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CARACTERSTICAS DE UN DILUYENTE.

Los diluyentes son compuestos qumicos, o conjunto de sustancias que


preservan la viabilidad y fertilidad del semen, a la vez que posibilitan el
procesamiento de un nmero previamente establecido de espermatozoos,
acondicionados en envases adecuados, de un tamao conveniente para la
inseminacin.

La concentracin de espermatozoos en un eyaculado de un toro normal, es


considerablemente alta, lo que posibilita que pueda ser utilizado para
inseminar cientos de vacas. Es necesario, por lo tanto, realizar una dilucin o
extensin del mismo para proveer una dosis de inseminacin conveniente, que
contenga un suficiente nmero de espermatozoos de modo de asegurar un
mximo porcentaje de fertilizacin sin desperdiciar espermatozoos. Al mezclar
espermatozoos con diluyentes (extensores), se agregan muchos ingredientes
que los mantienen y protegen, preservando por lo tanto su fertilidad hasta el
momento de la inseminacin.

Las principales funciones de los diluyentes son proveer nutrientes a los


espermatozoos, como fuente de energa, proteger los espermatozoos contra
los efectos dainos de un enfriado rpido, proveer un buffer para prevenir
efectos nocivos de cambios de pH, al formarse cido lctico, resultante del
metabolismo de la glucosa por los espermatozoos, mantener una presin
osmtica y un balance electroltico adecuado, inhibir el crecimiento bacteriano,
aumentar el volumen de semen de modo que pueda ser utilizado para
mltiples inseminaciones, proteger los espermatozoos del congelado.

Hay incontables medios que preservan el espermatozoo como son, soluciones


salinas fisiolgicas, glucosa, sulfatos, lecitinas y peptonas que tambin pueden
proteger la membrana lipdica del espermatozoo.

El mayor avance en diluyentes de semen surgi con el descubrimiento de la


yema de huevo (1939), as como el mayor avance en la congelacin de semen
surgi con el descubrimiento del glicerol (1949).

En la frmula original, el diluyente contena volmenes iguales de yema de


huevo y fosfato bufferado. Luego se descubri que si se reemplazaba el
fosfato por citrato de sodio se mantena la misma fertilidad, a la vez que
mejoraba la motilidad y la visibilidad lo que haca posible una mejor evaluacin
microscpica.

Dada la gran variedad de diluyentes existentes, cada laboratorio (o cada


profesional especializado) debe determinar qu diluyente, bajo sus
condiciones, provee un mximo de eficiencia reproductiva.
Componentes Bsicos de un Diluyente.

Agua Destilada: Acta como solvente para los componentes semanales y del
diluyente. Debe ser destilada para eliminar la presencia de metales pesados
en solucin, que son dainos para el semen.

Sustancias Buffer y no inicas. (Disueltas para mantener la osmolaridad y el


PH del medio). Entre stas se encuentran: Citrato de Sodio (dihidrato), TEST
(TRIS + TES), Glutamato Monosdico, diferentes buffers con combinaciones
de soluciones salinas o carbohidratos. Materiales orgnicos: Tienen la
capacidad de prevenir el shock de fro (yema de huevo o leche).
Concentraciones de aproximadamente 20% de YEMA DE HUEVO son comunes
en la mayora de los diluyentes. La yema de huevo acta previniendo el shock
de fro a travs de sus constituyentes: Lipoprotenas, fosfolpidos y lecitinas.
En el caso de la LECHE (que puede ser entera o descremada), la casena es la
sustancia responsable de la proteccin contra el shock de fro. Agentes
crioprotectores. Antibiticos. Para controlar el crecimiento de
microorganismos. Los ms utilizados son Penicilina y Estreptomicina.

FASES DEL PROCESO DE CONGELACION DE SEMEN.

El proceso de congelacin de semen bovino incluye los siguientes pasos:


colecta, evaluacin del semen, clculo del nmero de pajillas posibles, dilucin
del semen al volumen requerido y finalmente el proceso de criopreservacin.

El proceso de colecta debe ser higinico y evitando el shock trmico de los


espermatozoides. La colecta se realiza con vagina artificial (VA) o por
electroeyaculacin (EE; Palmer et al., 2005).

La evaluacin del semen incluye la determinacin del volumen, color, la


motilidad (masal e individual progresiva) y la morfologa. Con esta informacin
se calcula el nmero de espermatozoides viables en la muestra. Despus se
divide este nmero por el nmero deseado por pajilla (generalmente de 20
millones) y se calculan el total de pajillas posibles con el semen obtenido.
Tambin se calcula el volumen de diluyente que se requiere para ese nmero
de pajillas.
El diluyente que se aade para congelacin generalmente es del tipo TRIS
(buffer), El diluyente debe contener sustancias inicas o no inicas que
mantengan la osmolalidad del medio (TRIS), una fuente de lipoprotena de alto
peso molecular (yema de huevo, leche descremada), una fuente de energa
como fructosa o glucosa, y un crioprotector. Existen varios tipos de
crioprotectores: Los que penetran la membrana como son el 1,2-Propanodiol
(PROH), el Dimetilsulfxido (DMSO), el Etiln-Glicol (EG) y el Glicerol; los que
no penetran la membrana como, Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil-
pirrolidona (PVP), Dextran, Polietilen-glicol (PEG). De estos el ms utilizado
para la criopreservacin de semen bovino es el glicerol a una concentracin
final en el diluyente del 7%.
El diluyente puede venir en dos fracciones o en una fraccin. Si viene en una
fraccin (glicerol 7%) simplemente se aade el diluyente al semen (lo ms
rpido posible despus de la colecta). Si son dos fracciones, lo que implica es
que una fraccin es simplemente buffer (Fraccin A) y la otra contiene el
crioprotector que generalmente es glicerol al 14% (fraccin B). Cuando son
dos fracciones la mitad del diluyente es A (ej 64 ml) y la otra mitad es B (ej
64ml). La primera fraccin se aade a temperatura ambiente y la segunda
fraccin se aade a 4-5C.

Independiente de si es una fraccin o dos el semen, una vez diluido debe


empezar una curva de fro lenta para que ste llegue a 5C en un lapso de 2
horas. Una vez se logran los 5C, si hay que aadir la fraccin B, sta se aade
tambin a 5C. Despus de diluido completamente el semen viene el siguiente
paso que es el periodo de equilibrio que puede durar de 2-24 horas y se realiza
a 5C. En este tiempo el crioprotector penetra las membranas del
espermatozoide para protegerlo de los daos que se pueden generar durante
la criopreservacin y la descongelacin. Despus de alcanzado el equilibrio, se
congela el semen a vapores de nitrgeno lquido (-120C) por un lapso de 10
minutos y luego se sumergen las pajillas en el nitrgeno para ser
almacenadas. Muy importante el proceso de evaluacin del semen
postdescongelacin. Se considera que el semen apto para usar en
inseminacin artificial convencional, debe tener al menos 10 millones de
espermatozoides viables a la descongelacin, y este semen debe tener una
motilidad progresiva mnima del 30-35%. Tambin se le debe realizar una
prueba de resistencia que consiste en evaluar la motilidad del semen por dos
horas. El semen debe tener al menos 5% de motilidad a las dos horas de
descongelado. Tambin se debe tomar una pajilla y enviarse para cultivo
microbiolgico.