33,6 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada.
Mezclar hasta obtener una suspensin homognea.
Calentar la mezcla en mechero o microondas hasta llegar a ebullicin, agitando
con frecuencia.
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Esterilizar en el autoclave a 121C durante 15 minutos.


Aadir 1 miligramo de Cefotaxime sodium salt por 1 litro de agar TBX, cuando
la temperatura del medio sea de aproximadamente 50C y mezclar bien.
Dispensar en cajas Petri estriles.
Una vez que el medio se ha solidificado, guardar las cajas en bolsas plticas
cerradas hermticamente y almacenarlas en refrigeracin a 4-8C.
9.5 Anexo E: Preparacin del agar Triple Sugar Iron (DifcoTM BD)
Presentacin: Agar: 500 g Cdigo: 226540

Frmula* del agar por litro de agua purificada


Extracto de carne 10,0 g
Pluripeptona 10,0 g
Cloruro de sodio 5,0 g
Lactosa 10,0 g
Sacarosa 10,0 g
Glucosa 1,0 g
Sulfato ferroso y citrato de amonio frrico 0,2 g
Tiosulfato de sodio 0,2 g
Rojo de fenol 0,025 g
Agar 13,0 g
pH 7,4 +/- 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento

Preparacin
Disolver 65 gramos de polvo en 1 litro de agua destilada.
Mezclar hasta obtener una suspensin homognea.
Calentar la mezcla en mechero o microondas hasta llegar a ebullicin, agitando
con frecuencia.
Dispensar la mezcla en tubos.
Esterilizar en el autoclave a 121C durante 15 minutos.
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Dejar enfriar colocando los tubos en posicin inclinada.


Una vez que el medio se ha solidificado, almacenar los tubos en refrigeracin a
4-8C.
9.6 Anexo F: Preparacin del medio TrypticaseTM Soy Broth (BBLTM BD)
Presentacin: Agar: 500 g Cdigo: 226540

Frmula* del caldo por litro de agua purificada


Digerido pancretico de casena 17,0 g
Digerido papanico de soja 3,0 g
Cloruro sdico 5,0 g
Fosfato dipotsico 2,5 g
Dextrosa 2,5 g
pH 7,3 +/- 0,2
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento

Preparacin
Disolver 30 g del polvo en 1 L de agua purificada y mezclar bien.
Caliente suavemente para disolver completamente el polvo.
Autoclavar a 121C durante 15 minutos.
Dispensar el caldo en tubos estriles.
Almacenar los tubos en refrigeracin a 4-8C.
9.7 Anexo G: Preparacin de Agar Sangre (AS) (BBLTM BD)
Presentacin: Agar 500g Cdigo: 211037

Frmula del agar por litro de agua purificada


Infusin de musculo cardiaco a partir de slidos 2,0g
Casena digerida por enzimas pancreticas 13,0g
Extracto de levadura 5,0g
Agar 15,0g
pH 7,4 +/- 0,2 (25C)
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Preparacin
Aadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml
Pesar 20g de agar Sangre y agregar al matraz
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas)
Una vez disuelto autoclavar a 121C durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50C
Agregar el 5% de sangre desfibrinada estril de ovino.
Mezclar bien y dispensar en cajas Petri estriles.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4C hasta su utilizacin. (No ms de 12
das).
9.8 Anexo H: Preparacin de Agar Base selectivo para Campylobacter sin Sangre
(MCCDA-Preston) (OxoidTM)
Presentacin: Agar Base: 500g Cdigo: CM0739
Suplemento Liofilizado: 10 viales 2L.c/u Cdigo: SR0155H

Frmula* del agar por litro de agua purificada


Caldo nutritivo No.2 25,0 g
Carbn bacteriolgico 4,0 g
Casena hidrolizada 3,0 g
Desoxicolato de sodio 1,0 g
Sulfato ferroso 0,25 g
Piruvato de sodio 0,25 g
Agar 12,0 g
pH 7,4 +/- 0,2 (25C)
*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento

Frmula* del suplemento liofilizado por litro de agua purificada


Contenido Por litro Por vial*
Cefoperazona 16,0 mg 32,0 mg
Anfotericina B 5,0 mg 10,0 mg
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*Ajustada y/o suplementada para satisfacer los criterios de rendimiento


*Cada vial es suficiente para 500 ml de medio

Preparacin
Aadir 500ml de agua destilada en un matraz de 1000ml.
Pesar 22.75g de agar MCCDA (Base) y agregar al matraz.
Disolver la mezcla mediante calor (Mechero o Microondas).
Una vez disuelto autoclavar a 121C durante 15 minutos.
Dejar enfriar hasta que alcance entre 47 y 50C.
Reconstituir el complemento (CCDA) en 2 ml de agua estril.
Agregar el complemento reconstituido al medio autoclavado en base a la
cantidad preparada (vial para 2L.)
Mezclar bien y verter en cajas Petri estriles.
Dejar enfriar y almacenar entre 2 y 4C hasta su utilizacin. (No ms de 12
das).
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10 Flujograma
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12 Elaboracin, revisin y aprobacin

Elaborado por: Revisado por:


Jos Medina M.V.Z Sofa de Janon M.V.Z.

Revisado por:
Revisado por:
Dra. Mara Ins Baquero Coordinadora del
Dr. Christian Vinueza Coordinador UNIETAR
Laboratorio de Bacteriologa

Aprobado por:
Revisado por:
Dr. Eduardo Aragn Decano de la Facultad de
Dr. Fernando Pazmio Coordinador de la sub
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la
comisin de laboratorios FMVZ-UCE
Universidad Central del Ecuador

12 Modificaciones

Fecha de la
Versin
ltima Detalle de la modificacin
Modificada
modificacin