PROCEDIMIENTO

Siembra por extensin en el Agar Manitol Salado

10 gramos de la muestra
(queso) + 90 ml de agua
Pectona.

Pipetear 0,1ml del

homogenizado y extender
en el agar Manitol salado

Esterilizar la esptula
despus de la siembra y
llevarlo a la incubadora a una
T 37C por 18 24 horas

Resultado de la siembra
PREPARACION DEL AGAR NUTRITIVO

Esterilizar el asa de koller

hasta la incandescencia y
enfriar brevemente al
aire.

Se destapa la placa, se
extrae la muestra con el
asa esterilizada y se
transfiere a un medio
estril.

Tras tomar la muestra con

el asa, se destapa el tubo,
luego se pasa el extremo
del tubo por el fuego

Se realiza la siembra por

estriado, despus se pasa
el extremo del tubo por el
fuego y se tapa.

El asa se calienta de
nuevo antes de dejar de
utilizarla.
 PROCEDIMIENTO PARA LA TINCION GRAM

1. Extensin: En una placa porta objetos limpia bien limpia, se

coloca una gota de agua destilada a la que con el asa de koller,
previamente esterilizada a la llama, se lleva una pequea
cantidad de suspensin de bacterias o, en su caso, de una
colonia.
Con el asa se extiende la gota y las bacterias sobre la lmina
porta y se fija la extensin por el calor, calentando suavemente a
la llama del mechero hasta que se seque.

2. Coloracin:
a) 1 minuto en cristal violeta (colorante inicial)
b) se lava con agua destilada
c) 1 minuto en lugol (mordiente)
d) se lava con agua destilada.
e) se decolora con alcohol (decolorante) 30 segundos
f)) se lava con agua destilada
g) 1 minuto en safrarina (colorante de contraste
h) se lava con agua corriente
i) se seca suavemente y sin frotar con papel toalla
Una vez que la preparacin est totalmente seca, poner una gota muy
pequea de aceite de cedro y observar al microscopio con el objetivo de
inmersin.
RESULTADOS
 CONCLUSION

Tanto las bacterias Gram positivas como las Bacterias Gram negativas se
presentan morfolgicamente como cocos o bacilos, sin embargo al ejecutar
tincin de Gram en estas para identificar su grupo taxonmico, las
Gram positivas se tien de color violeta mientras que las Gram negativas se tien
de color rosado.
Mediante la tincin de Gram se identifican bacterias Gram positivas y Gram
negativas gracias al color que tornan despus de ser teidas; en el caso de las
bacterias Gram positivas se tien de violeta, esto se debe a que gracias a que
contienen una pared gruesa de peptidoglicano y gran cantidad de cidos
teicicos que permiten fijar y retener rpidamente el colorante inicial el cual es,
el cristal violeta de Hucker, y adems son resistentes a la decoloracin. Lo
contrario ocurre con el caso de las Gram negativas, las cuales poseen
una pared delgada con menos cantidad
de peptidoglicano y lpidos, la cual requiere de un colorante de contra tincin
como la safranina o la fucsina en este caso, ya que el colorante inicial es
fcilmente retirado en la decoloracin con alcohol, debido a que por su delgada
pared celular no lo retienen.
La tincin de Gram permite conocer la morfologa celular, el tamao, la forma
y su clasificacin taxonmica (Gram positivos o Gramnegativos) de acuerdo al
color que tornan las bacterias despus de la tincin, sin embargo no permite
conocer la especie o gnero de la bacteria al cual pertenece
Fue posible observar bacterias Gram negativas con forma de bacilos
(Escherichia coli), y Gram positivas en forma de estafilococos
(Staphylococcus sp).
 OBJETIVO
Comprender los pasos necesarios para realizar la tincin de Gram

Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al igual de la

aplicabilidad clnica de la tincin.

FUNDAMENTOS DE LA PRCTICA
La tincin de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del siglo XIX y
puede utilizarse para separar la mayora de las
especiesbacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan elcolorant
e bsico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas), y las que pierden
ese colorante por el lavado con el decolorante alcohol o acetona (es decir
las bacterias Gram negativas).
TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.
Preparacin del extendido:
Los mtodos de tincin se utilizan en forma directa con las muestras del
paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del desarrollo de los
microorganismos en cultivos. Por lo general las muestras se colocan sobre el
portaobjeto con un hisopo que contiene el material del paciente o con una
pipeta dentro de la cual se encuentra la muestra de lquido aspirado (Fig. 1). El
material que se va a teir se coloca en forma de una gota (si
lamuestra es liquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre lasuperficie de un
portaobjeto limpio y seco
Es importante evitar la contaminacin de los medios de cultivo; por lo tanto, una
vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no estril no debe
utilizarse para la inoculacin posterior de medios de cultivo. Para la tincin
de los microorganismos que crecen en cultivos puede utilizarse una aguja
estril para transferir una pequea cantidad
delcultivo desarrollado en un medio solido a la superficie delportaobjetos. Este
material se emulsiona en una gota de agua
osolucin salina 0.9% estril sobre el portaobjeto. En caso decantidades
pequeas que puedan perderse incluso en una gota de solucin fisiolgica se
puede utilizar en aplicador de madera estril para obtener el material; luego
este material se frota directamente sobre el portaobjetos que se va a teir se
deja secar y se fija al porta
objeto mediante su colocacin sobre una platina caliente (a 60C) durante por
lo menos 10 minutos o cubrindolo con metanol al95% durante 1 minuto.
Para examinar los microorganismos que crecen en medio lquido
seaplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre elportaobjetos, se
seca y se fija antes de la tincin. La preparacin de los frotis vara de acuerdo
con el tipo de muestra que se va a procesar y con los mtodos de tincin que
se van a utilizar. No obstante la regla general para la preparacin de frotis
esque debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre elportaobjeto
para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciarlos microorganismos.
Por ltimo, el mtodo de tincin que se debe utilizar est determinado por el
tipo de microorganismo buscado.