Cultivo Discontinuo de Escherichia coli en

caldo BHI
Daniela Castellar-Garca, Diana L. Gonzlez-Montejo
Laboratorio de Biotecnologa, Programa de Ingeniera Qumica, Universidad de la
Sabana, Cha, Cundinamarca.
danielacasga@unisabana.edu.co - dianagonmon@unisabana.edu.co

Resumen

Los medios de cultivo son de alta importancia en la industria debido a la capacidad

que poseen para suplir los requerimientos nutricionales del hbitat natural de un
microorganismo, como es en este caso Escherichia coli, este crecer a partir de una
limitada cantidad del medio hasta que se agote el sustrato o se acumulen productos
txicos que inhiben el crecimiento del microorganismo. Se estableci un medio de
cultivo, para estudiar tanto la cintica de crecimiento de Escherichia coli como el
consumo de sustrato durante el cultivo.

Introduccin microorganismos que pueden crecer

Escherichia coli es un bacilo
gramnegativo de la familia de las
enterobacterias. Esta se encuentra
normalmente en el intestino de los
seres humanos y de otros animales,
se ha descrito que esta bacteria tiene
la capacidad de absorber algunas
vitaminas como la vitamina K. Se dice
que la bacteria tambin es la principal
causa de infeccin urinaria u otras
infecciones como meningitis.
El crecimiento microbiano es el
aumento de nmero de
microorganismos a lo largo del
tiempo. El crecimiento es el resultante
de la suma de los ciclos celulares de
todos los individuos de dicha
poblacin. En funcin de los
en ellos, se denominan a los medios
generales o selectivos cuando
favorecen el crecimiento de dichos
microorganismos mientras inhiben el
de otros componentes, pueden ser
diferenciales cuando algunos de sus
componentes identifican las colonias
de un tipo de microorganismo o
selectivo- diferencial cuando
combinan los dos anteriores (Brock,
1998).
En los ltimos aos la determinacin
de controles ptimos para la
fermentacin por lotes ha sido un
gran campo de inters en la
ingeniera bioqumica. El proceso de
alimentacin por lotes tambin da al
operador la libertad de manipular el
proceso a partir de la velocidad de
alimentacin del sustrato. Este
mtodo es muy comn en la industria
debido a su capacidad de superar la acumulan productos txicos hasta
represin catablica (Paalme, Tiisma, inhibir el crecimiento (Tovar, 2012).
Kahru, Vanatalu & Vilu, 1989).
Metodologa
Existen diferentes tipos de medio de
Preparacin de la suspensin celular
cultivo, entre los cuales se
en solucin salina al 0.85% (p/v)
encuentran cultivo discontinuo, cultivo
En la caja que contena E.Coli se
discontinuo alimentado y cultivo
tom una muestra con asa curva y se
continuo. La principal diferencia entre
transfiri a un tubo el cual contena
el cultivo continuo y el discontinuo es
una solucin salina, se homogeneiz
que el cultivo continuo opera bajo
y se compar la turbidez con el tubo
condiciones limitantes de sustratos,
patrn.
mientras que el cultivo discontinuo,
en la fase exponencial, funciona en
Produccin del inculo
presencia de exceso de sustrato, otra
En un Erlenmeyer de 500 mL el cual
diferencia es que el cultivo continuo
contena 90 mL de caldo BHI se
opera bajo condiciones de un estado
inocul 10 mL de la suspensin
de equilibrio ya que las
mencionada anteriormente, este se
concentraciones de todos los
dej incubar por 12 horas a 37C,
componentes del cultivo son
luego se realiz la tincin de gram
constantes. La velocidad de
para verificar pureza.
crecimiento en el cultivo continuo est
controlada por la velocidad de
Fermentacin discontinua
dilucin y su valor es siempre menor
Para evaluar el crecimiento de E.Coli
que el de la velocidad especfica de
se tomaron diferentes muestras
crecimiento mxima, ( max). Por el
durante 8 horas (0, 0.5, 1, 1.5, 2.5, 3,
contrario la velocidad especfica de
5 y 6), con estas muestras se evalu
crecimiento en la fase exponencial de
el consumo de sustrato y la
un cultivo discontinuo alcanzar la
produccin de biomasa, para esto se
max correspondiente
a las
utiliz el mtodo DNS, se inocul 6
condiciones que prevalezcan en el
mL en cada Erlenmeyer con 54 mL
cultivo (Tovar, 2012).
de caldo BHI y se incubaron a 37C,
luego en cada hora correspondiente
Un microorganismo solo crecer en
se retir de la incubadora, se realiz
un medio de cultivo si contiene todos
una coloracin de gram, medicin de
los nutrientes necesarios y con
pH y lectura de absorbancia a 600nm
factores ambientales apropiados. El
con 3 mL del cultivo para medir
mtodo de cultivo ms sencillo es el
biomasa.
discontinuo en el cual el
