Facultad de Ciencias

Departamento de Qumica
Qumica Biolgica
Dra. Cecilia Rojas

Efecto de la fuerza inica en

la solubilidad de las
protenas

Autores: Felipe Barra y Fiorella Gonzlez

Ayudantes: Mariana Montanares y Pablo Gutirrez
Jueves 26 de Abril, 2017
 1. Introduccin
Una de las tcnicas utilizadas para la separacin y determinacin de protenas de
fuentes biolgicas es la precipitacin por salado (salting-out), lo cual evidencia la
dependencia de la solubilidad de las protenas con la fuerza inica de la solucin. En general,
a bajas concentraciones de sal las protenas son ms solubles que en agua pura (efecto de
salting-in), pero a medida que aumenta la concentracin de algunas sales (en general
bivalentes), la solubilidad alcanza un mximo y luego comienza decaer. Esto se observa en
la figura 1:

Figura 1. Efecto de la fuerza inica de algunas sales en la solubilidad de las protenas.

[1]

Se utilizar el efecto salting-in y salting-out de 2 sales (cloruro de sodio y sulfato de

amonio), para determinar la cantidad de protenas en el suero sanguneo. Para la
cuantificacin de protenas se utilizar el mtodo de Biuret:

La formacin del complejo violeta que tiene la capacidad de absorber en el UV

visible, nos permite utilizar la ley de Lambert-Beer, la cual relaciona la absorbancia (A) a
cierta longitud de onda con la concentracin del complejo (c), el paso ptico (l) y el
coeficiente de extincin () del complejo:
2
 = (1)
La ley de Lambert-Beer nos permite determinar cantidades entre 0,5 y 10 [mg], de
protena y la absorbancia mxima del complejo es aproximadamente a los 540 [nm].
El suero sanguneo usualmente contiene dos grandes grupos de protenas: las
albminas y las globulinas, dado que las protenas coagulantes fueron retirados. Las
albminas usualmente son muy solubles en agua, mientras que las globulinas son ms
insolubles, siendo estabilizadas en solucin a concentraciones bajas de sal. La relacin entre
las protenas albminas/globulinas es de 1,3-1,7, o bien, una proporcin de 60% albuminas
y 40% de globulinas, en el caso que son las nicas presentes. [2]

Objetivo especfico: Determinacin cuantitativa de la cantidad de protenas en el suero

sanguneo. Estudio del efecto solubilizante y de precipitacin de sales como el NaCl y
(NH4)2SO4.
Objetivo General: Estudio de la fuerza inica en la solubilidad de las protenas.

2. Resultados y discusin

2.a Curva de calibracin para mtodo de Biuret.

Para la calibracin del mtodo de Biuret se utilizaron soluciones de distinta

concentracin de un suero patrn, la cual contiene seroalbmina de bovino, cuya
concentracin es de 10 mg/mL. Para la preparacin de las soluciones, se utiliz reactivo de
Biuret (1,5 [g] de CuSO4.5H2O, 6 [g] de tartato de de sodio y potasio 4H2O en 500 mL de
agua, con 300 mL de NaOH y enrasado a 1L), calentado a 50C por 5 min para completar la
reaccin de formacin del complejo, y NaCl 0,15 M para dilucin [3]. Se utiliz una solucin
de NaCl 0,15 [M] y Biuret como blanco, fijando la absorbancia cero. Las absorbancias se
midieron por duplicado, y las cantidades utilizadas de cada solucin estn detalladas en la
tabla 1, junto con los valores obtenidos de absorbancia:

3
 Tabla 1. Cantidades usadas para la preparacin de las soluciones.
Vol.
[Protena] NaCl
Solucin A 1;540nm A 2;540nm A. ;540nm Biuret
[mg/6mL] [mL]
[mL]
1 0,125 0,112 0,119 2 1,8
2 0,214 0,192 0,203 4 1,6
3 0,308 0,272 0,29 6 1,4
4
4 0,379 0,36 0,37 8 1,2
5 0,455 0,435 0,445 10 1
0 0 0 0 0 2

La curva para la calibracin, hecha a partir de las absorbancias promedios se observa

en la figura 1:
0,5

0,45

0,4

0,35
y = 0,0463x
R = 0,9892
Absorbancia

0,3

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 2 4 6 8 10
Concentracin de proteina [mg/6mL]

Figura 2. Absorbancia promedio de ambas mediciones en funcin de la concentracin

de la protena. La ecuacin de la recta que define la curva est dada por y=0,0463x, donde
x es la concentracin de protena en [mg/6mL] y en tanto la pendiente 0,0463 representa el
producto coeficiente de extincin del complejo de cobre y el largo del paso ptico.

