Western Blot

Western Blot
Teknik ini pertama kali dibuat oleh W. Neal Burnette dan dinamai western blot sebagai olok-olokan
terhadap tekini southern blot yang pertama kali ditemukan.

Western blot merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik pada sampel jaringan yang
homogenat ataupun dari suatu ekstraksi berdasarkan kemampuan protein tersebut berikatan dengan
antibodi. Teknik ini menggunakan gel elektroforesis untuk memisahkan protein berdasarkan panjang
polipeptida atau berdasarkan struktur 3D-nya. Protein tersebut kemudian ditransfer ke sebuah
membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF, dimana mereka kemudian akan dilacak dengan
menggunakan antibodi yang spesifik kepada protein target.

Western blot dapat mendeteksi suatu protein dalam kombinasinya dengan sangat banyak protein lain,
dapat memberikan informasi mengenai ukuran dan ekspresi protein tersebut.

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran
ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran dapat
dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme dilakukan
dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah pemberian
antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau secara
fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi sekunder
akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini dilakukan
di kamar gelap

Langkah-langkah dalam Western Blot :

1) Menyiapkan sampel yang akan diteliti, apakah itu limfosit T atau fibroblas ataupun sel darah tepi.
Sampel harus dijaga tetap dingin.
2) Menyiapkan buffer agar pH dapat berada pada jangkauan yang stabil.
3) Menyiapkan antibodi yang akan digunakan sebagai pelacak
4) Melisis Sel
Kita perlu melisis sel untuk mengeluarkan protein yang diinginkan dari sel. Untuk melisis sel dapat
digunakan detergen SDS dan RIPA. Bila yang diinginkan adalah sebuah protein yang terfosforilasi,
maka perlu ditambahkan inhibitor fosfatase agar gugus fosfat pada protein tersebut tidak dibuang.
Cara melisis : sentrifuge dan ambil pellet yang terbentuk. Jaga agar tetap dingin dengan menggunakan
kotak es. Tambahkan buffer lisis, lalu kumpulkan dalam tabung eppendorf, jaga agar tetap dingin.
5) Gel Elektroforesis
Gel yang biasa dipakai misalnya SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate- polyacrylamide gel
electrophoresis) untuk memisahkan protein berdasarkan ukurannya dengan adanya arus listrik.
Akrilamid 10% juga ditambahkan. Kerja SDS-PAGE ini adalah dengan mendenaturasi polipeptida
setelah terlebih dahulu polipeptida tersebut dibuang struktur sekunder dan tersiernya. Sampel
terlebih dahulu dimasukkan ke dalam sumur gel. Satu jalur biasanya untuk satumarker. Protein sampel
akan memiliki muatan yang sama dengan SDS yang negatif sehingga bergerak menuju elektroda positif
melalui jaring-jaring akrilamid. Protein yang lebih kecil akan bergerak lebih cepat melewati jaring-
jaring akrilamid. Perbedaan kecepatan pergerakan ini akan terlihat pada pita-pita yang tergambar
pada tiap jalur.
6) Transfer Gel
Agar protein tersebut dapat diakses oleh antibodi, maka protein tersebut harus dipindahkan dari gel
ke sebuah kertas membran, biasanya nitroselulosa atau PVDF. Membran ini diletakkan di atas gel, dan
tumpukan kertas penyerap diletakkan di atasnya. Larutan buffer kemudian akan merambat ke atas
melalui reaksi kapiler dengan membawa protein-proteinnya.
Cara lain untuk mentransfer protein adalah dengan menggunakan teknik elektroblotting. Teknik ini
menggunakan arus listrik untuk menarik protein dari gel ke membran
7) Deteksi
Deteksi dilakukan dengan antibodi yang telah dimodifikasi bersama dengan sebuah enzim yang
disebut reporter enzyme. Proses deteksi biasanya berlangsung dalam dua tahap, yaitu :
a. Antibodi Primer
Antibodi yang digunakan di sini adalah antibodi yang pertama kali dihasilkan sistem imun ketika
terpajan protein target. Antibodi terlarut kemudian diinkubasi bersama kertas membran paling sedikit
selama 30 menit.
b. Antibodi Sekunder
Setelah diinkubasi bersama antibodi primer, kertas mebran dibilas terlebih dahulu barulah diinkubasi
dengan antibodi sekunder. Antobodi sekunder adalah antobodi yang spesifik untuk suatu spesies pada
antibodi primer. Misalnya, anti-tikus hanya akan berikatan pada antibodi primer yang berasal dari
tikus. Antibodi sekunder biasanya berikatan dengan enzim reporter seperti alkaline fosfatase atau
horseradish peroxidase. Antibodi sekunder ini kemudian akan menguatkan sinyal yang dihasilkan oleh
antibodi primer.
Sekarang, proses deteksi dapat dilakukan dengan satu langkah saja, yaitu dengan menggunakan
antibodi yang dapat mengenali protein yang diinginkan sekaligus memiliki label yang mudah dideteksi
8) Analisis
a. Colorimetric detection
Metode ini digunakan bila substrat dapat bereaksi dengan reporter enzyme sehingga dapat mewarnai
membran nitorselulosa
b. Chemiluminescent
Metode ini digunakan bila substrat merupakan molekul yang bila bereaksi dengan antibodi sekunder
atu dengan reporter enzyme akan teriluminasi. Hasilnya kemudian diukur dengan densitometri untuk
mengetahui jumlah protein yang terwarnai. Teknik terbarunya yang paking canggih disebut Enhanced
Cheiluminescent (ECL). Teknik inilah yang paling banyak digunakan sekarang.