microorganismo crece a partir de una
Luego el resto del cultivo se
limitada cantidad de medio hasta que
centrifug por 40 minutos, con el
se agota un nutriente esencial o se
sobrenadante se realiz la prueba
DNS para determinacin
azcares.
Resultados y discusin
La siguiente grfica representa la
concentracin de biomasa con el
tiempo de incubacin de cada cultivo,
como se puede observar en la curva
de crecimiento que se muestra se
alcanzan a diferenciar las diferentes
etapas de la misma, sin embargo no
se observa significativamente la fase
de latencia ya que el tipo de bacteria
con el que se trabaj llega a la fase
exponencial de manera muy rpida
(2-4 horas), por lo que se puede decir
que desde la hora cero a la hora 2,5
se observa la fase exponencial, luego
de la hora 2,5 a la 6 se observa tanto
la estacionaria como la fase de
muerte ya que entre 4 y 5 hay una
disminucin en la produccin de
biomasa
Grfica 1, Produccin de biomasa vs
tiempo
Para determinar el sustrato residual y
el consumo de sustrato se utiliz el
mtodo DNS(Anexo 1).
Ecuacin de la curva patrn DNS
de y = 0, 5369 x 0, 2086
R 2 = 0, 9869
En las grficas 2 y 3 se puede
observar como el sustrato residual
tiene una disminucin significativa
entre la hora cero y la hora uno,
debido a que en estas horas se da la
mayor produccin de biomasa ya que
el microorganismo se encontraba en
la fase exponencial, por otro lado, la
grfica 3, confirma lo mencionado
previamente, que la fase exponencial
puede encontrarse entre la hora 0 y la
hora 2,5 ya que es donde se puede
observar un mayor consumo de
sustrato haciendo as crecer al
microorganismo.
Grfica 2, Comportamiento del
sustrato residual
Grfica 3, Comportamiento del
consumo de sustrato
Velocidad de crecimiento x
Con los datos obtenidos para la un rendimiento del 61% (Fajardo &
produccin de biomasa se pudo Sarmiento, 2007).
calcular la tasa de crecimiento
Conclusiones
utilizando la siguiente frmula:
El rendimiento es adecuado
ln N = lnN o + t comparado con la literatura
para este tipo de
Obteniendo una tasa de crecimiento
microorganismos.
x 0,2051
h-1 es decir,
El medio de cultivo de BHI es
aproximadamente 12 minutos,
adecuado para cultivar
mientras que en la literatura se
bacterias de tipo E.Coli.
aproxima que es de 20 minutos, lo
La tasa de crecimiento de 12
cual indica que el medio de cultivo es
minutos es comparable con la
apropiado para E.Coli ya que se
literatura, sin embargo se
cumple con el objetivo de obtener la
puede decir que el medio de
curva de crecimiento con un rango de
cultivo influye en los datos de
error casi insignificante.
cintica bacteriana.
Tiempo de duplicacin
Bibliografa
Con el objetivo de saber la tasa de J. C Buitrago. D. G Tenjo Obtencin de
duplicacin, es decir, el tiempo que le un sustrato fermentable de origen vegetal
toma al microorganismo reproducirse y su evaluacin con clulas libres de
en el medio se utiliz la siguiente Saccharomyces cerevisiae. Pontificia
frmula: Universidad Javeriana. Bogot, D.C.
ln2 Enero, 2007.
=
Ins Arana, Maite Orruo e Isabel
Dando as un tiempo de duplicacin Barcina Departamento Inmunologa,
de 3,38h, mientras que la literatura es Microbiologa y Parasitologa Universidad
de aproximadamente 3, lo cual del Pas Vasco/Euskal Herriko
reafirma que el cultivo es apropiado Unibertsitatea. CLCULO DE LOS
para E.Coli, por ltimo se utiliz la PARMETROS QUE DEFINEN EL
siguiente ecuacin para calcular el CRECIMIENTO BACTERIANO
rendimiento Ing. Carlos Brunatti Lic. Ana Mara
Biomasa producida Martn.(2010) Introduccin a la
Y = Sustrato consumido
Espectroscopa de Absorcin Molecular
De esta manera se encontr que el Ultravioleta, Visible e Infrarrojo Cercano.
rendimiento es del 66% lo cual es un E.Fajardo. S. Sarmiento.Evaluacin de
valor significativo ya que en un mezcla de caa como sustrato para la
estudio similar realizado para produccin de Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae se obtuvo cerevisiae. Pontificia Universidad
Javeriana. Bogot, D.C. Enero, 2007.
 Biologa de los microorganismos, 8va
edicin (1998). Brock T.D.
Aura M. Pedroza, Norma C. lvarez, Ral
A. Poutou. DISEO DE UN MEDIO
DEFINIDO PARA El. CULTIVO
DISCONTINUO DE CEPAS
AUTCTONAS DE THERMUS SPP.
Laboratorio de Biotecnologa Aplicada,
Departamento de Microbiologa, Facultad
de Ciencias, Pontificia Universidad
Javeriana, Carrera 7 n 43-82. Santa Fe
de Bogot, D. C. Colombia. Razl A.
Poutou. 1997.
Scott H. Fogler. Elementos de ingeniera
de las reacciones qumicas. prentice
hall/pearson; edicin: 4 (2008)

ANEXO 1