4
 2.b Determinacin de protenas del suero sanguneo.

Se utilizar la curva de calibracin para determinar la cantidad de globulinas

presentes en el suero sanguneo humano, bajo dos suposiciones: las nicas protenas
presentes en el suero son las globulinas y las albuminas; el cloruro de amonio hace precipitar
selectivamente las globulinas del suero, dejando las albuminas en solucin. Las cantidades
utilizadas en la para la dilucin estn detalladas en los siguientes esquemas.
Solucin 1:

0,5 [mL] suero 10 [mL] sol A 2 [mL] sol A 6 [mL] sol 1**

+9,5 [mL] NaCl +4,0 [mL] sol Biuret

Solucin 2:

0,5 [mL] suero 10 [mL] sol B* 2 [mL] filtrado 6 [mL] sol 2**

+9,5 [mL] (NH4)2SO4 Filtracin por papel +4,0 [mL] sol Biuret

*La solucin fue calentada durante 15 min a 37C.**soluciones calentadas a 50C

durante 5 minutos, para completar la reaccin de biuret.

A partir de las soluciones se obtuvieron los valores de absorbancia a 540 nm, de 0,327
para la solucin 1 y de 0,109 para la solucin 2. Los valores son interpolados por la ecuacin
de la recta (ver figura 1), utilizando:

0,327
. 1 [] = [ ] = 7,06 [ ] = 35,3 [ ]
0,0463 6 1 2 10
0,109
. 2 [] = [ ] = 2,35 [ ] = 11,8 [ ]
0,0463 6 2 2 10

5
 Considerando que para ambas soluciones se comenz con 10 mL y que el cloruro de
amonio solo hizo precipitar a la globulina, los resultados se resumen en la tabla 2:
Tabla 2. Determinacin de abundancia relativa de protenas en el suero sanguneo.
[Protena] Masa de
Fraccin V [mL] %
[mg/mL] Protenas [mg]
Solucin A 10 3,53 35,3 100
Solucin B 10 1,18 11,8 33,4
Precipitado - - 23,5 66,6

Si se asume la precipitacin selectiva, se puede observar que la composicin de

protenas del suero sanguneo humano analizado es de un 33,4% de Albminas y un 66,6 %
de Globulina. A partir de estos resultados, se puede observar que este suero sanguneo posea
una alta cantidad de globulina, dado que en general los porcentajes de ambas protenas son
[2]
invertidos (albminas alrededor del 60% y globulinas cerca del 40% ). Tambin podra
pensarse que el efecto salting-out del cloruro de amonio logro precipitar parte de las
albminas, no logrando una precipitacin fraccionada prolija, lo cual se refleja en una menor
abundancia determinada.
Respecto a esto, queda demostrado el efecto salting-in del cloruro de sodio, dado que
la solucin preparada contena una alta cantidad de protenas, mientras que la capacidad del
efecto salting-out de sulfato de amonio se observa en la menor cantidad protena en la
solucin preparada con esta sal. Molecularmente esto se explica en un efecto de
estabilizacin de los grupos cargados de la protena en solucin y una competencia por la
solvatacin de las sales. Para todas las sales, cuando aumenta su concentracin (y por lo tanto
la fuerza inica), la solubilidad de las protenas aumenta dado la estabilizacin de sus grupos
polares y sus grupos cargados (residuos de lisina, de cido asprtico, de histidina, entre otros)
con los iones de las sales. Pasada cierta concentracin de la sal, efecto deja aumentar la
solubilidad, en algunos casos se estabiliza (como el cloruro de sodio, el cual no compite
significativamente por las molculas del solvente), y en otros casos se produce el efecto del
salting-out (sales bivalentes, como el sulfato de amonio), dado que iones de alta carga y
tamao son buenos competidores por la solvatacin de las molculas del solvente, quitndole
estabilizacin a la protena y precipitndola. Las distintas protenas requieren distintas
6
concentraciones de sal para precipitar, efecto que se utiliz para precipitarlas
fraccionadamente en este prctico.
2.c Estudio del efecto de la concentracin de NaCl en la solubilidad de protenas.
Se prepar una solucin de 100[mL] que contaba de 10[mL] de suero sanguneo, los
cuales se llevaron a 100[mL] con agua destilada en un matraz de aforo, luego la solucin fue
traspasada a un vaso de precipitado de 200[mL] de capacidad y por medio de soluciones de
hidrxido de sodio (NaOH) 0,1[N] y cido actico 0,1[N] se llev empricamente hasta su
punto isoelctrico.
Debido a que la solucin de suero est a pH fisiolgico el cual vara entre los valores
de 7,35 y 7,45, de forma aproximada, dependiendo de donde se obtuvo la sangre para el suero
se puede especular que su pH es de aproximadamente de 7,4 si la sangre era de origen arterial
o de 7,35 si era de origen venosa(4). Para llevarla a su PI primero se agreg cido actico gota
a gota hasta que empricamente se viera que se pas el punto de mayor turbidez, una vez
pasado ese punto se volvi al punto de mayor turbidez por medio de la adicin del NaOH,
una vez alcanzado este punto se agreg la sal de NaCl 2[M], de modo que visualmente se
observ como la protena se solubilizaba hasta el mximo posible, el proceso de agregado de
la sal puede ser observado en la figura 3.