c. Radioactive detection
Metode ini menggunakan X-ray yang bila mengenai label akan menciptakan region gelap. Namun
metode ini sangat maha dan beresiko tinggi terhadap kesehatan.
d. Fluorescent detection
Pelacak yang mmepunyai label yang dapat mengalami fluorosensi lalu kemudian dideteksi oleh
fotosensor seperti kamera CCD yang menangkap image digital dari western blot. Hasil kemudian dapat
dianalisi secara kuantitaif maupun kualitatif
Metode ini juga merupakan salah satu metode yang paling sering digunakan karena sangat sensitif

Beda sumber.

Western blot adalah proses pemindahan protein dari gel hasil elektroforesis ke membran. Membran
ini dapat diperlakukan lebih fleksibel daripada gel sehingga protein yang terblot pada membran
dapat dideteksi dengan cara visual maupun fluoresensi. Deteksi ekspresi protein pada organisme
dilakukan dengan prinsip imunologi menggunakan antibodi primer dan antibodi sekunder. Setelah
pemberian antibodi sekunder, deteksi dilakukan secara visual dengan pemberian kromogen atau
secara fluoresensi. Pada deteksi secara fluoresensi, reaksi antara antibodi primer dengan antibodi
sekunder akan memberikan hasil fluoresens yang selanjutnya akan membakar film X-ray, deteksi ini
dilakukan di kamar gelap.

Western blot adalah sebuah metode biologi molekuler untuk menentukan keberadaan sebuah
protein dalam sebuah jaringan atau sebuah homogenat dari sebuah jaringan. Western blot
mengidentifikasi antibodi spesifik pada protein yang telah dipishkan antara satu dengan yang lain
menurut ukuran nya lewat elektroforesis gel. Blot merupakan sebuah membran, biasanya berbahan
dasar nitroselulose atau PVDF (Polyvynilidine fluoride). Gel diletakkan di pada membran dan adanya
aliran listrik menginduksi protein pada gel untuk berpindah pada membran yang dilekatkan.
Membran tersebut kemudian merupakan replika dari pola protein pada gel yang kemudian diwarnai
secar sekuensial dengan antibodi. Prosedur western blot terdiri dari preparasi sampel, elektroforesis
gel, transfer dari gel ke membran, dan imunostain dari blot tersebut.

Western blot dikenal sebagai teknik yang sangat baik dan digunakan secara luas untuk
mengidentifikasi dan mengkuantifikasi protein yang spesifik dalam campuran yang kompleks. Teknik
ini memungkinkan deteksi tidak langsung atau indirek dari sampel protein yang diimobilisasi pada
nitroselulose atau membran PVDF. Pada western blot yang konvensional, sampel protein terlebih
dahulu di running dengan SDS PAGE dan secara elektroforesis ditransfer ke membran. Setelah
langkah blocking, membran di probe dengan antibodi primer baik monoclonal maupun poliklonal
yang jumlahnya meningkat dibanding antigen. Setelah pencucian yang sekuensial, membran
kemudian diinkubasi dengan antibody sekunder yang dikonjugasi dengan enzim yang sifatnya reaktif
terhadap antibodi

Western blotting merupakan teknik yang digunakan untuk mengidentifikasi dan memposisikan
protein berdasarkan kemampuannya untuk berikatan dengan antibody yang spesifik. Analisis
western blot dapat mendeteksi protein yang diinginkan dari campuran dari protein dalam jumlah
besar. Western blot dapat memberikan informasi tentang ukuran dari protein (dengan perbandingan
dengan ukuran marker dalam satuan kilodalton dan juga memberi informasi tentang ekspresi
protein (dengan perbandingan dengan kontrol seperti pada sampel yang tidak diberi perlakuan atau
sel atau jaringan tipe lain).
Metode dari westrn blot
1. Penyiapan sample dan pemberian antibodi antiprotein

2. Elektrophoresis menggunakan gel

3. Transfer ke membran filter