(1) (2)

Figura 1. Fotografas demostrativas del efecto de solubilidad de la sal en las protenas

donde (1) es la solucin en su PI emprico antes de agregar NaCl y (2) es la solucin lo ms
solubilizada posible con NaCl.

7
 Para solubilizar las protenas se utilizaron 30 gotas de solucin NaCl , estimando cada
gota con un volumen de 0,05[mL], de forma aproximada se puede decir que se utiliz
1,50[mL].
De lo observado se destaca que la presencia de sal afecta la solubilidad de una
protena a modo de que la aumenta, pero tambin, al menos en el caso del NaCl esta alcanza
un mximo de solubilidad para lo protena, de modo que al punto de llegar por sobre las 60
gotas adicionadas a la solucin de suero en agua, las protenas no mostraron signo de
aumentar an ms su solubilidad de lo ya observado a las 30 gotas, sin embargo tampoco fue
observable que la solubilidad de las protenas disminuyera, como se muestra con otras sales
en la figura 1, esto tambin corrobora empricamente la informacin sobre el NaCl mostrada
en la figura 1.

3. Conclusiones
A partir de los resultados obtenidos, se comprueba ele efecto salting in de las sales a
bajas concentraciones, y el efecto salting-out de sales bivalentes a concentraciones altas como
el sulfato de amonio. En el caso del experimento 2.b, se observa que los iones de gran tamao
y carga (como los NH4+ y el SO4-2), se pasa por un mximo de solubilidad y luego esta
disminuye. En tanto en el experimento 2.c se comprueba que para iones pequeos (Na+ y Cl-
) la solubilidad alcanza un mximo en el cual se estabiliza.
Se determin que en el suero utilizado, el porcentaje de albminas era de un 33,4% y
de globulinas de un 66,6%, una proporcin inusual para el suero sanguneo. Se observa que
las globulinas son protenas mucho ms sensibles a los cambios en la fuerza inica que las
albminas.

4. Bibliografa
[1] B.Q. Experimental. (2010). [En lnea]. Purificacin de la enzima lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo. Disponible en:
<https://bqexperimental.files.wordpress.com/2010/01/purificacion-salado.pdf> Consultado
el 23 de Abril del 2017.
8
 [2] M. Sabata. M. Serrano. R. Devis. (2014). Practico 2. Salado (Salting aot) de
proteinas, su aplicacin en la separacin de albmina y globulinas en suero o plasma
sanguineo. Departamento de ciencias fisiologicas. Pag. 8.
[3] M. C. Rojas. (2016) Qumica Biolgica, Guas de trabajos prcticos.Santiago de
Chile. Departamento de Qumica. Unidad I: Efectos de la fuerza inica. Precipitacin por
salazn y cuantificacin de las proteinas del suero sanguneo. Efecto solubilizante del NaCl
sobre las proteinas del suero sanguneo.
[4] Morcillo, Jess (1989). Temas bsicos de qumica (2. edicin). Alhambra
Universidad. Pag. 270-272.

Anexo
0,5

0,45
y = 0,0479x
0,4 R = 0,9832

0,35 y = 0,0448x
R = 0,9934
0,3
Absorvancia

0,25

0,2

0,15

0,1

0,05

0
0 2 4 6 8 10
Concentracin de proteina [mg/6mL]

Figura 1 Anexo. Absorbancias medidas por duplicado para las preparaciones 1

(naranja) y 2 (azul) en funcin de la concentracin de la protena.
Donde para la solucin 1 la ecuacin obtenida es de = 0,0479 y para la solcuin
2 es de = 0,0448, cada uno con sus respectivos valores de R.